CN105440112A - 多肽-白蛋白偶联药物、其制备方法及应用 - Google Patents

多肽-白蛋白偶联药物、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于癌症治疗的多肽-白蛋白偶联药物。所述多肽能够特异性结合上皮细胞粘附分子(Epithelial？cell？adhesion？molecule，EpCAM)，其末端修饰的3-马来酰亚胺基团(BMPA)可与人血清白蛋白的游离半胱氨酸发生迈克尔加成反应；所述多肽-白蛋白偶联药物由白蛋白结合型化疗药物与多肽通过化学偶联形成，优选地，白蛋白结合型化疗药物为白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)。本发明的多肽-白蛋白偶联药物具有较强的特异性，对癌变细胞有极强的杀伤力，为癌症的靶向治疗提供可行的方法和技术手段，在肿瘤的靶向治疗中具有重要价值。

Description

多肽-白蛋白偶联药物、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地说，涉及一种多肽-白蛋白偶联药物、其制备方法及应用。
背景技术
肿瘤是严重危害人类身体健康的疾病之一，我国的肿瘤发病率和死亡率逐年增高。肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，而上皮来源的恶性肿瘤又称为癌。在我国，平均每天有将近8500人被确诊为癌症，每分钟就有6人被诊断为癌症，每7到8人中就有1人死于癌症。全国恶性肿瘤发病率前三位是肺癌、乳腺癌和胃癌。统计显示，近两年来，女性癌症发病率上升明显，尤其是位居女性恶性肿瘤第一位的乳腺癌，每年新发约21万病例。我国的癌症发病率接近世界水平，但死亡率高于世界水平，持续上升的恶性肿瘤发病率，已成为一个必须高度重视的公共卫生问题乃至社会问题。
白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)是应用白蛋白纳米技术构建的靶向化疗药物，是FDA批准的用于治疗联合化疗失败的转移性乳腺癌或辅助化疗后6个月内复发乳腺癌的临床用药，包括紫杉醇Paclitaxel和人血清白蛋白(HumanSerumAlbumin，HSA)。紫杉醇Paclitaxel是Abraxane药物的活性成分，它是一种广谱抗癌药，在水中的溶解度极低，而临床制剂中采用表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油与无水乙醇1：1混合液来溶解，病人会因此产生严重的过敏反应；人血清白蛋白HSA是人体中一种重要的蛋白，在Abraxane药物中起分散、稳定和运载药物的作用，可以有效提高Paclitaxel的溶解度并减少过敏反应，其含有的游离半胱氨酸还可以作为反应位点与含有马来酰亚胺基团的其他分子进行偶联。
在肿瘤的治疗中，单独给药的裸抗药物(如Abraxane)临床疗效有一定的局限性。而由重组抗体、化学药物和连接物三部分组成的抗体-药物偶联物(Antibody-drugconjugates,ADCs)，其互补地使用“化学疗法”和“免疫疗法”，利用抗体对靶细胞特异性结合能力，将高细胞毒性的化学药物选择性输送到肿瘤靶点，实现对癌变细胞的有效杀伤。但是单抗作为靶向药物载体有如下缺点：其较大的分子量限制了穿透上皮细胞膜的被动运输能力；对肝脏和网状内皮***非特异性吸收而导致其剂量限制性毒性；生产和鉴定成本较高。而基于靶向多肽与药物分子偶联的多肽偶联药物(PDC)，用靶向多肽代替单克隆抗体具有很多优势：成本低；可利用固相合成法进行大规模制备；分子量小更易有效穿透到组织中去；有较好的亲和力或特异性；免疫原性低；可快速被肾脏消除，对骨髓和肝脏的毒性更低等，而目前还没有上市的多肽偶联药物，因此对多肽偶联药物的研究有更广阔的发展前景。
