CN103874699A - 吡唑并[4,3-c]吡啶衍生物作为激酶抑制剂 - Google Patents

吡唑并[4,3-c]吡啶衍生物作为激酶抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及式(I)化合物，其中X1至X5、Y、ZA、ZB、R和A具有如在说明书和权利要求书所引用的含义。所述化合物可用作激酶抑制剂用于治疗或预防免疫性、炎性、自身免疫性或变应性病症以及免疫介导的疾病。本发明还涉及包含所述化合物的药物组合物以及作为药物的用途。

Description

吡唑并[4,3-c]吡啶衍生物作为激酶抑制剂
本发明涉及新类型的激酶抑制剂，包括其药学上可接受的盐，其可用于调节蛋白激酶活性以调节细胞活性如信号转导、增殖和细胞因子分泌。更具体地，本发明提供抑制激酶活性(特别是JAK3、BTK、BLK、ITK和TEC活性)以及如上文提到的涉及细胞活性的信号转导通路的化合物。此外，本发明涉及包含所述化合物的药物组合物，例如用于治疗或预防免疫性、炎性、自身免疫性或变应性病症或疾病或移植排斥或移植物抗宿主病。
激酶催化蛋白质、脂质、糖、核苷和其它细胞代谢物的磷酸化并在真核细胞生理学的所有方面起关键作用。特别地，蛋白激酶和脂质激酶参与信号传导事件，该事件控制对细胞外调节物或刺激物(如生长因子、细胞因子或趋化因子)响应的细胞的激活、生长、分化和存活。通常，蛋白激酶分为两类，优先磷酸化酪氨酸残基的那些和优先磷酸化丝氨酸和/或苏氨酸残基的那些。酪氨酸激酶包括跨膜生长因子受体如表皮生长因子受体(EGFR)和胞质非受体激酶如如TEC激酶和Janus激酶(JAK)。
激酶的TEC家族包括五个成员(TEC、BTK、ITK、RLK和BMX)，其主要由造血细胞表达并在经免疫受体(例如高亲和性IgE受体(FcεRI)、T细胞抗原受体(TCR)和B细胞受体(BCR)的信号传导中起关键作用。TEC家族的成员共享相同的蛋白域结构。它们具有氨基末端Pleckstrin Homology(PH)域、含一个或两个富含脯氨酸的区域的TEC同源域、SRC同源3(SH3)和2(SH2)蛋白质相互作用域和羧基末端激酶域。TEC家族激酶的激活需要以下几个步骤：经它们的Pleckstrin Homology域募集至质膜，被SRC家族激酶磷酸化和与蛋白质相互作用，这将它们带入免疫受体信号传导复合物的附近(Schwartzberg等,2005,Nature Reviews Immunology5,284-295)。
TEC家族激酶对B细胞发育和激活至关重要。具有突变的BTK的患者显示B细胞发育障碍，导致几乎完全缺乏B细胞和血浆细胞、免疫球蛋白水平降低和体液免疫响应受损。
另外，TEC激酶在肥大细胞的激活中通过高亲和性IgE受体(FcεRI)起作用。ITK和BTK在肥大细胞中表达，并且通过FcεRI交联激活。当用变应原经气道激发时，ITK缺乏小鼠中的急性和晚期炎性过敏反应均显著降低。重要地，气道肥大细胞脱粒化受损，尽管变应原特异性IgE和IgG1的野生型水平(Forssell等,2005,Am.J.Respir.Cell Mol.Bio.32,511-520)。
T细胞表达三种TEC激酶(ITK、RLK和TEC)，其在T细胞受体(TCR)的下游激活，并且参与TCR信号传导。其中编码Itk蛋白质的基因缺失的遗传操作小鼠的研究得出关于Itk的生理和病生理功能的重要信息。Itk缺乏(Itk-/-)小鼠在T辅助细胞2(TH2)响应中具有特殊缺陷，并且在过敏性哮喘模型中具有病理学降低。相反，ITK表达在特应性皮炎(TH2-细胞介导的疾病)患者的T细胞中升高。因此，已经建议ITK作为TH2-细胞介导的疾病的治疗靶点(Schwartzberg等,2005,Nature Reviews Immunology5,284-295)。
已经成为目前药物开发焦点的另一组激酶是非受体酪氨酸激酶的Janus激酶(JAK)家族。在哺乳动物中，该家族具有四个成员，JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶2(TYK2)。每个蛋白质都具有激酶域和催化惰性假性激酶域。JAK蛋白质通过其氨基末端FERM(带4.1蛋白(Band-4.1)、埃兹蛋白(ezrin)、根蛋白(radixin)、膜突蛋白(moesin))域结合到细胞因子受体上。细胞因子与其受体结合后，激活JAKs并使受体磷酸化，从而产生用于信号传导分子(尤其是信号传感器的成员和转录激活子(Stat)家族)的停靠位点(dockingsites)(Yamaoka等，2004.The Janus kinases(Jaks).Genome Biology5(12)：253)。
在哺乳动物中，JAK1、JAK2和TYK2普遍表达。相反，JAK3的表达主要在造血细胞中并且受细胞发育与激活的高度调节(Musso等，1995.181(4)：1425-31)。
JAK-缺陷细胞系和基因靶向小鼠的研究已经揭示了JAKs在细胞因子信号传导中的基本的，不重复的功能。JAK1敲除小鼠显示围产期致死表型，可能与阻止其哺乳的神经作用有关(Rodig等，1998.Cell93(3)：373-83)。由于红细胞生成障碍，JAK2基因的删除导致在胚胎第12.5天时产生胚胎致死性(Neubauer等，1998.Cell93(3)：397-409)。有趣地，JAK3缺陷首次在患有常染色体隐性重度联合免疫缺陷(SCID)的人中被识别(Macchi等，1995.Nature377(6544)：65-68)。JAK3敲除小鼠也显示SCID但未显示非免疫性缺陷，表明JAK3抑制剂作为免疫抑制剂将在体内具有有限效应并因此成为用于免疫抑制的有前景的药物(Papageorgiou和Wikman2004，Trends inPharmacological Sciences25(11)：558-62)。
在急性成巨核细胞白血病(AMKL)患者中已经观察到JAK3的激活突变(Walters等，2006.Cancer Cell10(1)：65-75)。JAK3的这些突变形式可将Ba/F3细胞转变为因子独立性生长并在小鼠模型中诱导巨核母细胞白血病的特征。
与JAK3抑制有关的疾病和病症进一步描述于例如WO01/42246和WO2008/060301中。
文献中已报道一些JAK3抑制剂可用于医学领域(O’Shea等，2004.Nat.Rev.Drug Discov.3(7)：555-64)。据报道，有效的JAK3抑制剂(CP-690，550)在器官移植的动物模型(Changelian等，2003，Science302(5646)：875-888)和临床试验(参考：Pesu等，2008.Immunol.Rev.223，132-142)中显示效力。CP-690，550抑制剂对JAK3激酶没有选择性且几乎等效抑制JAK2激酶(Jiang等，2008，J.Med.Chem.51(24)：8012-8018)。预期与JAK2相比能更有效地抑制JAK3的选择性JAK3抑制剂可能具有有利的治疗性质，因为JAK2的抑制可引起贫血(Ghoreschi等，2009.Nature Immunol.4，356-360)。
显示JAK3和JAK2激酶抑制活性的嘧啶衍生物描述于WO-A2008/009458中。治疗其中JAK通路调节或JAK激酶(特别是JAK3)抑制的疾病(conditions)的嘧啶化合物描述于WO-A2008/118822和WO-A2008/118823中。
氟取代的嘧啶化合物作为JAK3抑制剂描述于WO-A2010/118986中。杂环基吡唑并嘧啶类似物作为JAK抑制剂描述于WO-A2011/048082中。
吡咯并嘧啶化合物描述于WO2009/098236A1、WO2010/100431A1和WO2010/129053A2中。
吡唑并吡啶及其制备已知于WO2006/063820A1、WO2011/019780A1和R.V.Fucini等,Bioorg.&Med.Chem.Lett.18(2008),5648-5652中。
Jak抑制剂还描述于国际专利申请PCT/EP2012/056887、PCT/EP2012/064510和PCT/EP2012/064512以及WO2012/022681A2中。
尽管JAK抑制剂是本领域已知的，但仍然需要提供另外的JAK抑制剂，其具有至少部分更有效的药物相关性质，如活性、选择性尤其是对JAK2激酶的选择性以及ADME性质。
因此，本发明的目的是提供新类型的化合物，其可以有效地治疗或预防与JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC相关的病症。
因此，本发明提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐
其中
R是H或F；
ZA和ZB独立地选自CH；和N；
环A是苯基、萘基、芳香5至6元杂环基；或芳香9至11元杂双环基，其中环A任选被一个或多个R1取代；
每个R1独立地为卤素；CN；C(O)OR2；OR2；C(O)R2；C(O)N(R2R2a)；S(O)2N(R2R2a)；S(O)N(R2R2a)；S(O)2R2；S(O)R2；N(R2)S(O)2N(R2aR2b)；N(R2)S(O)N(R2aR2b)；SR2；N(R2R2a)；NO2；OC(O)R2；N(R2)C(O)R2a；N(R2)S(O)2R2a；N(R2)S(O)R2a；N(R2)C(O)N(R2aR2b)；N(R2)C(O)OR2a；OC(O)N(R2R2a)；T1；C1-6烷基；C2-6烯基；或C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R3取代；
R2、R2a、R2b独立地选自H；T1；C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R3取代；
R3是卤素；CN；C(O)OR4；OR4；C(O)R4；C(O)N(R4R4a)；S(O)2N(R4R4a)；S(O)N(R4R4a)；S(O)2R4；S(O)R4；N(R4)S(O)2N(R4aR4b)；N(R4)S(O)N(R4aR4b)；SR4；N(R4R4a)；NO2；OC(O)R4；N(R4)C(O)R4a；N(R4)S(O)2R4a；N(R4)S(O)R4a；N(R4)C(O)N(R4aR4b)；N(R4)C(O)OR4a；OC(O)N(R4R4a)；或T1；
R4、R4a、R4b独立地选自H；T1；C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；
T1是C3-7环烷基；饱和4至7元杂环基；或饱和7至11元杂双环基，其中T1任选被一个或多个相同或不同的R10取代；
Y是(C(R5R5a))n；
n是0、1、2、3或4；
R5、R5a独立地选自H；和未取代的C1-6烷基；或连接形成氧代(=O)；
任选地，R5、R5a连接形成未取代的C3-7环烷基；
X1是C(R6)或N；X2是C(R6a)或N；X3是C(R6b)或N；X4是C(R6c)或N；X5是C(R6d)或N，条件是最多两个X1、X2、X3、X4、X5是N；
R6、R6a、R6b、R6c、R6d独立地选自R6e；H；卤素；CN；C(O)OR7；OR7；C(O)R7；C(O)N(R7R7a)；S(O)2N(R7R7a)；S(O)N(R7R7a)；S(O)2R7；S(O)R7；N(R7)S(O)2N(R7aR7b)；N(R7)S(O)N(R7aR7b)；SR7；N(R7R7a)；NO2；OC(O)R7；N(R7)C(O)R7a；N(R7)S(O)2R7a；N(R7)S(O)R7a；N(R7)C(O)N(R7aR7b)；N(R7)C(O)OR7a；OC(O)N(R7R7a)；T2；C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R11取代，条件是一个R6、R6a、R6b、R6c、R6d是R6e；
R6e是N(R7)C(O)C(R11a)=C(R11bR11c)；N(R7)S(O)2C(R11a)=C(R11bR11c)；或N(R7)C(O)C≡C(R11a)；
任选一对R6/R6a、R6a/R6b连接形成环T3；
R7、R7a、R7b独立地选自H；T2；C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R8取代；
R8是卤素；CN；C(O)OR9；OR9；C(O)R9；C(O)N(R9R9a)；S(O)2N(R9R9a)；S(O)N(R9R9a)；S(O)2R9；S(O)R9；N(R9)S(O)2N(R9aR9b)；N(R9)S(O)N(R9aR9b)；SR9；N(R9R9a)；NO2；OC(O)R9；N(R9)C(O)R9a；N(R9)S(O)2R9a；N(R9)S(O)R9a；N(R9)C(O)N(R9aR9b)；N(R9)C(O)OR9a；OC(O)N(R9R9a)；或T2；
R9、R9a、R9b独立地选自H；T2；C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R12取代；
R10是卤素；CN；C(O)OR13；OR13；氧代(=O)，其中该环至少部分饱和；C(O)R13；C(O)N(R13R13a)；S(O)2N(R13R13a)；S(O)N(R13R13a)；S(O)2R13；S(O)R13；N(R13)S(O)2N(R13aR13b)；N(R13)S(O)N(R13aR13b)；SR13；N(R13R13a)；NO2；OC(O)R13；N(R13)C(O)R13a；N(R13)S(O)2R13a；N(R13)S(O)R13a；N(R13)C(O)N(R13aR13b)；N(R13)C(O)OR13a；OC(O)N(R13R13a)；C1-6烷基；C2-6烯基；或C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R14取代；
R13、R13a、R13b独立地选自H；C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R14取代；
R11、R12独立地选自卤素；CN；C(O)OR15；OR15；C(O)R15；C(O)N(R15R15a)；S(O)2N(R15R15a)；S(O)N(R15R15a)；S(O)2R15；S(O)R15；N(R15)S(O)2N(R15aR15b)；N(R15)S(O)N(R15aR15b)；SR15；N(R15R15a)；NO2；OC(O)R15；N(R15)C(O)R15a；N(R15)S(O)2R15a；N(R15)S(O)R15a；N(R15)C(O)N(R15aR15b)；N(R15)C(O)OR15a；OC(O)N(R15R15a)；和T2；
R11a、R11b、R11c独立地选自H；卤素；CN；OR15；C(O)N(R15R15a)；和C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的R14取代；
R15、R15a、R15b独立地选自H；T2；C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；
