CN113125738A - 循环肿瘤细胞的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种循环肿瘤细胞的检测方法，包括如下步骤：1）待测血液处理：采用密度梯度离心法对待测血液进行离心，离心后体系分为四层，白细胞和循环肿瘤细胞处于自上而下的第二层，将其中所述第二层与其他层分离并取出，得到检测液；2）循环肿瘤细胞富集：使所述检测液通过富集筛选机构进行富集；3）采用细胞核染料以及荧光标记抗体对步骤2）中富集的循环肿瘤细胞进行染色；4）荧光检测。本发明的循环肿瘤细胞的检测方法，采用密度梯度离心液对样本进行预处理，提高CTCs富集稳定性，极大地降低了血液中红细胞的干扰，且采用富集筛选机构进行循环肿瘤细胞的富集，能够在富集筛选机构中实现原位染色，避免了转移导致CTCs丢失的问题，提高了CTCs的回收率。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞的检测方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulating Tumour Cells, CTCs)是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。
早在1889年，Paget提出了“种子和土壤”的学说，他认为处于旺盛生长状态的肿瘤细胞作为“种子”，当遇到合适的环境——即“土壤”时，就会发生肿瘤的转移。在1896年，澳大利亚学者Ashworth在一例转移性肿瘤患者血液中首次观察到从实体肿瘤中脱离并进入血液循环的肿瘤细胞，提出了CTCs的概念。
近几年CTCs在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现逐渐崭露头角，被称为“液体活检”，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，临床应用价值极其显著：（1）与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比，优势显著，可更加敏感地发现疾病的变化，更加科学、迅速地评价某一治疗方案的效果；（2）分离富集CTCs只需抽取患者少量外周血，对患者没有副作用，因此可以高频度的监测，达到实时监测疾病进展的目的；（3）更为重要的是，CTCs可作为分析患者肿瘤生物学特征的实时样本，可以发现患者的实时生物学变化，并根据结果及时调整治疗方案，实现实时的个体化治疗。
现有技术中CTCs直接检测方法主要有两大类：一类是基于CTCs物理尺寸的粗分离，例如，使用孔径8um的滤膜，设想CTCs尺寸普遍大于8um，通过过滤方法筛选CTCs。但是，很多白细胞粒径大于8um，并且不同时期的CTCs，如进入休眠期的CTCs，可以轻易穿过8um孔径滤膜，导致白细胞堵塞滤膜和CTCs漏检情况。另一类是基于细胞表面抗原标志物的分离，该方法最具代表性产品是强生公司的CellSearch全自动CTCs检测仪，是惟一被FDA和CFDA批准的用于CTCs临床检测的技术。但是该方法使用的是免疫磁珠，分离出的CTCs活性较差，存在检测灵敏度较差、漏检等问题。
针对上述问题，现有技术中已经出现采用富集筛选机构对循环肿瘤细胞进行富集和检测的方案。如申请号201820848148.4、名称为：用于捕获目标细胞或生物分子的富集筛选机构的中国专利中公开了可以采用富集筛选机构对循环肿瘤细胞进行富集以及后续的检测操作。但是研究人员发现，现有的富集和检测方法中，血液中红细胞的处理较为繁琐，无法避免红细胞对富集和检测循环肿瘤细胞过程中的影响，且在操作过程中循环肿瘤细胞的丢失严重。
发明内容
有鉴于此，为了达到上述目的和解决现有技术的问题，本发明提供了一种改进的循环肿瘤细胞的检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下的技术方案：
一种循环肿瘤细胞的检测方法，包括如下步骤：
1）待测血液处理：采用密度梯度离心法对待测血液进行离心，离心后体系至少分为四层，其中待测血液中的红细胞进入最下层，白细胞和循环肿瘤细胞处于自上而下的第二层，将其中所述第二层与其他层分离并取出，得到检测液；通过将白细胞和循环肿瘤细胞单独取出，能够有效避免红细胞对后续操作的干扰；