上皮细胞粘附分子(Epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)也称TACSTD1(tumor-associatedcalciumsignaltransducer1)，CD326(clusterofdifferentiation)，17-A，ESA，EGP40，是一种由GA-733-2基因编码的分子量为40KDa的跨膜糖蛋白，由胞外结构域、单次跨膜结构域和胞内结构域构成。生理情况下，EpCAM不同程度地表达于除鳞状上皮之外所有的正常上皮，肿瘤病理情况下，EpCAM在肺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中呈过表达。研究表明，EpCAM在上皮癌变过程中发挥着重要作用，其作为肿瘤诊断和治疗的靶点蛋白，受到了越来越多的关注。因此发展靶向EpCAM的多肽偶联药物可以为靶向治疗癌症提供新的有效手段和策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于癌症治疗的多肽-白蛋白偶联药物。
本发明的另一目的是提供所述多肽-白蛋白偶联药物的制备方法及应用。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种特异性结合上皮细胞粘附分子的多肽PepB，所述多肽的氨基酸序列为VRRDAPRFSMQGLDACGGNCNK，且在多肽的C末端修饰有马来酰亚胺基团。多肽PepB是可以靶向结合上皮细胞粘附分子(EpCAM)和化学偶联Abraxane的双功能多肽。多肽PepB具有水、PBS缓冲液溶解性好等特点。
本发明提供的多肽-白蛋白偶联药物，其是将所述多肽PepB与白蛋白结合型化疗药物通过化学偶联形成的多肽-白蛋白偶联药物。多肽PepB末端修饰的3-马来酰亚胺基团(BMPA)可与人血清白蛋白的游离半胱氨酸发生迈克尔加成反应。
本发明所述白蛋白结合型化疗药物为白蛋白结合型紫杉醇。
本发明还提供所述多肽-白蛋白偶联药物的制备方法，包括以下步骤：
1)分别配制白蛋白结合型紫杉醇溶液和多肽PepB溶液；
2)将配制好的白蛋白结合型紫杉醇溶液和多肽PepB溶液混匀，摇床孵育，即得多肽-白蛋白偶联药物溶液；
3)将上述药物溶液进行超滤脱盐后，冷冻干燥，即得多肽-白蛋白偶联药物粉末。
前述的方法，步骤1)中用PBS缓冲液溶解多肽PepB配制成浓度0.3-9mg/mL的多肽PepB溶液；用生理盐水溶解白蛋白结合型紫杉醇药物粉末，配制成一定浓度的母液，再用PBS缓冲液稀释成浓度0.7-20mg/mL的白蛋白结合型紫杉醇溶液。
其中，多肽PepB与白蛋白结合型紫杉醇中所含人血清白蛋白的摩尔比为10-1:1，优选为10:1、5:1、2:1、1:1。
前述的方法，步骤2)中孵育温度为20～40℃，孵育时间为2～12h。
前述的方法，步骤3)中用0.22μm滤膜进行超滤，以去除多肽-白蛋白偶联药物溶液中过量的多肽和盐离子。
本发明还提供所述的多肽-白蛋白偶联药物在制备肿瘤靶向性治疗药物中的应用。
本发明进一步提供所述的多肽-白蛋白偶联药物在制备高表达上皮细胞粘附分子的相关肿瘤靶向药物中的应用，所述肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、直肠癌、胃癌等恶性肿瘤，优选乳腺癌。
本发明提供的多肽PepB具有双功能，可以特异性结合上皮细胞粘附分子，其末端修饰的马来酰亚胺基团还可通过与人血清白蛋白之间的化学反应与化学药物Abraxane形成多肽-白蛋白偶联药物；同时，所得多肽-白蛋白偶联药物具有更强的特异性，对癌变细胞有更强的杀伤力，为癌症的靶向治疗提供可行的方法和技术手段，在肿瘤的靶向治疗中具有重要价值。
附图说明
图1为本发明实施例3中多肽Pep7-2(a)和PepB(b)分别与细胞SK-BR-3和HL-60在不同多肽浓度下的结合力测定结果图。