R14是卤素；CN；C(O)OR16；OR16；C(O)R16；C(O)N(R16R16a)；S(O)2N(R16R16a)；S(O)N(R16R16a)；S(O)2R16；S(O)R16；N(R16)S(O)2N(R16aR16b)；N(R16)S(O)N(R16aR16b)；SR16；N(R16R16a)；NO2；OC(O)R16；N(R16)C(O)R16a；N(R16)S(O)2R16a；N(R16)S(O)R16a；N(R16)C(O)N(R16aR16b)；N(R16)C(O)OR16a；或OC(O)N(R16R16a)；
R16、R16a、R16b独立地选自H；C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；
T2是苯基；萘基；茚基；茚满基；C3-7环烷基；4至7元杂环基；或7至11元杂双环基，其中T2任选被一个或多个相同或不同的R17取代；
T3是苯基；C3-7环烷基；或4至7元杂环基，其中T3任选被一个或多个相同或不同的R18取代；
R17、R18独立地选自卤素；CN；C(O)OR19；OR19；氧代(=O)，其中该环至少部分饱和；C(O)R19；C(O)N(R19R19a)；S(O)2N(R19R19a)；S(O)N(R19R19a)；S(O)2R19；S(O)R19；N(R19)S(O)2N(R19aR19b)；N(R19)S(O)N(R19aR19b)；SR19；N(R19R19a)；NO2；OC(O)R19；N(R19)C(O)R19a；N(R19)S(O)2R19a；N(R19)S(O)R19a；N(R19)C(O)N(R19aR19b)；N(R19)C(O)OR19a；OC(O)N(R19R19a)；C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R20取代；
R19、R19a、R19b独立地选自H；C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R20取代；
R20是卤素；CN；C(O)OR21；OR21；C(O)R21；C(O)N(R21R21a)；S(O)2N(R21R21a)；S(O)N(R21R21a)；S(O)2R21；S(O)R21；N(R21)S(O)2N(R21aR21b)；N(R21)S(O)N(R21aR21b)；SR21；N(R21R21a)；NO2；OC(O)R21；N(R21)C(O)R21a；N(R21)S(O)2R21a；N(R21)S(O)R21a；N(R21)C(O)N(R21aR21b)；N(R21)C(O)OR21a；或OC(O)N(R21R21a)；
R21、R21a、R21b独立地选自H；C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6烯基；和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
令人惊讶地，不受限于理论，发现本发明化合物可以作为激酶抑制剂与它们的蛋白质靶点形成共价键，因此与非共价抑制剂相比可能具有有利的性质，因为它们可以不可逆地结合至它们的靶蛋白质，并永远地将其失活。在不可逆地抑制靶点后，重新合成蛋白质对恢复其功能可能是必要的。因此，延长的药物作用时间可能将药物的药效学与药代动力学暴露分开(Singh等,2011.Nat.Rev.Drug Discov.10(4)：307-317；Singh等,2010.Curr.Opin.Chem.Biol.14(4):475-480)。
如果变项或取代基可选自不同变项的组并且这样的变项或取代基出现超过一次时各个变项可以相同或不同。
在本发明的含义中，使用术语如下：
术语“任选取代的”是指未取代的或取代的。通常-但不限于-，“一个或多个取代基”是指一个、两个或三个，优选一个或两个且更优选一个取代基。通常这些取代基可以相同或不同。
“烷基”是指直链或支链的烃链。烷基碳的每个氢可被本文进一步说明的取代基取代。
“C1-4烷基”是指具有1-4个碳原子的烷基链，例如当存在于分子末端时：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基，或当分子的两个部分由烷基连接时，例如-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-。C1-4烷基碳的每个氢可被本文进一步说明的取代基取代。
“C1-6烷基”是指具有1-6个碳原子的烷基链，例如当存在于分子末端时：C1-4烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基；叔丁基、正戊基、正己基，或当分子的两个部分由烷基连接时，例如-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-。C1-6烷基碳的每个氢可被本文进一步说明的取代基取代。
“C3-7环烷基”或“C3-7环烷基环”是指具有3-7个碳原子的环烷基链，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基。优选地，环烷基指的是环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。环烷基碳的每个氢可被本文进一步说明的取代基取代。术语“C3-5环烷基”或“C3-5环烷基环”由此定义。
“卤素”是指氟、氯、溴或碘。通常优选卤素是氟或氯。
“4至7元杂环基”或“4至7元杂环”指的是含有4、5、6或7个环原子的环，其可含有最高达最大数量的双键(完全饱和、部分饱和或不饱和的芳香或非芳香环)，其中至少一个环原子最高达4个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括=N(O)-)的杂原子替换，且其中该环通过碳或氮原子与分子剩余部分相连。4至7元杂环的实例是氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、
Figure BDA0000487894180000081
唑、
Figure BDA0000487894180000082
唑啉、异唑、异唑啉、噻唑、噻唑啉、异噻唑、异噻唑啉、噻二唑、噻二唑啉、四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、
Figure BDA0000487894180000085
唑烷、异
Figure BDA0000487894180000086
唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、噻二唑烷、环丁砜、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、咪唑烷、吡啶、哒嗪、吡嗪、嘧啶、哌嗪、哌啶、吗啉、四唑、***、***烷、四唑烷、二氮杂环庚烷(diazepane)、氮杂环庚三烯(azepine)或高哌嗪(homopiperazine)。术语“5至6元杂环基”或“5至6元杂环”由此定义。
“饱和的4至7元杂环基”或“饱和的4至7元杂环”是指完全饱和的“4至7元杂环基”或“4至7元杂环”。
“芳香5至6元杂环基”或“芳香5至6元杂环”是指源自环戊二烯基或苯的杂环，其中至少一个碳原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括=N(O)-)的杂原子替换。这类杂环的实例是呋喃、噻吩、吡咯、咪唑、吡唑、
Figure BDA0000487894180000087
唑、异
Figure BDA0000487894180000088
唑、噻唑、异噻唑、噻二唑、***、四唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、三嗪。
“5元芳香杂环基”或“5元芳香杂环”是指衍生自环戊二烯基的杂环，其中至少一个碳原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括=N(O)-)的杂原子替换。这类杂环的实例是呋喃、噻吩、吡咯、咪唑、吡唑、
Figure BDA0000487894180000089
唑、异
Figure BDA00004878941800000810
唑、噻唑、异噻唑、噻二唑、***、四唑。
“7至11元杂双环基”或“7至11元杂双环”是指具有7至11个环原子的双环杂环体系，其中至少一个环原子被两个环共有且可含有最高达最大数量的双键(完全饱和、部分饱和或不饱和的芳香或非芳香环)，其中至少一个环原子最高达6个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括=N(O)-)的杂原子替换，且其中该环通过碳或氮原子与分子剩余部分相连。7至11元杂双环的实例是吲哚、二氢吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并唑、苯并异
Figure BDA0000487894180000092
唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉、二氢喹唑啉、喹啉、二氢喹啉、四氢喹啉、十氢喹啉、异喹啉、十氢异喹啉、四氢异喹啉、二氢异喹啉、苯并氮杂环庚三烯(benzazepine)、嘌呤或蝶啶。术语7至11元杂双环还包括两环的螺结构如6-氧杂-2-氮杂螺[3,4]辛烷、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基或2,6-二氮杂螺[3.3]庚-6-基或桥杂环如8-氮杂-双环[3.2.1]辛烷或2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛-2-基或3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷。
“饱和的7至11元杂双环基”或“饱和的7至11元杂双环”是指完全饱和的“7至11元杂双环基”或“7至11元杂双环”。
“芳香9至11元杂双环基”或“芳香9至11元杂双环”是指两个环的杂环***，其中至少一个环是芳香的，且其中所述杂环***含有9至11个环原子，其中两个环原子被两个环共享并且可能含有最大数量的双键(完全或部分芳香的)，其中至少一个环原子至高达6个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括=N(O)-)的杂原子替换，且其中该环通过碳或氮原子与分子剩余部分相连。芳香9至11元杂双环的实例为吲哚、二氢吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并
Figure BDA0000487894180000093
唑、苯并异
Figure BDA0000487894180000094
唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉、二氢喹唑啉、二氢喹啉、四氢喹啉、异喹啉、四氢异喹啉、二氢异喹啉、苯并氮杂环庚三烯、嘌呤或蝶啶。
优选的式(I)化合物是其中包含的一个或多个具有下文给出含义基团的那些化合物，优选的取代基定义的所有组合是本发明的主题。关于所有优选的式(I)化合物，本发明还包括所有互变异构体和立体异构体及其所有比例的混合物，及其药学上可接受的盐。
在本发明的优选实施方案中，下文提到的取代基独立地具有以下含义。因此，这些取代基中一个或多个可具有下文给出的优选或更优选含义。
优选地，在式(I)中，环A、ZA、ZB定义被定义以得到式(Ia)
Figure BDA0000487894180000101
其中环A是芳香5元杂环，其中Z1、Z2和Z3独立地选自C(R1)、N、N(R1)、O和S，条件是至少一个Z1、Z2、Z3为N；且其中R、Y、X1至X5和R1如上定义。
优选地，在式(I)中，环A、ZA、ZB、R被定义以得到式(Ib)
Figure BDA0000487894180000102
其中环A是5元芳香杂环，其中Z1、Z2和Z3独立地选自C(R1)、N、N(R1)、O和S，条件是至少一个Z1、Z2、Z3为N；且其中Y、X1至X5和R1如上定义。
优选地，在式(I)中，环A、ZA、ZB被定义以得到式(Ic)
其中环A是芳香5元杂环，其中Z1、Z2、Z3和Z4独立地选自C(R1)、N、N(R1)、O和S，条件是至少一个Z1、Z2、Z3、Z4为N或N(R1)；且其中R、Y、X1至X5和R1如上定义。
优选地，在式(I)中，A、ZA、ZB被定义以得到式(Id)
Figure BDA0000487894180000111
其中在环A中Z1为C(R1)或N；Z2为C(R1)或N；Z3为C(R1)或N；Z4为C(R1)或N；Z5为C(R1)或N，条件是最多两个Z1、Z2、Z3、Z4、Z5为N；
任选两个相邻的R1与包括Z1至Z5的环连接共同形成芳香双环T0；
T0是芳香9至11元杂双环基；萘基；茚基；或茚满基，其中T0任选被一个或多个相同或不同的R1a取代；
R1a是卤素；CN；C(O)OR2；OR2；氧代(=O)，其中所述环至少部分饱和；C(O)R2；C(O)N(R2R2a)；S(O)2N(R2R2a)；S(O)N(R2R2a)；S(O)2R2；S(O)R2；N(R2)S(O)2N(R2aR2b)；N(R2)S(O)N(R2aR2b)；SR2；N(R2R2a)；NO2；OC(O)R2；N(R2)C(O)R2a；N(R2)S(O)2R2a；N(R2)S(O)R2a；N(R2)C(O)N(R2aR2b)；N(R2)C(O)OR2a；OC(O)N(R2R2a)；T1；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的R3取代；和
其中R、R1、R2、R2a、R2b、R3、Y、X1至X5和R1如上定义。
优选地，R是H。
优选地，Y是CH2。
优选地，没有或一个(更优选没有)R6、R6a、R6b、R6c、R6d是N。
优选地，R6、R6a、R6b、R6c、R6d独立地选自R6e；H；卤素；和C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代，条件是一个R6、R6a、R6b、R6c、R6d是R6e。更优选地，一个R6、R6a、R6b、R6c、R6d是R6e且其它最多两个(更优选一个，甚至更优选没有)不是H。
优选地，R7、R11a、R11b、R11c独立地选自H；和C1-4烷基，其中C1-4烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
优选地，R6a是R6e。
优选地，R6e是NHC(O)CH=CH2；NHC(O)C(CH3)=CH2；NHC(O)CH=C(CH3)2；NHS(O)2CH=CH2；或NHC(O)C≡CH。
优选地，环A是吡唑、
Figure BDA0000487894180000121
唑、异