2）循环肿瘤细胞富集：使所述检测液通过富集筛选机构进行富集，所述富集筛选机构包含一个或多个层叠的捕获筛，所述捕获筛包括网状基体及覆设于所述网状基体上的捕获层，所述捕获层含有捕获物，所述捕获物为能够与循环肿瘤细胞特异性结合的物质；
3）采用荧光标记抗体以及细胞核染料对步骤2）中富集的循环肿瘤细胞进行染色；本发明的检测方法，在进行染色时，无需将富集的循环肿瘤细胞从富集筛选机构中洗脱下来，能够实现原位染色，避免了转移导致CTCs丢失的问题，实现了CTCs富集完成后直接原位染色操作，提高了CTCs的回收率；
4）荧光检测：在激发光激发下观察荧光效果，并进行结果判读和统计。
采用密度梯度离心液对样本进行预处理，简化了操作流程，方便操作人员快速掌握，提高CTCs富集稳定性，极大地降低了血液中红细胞的干扰，从而更加有效的富集CTCs。
根据本发明一些优选地实施方面，在将通过富集筛选机构对检测液进行富集前，需要对检测液进行清洗和重悬，清洗和重悬均采用PBS溶液。
根据本发明一些优选地实施方面，步骤1）中，所述密度梯度离心法所采用的密度梯度离心液为淋巴细胞分离液。本发明中采用的密度梯度离心液为市购的用于对血液样本进行处理使其能够分为四层的淋巴细胞分离液。
根据本发明一些优选地实施方面，步骤1）中，在开启所述离心前，先将密度梯度离心液与待测血液混合均匀，然后加入密度梯度离心液和血液样本总体积1-2倍的缓冲液进行稀释。如在一些实施例中，将密度梯度离心液和血液样本等比例混合后，加入血液样本两倍体积的缓冲液进行稀释。稀释所采用的缓冲液为磷酸盐-吐温20缓冲液，具体为含有质量百分含量0.5%吐温20的PBS溶液。
根据本发明一些优选地实施方面，所述密度梯度离心液与待测血液的体积比为1-1.5:1，在具体的一些实施例中优选为1:1等体积混合。
根据本发明一些优选地实施例，步骤1）和步骤2）中待测血液处理和循环肿瘤细胞的富集过程如下：将密度梯度离心液和待测血液在淋巴分离管中混合，向混合后的血样中加入磷酸盐-吐温20缓冲液进行稀释，离心使样本分层，离心后共分为四层，由下至上依次为：底层红色部分为聚集的红细胞，其次是密度梯度离心液层，中间位置略带白色的中间白色层为白细胞和循环肿瘤细胞，上层淡黄色部分为血浆成分。移除血浆层后，将中间的白色层（白细胞和循环肿瘤细胞）转移至盛有磷酸盐-吐温20缓冲液的离心管中，离心清洗后，弃上清液，并重悬离心清洗后的细胞沉淀得到细胞悬液，将细胞悬液转移至富集筛选机构的加样口，使用富集筛选机构富集循环肿瘤细胞。
根据本发明一些优选地实施方面，步骤3）中的染色步骤包括：先采用固定液和封闭液对富集的循环肿瘤细胞进行染色前处理，之后使用荧光标记抗体对循环肿瘤细胞进行染色，然后使用细胞核染料对细胞核进行染色。
根据本发明一些优选地实施方面，所述荧光标记抗体包括采用荧光染料AlexaFluor 488（简称AF488）标记的光谱细胞角蛋白（pan cytokeratin，pan-CK）抗体（简称pan-CK-AF488），白细胞表面共同抗原抗体45（Cluster of Differentiation 45，简称CD45）抗体，荧光染料AlexaFluor 568（简称AF568）标记的山羊抗兔IgG H&L（简称AF568-goat anti rabbit IgG H&L）抗体；所述细胞核染料为4',6-二脒基-2-苯基吲哚（简称DAPI）。
在一些实施例中，染色时，先使用pan-CK-AF488抗体和CD45抗体一起进行细胞染色1h，之后使用AF568-goat anti rabbit IgG H&L二抗染色1h，然后使用DAPI对细胞核进行染色1h。
荧光标记抗体：通过连接有不同荧光基团的抗体，该荧光标记抗体即可结合对应抗原分子，这些荧光基团在特定条件下被激发即可发出该荧光基团特有的荧光。