图2为本发明实施例4中单药HSA、PepB及PepB-HSA偶联物在SK-BR-3细胞表面结合力的激光共聚焦显微镜图像。
图3为本发明实施例4中HSA与SK-BR-3和HL-60细胞在不同多肽浓度下的结合力检测结果图；其中，a为多肽Pep7-2，b为多肽PepB。
图4为本发明实施例5中多肽Pep7-2(a)和PepB(b)分别对SK-BR-3和HL-60细胞的细胞活力影响结果图。
图5为本发明实施例6中HSA(a)和Abraxane(b)分别对SK-BR-3和HL-60细胞的细胞活力影响结果图。
图6为本发明实施例7中多肽Pep7-2和PepB加强Abraxane的肿瘤靶向性及其对SK-BR-3(a)和HL-60细胞(b)的细胞活力影响结果图。
图7为本发明实施例8中Abraxane与PepB-Abraxane(a)，以及Pep7-2-Abraxane与PepB-Abraxane(b)对EpCAM阳性细胞SK-BR-3的增殖-毒性检测结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中所用的乳腺癌细胞系SK-BR-3和人早幼粒白血病细胞系HL-60均购自中国医学科学院。所用PBS缓冲液为1×PBS溶液。
实施例1特异性结合上皮细胞粘附分子的多肽PepB的合成
多肽PepB的氨基酸序列：VRRDAPRFSMQGLDACGGNCNK-BMPA，其中BMPA为3-马来酰亚胺基基团，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的多肽PepB的氨基酸序列为FITC-VRRDAPRFSMQGLDACGGNCNK-BMPA，如表1所示。按照所示的氨基酸序列合成多肽(由上海科肽生物科技有限公司合成，纯度为98％)，实验前用PBS缓冲液配制成合适浓度的母液。
表1多肽序列
多肽名称 序列
Pep7-2 VRRDAPRFSMQGLDACGGNCN
PepB VRRDAPRFSMQGLDACGGNCNK-BMPA
FITC-Pep7-2 FITC-VRRDAPRFSMQGLDACGGNCN
FITC-PepB FITC-VRRDAPRFSMQGLDACGGNCNK-BMPA
需要说明的是，FITC的作用是将多肽用于荧光检测手段的表征，属于常用的技术手段，对本发明多肽的作用没有实质性影响。
实施例2EpCAM阳性及阴性细胞系的验证
1、所使用的细胞材料
将SK-BR-3细胞系作为待验证的EpCAM阳性细胞，HL-60细胞系作为待验证的EpCAM阴性细胞。
2、具体方法
1)多肽溶解：用PBS缓冲液溶解多肽FITC-Pep7-2粉末至浓度为1mg/mL的母液，再涡旋震荡3min，保证多肽充分溶解分散，置于4℃保存备用。
2)细胞计数：按照细胞培养方法培养SK-BR-3和HL-60细胞，对于贴壁细胞SK-BR-3，待其生长至80～90％铺满培养皿并连接成网状时，将其消化离心，弃去培养液，加入PBS重悬，轻轻吹打均匀后计数；对于悬浮细胞HL-60，待其生长至80～90％铺满培养皿时，将其离心弃去培养液，加入PBS重悬，轻轻吹打均匀后计数。
3)孵育多肽及抗体：收集一定量(≥106个)的SK-BR-3及HL-60细胞于1.5μL的离心管中，将多肽FITC-Pep7-2母液稀释至20μM，取50μL加至收集了细胞的离心管，用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀，摇床孵育1h；抗体和多肽与细胞孵育的体积相同，取抗体母液10稀释至50μL与细胞混合，并吹打均匀，摇床孵育1h。