Figure BDA0000487894180000122
唑、***、苯基或吡啶环。更优选地，环A是吡唑环；甚至更优选的环选自：
Figure BDA0000487894180000123
甚至更优选为
Figure BDA0000487894180000124
甚至更优选为
Figure BDA0000487894180000125
优选地，0、1或2个(更优选0或1个，甚至更优选1个)相同或不同的R1不是H。
优选地，R1是C1-4烷基，其任选被1或2个相同或不同的R3取代。优选地，R1是未取代的C1-4烷基。
优选地，R3是卤素；CN；OR4；C(O)N(R4R4a)；或C(O)T1。
其中某些或所有上文提到的基团具有优选含义的式(I)化合物也是本发明的目的。
进一步优选的本发明化合物选自
N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酰胺；
N-(2-氟-5-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酰胺；
N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)丙炔酰胺；
N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)乙烯磺酰胺；
N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)甲基丙烯酰胺；
3-甲基-N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)丁-2-烯酰胺；
N-(3-((2-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)苯基)乙烯磺酰胺；
N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酰胺；
N-(3-((2-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)苯基)丙烯酰胺；和
N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酰胺。
当通式(I)化合物可存在互变异构(例如酮-烯醇互变异构)时，独立的形式，例如酮和烯醇形式，被单独构成或以任何比例作为混合物一起被构成。所述互变异构适用于立体异构体，例如对映异构体，顺/反异构体，构象异构体等。
同位素标记的式(I)化合物(“同位素衍生物”)也在本发明的范围内。用于同位素标记的方法是本领域已知的。优选的同位素是元素H、C、N、O和S的同位素。
如果需要，异构体可通过本领域熟知的方法分离，例如通过液相色谱法分离。所述方法适用于通过使用例如手性固定相的对映异构体。此外，对映异构体可通过将其转变为非对映异构体而分离，即与对映异构体纯(enantiomerically pure)的辅助化合物耦合，随后分离得到的非对映异构体并裂解辅助基团。或者，式(I)化合物的任何对映异构体可使用光学纯(opticallypure)的初始物料由立体选择性合成而得到。
式(I)化合物可以晶体或无定形体存在。此外，式(I)化合物的一些晶体可以多晶型体存在，其包括在本发明的范围内。式(I)化合物的多晶型形式可使用许多常规分析技术表征并区分，所述技术包括但不限于X-射线粉末衍射(XRPD)图、红外(IR)光谱、拉曼光谱、差示扫描量热法(DSC)、热重分析(TGA)和固态核磁共振(ssNMR)。
如果式(I)化合物含有一个或多个酸性或碱性基团，则本发明也包括其相应药学或毒理学上可接受的盐，特别是其药学上可利用的盐。因此，含有酸性基团的式(I)化合物可根据本发明，用作例如碱金属盐、碱土金属盐或铵盐。该类盐更精确的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或铵盐或有机胺盐，例如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸盐。含有一个或多个碱性基团(即可质子化的基团)的式(I)化合物可以其与无机或有机酸的加成盐形式存在或根据本发明使用。合适酸的实例包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、乙二酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、丁二酸、庚二酸、富马酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯基丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、柠檬酸、己二酸以及本领域技术人员已知的其它酸。如果式(I)化合物在分子中同时含有酸性和碱性基团，则本发明除提到的盐形式之外也包括内盐或内铵盐(两性离子)。式(I)的各种盐可通过本领域技术人员已知的常规方法得到，例如通过将这些化合物在溶剂或分散剂中与有机或无机酸或碱接触，或通过与其它盐进行阴离子交换或阳离子交换。本发明也包括如下的式(I)化合物的所有盐，其由于低生理相容性，不直接适用于医药应用，但其可用于例如作为化学反应中间体或药学上可接受的盐的制备。
在整个本发明中，术语“药学上可接受的”是指相应的化合物、载体或分子适用于人类给药。优选地，该术语是指由管理机构如EMEA(欧洲)和/或FDA(美国)和/或任何其它国家管理机构批准用于动物，优选人类。
本发明还包括本发明化合物的所有溶剂合物。
根据本发明，“JAK”包含JAK家族的所有成员(例如JAK1、JAK2、JAK3和TYK2)。
根据本发明，表达式“JAK1”或“JAK1激酶”是指“Janus激酶1”。
根据本发明，表达式“JAK2”或“JAK2激酶”是指“Janus激酶2”。
根据本发明，表达式“JAK3”或“JAK3激酶”是指“Janus激酶3”。编码JAK3的基因位于人染色体19p13.1中且其主要存在于造血干细胞中。JAK3是与白介素2(IL-2)受体的γ链相关连的胞浆蛋白酪氨酸激酶。该链也用作几种嗜淋巴细胞因子(包括白细胞介素IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21)受体组分的作用(Schindler等，2007.J.Biol.Chem.282(28)：20059-63)。JAK3在免疫细胞对细胞因子的响应中，尤其在肥大细胞、淋巴细胞和巨噬细胞中起重要作用。JAK3的抑制在预防移植排斥中显示有效作用(Changelian等，2003，Science302(5646)：875-888)。
此外，根据本发明，表达式“JAK3”或“JAK3激酶”包括JAK3的突变形式，优选见于急性成巨核细胞白血病(AMKL)患者中的JAK3突变。更优选地，这些突变是单氨基酸突变。在急性成巨核细胞白血病(AMKL)患者中观察到激活JAK3突变(Walters等，2006.Cancer Cell10(1)：65-75)。因此，在一个优选实施方案中，表达式“JAK”也包括具有V7221或P132T突变的JAK3蛋白。
根据本发明，表达式“TYK2”或“TYK2激酶”是指“蛋白酪氨酸激酶2”。
根据本发明，表达“BTK”是指“Bruton’s酪氨酸激酶”。
根据本发明，表达“BLK”是指“B-淋巴细胞特异性激酶”。
根据本发明，表达“ITK”是指“白介素-2(IL-2)-可诱导的T细胞激酶”。
根据本发明，表达“TEC”是指“TEC激酶”。
如实施例所述，测试了本发明化合物的效力、选择性、有效性和作用方式。在JAK家族中，所有测试的化合物与JAK3的结合强于与JAK1、JAK2和TYK2的结合(见表6)。
本发明化合物有效地结合至BTK、BLK、ITK和TEC(见表8)并抑制激酶功能(见表10)。在细胞的清除研究中，证明了预期为共价抑制剂的本发明化合物显示了长效药理作用至高达四小时，而两种参考抑制剂显示了较短的活性(见表12)。另外，质谱分析证明了实施例1共价结合至JAK3的丝氨酸残基909(Cys909)(见表15)。
因此，本发明化合物被认为可用于预防或治疗与JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC相关的疾病和病症，例如免疫性、炎性、自身免疫性或变应性病症、移植排斥、移植物抗宿主病或增生性疾病如癌症。
在一个优选实施方案中，本发明化合物是选择性JAK3抑制剂。
本发明提供药物组合物，其包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分以及药学上可接受的载体，任选地与一种或多种其它药物组合物组合。
“药物组合物”是指一种或多种活性成分和一种或多种构成载体的惰性成分，以及由以下直接或间接得到的产品，该产品由任何两种或更多种成分的组合、复合或聚集得到，或由一种或多种成分的分离得到，或由一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用得到。因此，本发明的药物组合物包括通过将本发明化合物和药学上可接受的载体混合而得到的任意组合物。
术语“载体”指的是给药治疗药物的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这种药物载体可以是无菌液体，如水或油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物口服给药时水是优选载体。当药物组合物静脉给药时盐水和葡萄糖水溶液是优选载体。对于注射溶液优选使用盐水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液作为液体载体。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米(rice)、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物也可以含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液剂、悬浮剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等形式。该组合物可用传统的粘合剂和载体如甘油三酯制成栓剂。口服制剂可包括标准载体如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington'sPharmaceutical Sciences”中。这种组合物将含有治疗有效量的治疗剂，优选地以纯化的形式，与合适量的载体一起从而提供适当给药患者的形式。制剂应适合给药方式。
本发明的药物组合物可包含一种或多种其它化合物作为活性成分，如不是组合物中的首要化合物的一种或多种式(I)化合物或其它JAK抑制剂。其它生物活性化合物可以是类固醇、白三烯拮抗剂、环孢霉素或雷帕霉素。
本发明化合物或其药学上可接受的盐及其它药学活性剂可以一起或单独给药，当单独给药时，可以任何顺序单独或相继给药。当在同一制剂中组合时，应理解为两种化合物必须是稳定的且彼此和与制剂的其它组分相容。当单独配制时，它们可以任何方便的制剂提供，方便地以对于本领域的这种化合物所已知的方式提供。
本发明进一步包括使式(I)化合物或其药学上可接受的盐或包含式(I)化合物的药物组合物与其它药物或药学活性剂组合给药和/或本发明的药物组合物进一步包含这种药物或药学活性剂。
在上下文中，术语“药物或药物活性剂”包括将引起组织、***、动物或人的生物或医学反应的药物或药剂，其是例如研究者或临床医生所追求的。
“组合的(Combined)”或“相组合(in combination)”或“组合(combination)”应理解为功能性共同给药(functional coadministration)，其中一些或所有化合物可以不同的制剂、不同的给药方式(例如皮下、静脉或口服)和不同的给药次数单独给药。该类组合的单个化合物可以单独的药物组合物相继给药以及以结合的药物组合物同时给药。
例如，在类风湿性关节炎治疗中，可考虑与其它化学治疗剂或抗体剂组合。可用于与本发明化合物及其盐组合用于类风湿性关节炎治疗的药学活性剂的合适实例包括：免疫抑制剂，如呱氨托美丁、咪唑立宾和利美索龙；抗TNFα剂，如依那西普、英夫利昔、阿达木单抗、阿那白滞素(Anakinra)、阿贝西普(Abatacept)、利妥希玛(Rituximab)；酪氨酸激酶抑制剂，如来氟米特；激肽释放酶拮抗剂，如subreum；白细胞介素11激动剂，如奥普瑞白介素(oprelvekin)；β1干扰素激动剂；透明质酸激动剂，如NRD-101(安万特(Aventis))；白细胞介素1受体拮抗剂，如阿那白滞素；CD8拮抗剂，如盐酸氨普立糖；β淀粉样前体蛋白拮抗剂，如reumacon；基质金属蛋白酶抑制剂，如西马司他及其它缓解疾病的抗风湿药(DMARD)，如甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、环孢霉素A、羟氯喹、金诺芬、金硫葡糖、硫代苹果酸金钠和青霉胺。
特别地，本文定义的治疗剂可以用作单独治疗，或除本发明化合物之外还可包括常规手术或放射疗法或化学疗法。因此，本发明化合物也可与现有的治疗剂结合用于治疗增生性疾病如癌症。组合使用的合适药剂包括：
(i)抗增殖/抗肿瘤药物及其结合，用于肿瘤内科如烷基化试剂(例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安和亚硝基脲)；抗代谢物(例如叶酸拮抗剂如氟嘧啶例如5-氟脲嘧啶和替加氟、雷替曲塞、甲氨蝶呤、胞嘧啶***糖苷、羟基脲)和吉西他滨)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类药物如阿霉素、博莱霉素、多柔比星、柔红霉素、表阿霉素、去甲氧柔红霉素、丝裂霉素、放线菌素和光辉霉素)；抗有丝***剂(例如长春花生物碱如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨以及紫杉烷类物质(taxoids)如紫杉醇和泰索帝)；和拓扑异构酶抑制剂(例如鬼臼毒素类如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、拓扑替康和喜树碱)；
(ii)细胞抑制剂如抗***作用药(例如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和iodoxyfene)、***受体下调剂(例如氟维司群)、抗雄激素(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和醋酸环丙孕酮)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林布舍瑞林)、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、vorazole和依西美坦)和5α-还原酶抑制剂如非那雄胺；