本发明的循环肿瘤细胞的检测方法，所采用的pan-CK抗体用AF488荧光基团标记发出绿色荧光、CD45抗体和AF568-goat anti rabbit IgG H&L抗体荧光基团标记发出红色荧光，细胞核染料DAPI发出蓝色荧光，三种荧光染料的颜色各不相同，互不干扰，不存在串色现象。其中，pan-CK是一种较为优良的靶蛋白，可以有效检出表达CK蛋白的肿瘤细胞，通过对CK的特异性识别可以有效地捕获到目的细胞，最大程度避免CTCs的丢失，提高了CTCs的检出率；通过细胞核染料DAPI，以及广角蛋白家族荧光抗体pan-CK和白细胞特异性抗体CD45荧光抗体共染，简化了操作流程，避免了染色步骤繁多。且采用本发明能够实现在富集筛选机构中原位染色，避免了转移导致CTCs丢失的问题，实现了CTCs富集完成后直接原位染色的操作，提高了CTCs的回收率。
根据本发明一些优选地实施方面，所述固定液为质量百分浓度1～10%多聚甲醛水溶液，优选为4%多聚甲醛水溶液；所述封闭液为山羊血清、甘氨酸和BSA组成的混合液。具体的，在本发明的一些实施方面，封闭液为0.001～5g/mL山羊血清、0.001～2mg/mL BSA和0.001～5g/mL甘氨酸组成的混合液。
根据本发明一些优选地实施方面，所述网状基体包括不锈钢体以及包覆所述不锈钢体表面的保护层，所述保护层由贵金属或其合金制成，所述捕获物连接在所述保护层上。
根据本发明一些优选地实施方面，所述捕获物通过traut’s试剂或带有生物素-亲和素的硫醇盐分子连接于保护层上。
根据本发明一些优选地实施方面，所述捕获物包括EpCAM、EGFR、HER2、FRA抗体中的一种或多种。通过设置连接有的特异性抗体的富集筛选机构，能够有效检出不同类别的肿瘤细胞株，背景干净无杂质，且染色效果稳定，易于判读。
根据本发明一些优选地实施方面，所述网状基体的尺寸为2～10 mm×2～10 mm，所述筛的孔为20 µm～100 µm。
根据本发明一些优选地实施方面，在步骤4）中通过对DAPI阳性、pan-CK-AF488阳性和CD45阴性的细胞优先进行显微镜荧光计数，显微镜下观察以pan-CK-AF488+/CD45-AF568-/DAPI+为循环肿瘤细胞，以pan-CK-AF488-/CD45-AF568+/ DAPI+为白细胞，其中，“+”表示阳性，“-”表示阴性。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明的循环肿瘤细胞的检测方法，采用密度梯度离心液对样本进行预处理，简化了操作流程，方便操作人员快速掌握，提高CTCs富集稳定性，极大地降低了血液中红细胞的干扰，从而更加有效的富集CTCs，且采用富集筛选机构进行循环肿瘤细胞的富集，无需将富集的循环肿瘤细胞洗脱下来，能够在富集筛选机构中实现原位染色，避免了转移导致CTCs丢失的问题，提高了CTCs的回收率，进一步保证了后续检测结果的准确性。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例 循环肿瘤细胞的检测方法
本实施例的循环肿瘤细胞的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、采用密度梯度离心法对待测血液进行离心
将密度梯度离心液和待测血液按照1:1的体积比在淋巴分离管中混合，按照混合后血样的总体积等体积的加入缓冲液进行稀释，400g下离心25min使样本分层。离心后样本共分为四层，由下至上依次为：底层红色部分为聚集的红细胞，其次是密度梯度离心液层，中间位置略带白色的中间白色层为白细胞和循环肿瘤细胞，上层淡黄色部分为血浆成分。
移除最上层的血浆层后，使用吸管将中间的白色层转移至盛有10mL PBS溶液的离心管中，400g离心清洗3次，弃上清；之后使用500uL PBS溶液重悬离心清洗后的细胞沉淀，得到细胞悬液为检测液。通过将白细胞和循环肿瘤细胞单独取出，能够有效避免红细胞对后续操作的干扰。
本实施例中的采用的密度梯度离心液为市购的用于对血液样本进行处理使其能够分为四层的淋巴细胞分离液；稀释所采用的缓冲液为含有质量百分含量0.5%吐温20的PBS溶液。
步骤二、采用富集筛选机构富集循环肿瘤细胞
使步骤一中得到的检测液通过富集筛选机构进行循环肿瘤细胞的富集。
本实施例中的富集筛选机构包括一个或多个层叠的捕获筛，捕获筛包括网状基体及覆设于网状基体上的捕获层，捕获层含有捕获物。网状基体包括不锈钢体以及包覆不锈钢体表面的保护层，保护层由贵金属或其合金制成如金，捕获物连接在保护层上。本实施例中的网状基体的尺寸为8 mm×8 mm，筛的孔为40 µm。