4)流式细胞仪测量：将孵育好多肽和抗体的细胞悬浮液在转速为1000rpm的离心机(LD5-2A，北京雷勃尔离心机有限公司)中离心3min，弃去上清，再用PBS重悬，如此重复三次，去除非特异性结合的多肽及抗体，然后将细胞重悬成1mL的溶液，过滤后得到细胞的流式测试液，选择流式细胞仪(FCM，acousticfocusingcytometer，AppliedBiosystems，LifeTechnologies，Carlsbad，CA)的FL-1通道(FITC荧光检测通道，激发波长为488nm)进行检测；先检测空白对照组细胞的流式测试液，调节参数使空白细胞的阳性结合率接近于0，以此为参考标准依次检测相应细胞系的实验组样品测试液，记录多肽和抗体与细胞的结合率。
两个细胞系的检测结果如表2所示。
表2SK-BR-3、HL-60细胞系的检测结果
综合抗体的检测结果，可知SK-BR-3为EpCAM阳性细胞，HL-60为EpCAM阴性细胞，与已有报道一致，且多肽Pep7-2可特异性识别EpCAM。
实施例3双功能多肽PepB的靶向性验证
1、使用的细胞系
将已验证的与报道一致的SK-BR-3细胞系作为EpCAM阳性细胞，HL-60细胞系作为EpCAM阴性细胞。
2、具体方法
1)多肽溶解：用PBS缓冲液溶解多肽FITC-Pep7-2及多肽FITC-PepB粉末至浓度为1mg/mL的母液，再涡旋震荡3min，保证多肽充分溶解分散，置于4℃保存备用。
2)细胞计数：按照细胞培养方法培养SK-BR-3和HL-60细胞，对于贴壁细胞SK-BR-3，待其生长至80～90％铺满培养皿并连接成网状时，将其消化离心，弃去培养液，加入PBS重悬，轻轻吹打均匀后计数；对于悬浮细胞HL-60，待其生长至80～90％铺满培养皿时，将其离心弃去培养液，加入PBS重悬，轻轻吹打均匀后计数。
3)孵育多肽：收集一定量(≥106个)的SK-BR-3及HL-60细胞于1.5μL的离心管中，将多肽FITC-Pep7-2及FITC-PepB的母液稀释至以下浓度梯度:0.1、0.5、1、5、10、20、30μM，分别取50μL的多肽溶液加至收集了细胞的离心管，用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀，摇床孵育1h。
4)流式细胞仪测量：将孵育好多肽的细胞悬浮液在转速为1000rpm的离心机中离心3min，弃去上清，再用PBS重悬，如此重复三次，去除非特异性结合的多肽，然后将细胞重悬成1mL的溶液，过滤后得到细胞的流式测试液，选择流式细胞仪的FL-1通道进行检测；先检测空白对照组细胞的流式测试液，调节参数使空白细胞的阳性结合率接近于0，以此为参考标准依次检测相应细胞系的实验组样品测试液，记录多肽与细胞结合的荧光强度，结果如图1所示。
由图1可见，多肽PepB的末端修饰马来酰亚胺基团之后，由于多肽基本序列没有发生改变，其依然保留了多肽Pep7-2的靶向性特征，对EpCAM阳性细胞SK-BR-3具有特异性结合，且结合量随着多肽浓度的增大而增大，而PepB对EpCAM阴性细胞HL-60则基本没有结合。多肽PepB和Pep7-2与上述细胞系的结合情况一致，说明引入的马来酰亚胺基团并没有改变多肽的靶向性。
实施例4双功能多肽PepB与人血清白蛋白HSA的偶联
HSA-Cy5的制备：天平称取4.2mg的HSA，溶于900μLpH为8.3-8.5的PBS缓冲液；取0.3mg的Cy5-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于100μL的DMF溶液；将Cy5-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液加入到HSA溶液中，调节pH值并涡旋，混合均匀后冰上过夜；然后进行超滤和脱盐，冷冻干燥，即得HSA-Cy5粉末。
1、单光子激光共聚焦成像检测
1)细胞接种：配制EpCAM阳性细胞SK-BR-3的细胞悬浮液并计数，分别向三个Confocal小皿中加入1×105个SK-BR-3细胞，待细胞形态清晰，均匀贴在小皿底部，即可进行下一步操作。
2)PepB与HSA偶联：分别用培养基溶解HSA-Cy5及FITC-PepB的样品粉末，配制1mL浓度为5μM的HSA-Cy5溶液，以及1mL浓度为50μM的FITC-PepB溶液，然后将两溶液共混，摇床孵育10h，以充分保证两者之间发生化学偶联反应。