(iii)抗侵袭剂(anti-invasion agents)(例如c-Src激酶家族抑制剂如4-(6-氯-2,3-亚甲基二氧基苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基氧基-喹唑啉(AZD0530)和N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-{6-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-l-基]-2-甲基嘧啶-4-基氨基}噻唑-5-甲酰胺(达沙替尼，BMS-354825)以及金属蛋白酶抑制剂如马立马司他和尿激酶纤溶酶原激活剂受体功能抑制剂)；
(iv)生长因子功能抑制剂：例如这种抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体抗体(例如抗erbB2抗体曲妥单抗[HerceptinTM]和抗erbBl抗体西妥昔单抗[C225])；这种抑制剂也包括例如酪氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼(gefitinib)，ZD1839)、Λ/-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(厄洛替尼(erlotinib)，OSI-774)和6-丙烯酰胺基-Λ/-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)-喹唑啉-4-胺(CI1033)和erbB2酪氨酸激酶抑制剂如拉帕替尼(lapatinib))、肝细胞生长因子家族抑制剂、血小板衍生生长因子家族抑制剂如伊马替尼、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂(例如Ras/Raf信号传导抑制剂如法尼基转移酶抑制剂，例如索拉非尼(BAY43-9006))以及通过MEK和/或Akt激酶的细胞信号传导de抑制剂；
(v)抗血管生成剂如抑制血管内皮生长因子作用的那些，例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗(AvastinTM)和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474；WO01/32651的实施例2)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-l-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171；WO00/47212的实施例240)、vatalanib(PTK787；WO98/35985)和SUl1248(舒尼替尼；WO01/60814))，或以其它机制作用的化合物(例如利诺胺、整合素αvβ3功能抑制剂和血管抑素)；
(vi)血管损伤剂如考布他汀A4和在国际专利申请WO99/02166中公开的化合物；
(vii)反义治疗，例如针对上文列出的靶标的那些，如ISIS2503，一种抗ras反义剂；
(viii)基因治疗方法，包括替代异常基因如异常p53或异常BRCAl或BRCA2的方法；GDEPT(基因导向酶前体药物疗法)方法，如那些使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的方法和增加患者对化疗或放射治疗耐受能力的方法，如多药耐受基因治疗法；和(ix)免疫治疗方法，包括体外和体内方法以提高患者肿瘤细胞的免疫原性，如用细胞因子如白细胞介素2、白细胞介素4或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子转染、减少T细胞无反应性的方法、使用转染的免疫细胞如细胞因子转染的树突细胞的方法、使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法和使用抗独特型抗体的方法。
其它结合治疗描述于WO-A2009/008992和WO-A2007/107318中，其通过引用并入本文中。
因此，这种结合的单一化合物可以单独的药物组合物相继给药以及以结合的药物组合物同时给药。
本发明的药物组合物包括适用于口服、直肠、局部、肠胃外(包括皮下、肌肉内和静脉内)、眼部(眼的)、肺部(鼻或口腔吸入)或鼻腔给药的组合物，但在任何给定情况下最适当的途径取决于治疗病状的性质和严重性以及活性成分的性质。它们可便利地以单位剂量形式提供并通过药学领域熟知的任何方法制备。
在实际应用中，式(I)化合物可在紧密掺混物(intimate admixture)中作为活性成分与根据传统药学配合技术的药用载体结合。载体可以根据给药所需的制剂形式而采用广泛的形式，例如口服或肠胃外(包括静脉内)。在制备用于口服剂量形式的组合物时，可以采用任何通常的药用媒介，如水、乙二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等，在口服液体制剂情况下如悬浮剂、酏剂(elixir)和溶液剂；或载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等，在口服固体制剂情况下如粉末剂、硬胶囊和软胶囊和片剂，且固体口服制剂比液体制剂优选。
由于给药简便，片剂和胶囊代表最有利的口服剂量单位形式，在该情况下显而易见地采用固体药用载体。如果需要，片剂可通过标准含水或无水技术包衣。这种组合物和制剂应含有至少0.1%的活性化合物。这些组合物中活性化合物的百分比当然可以变化并可便利地为单位(unit)的约2重量%至约60重量%。在这种治疗有用的组合物中活性化合物的量是使得到有效剂量的量。活性化合物也可鼻腔内给药，例如，作为液滴或喷雾。
片剂、丸剂、胶囊剂等也可含有粘合剂如黄蓍胶、***树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸氢钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；以及甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的材料之外其可以含有液体载体如脂肪油。
各种其它材料可作为涂层存在或存在以改变剂量单位的物理形式。例如，片剂可涂上虫胶、糖或两者。糖浆或酏剂除活性组分之外可含有作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、染料和香料如樱桃香精或桔子香精。
式(I)化合物也可肠胃外给药。这些活性化合物的溶液剂或悬浮剂可在水中与表面活性剂如羟丙基纤维素适当混合而制备。分散剂也可在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备。在储存和使用的一般条件下，这些制剂含有防腐剂以预防微生物生长。
适用于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散剂和用于即时制备无菌注射溶液剂或分散剂的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须无菌且必须是达到易于注射程度的液体。所述形式必须在生产和储存条件下稳定且必须保护以预防微生物如细菌和真菌的污染行为。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如乙二醇、丙二醇和液态聚乙二醇)、其合适的混合物以及植物油。
任何合适的给药途径都可用于提供哺乳动物，尤其是人类以有效剂量的本发明化合物。例如，可使用口服、直肠、局部、肠胃外、眼部、肺部、鼻腔给药等。剂量形式包括片剂、锭剂、分散剂、悬浮剂、溶液剂、胶囊剂、乳膏剂、软膏剂、气溶胶等。优选式(I)化合物口服给药。
使用的活性组分的有效剂量可以根据使用的特定化合物、给药模式、治疗病状和治疗病状的严重程度而改变。此类剂量可以由本领域技术人员容易确定。
本发明化合物的治疗有效量通常取决于许多因素，包括例如动物的年龄和重量、需要治疗的精确病状及其严重性、制剂的性质以及给药途径。然而，式(I)化合物用于治疗炎症疾病(例如类风湿性关节炎(RA))的有效量通常在每天0.1至100mg/kg受者(哺乳动物)体重范围内且更通常在每天1至10mg/kg受者体重范围内。因此，对于70kg的成年哺乳动物，每天的实际用量通常为70至700mg且该用量可以每天单剂量给药或更通常为每天多次(如两次、三次、四次、五次或六次)分剂量给药从而使总日剂量相同。其药学上可接受的盐、前药或代谢物的有效量可按式(I)化合物本身有效量的比例确定。预期相似剂量也适合于治疗上文指出的其它病状。
如本文使用的，术语“有效量”是指将引起组织、***、动物或人的生物或医学反应的药物或药物制剂的量，所反应是例如研究者或临床医生所追求的。
此外，术语“治疗有效量”是指与未接受该用量的相应受试者相比，能使对疾病、病症或副作用的治疗、治愈、预防或改善有所提高，或使疾病或病症的进展速率(rate of advancement)降低的任何用量。该术语也包括在其用量范围内能有效地增强正常的生理功能。
本发明的另一方面是本发明化合物或其药学上可接受的盐作为药物。
本发明的另一方面是本发明化合物或其药学上可接受的盐用在治疗和预防与JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC相关的疾病或病症的方法中。
在本发明的上下文中，与JAK3、BTK、BLK、ITK和TEC相关的疾病或病症定义为其中涉及JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC的疾病或病症。
在一个优选实施方案中，其中与JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC相关的疾病或病症是免疫性、炎性、自身免疫性或变应性病症或疾病或移植排斥或移植物抗宿主病。
因此，本发明的另一方面是本发明化合物或其药学上可接受的盐用在治疗或预防免疫性、炎性、自身免疫性或变应性病症或疾病或移植排斥或移植物抗宿主病的方法中。
组织和器官的炎症在广泛的病症和疾病中发生并在由于激活细胞因子受体家族而产生的某些变种中发生。与JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC激活相关的示例性炎症病症以非限制性的方式包括辐射照射引起的皮肤炎症、哮喘、变应性炎症和慢性炎症。
根据本发明，自身免疫性疾病是至少部分由机体对自身组分(例如蛋白质、脂质或DNA)的免疫反应引起的疾病。器官特异性自身免疫性病症的实例是影响胰腺的胰岛素依赖型糖尿病(I型)、影响甲状腺的桥本氏甲状腺炎和格雷夫斯病、影响胃的恶性贫血、影响肾上腺的库欣病和阿狄森病、影响肝脏的慢性活动性肝炎；多囊性卵巢综合症(PCOS)、腹腔疾病、银屑病、炎性肠病(IBD)和强直性脊柱炎。非器官特异性自身免疫性病症的实例是类风湿性关节炎、多发性硬化、***性红斑狼疮和重症肌无力。
I型糖尿病由自身反应性T细胞对分泌胰岛素的胰岛β细胞的选择性进攻而继发。在这种疾病中以JAK3为靶标是基于这样的观察：已知通过JAK途径传导信号的多种细胞因子参与β细胞的T细胞介导的自身免疫性损伤。事实上，JAK3抑制剂，JANEX-1在I型糖尿病的NOD小鼠模型中显示预防自发的自身免疫性糖尿病的发展。
在一个优选实施方案中，自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD；克罗恩病和溃疡性结肠炎)、银屑病、***性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化(MS)。
类风湿性关节炎(RA)是影响大约1%世界人口的慢性进行性衰弱性炎症性疾病。RA是主要影响手足小关节的对称多发性关节炎。除滑膜(synovium)、关节内衬中的炎症之外，称作血管翳(pannus)的组织攻击正面会侵略并破坏局部关节结构(Firestein2003，Nature423：356-361)。
炎性肠病(IBD)的特征在于慢性复发性肠道炎症。IBD进一步分为克罗恩病和溃疡性结肠炎。克罗恩病最经常涉及末端回肠和结肠，是透壁的和不连续的。相反，在溃疡性结肠炎中，炎症是连续的且局限于直肠和结肠黏膜层。大约10%的情况局限于直肠和结肠，克罗恩病或溃疡性结肠炎无法明确分类且被指定为是“未确定型结肠炎(indeterminate colitis)”。两种疾病均包括皮肤、眼睛或关节的肠外炎症。中性粒细胞诱导的伤害可通过使用中性粒细胞迁移抑制剂而预防(Asakura等，2007，World J Gastroenterol.13(15)：2145-9)。
银屑病是影响大约2%人口的慢性炎症性皮肤病。其特征在于通常出现于头皮、肘部和膝盖的红色鳞状皮肤斑并可能与严重的关节炎相关。这种损伤是由角质化细胞异常增殖和炎症细胞渗透进入真皮和表皮而引起的(等，2005，New Engl.J.Med.352：1899-1912)。
***性红斑狼疮(SLE)是由T细胞介导的B细胞激活产生的慢性炎症性疾病，其导致肾小球肾炎和肾功能衰竭。人类SLE的早期特征在于长期自身反应性CD4+记忆细胞的扩增(D’Cruz等，2007，Lancet369(9561)：587-596)。
多发性硬化(MS)是炎症和脱髓鞘性神经***疾病(demyelatingneurological disease)。其被认为是CD4+1型T辅助细胞介导的自身免疫性病症，但近期研究指出其它免疫细胞的作用(Hemmer等，2002，Nat.Rev.Neuroscience3，291-301)。
在优选的实施方案中，所述过敏性疾病选自哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、支气管炎、结膜炎、皮炎和过敏性鼻炎。
肥大细胞表达JAK3并且JAK3是IgE介导的肥大细胞响应(包括炎症介质的释放)的主要调节剂。JAK3被证明是治疗肥大细胞介导的过敏性反应的有效靶标。与肥大细胞激活相关的变应性病症包括I型速发型超敏反应如过敏性鼻炎(花粉症)、过敏性荨麻疹(荨麻疹)、血管性水肿、过敏性哮喘和过敏性反应例如过敏性休克。这些病症可通过抑制JAK3活性而治疗或预防，例如通过给药本发明的JAK3抑制剂。
移植排斥(同种异体移植排斥)包括但不限于例如肾脏、心脏、肝脏、肺、骨髓、皮肤和角膜移植后的急性和慢性同种异体移植排斥。已知T细胞在同种异体移植排斥的特异性免疫应答中起到主要作用。可以治疗超急性、急性和慢性器官移植排斥。超急性排斥发生在移植后的几分钟内。急性排斥通常发生在移植后的6至12个月内。当用免疫抑制剂治疗时，超急性和急性排斥通常是可逆的。慢性排斥的特征在于器官功能逐渐丧失，其由于可发生在移植后的任何时间因而对于移植受体是持续关注的。
移植物抗宿主病(GVDH)是同种骨髓移植(BMT)中的主要并发症。GVDH由识别并对组织相容性复合体***中的受体差异反应的供体T细胞引发，导致显著的发病率和死亡率。JAK3在GVHD的诱导中起重要作用且使用JAK3抑制剂(JANEX-1)治疗已证实可减轻GVHD的严重性(参见Cetkovic-Cvrlje和Ucken，2004)。