捕获物能够与目标细胞或生物分子特异性结合，本实施例中的目标细胞即为循环肿瘤细胞，本实施例中的捕获物为EpCAM、EGFR、HER2、FRA抗体中的一种或多种，其通过traut’s试剂或带有生物素-亲和素的硫醇盐分子连接于保护层上。通过富集筛选机构中的捕获筛连接有特异性抗体，能够有效检出不同类别的肿瘤细胞株，背景干净无杂质，且后续的染色效果稳定，易于判读。
步骤三、通过荧光标记抗体以及细胞核染料对步骤二中富集的循环肿瘤细胞进行染色鉴定
先采用固定液和封闭液对步骤二中富集的循环肿瘤细胞进行染色前处理。其中，固定液为质量百分浓度4%的多聚甲醛水溶液；封闭液为0.2g/mL山羊血清、0.2mg/mL BSA和0.2g/mL甘氨酸组成的混合液。
之后采用不同的荧光标记抗体（pan-CK-AF488、CD45-AF568）以及细胞核染料进行染色鉴定。其中，荧光标记抗体包括pan-CK-AF488抗体、CD45抗体和AF568-goat antirabbit IgG H&L抗体；细胞核染料为4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。
染色时，先使用pan-CK-AF488抗体和CD45抗体一起进行细胞染色1h，之后使用AF568-goat anti rabbit IgG H&L二抗染色1h，然后使用DAPI对细胞核进行染色1h。染色步骤为相关技术领域的常规技术手段。
本实施例中采用的pan-CK用AF488荧光基团标记发出绿色荧光、CD45抗体和AF568-goat anti rabbit IgG H&L抗体荧光基团标记发出红色荧光，细胞核染料DAPI发出蓝色荧光，三种荧光染料的颜色各不相同，互不干扰，不存在串色现象。其中，pan-CK可以有效检出表达CK蛋白的肿瘤细胞，通过对CK的特异性识别可以有效地捕获到目的细胞，最大程度避免CTCs的丢失，提高了CTCs的检出率；通过细胞核染料DAPI，以及广角蛋白家族荧光抗体pan-CK和白细胞特异性抗体CD45荧光抗体共染，简化了操作流程，避免了染色步骤繁多。
且本实施例在步骤二中通过富集筛选机构进行循环肿瘤细胞的富集，在步骤三染色时能够在富集筛选机构中实现原位染色，避免了转移导致CTCs丢失的问题，实现了CTCs富集完成后直接原位染色操作，提高了CTCs的回收率和染色效果。
步骤四、在激发光激发下观察荧光效果，并进行结果判读和统计
具体的，在不同波段的激发光激发下观察步骤三中染色后的富集筛选机构的荧光效果。通过对DAPI阳性、pan-CK-AF488阳性和CD45阴性的细胞优先进行显微镜荧光计数，镜下观察以pan-CK-AF488+/CD45-AF568-/DAPI+为循环肿瘤细胞，以pan-CK-AF488-/CD45-AF568+/ DAPI+为白细胞，其中，“+”表示阳性，“-”表示阴性。
本实施例的循环肿瘤细胞的检测方法，根据不同癌肿，利用相应抗体可以检测血液标本中CTCs表达的分子标记物，可以高效地捕获所有待测血液标本中的CTCs，极大地提高了CTCs的检测率和准确性。本发明的循环肿瘤细胞的检测方法，使用富集筛选机构对CTCs进行捕获，利用细胞核染料DAPI、荧光抗体pan- CK-AF488和CD45-AF568对富集的循环肿瘤细胞进行染色鉴定，且能够实现原位染色，避免循环肿瘤细胞的转移丢失，之后在不同波段的激发光激发下观察荧光效果，并进行结果判读和统计，能有效检出不同类别的肿瘤细胞株，背景干净无杂质，且原位染色效果稳定，易于判读，极大地提高了CTCs的检测率和准确性，针对不同类别细胞株的检出效率可以稳定在80%以上，优于同类竞品。
以上实施例中未有特别说明的原料均通过商购获得。没有特别提及温度的操作在室温下进行。未有特别说明的操作方法与条件可采用本领域的公知或常规的手段与条件。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）待测血液处理：采用密度梯度离心法对待测血液进行离心，离心后体系至少分为四层，其中待测血液中的红细胞进入最下层，白细胞和循环肿瘤细胞处于自上而下的第二层，将其中所述第二层与其他层分离并取出，得到检测液；