3)样品制备：分别用培养基溶解多肽FITC-PepB及HSA-Cy5粉末至浓度为1mg/mL的母液，涡旋震荡3min，保证样品充分溶解分散，再将两者分别稀释至浓度为25μM及2.5μM，与PepB及HSA偶联样品各组分浓度保持一致。
4)细胞孵育：将配制好的三个样品溶液分别与Confocal小皿的SK-BR-3细胞于37℃、5％CO2条件的孵箱孵育1h，然后用PBS缓冲液冲洗两遍。
5)细胞染核：待步骤4)中的细胞冲洗干净，向每个小皿加入200μL浓度为1μg/mL的DAPI染核试剂，染色15min，然后用PBS缓冲液冲洗两遍，加入500μL的培养基或者PBS缓冲液进行单分子激光共聚焦观察。
6)激光共聚焦显微镜成像：在软件上分别设置明场、DAPI通道、FITC通道及Cy5通道，找到细胞平面之后，调整细胞清晰度，依次调节各个通道的属性并拍照，结果如图2所示。
由图2可以看出，多肽PepB可靶向于细胞膜表面的EpCAM，PepB-HSA对细胞孵育之后，可在细胞膜定位观察到PepB和HSA均和细胞有结合，HSA荧光强度比其单独与细胞孵育时更强，由此推断HSA由于与PepB之间化学偶联，被靶向多肽运输至EpCAM阳性细胞。
2、流式细胞仪检测
1)多肽溶解：用PBS缓冲液溶解多肽FITC-Pep7-2和FITC-PepB及HSA-Cy5粉末至浓度为1mg/mL的母液，再涡旋震荡3min，保证样品充分溶解分散，置于4℃保存备用。
2)细胞计数：按照细胞培养方法培养SK-BR-3和HL-60细胞，对于贴壁细胞SK-BR-3，待其生长至80～90％铺满培养皿并连接成网状时，将其消化离心，弃去培养液，加入PBS重悬，轻轻吹打均匀后计数；对于悬浮细胞HL-60，待其生长至80～90％铺满培养皿时，将其离心弃去培养液，加入PBS重悬，轻轻吹打均匀后计数。
3)样品制备：将多肽FITC-Pep7-2和FITC-PepB的母液分别稀释至如下浓度梯度：0.2、1、2、10、20、40、60μM，HSA-Cy5母液稀释至如下浓度梯度：0.02、0.1、0.2、1、2、4、6μM。多肽FITC-Pep7-2和FITC-PepB分别和对应浓度的HSA-Cy5溶液共混，摇床孵育10h。
4)孵育多肽：收集一定量(≥106个)的SK-BR-3及HL-60细胞于1.5μL的离心管中，分别取50μL制备好的不同浓度的样品溶液至收集了细胞的离心管，用移液枪轻轻吹打至细胞悬浮均匀，摇床孵育1h。
5)流式细胞仪检测：将孵育好多肽的细胞悬浮液在转速为1000rpm的离心机中离心3min，弃去上清，再用PBS重悬，如此重复三次，去除非特异性结合的多肽及HSA-Cy5，然后将细胞重悬成1mL的溶液，过滤后得到细胞的流式测试液，选择流式细胞仪的FL-4通道(Cy5荧光检测通道，激发波长为640nm)进行检测；先检测空白对照组细胞的流式测试液，调节参数使空白细胞的阳性结合率接近于0，以此为参考标准依次检测相应细胞系的实验组样品测试液，记录HSA-Cy5与细胞结合的荧光强度，结果如图3所示。
由图3可见，HSA与细胞SK-BR-3的结合随着多肽Pep7-2及PepB浓度的增大而增大，而与HL-60的结合很低，且不随多肽浓度的改变而变化，说明HSA与EpCAM阳性细胞的结合是由多肽Pep7-2及PepB的靶向运输导致的；而与多肽Pep7-2共孵育之后，HSA与SK-BR-3的结合强度远不如与等浓度的PepB作用之后效果强，由此验证，多肽PepB的马来酰亚胺基团通过和HSA的游离半胱氨酸反应将HSA靶向运输到EpCAM靶点，而多肽Pep7-2与HSA之间则为物理结合。
实施例5多肽Pep7-2及PepB对SK-BR-3及HL-60细胞毒性的检测实验
1、EpCAM阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3的细胞毒性检测