哮喘是在成人和儿童中均具有许多临床表型的复杂综合征。其主要特征包括各种程度的通气障碍、支气管高反应性和气道炎症(Busse and Lemanske,2001,N.Engl.J.Med.344:350-362)。
慢性阻塞性肺病(COPD)特征在于炎症、不能完全可逆的通气限制以及逐渐丧失肺功能。在COPD中，慢性吸入刺激物导致异常炎症应答、气道重塑和肺中的通气限制。吸入的刺激物通常为烟草烟雾，但是职业灰尘和环境污染也不断涉及(Shapiro2005,N.Engl.J.med.352,2016-2019)。
在一个优选实施方案中，炎性疾病是眼病。
干眼症(DES，也称为干燥性角膜结膜炎)是眼科医生治疗的最常见问题之一。有时DES被称为泪液功能不全综合征(Jackson，2009.Canadian JournalOphthalmology44(4)，385-394)。DES影响最高达10%的年龄在20至45岁之间的人口，且百分比随年龄增长。尽管可利用许多种类的人工泪液产品，但这些产品仅提供症状的暂时缓解。因此，需要治疗干眼的制剂、组合物和治疗方法。
如本文使用的，“干眼症”意图包括干眼症研讨会(DEWS)最近的官方报告中总结的病状，其定义干眼为“眼泪和眼球表面的多因素疾病，其导致不适症状、视觉障碍和具有眼球表面潜在伤害的泪膜不稳定性。该病伴随有泪膜的渗透压增加和眼球表面的炎症。”(Lemp，2007.“The Definition andClassification of Dry Eye Disease：Report of the Definition and ClassificationSubcommittee of the International Dry Eye Workshop”，The Ocular Surface，5(2)，75-92)。干眼有时也称为干燥性角膜结膜炎。在一些实施方案中，干眼症的治疗包括改善干眼症的特定症状，如眼部不适、视觉障碍、泪膜不稳定、眼泪高渗透压和眼球表面的炎症。
葡萄膜炎是眼内炎症的最常见形式且仍然是失明的重要原因。目前用于葡萄膜炎的治疗使用全身药物，其具有严重副作用且为完全免疫抑制的。临床上，非感染性葡萄膜炎的慢性渐进性或复发形式使用局部和/或全身性类固醇治疗。此外，使用大环内酯类如环孢霉素和雷帕霉素，且在有些情况下使用细胞毒性剂如环磷酰胺和苯丁酸氮芥，以及抗代谢药物如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤和来氟米特(Srivastava等，2010.Uveitis：Mechanisms and recent advancesin therapy.Clinica Chimica Acta，doi：10.1016/j.cca.2010.04.017)。
其它眼部疾病、结合治疗和给药途径描述于例如WO-A2010/039939中，其在此通过引用并入本文中。
在另一个优选实施方案中，与JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC相关的疾病或病症是增生性疾病，尤其是癌症。
与JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC尤其相关的疾病和病症是增殖性病症或疾病，尤其是癌症。
因此，本发明的另一个方面是本发明化合物或其药学上可接受的盐用在治疗或防治增生性疾病(尤其是癌症)的方法中。
癌症包含一组特征在于异常细胞的失控生长和扩散的疾病。癌症的所有类型通常包括在细胞生长、***和存活控制中的一些异常，导致细胞恶性生长。促进所述细胞恶性生长的关键因素是不依赖于生长信号、对抗生长信号不敏感、逃避细胞凋亡、无限复制潜力、持续的血管生成、组织入侵和转移、以及基因组不稳定(Hanahan和Weinberg，2000.The Hallmarks of Cancer.Cell100，57-70)。
通常，癌症分类为血液癌症(hematological cancer)(例如白血病和淋巴瘤和实体癌症如肉瘤和癌(例如脑癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、***癌、卵巢癌)。
本发明的激酶抑制剂也可用于治疗某些恶性肿瘤，包括皮肤癌和血液恶性肿瘤如淋巴瘤和白血病。
尤其是其中JAK-STAT信号转导通路被激活(例如由于JAK3的激活)的癌症，被认为响应JAK3抑制剂的治疗。包含JAK3突变的癌症的实例是急性成巨核细胞白血病(AMKL)(Walters等，2006.Cancer Cell10(1)：65-75)和乳腺癌(Jeong等，2008.Clin.Cancer Res.14，3716-3721)。
本发明的又一方面是本发明化合物或其药学上可接受的盐用于制备治疗或预防与JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC相关的疾病和病症的药物的用途。
本发明的又一方面是本发明化合物或其药学上可接受的盐用于制备治疗或预防免疫性、炎性、自身免疫性或变应性病症或疾病或移植排斥或移植物抗宿主病的药物的用途。
本发明的又一方面是本发明化合物或其药学上可接受的盐用于制备治疗或预防增生性疾病(尤其是癌症)的药物的用途。
在本发明这些用途的上下文中，与JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC相关的疾病和病症如上文所定义。
本发明的又一方面是一种用于在需要其的哺乳动物患者中治疗、控制、延迟或预防一种或多种选自与JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC相关的疾病或病症的病状的方法，其中该方法包括对所述患者给药治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的又一方面是一种用于在需要其的哺乳动物患者中治疗、控制、延迟或预防一种或多种选自免疫性、炎性、自身免疫性或变应性病症或疾病或移植排斥或移植物抗宿主病的病状的方法，其中该方法包括对所述患者给药治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的又一方面是一种用于在需要其的哺乳动物患者中治疗、控制、延迟或预防增生性疾病(尤其是癌症)的方法，其中该方法包括对所述患者给药治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐。
在本发明这些方法的上下文中，与JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC相关的疾病和病症如上文所定义。
在本发明的这些方法的上下文中，本发明化合物优选共价结合至JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC，优选共价结合至半胱氨酸残基。
如本文使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指的是其中可存在疾病进展的减缓、阻断、阻止或停止，但不是必须显示所有症状完全消失的所有方法。
以上讨论的关于本发明药物组合物的所有实施方案也适用于上文提到的本发明的第一或第二医疗用途或方法。
本发明化合物的制备如文献所述，例如WO2011/048082A1。制备本发明化合物的一个示例性路线如下所述。很明显，本领域技术人员可以组合或调整该路线，尤其组合活化基或保护基的引入。
一个制备本发明化合物的示例性通用路线如方案1所述。化合物(IV)用于例示目的。本领域技术人员将意识到，化合物(IV)可以被相似试剂替换以合成更多本文所述的化合物。
Figure BDA0000487894180000271
方案1
式(II)化合物可以由可市售获得的或可以由本领域熟练技术人员制得的化合物(III)、(IV)、(VI)和(IX)形成。这些反应任选应用大范围的溶剂，包括质子溶剂，例如醇；极性非质子溶剂，例如二甲基亚砜、DMF、乙腈、二烷、THF；非极性溶剂，例如甲苯、DCM；或碱性溶剂，例如吡啶。反应可以任选通过加入碱来促进，所述碱包括但不限于胺碱，例如三乙胺和DIPEA；或金属碳酸盐。反应可以任选通过酸促进，所述酸包括无机酸，例如氯化氢；有机酸和Lewis酸。A、B和C为合适的离去基团，例如卤素。G为SO2或C(O)。D为任选取代的烯烃或炔烃。
本领域技术人员将理解，反应的顺序将取决于反应条件和试剂性质；各个化合物可能存在一种以上的路线；改变方案1中详细说明的路线的反应顺序是可能的。
在一个实施方案中，式(III)化合物与式(IV)化合物在碱(例如碳酸钾)的存在下；在极性非质子溶剂(例如乙腈)中反应得到式(V)化合物。然后式(V)化合物与式(VI)化合物在酸(例如氯化氢)的存在下；在质子溶剂(例如异丙醇)中；在高于20℃的温度(例如90℃)反应得到式(VII)化合物。然后式(VII)化合物与还原剂(例如氢气)；在催化剂(例如Pd/C)的存在下；在质子溶剂(例如甲醇)中反应得到式(VIII)化合物。然后式(VIII)化合物与式(IX)化合物在碱(例如DIPEA)的存在下；在非质子溶剂(例如DCM)中反应得到式(II)化合物。
附图说明
图1：人JAK3的氨基酸序列(IPIIPI00002773.4)。具有半胱氨酸残基909的肽LVMEYLPSGCLR(位置900-911)以下划线示出。
实施例
分析方法
NMR波谱在Brucker dpx400上获得。LCMS在Agilent1100上使用Gemini C18,3x30mm,3微米进行。柱流速为1.2mL/min，所用溶剂为水和乙腈(0.1%甲酸：高pH，0.1%氨水：低pH)，进样量为3μL。波长为254和210nm。
方法A
柱：Phenomenex Gemini-C18,3x30mm,3微米。流速：1.2mL/min
表1
Figure BDA0000487894180000291
方法B
柱：Phenomenex Gemini-C18,4.6x150mm,5微米。流速：1.0mL/min
表2
Figure BDA0000487894180000292
方法C
柱：Phenomenex Gemini-NX C18,4.6x150mm,5微米。流速：1mL/min。梯度：
表3
Figure BDA0000487894180000293
表4：缩写
Figure BDA0000487894180000294
Figure BDA0000487894180000301
实验
实施例1：N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酰胺
将6-氯-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶(10g,52mmol)、碳酸钾(2eq)和1-(溴甲基)-3-硝基苯(1.2eq)在乙腈(150mL)中的悬浮液在室温搅拌20h。在真空中除去溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯，并用水洗涤。干燥有机相(Na2SO4)，在真空中减少并用柱色谱纯化，得到6-氯-1-(3-硝基苄基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
向6-氯-1-(3-硝基苄基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶(2.2g,7.6mmol)在异丙醇(62mL)中的溶液中加入1-甲基-1H-吡唑-4-胺(2.5eq)和浓HCl溶液(0.2mL)，并将反应在90℃加热18h。冷却至室温后，过滤固体，用冷异丙醇洗涤，然后风干，得到N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1-(3-硝基苄基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺。
向N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1-(3-硝基苄基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺(0.6g,1.7mmol)在MeOH(25mL)中的溶液中加入浓HCl溶液(0.6mL)，然后加入钯/碳(60mg)，并将反应在氢气球下搅拌2h。将所得混合物经硅藻土过滤，并将滤液在真空中进行浓缩，得到1-(3-氨基苄基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺。
向1-(3-氨基苄基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺(50mg,0.16mmol)在DCM(1mL)和DMF(1mL)中的溶液中加入DIPEA(2eq)，然后加入丙烯酰氯(1.2eq)，并将反应在室温搅拌16h。将混合物用DCM稀释，并用1M HCl水溶液洗涤。将有机相用饱和NaHCO3水溶液然后用水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中减少，并通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物。LC-MS方法C,(ES+)375,RT=7.08min。
实施例2：N-(2-氟-5-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0000487894180000321
标题化合物根据实施例1的操作，使用4-(溴甲基)-1-氟-2-硝基苯制备。LC-MS方法C,(ES+)393,RT=7.19min。
实施例3：N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)丙炔酰胺
Figure BDA0000487894180000322
向1-(3-氨基苄基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺(在实施例1中制备)(50mg,0.16mmol)在DMF(1.5mL)中的溶液中加入丙炔酸(0.9eq)、DIPEA(3eq)和PyBroP(1.3eq)，然后将反应在室温搅拌3h。将反应用DCM稀释，并用1M HCl水溶液洗涤。将有机相用饱和NaHCO3水溶液然后用水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中减少，并通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物。LC-MS方法C,(ES+)373,RT=6.99min。
实施例4：N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)乙烯磺酰胺
Figure BDA0000487894180000331