2）循环肿瘤细胞富集：使所述检测液通过富集筛选机构进行富集，所述富集筛选机构包含一个或多个层叠的捕获筛，所述捕获筛包括网状基体及覆设于所述网状基体上的捕获层，所述捕获层含有捕获物，所述捕获物为能够与循环肿瘤细胞特异性结合的物质；
3）采用荧光标记抗体以及细胞核染料对步骤2）中富集的循环肿瘤细胞进行染色；
4）荧光检测。
2.根据权利要求1或2所述的循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，步骤1）中，所述密度梯度离心法所采用的密度梯度离心液为淋巴细胞分离液。
3.根据权利要求1或2所述的循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，步骤1）中，在开启所述离心前，先将密度梯度离心液与待测血液混合均匀，然后加入密度梯度离心液和血液样本总体积1-2倍的缓冲液进行稀释。
4.根据权利要求3所述的一种循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述密度梯度离心液与待测血液的体积比为1-1.5:1。
5.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，步骤3）中的染色步骤包括：先采用固定液和封闭液对富集的循环肿瘤细胞进行染色前处理，之后使用荧光标记抗体对循环肿瘤细胞进行染色，然后使用细胞核染料对细胞核进行染色。
6.根据权利要求5所述的循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述荧光标记抗体包括采用荧光染料AlexaFluor 488标记的光谱细胞角蛋白抗体、白细胞表面共同抗原CD45抗体、荧光染料AlexaFluor 568标记的山羊抗兔IgG H&L抗体；所述细胞核染料为4',6-二脒基-2-苯基吲哚。
7.根据权利要求5所述的循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述固定液为质量百分浓度1～10%多聚甲醛水溶液；所述封闭液为0.001～5g/mL山羊血清、0.001～2mg/mL BSA和0.001～5g/mL甘氨酸组成的混合液。
8.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述网状基体包括不锈钢体以及包覆所述不锈钢体表面的保护层，所述保护层由贵金属或其合金制成，所述捕获物连接在所述保护层上。
9.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述捕获物通过traut’s试剂或带有生物素-亲和素的硫醇盐分子连接于保护层上。
10.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述捕获物包括EpCAM、EGFR、HER2、FRA抗体中的一种或多种。
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| CN113789303A (zh) * | 2021-09-24 | 2021-12-14 | 安徽贝铭生物科技有限公司 | 一种提高血液循环肿瘤细胞俘获的方法 |
| CN114935561A (zh) * | 2022-03-04 | 2022-08-23 | 湘潭大学 | 一种测量循环肿瘤细胞穿过多孔滤膜微流控芯片中孔道的时间的方法 |
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| CN107338185A (zh) * | 2017-08-02 | 2017-11-10 | 苏州博福生物医药科技有限公司 | 一种细胞或溶液中生物分子的捕获方法 |
| CN107656044A (zh) * | 2017-09-25 | 2018-02-02 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 一种循环肿瘤细胞的检测试剂盒及检测方法 |
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