收获对数生长期的SK-BR-3细胞作为EpCAM阳性细胞系进行细胞毒性检测。细胞进行消化计数，在Corning96孔板中，每孔使用RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养1×104个细胞，将96孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，隔天用培养基配制好的不同浓度的多肽Pep7-2及PepB溶液对96孔板细胞进行换液，空白对照组只加相同量的培养基。将96孔板放置于孵箱中培养48h，然后向每个孔加入10μL的CCK溶液(北京泛博生物化学有限公司)，在孵箱中继续孵育2h，用连续光谱多功能酶标仪(TecaninfiniteM200，TECAN，瑞士)测定在450nm波长下的吸光度(OD)值，计算细胞存活率。
细胞存活率＝OD450nm(多肽)/OD450nm(空白对照)×100％
2、EpCAM阴性人早幼粒白血病细胞系HL-60的细胞毒性检测
收获对数生长期的HL-60细胞作为EpCAM阴性细胞系进行细胞毒性检测。将细胞吹打均匀计数，用含有1×104个细胞的悬浮液与多肽Pep7-2及PepB的母液分别配制所需浓度的多肽-细胞悬浮液，以每孔1×104个细胞进行96孔板种板，于37℃、5％CO2条件的孵箱中培养48h，然后向每个孔加入10μL的CCK溶液，在孵箱中继续孵育2h，用连续光谱多功能酶标仪测定在450nm波长下的OD值，计算细胞存活率。
多肽Pep7-2及PepB孵育条件下，细胞SK-BR-3及HL-60的存活率见图4。由图4的细胞存活率可知，靶向多肽PepB没有细胞毒性，由其合成的多肽-药物偶联物的毒性全部来自化学药物Abraxane。
实施例6HSA及Abraxane对SK-BR-3和HL-60细胞毒性的检测实验
1、EpCAM阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3的细胞毒性检测
收获对数生长期的SK-BR-3细胞作为EpCAM阳性细胞系进行细胞毒性检测。细胞进行消化计数，在Corning96孔板中，每孔使用RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养1×104个细胞，将96孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，隔天用培养基配制好的不同浓度的HSA及Abraxane溶液对96孔板细胞进行换液，空白对照组只加相同量的培养基。将96孔板放置于孵箱中培养48h，然后向每个孔加入10μL的CCK溶液，在孵箱中继续孵育2h，用连续光谱多功能酶标仪测定在450nm波长下的吸光度(OD)值，计算细胞存活率。
细胞存活率＝OD450nm(多肽)/OD450nm(空白对照)×100％
2、EpCAM阴性人早幼粒白血病细胞系HL-60的细胞毒性检测
收获对数生长期的HL-60细胞作为EpCAM阴性细胞系进行细胞毒性检测。将细胞吹打均匀计数，用含有1×104个细胞的悬浮液与HSA及Abraxane的母液分别配制所需浓度的HSA细胞悬浮液及Abraxane细胞悬浮液，以每孔1×104个细胞进行96孔板种板，于37℃、5％CO2条件的孵箱中培养48h，然后向每个孔加入10μL的CCK溶液，在孵箱中继续孵育2h，用连续光谱多功能酶标仪测定在450nm波长下的OD值，计算细胞存活率。
HSA及Abraxane孵育条件下，细胞SK-BR-3及HL-60的存活率见图5。由图5看出，HSA没有细胞毒性，那么基于多肽PepB设计的靶向性抗体-药物偶联物的毒性全部来自于化学药物Abraxane的紫杉醇成分，PepB-Abraxane偶联物的各部分成分及功能由此明了。
实施例7多肽Pep7-2及PepB靶向性结合EpCAM的细胞毒性验证