向2-氯乙磺酰氯(1.1eq)在DCM(2mL)中的溶液中加入二异丙基乙基胺(2.5eq)，并将混合物搅拌30min。加入1-(3-氨基苄基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺(在实施例1中制备)(100mg,0.32mmol)和饱和NaHCO3水溶液(2mL)，并将反应在室温搅拌3h。分离各相，并将产物萃取至DCM中，干燥(Na2SO4)，在真空中减少，并通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物。LC-MS方法C,(ES+)411,RT=7.17min。
实施例5：N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)甲基丙烯酰胺
Figure BDA0000487894180000332
标题化合物根据实施例1的操作，使用甲基丙烯酰氯制备。LC-MS方法C,(ES+)389,RT=7.44min。
实施例6：3-甲基-N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)丁-2-烯酰胺
Figure BDA0000487894180000333
标题化合物根据实施例1的操作，使用3-甲基丁-2-烯酰氯制备。
LC-MS方法C,(ES+)403,RT=7.72min。
实施例7：N-(3-((2-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)苯基)乙烯磺酰胺
将2-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(1g,6.5mmol)、碳酸钾(2eq)和1-(溴甲基)-3-硝基苯(1.2eq)在乙腈(150mL)中的悬浮液在室温搅拌20h。然后在真空中减少溶剂，并将残余物用乙酸乙酯稀释，并用水洗涤。干燥有机相(Na2SO4)并在真空中减少，得到2-氯-7-(3-硝基苄基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶。
向2-氯-7-(3-硝基苄基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(100mg,0.4mmol)在异丙醇(2mL)中的溶液中加入1-甲基-1H-吡唑-4-胺(2.5eq)和浓HCl溶液(0.05mL)，并将混合物在微波中在140℃反应1h。然后将混合物过滤，用冷异丙醇洗涤，然后风干，得到N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-7-(3-硝基苄基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-胺。
向N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-7-(3-硝基苄基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-胺(80mg,0.2mmol)在MeOH(5mL)中的溶液中加入SnCl2，并将反应在60℃加热4h。冷却至室温后，将混合物萃取至乙酸乙酯中，用水和饱和食盐水洗涤，干燥(MgSO4)并在真空中减少，得到7-(3-氨基苄基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-胺。
向7-(3-氨基苄基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-胺(50mg,0.16mmol)在DCM(1mL)和DMF(1mL)中的溶液中加入DIPEA(2eq)然后加入丙烯酰氯(1.2eq)，并将反应在室温搅拌16h。然后将混合物用DCM稀释，并用1M HCl水溶液洗涤。然后将有机相用饱和NaHCO3水溶液和水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中减少并用柱色谱纯化，得到标题化合物。LC-MS方法C,(ES+)410,RT=5.76min。
实施例8：N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酰胺
将6-氯-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶(1g,6.5mmol)、碳酸钾(2eq)和1-(溴甲基)-3-硝基苯(1.2eq)在乙腈(30mL)中的悬浮液在室温搅拌20h。在真空中除去溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯，并用水洗涤。干燥有机相(Na2SO4)，在真空中减少，并用柱色谱纯化，得到6-氯-1-(3-硝基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶。
向脱气的Pd2(dba)3(0.1eq)和XANTPHOS(0.2eq)在二烷(5mL)中的溶液中加入碳酸铯(2eq)、1-甲基-1H-吡唑-3-胺(1.2eq)和6-氯-1-(3-硝基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶(100mg,0.34mmol)，并将反应在110℃加热18h。冷却至室温后，将反应用乙酸乙酯稀释，并用水洗涤。干燥有机相(Na2SO4)，在真空中减少，并用柱色谱纯化，得到N-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-1-(3-硝基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-胺。
向N-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-1-(3-硝基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-胺(50mg,0.14mmol)在MeOH(5mL)中的溶液中加入浓HCl溶液(0.1mL)，然后加入钯/碳(10mg)，并将反应在氢气球下搅拌2h。所得混合物经硅藻土过滤，并将滤液在真空中进行浓缩，得到1-(3-氨基苄基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-胺。
向1-(3-氨基苄基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-胺(40mg,0.13mmol)在DCM(1mL)和DMF(1mL)中的溶液中加入DIPEA(2eq)，然后加入丙烯酰氯(1.2eq)，并将反应在室温搅拌16h。将混合物用DCM稀释，并用1M HCl水溶液洗涤。将有机相用饱和NaHCO3水溶液然后用水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中减少，并通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物。LC-MS方法C,(ES+)374,RT=5.38min。
实施例9：N-(3-((2-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0000487894180000361
向7-(3-氨基苄基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-胺(在实施例7中制备)(20mg,0.06mmol)在DCM(1mL)和DMF(1mL)中的溶液中加入DIPEA(2eq)，然后加入丙烯酰氯(1.2eq)，并将反应在室温搅拌16h。将混合物用DCM稀释，并用1M HCl水溶液洗涤。将有机相用饱和NaHCO3水溶液然后用水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中减少，并通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物。LC-MS方法C,(ES+)374,RT=5.75min。
实施例10：N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酰胺
Figure BDA0000487894180000362
将6-氯-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶(1g,6.5mmol)、碳酸钾(2eq)和1-(溴甲基)-3-硝基苯(1.2eq)在乙腈(30mL)中的悬浮液在室温搅拌20h。在真空中除去溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯，并用水洗涤。干燥有机相(Na2SO4)，在真空中减少并用柱色谱纯化，得到6-氯-1-(3-硝基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶。
向脱气的Pd2(dba)3(0.1eq)和XANTPHOS(0.2eq)在二烷(5mL)中的溶液中加入碳酸铯(2eq)、1-甲基-1H-吡唑-4-胺(1.2eq)和6-氯-1-(3-硝基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶(100mg,0.34mmol)，并将反应在110℃加热18h。冷却至室温后，将反应用乙酸乙酯稀释，并用水洗涤。干燥有机相(Na2SO4)，在真空中减少并用柱色谱纯化，得到N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1-(3-硝基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-胺。
向N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1-(3-硝基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-胺(50mg,0.14mmol)在MeOH(5mL)中的溶液中加入浓HCl溶液(0.1mL)，然后加入钯/碳(10mg)，并将反应在氢气球下搅拌2h。所得混合物经硅藻土过滤，并将滤液在真空中进行浓缩，得到1-(3-氨基苄基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-胺。
向1-(3-氨基苄基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-6-胺(25mg,0.08mmol)在DCM(1mL)和DMF(1mL)中的溶液中加入DIPEA(2eq)，然后加入丙烯酰氯(1.2eq)，并将反应在室温搅拌16h。将混合物用DCM稀释，并用1M HCl水溶液洗涤。将有机相用饱和NaHCO3水溶液然后用水洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中减少，并通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物。LC-MS方法C,(ES+)374,RT=5.38min。
参考实施例1：N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1-(3-(氧杂环丁烷-3-基氨基)苄基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺
Figure BDA0000487894180000371
该化合物通过类似于上述操作的操作合成。此外，还参考了WO2012/022681A2，第121页的实施例114。
参考实施例2：
N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)乙酰胺
该化合物通过类似于上述操作的操作合成。
参考实施例3：JAK3抑制剂CP690,550(Changelian等,2003,Science302(5646):875-888)。
生物学检测
本发明化合物在能够免疫检测激酶的KinobeadsTM检测中对Janus激酶(JAK家族)的作用的测定
检测原理
如上述实施例所描述的本发明化合物通过KinobeadsTM检测测试，如对ZAP-70(WO-A2007/137867)所描述的。简言之，将测试化合物(以各种浓度)和经氨基吡啶并嘧啶配体24固定的亲和基质加入到细胞溶胞产物等份中并使之与溶胞产物样品中的蛋白质结合。培养时间后将俘获蛋白的珠(bead)从溶胞产物中分离。然后洗脱结合的蛋白并使用特异性抗体以斑点印迹法在Odyssey红外探测***中检测并量化JAK1、JAK2、JAK3和TYK2的存在。得到对于单个激酶的剂量反应曲线并计算IC50值。用于ZAP-70(WO-A2007/137867)和激酶选择性分析的KinobeadsTM检测(WO-A2006/134056)已经在前描述。
方案
亲和基质的洗涤
将亲和基质用15mL含有0.2%NP40(CA-630，Sigma，#I3021)的1xDP缓冲液洗涤两次，然后再悬浮于含有0.2%NP40(3%珠浆)的1xDP缓冲液中。
5xDP缓冲液：250mM Tris-HCl pH7.4、25%甘油、7.5mM MgCl2、750mMNaCl、5mM Na3VO4；通过0.22μm滤膜过滤5xDP缓冲液并在-80℃下等份储存。将5xDP缓冲液用H2O稀释成含有1mM DTT和25mM NaF的1xDP缓冲液。
测试化合物的制备
测试化合物的母液用DMSO制备。在96孔板中制备30μL稀释的5mM测试化合物的DMSO溶液。以该溶液开始制备1：3系列稀释液(9步)。对于对比试验(没有测试化合物)使用含有2%DMSO的缓冲液。
细胞培养和细胞溶胞产物的制备
在1L Spinner烧瓶(Integra Biosciences，#182101)中在补充有10%胎牛血清(Invitrogen)的RPMI1640培养基(Invitrogen，#21875-034)中在悬浮液中以0.15x106至1.2x106细胞/mL的密度培养Molt4细胞(ATCC目录号CRL-1582)和Ramos细胞(ATCC目录号CRL-1596)。通过离心收集细胞，用1x PBS缓冲液(Invitrogen，#14190-094)洗涤一次并将细胞颗粒在液氮中冷冻，随后在-80℃下储存。将细胞在Potter S匀化器中在包含以下组分的溶胞缓冲液中匀化：50mM Tris-HCl、0.8%NP40、5%甘油、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、25mM NaF、1mM钒酸钠、1mM DTT，pH7.5。每25mL缓冲液加入一个完整的不含EDTA的片(蛋白酶抑制剂混合物，Roche Diagnostics，1873580)。将该材料使用机械化POTTER S上下振荡10次，转移至50mL falcon管，在冰上培养30分钟并在4℃下以20,000g离心(spun down)10分钟(SorvallSLA600中10,000rpm，预冷冻)。将上清液转移至超速离心机(UZ)-聚碳酸酯管(Beckmann，355654)并在4℃下以100.000g离心1小时(Ti50.2中33.500rpm，预冷冻)。将上清液再次转移至新的50mL falcon管中，通过Bradford检测(BioRad)测定蛋白质浓度并制备每等份含有50mg蛋白质的样品。该样品立刻用于实验或在液氮中冷冻并在-80℃下储存。
细胞溶胞产物的稀释
将细胞溶胞产物(每板大约50mg蛋白)在室温下在水浴中解冻，然后在冰上储存。向解冻的细胞溶胞产物中加入含有蛋白酶抑制剂(25mL缓冲液1片；不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物；Roche Dagnostics1873580)的1xDP0.8%NP40缓冲液以达到10mg/mL总蛋白质的最终蛋白质浓度。将稀释的细胞溶胞产物在冰上储存。混合的Molt4/Ramos溶胞产物通过将一体积Molt4溶胞产物和两体积Ramos溶胞产物(比例1：2)混合而制备。
使用测试化合物和亲和基质培养溶胞产物
向96孔过滤板(Multiscreen HTS，BV Filter Plates，Millipore#MSBVN1250)的每个孔中加入：100μL亲和基质(3%珠浆)、3μL化合物溶液和50μL稀释的溶胞产物。将板密封并在冷却室的板振动器(Heidolph tiramax1000)上以750rpm培养3小时。随后将所述板用230μL洗涤缓冲液(1xDP0.4%NP40)洗涤3次。将该过滤板放置于收集板(Greiner bio-one，PP-microplate96孔V-型，65120)顶部，然后用20μL样品缓冲液(100mM Tris、pH7.4，4%SDS、0.00025%溴苯酚蓝、20%甘油、50mM DTT)洗脱珠。将洗脱液在-80℃下快速冷冻并在-20℃下储存。
洗脱的激酶的检测和量化
洗脱液中的激酶通过在硝基纤维素膜上点样(spotting)并使用针对感兴趣的激酶的第一抗体和荧光标记的第二抗体(抗兔IRDyeTM抗体800(Licor，#926-32211)检测并量化。LI-COR Biosciences(Lincoln，Nebraska，USA)的Odyssey红外成像***根据生产者提供的说明书(Schutz-Geschwendener等，2004.Quantitative，two-color Western blot detection with infrared fluorescence.2004年5月由LI-COR Biosciences出版，www.licor.com)操作。
洗脱液点样后将硝基纤维素膜(BioTrace NT；PALL，#BTNT30R)首先通过使用Odyssey封闭缓冲液(LICOR，927-40000)在室温下培养1小时而封闭。然后将封闭的膜在表4中示出的温度下用以Odyssey封闭缓冲液(LICOR#927-40000)稀释的第一抗体培养16小时。随后将该膜用含有0.2%吐温20的PBS缓冲液在室温下洗涤两次，持续10分钟。然后将该膜在室温下用以Odyssey封闭缓冲液(LICOR#927-40000)稀释的检测抗体(抗兔IRDyeTM抗体800，Licor，#926-32211)培养60分钟。随后每次用含有0.2%吐温20的1xPBS缓冲液在室温下洗涤该膜两次，持续10分钟。然后将该膜用PBS缓冲液冲洗一次以移除残余的吐温20。将该膜在4℃下保持于PBS缓冲液中，然后用Odyssey仪器扫描。记录荧光信号并根据生产者的说明书进行分析。
表5：抗体的来源和稀释
Figure BDA0000487894180000411
结果
表6提供本发明所选化合物在JAK KinobeadsTM检测中的数据。
表6：在KinobeadsTM检测中使用抗体检测测定的抑制值(IC50，以nM计)。
实施例 JAK1 JAK2 JAK3 Tyk2
1 >10000 >10000 5 >10000
2 >10000 >10000 16 >10000
3 >10000 >10000 10 6958
4 >10000 >10000 10 6132
5 >10000 >10000 57 >10000
6 >10000 >10000 1309 >10000
7 7694 >10000 12 901
8 >10000 >10000 5 >10000
9 9420 >10000 3 8083
10 5368 >10000 1 5080
参考实施例2 >10000 >10000 206 >10000
化合物在使用定量质谱检测激酶的KinobeadsTM检测中的激酶选择性
将之前实施例中所述的本发明所选化合物在KinobeadsTM检测中测试(WO-A2006/134056；Bantscheff等,2007.Nature Biotechnol.25,1035-1044)。
将化合物用细胞裂解物等份(Jurkat和Ramos细胞裂解物的1:1混合物)在4℃培养45分钟，并允许结合至裂解物样品中的蛋白质。然后加入KinobeadsTM亲和性基质以捕捉蛋白质，所述蛋白质不与之前加入的化合物相互作用。在该两小时的4℃培养步骤后，将株从裂解物中分离，并将株结合的蛋白质在SDS样品缓冲液中洗脱，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。将凝胶用胶体Coomassie染色，将各凝胶道的染色区域切下，用胰蛋白酶进行凝胶内蛋白质分解消化。将来自不同的凝胶区域的肽用等重同位素标记试剂(TMT试剂,Thermofisher)标记，如表7所示。所述TMT试剂为一套多种类的、胺特异性的、稳定的同位素试剂，其可在高达六种不同的生物样品中标记肽，能够同时鉴定和定量肽。将组合的样品使用反相色谱在pH11分级，然后将级分用在线联用至串联色谱仪的纳升级液相色谱***(nano-flow liquid chromatography system)(LC-MS/MS)实验分析，然后在MS/MS谱中进行报道分子的离子定量(Ross等,2004.Mol.Cell.Proteomics3(12):1154-1169;Dayon等,2008.Anal.Chem.80(8):2921-2931；Thompson等,2003.Anal.Chem.75(8):1895-1904)。可以在WO2006/134056和先前出版物(Bantscheff等,2007.Nat.Biotechnol.25,1035-1044；Bantscheff等,2011.Nat.Biotechnol.29(3):255-265)中找到进一步实验方案。
表7：用TMT等重同位素标记试剂标记肽
样品 化合物浓度(nM) TMT6试剂
1 3000 126
2 750 127
3 187 128
3 47 129
5 12 130
6 0 131
如表8所示，在kinobeads检测中使用先前所述的质谱检测激酶来确定本发明所选化合物的激酶选择性(Bantscheff等,2007.Nat Biotechnol.25(9):1035-1044；WO-A2006/134056)。
表8：在KinobeadsTM检测中使用定量质谱确定的抑制值(IC50，以nM计)。
实施例 BTK TEC BLK ITK
1 12 12 20 86
2 72 34 406 818
3 12 n.d. 12 12
(n.d.=未测出)
本发明化合物在激酶检测中对BLK、BTK、ITK和JAK3的作用的测定
放射测量的蛋白激酶检测(活性检测；ProQinase GmbH,Freiburg,Germany)用于测量蛋白激酶BLK、BTK、ITK和JAK3的激酶活性。所有激酶检测在来自PerkinElmer(Boston,MA,USA)的96孔FlashPlatesTM上进行，反应量为50μl。在四个步骤中吸取反应混合物(cocktail)，按照以下顺序：
20μl检测缓冲液(标准缓冲液)
5μl的ATP溶液(在H2O中)
5μl测试化合物(在10%DMSO中)
10μl底物/10μl酶溶液(预混合)
所有酶的检测含有70mM HEPES-NaOH,pH7.5、3mM MgCl2、3mMMnCl2、3μM正钒酸钠、1.2mM DTT、ATP/[γ-33P]-ATP(可变量，对应于各个激酶的表观ATP-Km)、蛋白激酶和底物(表9)。
将反应混合物在30℃培养60分钟。用50μl的2%(v/v)H3PO4终止反应，吸干该板并用200μl的0.9%(w/v)NaCl洗涤两次。用微板闪烁计数器(Microbeta,Wallac)测定33Pi。所有检测在BeckmanCoulter/SAGIANTM CoreSystem上进行。
表9：酶和底物
Figure BDA0000487894180000431
表10提供了本发明所选化合物在激酶检测中的数据。
表10：Proquinase酶检测数据(IC50值，以nM计)
实施例 BLK BTK ITK JAK3
1 nd 20 230 3
2 2000 323 n.d. n.d.
3 n.d. 1 3 4
4 n.d. 20 80 7
参考实施例2 n.d. 2000 无活性 290
(n.d.=未测出)
细胞检测
pSTAT5检测
检测原理
STAT5磷酸化代表JAK3激活的下游信号级联的临近事件之一。因此，STAT5磷酸化是评估JAK3抑制的机理作用的适当读出(readout)。白细胞介素-2(IL-2)激活人类YT细胞(NK样细胞系)导致酪氨酸残基694(Tyr694)处的STAT5磷酸化，其可通过特异性抗体的免疫检测和适当检测方法(在该情况下AlphaScreen检测技术)进行定量测量。
检测方案
细胞培养和细胞接种
人类YT细胞生长在含有2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen，25030-024)和10%热灭活FBS(Invitrogen，10106-169)的RPMI培养基(Lonza，BE12-167)中并保持在潮湿的培养箱(37℃，5%CO2)中。通过离心获取细胞，用HBSS(Invitrogen，14180-046)洗涤一次，以1.5x106个细胞/ml重新悬浮于HBSS中并将0.9x104个细胞以每孔6μl接种于96孔白色板(PerkinElmer，6005569)中。
用测试化合物和IL-2刺激处理
将测试化合物溶于DMSO并制备1:3系列稀释液(9步)。为得到剂量响应曲线，将4%DMSO/HBSS中的3μl四倍浓缩化合物加入到96孔板的每个细胞样品中，产生1%DMSO的最终DMSO浓度。将细胞在潮湿的培养箱(37℃，5%CO2)中培养一小时。向每个孔中加入3μl四倍浓缩的IL-2溶液(重组人IL-2，Peprotech200-02；120nM的HBSS溶液)并在室温下培养30分钟。通过加入3μl5x裂解缓冲液(SureFire裂解缓冲液；Perkin Elmer，TGRS5S10K)将细胞裂解并在室温下轻轻摇动培养10分钟。
信号检测
对于通过
Figure BDA0000487894180000451
技术的信号检测，根据生产者(Perkin Elmer，TGRS5S10K)提供的说明书使用SureFire磷酸-STAT5(Tyr694/Tyr699)试剂盒。按照生产者的推荐加入受体珠(再活化缓冲液/活化缓冲液/受体珠以40:10:1的比率)并在室温下轻轻摇动培养1.5小时。然后按照推荐(稀释缓冲液/供体珠以20:1的比率)加入供体珠并在室温下轻轻摇动培养1.5小时。在含有AlphaScreen设计的Envision仪器(Perkin Elmer)上读取平板。在生物检测中使用非线性回归对具有可变斜率的S形剂量-响应数据进行分析。
表11提供了本发明所选化合物在pSTAT5细胞检测中的数据。
表11：pSTAT5细胞检测数据(IC50值，以nM计)
实施例 pSTAT5
1 31
2 378
3 33
4 74
5 2005
7 79
清除化合物的细胞检测
检测原理
该时程实验能够测定是否测试化合物的药理学作用随时间持续，甚至当化合物从细胞样品中除去后。
检测方案
细胞培养和细胞接种
将人YT细胞如上述进行生长。通过离心收获细胞并将其悬浮在RPMI/0.5%热失活的FBS中。将3x105个细胞以60μl/孔接种在圆底96孔板(BD-Falcon,353077)中。
用测试化合物处理和IL-2刺激
将测试化合物溶于DMSO并制备1:3稀释系列(9个步骤)。为了生成剂量响应曲线，将30μl在4%DMSO/RPMI/0.5%FBS中四倍浓缩的化合物加入96孔板的各孔细胞样品中，得到最终DMSO浓度为1%DMSO。将细胞在增湿的培养箱(37℃,5%CO2)中培养一小时。培养后，将细胞通过离心清洗两次，并替换培养基(RPMI/0.5%FBS)，除了0时间板。将清洗的细胞在增湿的培养箱(37℃,5%CO2)中培养30分钟、1、2和4小时，然后用IL-2刺激。向各孔中加入30μl四倍浓缩的IL-2溶液(重组的人IL-2，Peprotech200-02；120nM的RPMI溶液)，并在室温培养30分钟。通过加入30μl的5x裂解缓冲液(MSD裂解缓冲液)裂解细胞，并在4℃伴随轻轻振荡培养10分钟。
信号检测
在裂解物中使用MSD
Figure BDA0000487894180000461
964-spot phosphor-STAT5a,b全细胞裂解物试剂盒(MesoScale Discovery,K150IGD-3)，根据生产商的说明方案检测化合物对STAT5磷酸化的作用。在BioAssay中使用具有可变斜率的S形曲线剂量-响应的非线性回归分析数据，并确定IC50值。
结果
对于参考实施例3(JAK3抑制剂CP690,550)，在清洗细胞之后30分钟观察到活性的显著下降，并且在之后1小时观察到抑制活性完全丧失。参考实施例2的活性在清洗之后30分钟完全丧失。不同的是，在清洗之后长达4小时，实施例1和3仍保持了活性，仅少许活性降低。
表12提供了本发明所选化合物和参考化合物在细胞清除研究中的数据。
表12：在IL-2刺激的YT细胞中在清除化合物后pSTAT5抑制(pIC50值)的时程。
Figure BDA0000487894180000471
质谱鉴定实施例1化合物修饰的JAK3肽
检测原理
化合物处理后，质谱分析免疫沉淀的JAK3用于确定是否实施例1化合物共价结合至JAK3。将Jurkat细胞裂解物用10μM实施例1化合物预培养45分钟。对照样品不用化合物培养(DMSO对照)。然后，用抗-JAK3抗体(Abcam ab45141)将JAK3免疫沉淀。另外，用抗-IgG(模拟免疫沉淀)进行对照实验。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离沉淀的蛋白质。用胶体Coomassie染色凝胶，将各凝胶道的染色区域切下，并用胰蛋白酶进行凝胶内蛋白质分解消化。将源自三个样品的肽用iTRAQ试剂标记(如表13所述)，并将合并的样品用在线联用至串联色谱仪的纳升级液相色谱***(LC-MS/MS)实验分析，然后在MS/MS谱中进行iTRAQ报道分子的离子定量(Ross等,2004.Mol.Cell.Proteomics3(12):1154-1169)。将包含JAK3的凝胶区域用HCDiq(高质量精度的MS/MS谱)在Orbitrap Velos质谱仪上分析270分钟。对于Mascot检索，使用了标准参数和实施例1化合物对半胱氨酸的可变修饰。其它实验方案可见于WO2006/134056和之前的出版物(Bantscheff等,2007.Nature Biotechnology25,1035-1044)。