1、EpCAM阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3的细胞毒性检测
首先用培养基溶解多肽Pep7-2及PepB的样品粉末，得到母液，逐步稀释至以下浓度：5、10、20、40、120、360μM，等体积的多肽溶液与浓度为0.1μg/mL的Abraxane溶液共混过夜，得到Pep7-2-Abraxane及PepB-Abraxane溶液，其中Abraxane的浓度均为0.05μg/mL。
收获对数生长期的SK-BR-3细胞作为EpCAM阳性细胞系进行细胞毒性检测。细胞进行消化计数，在Corning96孔板中，每孔使用RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养1×104个细胞，将96孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，隔天用浓度为0.05μg/mL的Abraxane溶液及一系列浓度梯度的Pep7-2-Abraxane及PepB-Abraxane溶液对96孔板细胞进行换液，空白对照组只加相同量的培养基。将96孔板放置于孵箱中培养48h，然后向每个孔加入10μL的CCK溶液，在孵箱中继续孵育2h，用连续光谱多功能酶标仪测定在450nm波长下的吸光度(OD)值，计算细胞存活率。
细胞存活率＝OD450nm(多肽)/OD450nm(空白对照)×100％
2、EpCAM阴性人早幼粒白血病细胞系HL-60的细胞毒性检测
收获对数生长期的HL-60细胞作为EpCAM阴性细胞系进行细胞毒性检测。将细胞吹打均匀计数，用含有1×104个细胞的悬浮液与Pep7-2-Abraxane及PepB-Abraxane溶液分别配制所需浓度的Pep7-2-Abraxane、PepB-Abraxane细胞悬浮液及浓度为0.05μg/mL的Abraxane细胞悬浮液，以每孔1×104个细胞进行96孔板种板，于37℃、5％CO2条件的孵箱中培养48h，然后向每个孔加入10μL的CCK溶液，在孵箱中继续孵育2h，用连续光谱多功能酶标仪测定在450nm波长下的OD值，计算细胞存活率。
细胞SK-BR-3及HL-60的存活率见图6。由图6a及图6b可知，EpCAM阳性细胞SK-BR-3的存活率随着多肽浓度的增大而降低，而阴性HL-60的存活率只与Abraxane的浓度有关，受多肽浓度的影响不大，这是由于多肽Pep7-2及PepB对Abraxane的靶向运输导致的，使更多的Abraxane被运输至EpCAM阳性细胞发挥药效；从图6a还可知，Pep7-2-Abraxane对SK-BR-3细胞的毒性要弱于PepB-Abraxane的毒性。
实施例8PepB-Abraxane提高对肿瘤杀伤力的细胞毒性验证
1、Abraxane及PepB-Abraxane对SK-BR-3细胞毒性的检测实验
收获对数生长期的SK-BR-3细胞作为EpCAM阳性细胞系进行细胞毒性检测。细胞进行消化计数，在Corning96孔板中，每孔使用RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养1×104个细胞，将96孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，隔天用培养基配制好的一系列梯度浓度的Abraxane及PepB-Abraxane溶液对96孔板细胞进行换液，空白对照组只加相同量的培养基。将96孔板放置于孵箱中培养48h，然后向每个孔加入10μL的CCK溶液，在孵箱中继续孵育2h，用连续光谱多功能酶标仪测定在450nm波长下的吸光度(OD)值，计算细胞存活率。
细胞存活率＝OD450nm(多肽)/OD450nm(空白对照)×100％
2、Pep7-2-Abraxane及PepB-Abraxane对SK-BR-3细胞毒性的检测实验
收获对数生长期的SK-BR-3细胞作为EpCAM阳性细胞系进行细胞毒性检测。细胞进行消化计数，在Corning96孔板中，每孔使用RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养1×104个细胞，将96孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，隔天用培养基配制好的一系列梯度浓度的Pep7-2-Abraxane及PepB-Abraxane溶液对96孔板细胞进行换液，空白对照组只加相同量的培养基。将96孔板放置于孵箱中培养48h，然后向每个孔加入10μL的CCK溶液，在孵箱中继续孵育2h，用连续光谱多功能酶标仪测定在450nm波长下的吸光度(OD)值，计算细胞存活率。
Abraxane与PepB-Abraxane，以及Pep7-2-Abraxane与PepB-Abraxane对EpCAM阳性细胞SK-BR-3的增殖-毒性检测结果见图7。由图7a可知，PepB-Abraxane偶联物给药对细胞的毒性强于单独的Abraxane给药，由图7b可知，PepB-Abraxane偶联物对EpCAM阳性细胞SK-BR-3的细胞毒性高于Pep7-2-Abraxane，同时也验证了多肽PepB与Abraxane化学偶联对Abraxane的靶向运输效果优于多肽Pep7-2与Abraxane物理结合靶向运输Abraxane的效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.特异性结合上皮细胞粘附分子的多肽PepB，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为VRRDAPRFSMQGLDACGGNCNK，且在多肽的C末端修饰有马来酰亚胺基团。
2.多肽-白蛋白偶联药物，其特征在于，其是将权利要求1所述多肽PepB与白蛋白结合型化疗药物通过化学偶联形成的多肽-白蛋白偶联药物。
3.根据权利要求2所述的多肽-白蛋白偶联药物，其特征在于，所述白蛋白结合型化疗药物为白蛋白结合型紫杉醇。
4.权利要求3所述多肽-白蛋白偶联药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分别配制白蛋白结合型紫杉醇溶液和多肽PepB溶液；
2)将配制好的白蛋白结合型紫杉醇溶液和多肽PepB溶液混匀，摇床孵育，即得多肽-白蛋白偶联药物溶液；
3)将上述药物溶液进行超滤脱盐后，冷冻干燥，即得多肽-白蛋白偶联药物粉末。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中用PBS缓冲液溶解多肽PepB配制成浓度0.3-9mg/mL的多肽PepB溶液；用生理盐水溶解白蛋白结合型紫杉醇药物粉末，配制成一定浓度的母液，再用PBS缓冲液稀释成浓度0.7-20mg/mL的白蛋白结合型紫杉醇溶液。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，多肽PepB与白蛋白结合型紫杉醇中所含人血清白蛋白的摩尔比为10-1:1，优选为10:1、5:1、2:1、1:1。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中孵育温度为20～40℃，孵育时间为2～12h。
8.根据权利要求1-7任一项所述的，其特征在于，步骤3)中用0.22μm滤膜进行超滤。
9.权利要求2或3所述的多肽-白蛋白偶联药物在制备肿瘤靶向性治疗药物中的应用。
10.权利要求2或3所述的多肽-白蛋白偶联药物在制备高表达上皮细胞粘附分子的相关肿瘤靶向药物中的应用，所述肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、直肠癌、胃癌，优选乳腺癌。
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