表13：用iTRAQ等重同位素标记试剂标记肽
方案
1.细胞裂解物的制备
将Jurkat细胞(ATCC目录号TIB-152Jurkat，克隆E6-1)以悬浮液形式在一升Spinner瓶(Integra Biosciences,#182101)中的补充有10%胎牛血清(Invitrogen)的RPMI1640培养基(Invitrogen,#21875-034)中生长，其密度为0.15x106至1.2x106个细胞/ml。通过离心收获细胞，用1x PBS缓冲液(Invitrogen,#14190-094)洗涤一次，并将细胞沉淀物在液氮中冰冻，然后保存在-80℃。将Jurkat细胞在Potter S匀浆器中在以下裂解缓冲液中匀浆：50mMTris-HCl、0.8%NP40、5%甘油、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、25mM NaF、1mM钒酸钠、1mM DTT，pH7.5。完成后，每25ml缓冲液加入无EDTA的片剂(蛋白酶抑制剂混合物，Roche Diagnostics,1873580)。使用机械化的POTTER S将所述原料进行10次杜恩斯匀浆操作(dounced)，转移至50mlfalcon管，在冰上培养30分钟，并在20,000g在4℃旋转沉淀10min(10,000rpm，在Sorvall SLA600中，预冷却)。将上清液转移至超离心(UZ)-聚碳酸酯管(Beckmann,355654)中，并在100,000g在4℃旋转1小时(33,500rpm，在Ti50.2中，预冷却)。再次将上清液转移至新的50ml falcon管，通过Bradford检测(BioRad)确定蛋白质浓度，并且制备含有50mg蛋白质/等份的样品。立即将样品用于实验，或在液氮中冰冻并保存在-80℃。
2.蛋白质的免疫沉淀
抗体的偶联
经伯胺将抗体共价偶联至活化的株状琼脂糖上。所述
Figure BDA0000487894180000481
PlusCoupling Reaction(Thermo Scientific Inc.,Rockford,IL61105,USA)包括醛(在支持相上)和胺(在抗体上)之间自发形成的希夫碱(Schiff base)键，它们随后通过用温和还原剂(氰基硼氢化钠)反应而得以稳定。将200μl的
Figure BDA0000487894180000482
树脂(Thermo Scientific Inc.,20501)在一批中以合适的浓度与抗-JAK3抗体(80μl Abcam ab45141,Lot GR5571-5)偶联。对于模拟免疫沉淀，将合适量的兔IgG(80μg Sigma I5006)偶联至100μl的
Figure BDA0000487894180000483
树脂(ThermoScientific Inc.,20501)。
将
Figure BDA0000487894180000484
树脂用10株体积的PBS洗涤三次，然后在1.5ml硅化微量离心管中将抗体溶液加入树脂中。在0.01M NaOH(由1M NaOH配制，Merck,109137)中新鲜配制1M NaCNBH3(Thermo Scientific Inc.,44892)，并且每1ml反应体积加入25μl。将混合物在4℃旋转(NeoLab Rotator,2-1175)培养过夜。保留少量上清液以通过Bradford检测确定偶联效率，弃去其余上清液。将株用10株体积1M Tris pH7.4(Sigma-Aldrich,S5150)洗涤两次。将1M Tris pH7.4以1:1的比例加入株中，每1ml反应体积加入25μl新鲜配制的NaCNBH3，并在室温培养旋转30分钟。弃去上清液，并将株用10株体积的1M NaCl(由5M NaCl配制，Sigma-Aldrich,S5150)洗涤两次。使用前，将株用含有0.2%NP40的裂解缓冲液(不含DTT)洗涤两次。
用化合物培养细胞裂解物并免疫沉淀
将细胞裂解物解冻，用不含DTT和NP40的裂解缓冲液稀释1倍，再用含有0.4%NP40(无DTT)的裂解缓冲液稀释至5mg/ml蛋白质浓度。将裂解物转移至超离心管(Beckmann,355654)中，并在100,000x g在4℃离心20分钟(33,500rpm，在Ti50.2中，预冷却)。将上清液转移至新的falcon管中。
同时，通过用DMSO稀释30mM储备溶液配制4mM化合物溶液。将5μl的4mM化合物溶液和2ml超离心的裂解物(10mg蛋白质/样品)在15mlGreiner管中在翻滚式振荡器(end-over-end shaker)(Roto Shake Genie,Scientific Industries Inc.)上在4℃培养45分钟。这对应于最终浓度为10μM的实施例1化合物。对于对照实验，使用0.25%DMSO。
培养步骤后，将亲和性基质(具有固定的抗体的
Figure BDA0000487894180000491
树脂；100μl株/免疫沉淀样品)与裂解物样品在翻滚式振荡器上在4℃培养1小时。通过在2000rpm离心2分钟收集株，保留少量未结合的部分，并将剩余上清液弃去。将株转移至含有600μl裂解缓冲液(无DTT)的Mobicol柱(MoBiTech,10055)，并用10ml含有0.2%NP40洗涤剂的裂解缓冲液、然后用5ml不含洗涤剂的裂解缓冲液洗涤。为了洗脱结合的蛋白质，将80μl2x SDS样品缓冲液加至柱中。将柱在95℃培养10分钟，并通过离心将洗脱物转移至硅化的微量离心管中。然后用50mM DTT将蛋白质还原，再用108mM碘乙酰胺烷基化。然后将蛋白质通过SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分离。
3.质谱鉴定蛋白质
3.1质谱分析前的蛋白质消化
将凝胶分离的蛋白质在凝胶内消化，基本按照之前所述的操作(Shevchenko等,1996,Anal.Chem.68:850-858)。简言之，使用干净的解剖刀将凝胶分离的蛋白质从凝胶上切下，使用100μl5mM三乙铵碳酸氢盐缓冲剂(TEAB；Sigma T7408)和40%乙醇水溶液脱色两次，并用绝对乙醇脱水。然后将蛋白质在凝胶内使用猪的胰蛋白酶(Promega)以10ng/μl在5mMTEAB中的蛋白酶浓度消化。在37℃消化4小时，然后使用5μl的5%甲酸停止反应。
3.2质谱分析前的样品制备
将凝胶填料用用20μl的1%甲酸萃取两次，然后用增加浓度的乙腈萃取三次。然后将萃取物与酸化的消化上清液混合，并在真空离心干燥。
3.3iTRAQ标记肽萃取物
将用200μM实施例1和溶剂对照(0.5%DMSO)处理的样品的肽萃取物用不同种类的等重同位素标记试剂(iTRAQ Reagents Multiplex Kit,partnumber4352135,Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)处理。iTRAQ试剂为一套多种类的、胺特异性的、稳定的同位素试剂，其可在高达四种不同的生物样品中标记肽的氨基，能够同时鉴定和定量肽。根据生产商提供的说明书使用iTRAQ。将样品重新悬浮在10μl的50mM TEAB溶液，pH8.5中，并加入10μl乙醇。将iTRAQ试剂溶于120μl乙醇，并将10μl试剂溶液加入样品中。该标记反应在水平振荡器上在室温进行一小时，并通过加入5μl的100mM TEAB和100mM甘氨酸的水溶液终止。然后将两个标记的样品混合、在真空离心干燥，并重新悬浮在10μl的0.1%甲酸的水溶液中。
3.4质谱数据获得
将肽样品进样至直接偶联至Thermo OrbitrapVelos质谱仪的1D+,Eksigent Nano LC***中。在LC***上使用水溶液和有机溶剂的梯度分离肽(如下)。溶剂A为0.1%甲酸，溶剂B为70%乙腈和0.1%甲酸。
表14：LC***的肽洗脱
时间(min) %A %B
0 95 5
230 40 60
240 10 90
250 10 90
251 95 5
260 95 5
3.5蛋白质鉴定和定量
将在LC-MS/MS实验中产生的肽质量和裂解数据用于查询蛋白质数据库，所述数据库由International Protein Index(IPI)蛋白质序列数据库的内部注释版本(in-house curated version)和该数据库的教程版本(decoy version)组合而成(Elias and Gygi,2007.Target-decoy search strategy for increased confidencein large-scale protein identifications by mass spectrometry.Nature Methods4,207-214)。通过使用软件工具Mascot关联测得的肽质量和裂解数据与在数据库中输入而计算的数据来鉴定蛋白质(Perkins等,1999.Probability-basedprotein identification by searching sequence database using mass spectrometrydata.Electrophoresis20,3551-3567)。Mascot搜索参数为：限差：20ppm肽质量。碎片质量限差：20mmu。酶：胰蛋白酶。固定修饰：iTRAQ(K)。可变修饰：iTRAQ(N-末端)&乙酰化(N-末端)&氧化(M)&脲甲基化(C)&实施例1化合物结合(C)。最大漏切：3。调节蛋白质验收阈值以达到低于1%的错误发现率，如教程数据库建议的命中率(Elias and Gygi,2007.Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale proteinidentifications by mass spectrometry.Nature Methods4,207-214)。使用iTRAQ报道分子离子信号的峰面积进行相对蛋白质定量，基本如之前的出版物所述(Bantscheff等,2007.Nature Biotechnology25,1035-1044)。
结果
图1显示了人JAK3的序列。肽LVMEYLPSGCLR(JAK3的900-911位)是唯一被实施例1化合物共价修饰的肽。该肽在半胱氨酸909上被修饰(见表15至17)。
表15：肽LVMEYLPSGCLR(JAK3序列中的氨基酸残基900-911)的鉴定。固定修饰：4TRAQ(K)。可变修饰：4TRAQ(N-末端)，乙酰化(蛋白质N-末端)，脲甲基化(C)，实施例1化合物结合(C)，氧化(M)。被胰蛋白酶裂解：切割K或R的C末端侧，除非下一残基为P。
Figure BDA0000487894180000521
表16：iTRAQ-LVM(ox)EYLPSGC(脲甲基)LR MS/MS谱的前40个最高离子强度的峰
m/z 离子强度 相对强度 离子
115.107 381.8 4.48 iTRAQ
116.111 6769.6 79.51 iTRAQ
117.114 662.9 7.79 iTRAQ
145.109 3083.4 36.22
175.119 580.7 6.82 y1
230.197 885.3 10.4
258.194 1633.7 19.19 b1
326.961 424.6 4.99
329.267 669.8 7.87
340.999 766.1 9
357.261 412.4 4.84
402.145 397.1 4.66
429.088 8513.7 100 锁质量
440.299 390.4 4.59
444.331 564.9 6.64
447.097 956.6 11.24
569.338 464.6 5.46
633.34 583.9 6.86
672.315 1102.2 12.95
673.32 553.5 6.5
689.34 1439.5 16.91 y6
690.341 1046.5 12.29
802.423 361.6 4.25
803.441 345.9 4.06
879.49 331.4 3.89
965.49 535 6.28
966.489 780.7 9.17 y8
1077.54 329 3.86
1094.535 401.4 4.71 y9
1095.531 555.8 6.53
1096.533 392.6 4.61
1177.547 395.8 4.65
1178.572 1767.3 20.76 y10
1234.62 352.4 4.14
1276.628 424.4 4.98 y11
1277.64 1666.4 19.57
1278.624 563.2 6.62
1389.747 559.1 6.57
1390.721 1760.9 20.68 [M+H-iTRAQ]
1391.733 473.2 5.56
表17：iTRAQ-LVM(ox)EYLPSGC(实施例1)LR MS/MS谱的前40个最高离子强度的峰
m/z 离子强度 相对强度 离子
115.107 3035.7 58.12 iTRAQ
116.111 936.9 17.94 iTRAQ
136.076 5223.1 100
145.107 1095.1 20.97
175.119 888.5 17.01
230.195 480.1 9.19
252.65 372.4 7.13
258.191 1328.4 25.43 b1
285.174 492.4 9.43
321.158 378.3 7.24
340.987 334.7 6.41
357.259 1715.5 32.85
409.155 1177.8 22.55
429.088 5148.8 98.58 锁质量
433.155 800 15.32
440.297 838.7 16.06
447.099 629.7 12.06
503.743 639 12.23
504.294 2309.4 44.21 b3
505.298 523 10.01
569.34 1300.4 24.9
570.341 504.3 9.66
605.345 742.1 14.21
622.232 529.6 10.14
633.338 3013.1 57.69
634.341 1088.4 20.84
691.288 412.3 7.89
732.405 306.7 5.87
796.41 433.6 8.3
805.358 304.8 5.83
822.4 762.3 14.59 y4
909.426 2328.5 44.58 y5
910.429 1009.9 19.33
911.428 311.6 5.97
989.455 656.6 12.57
990.454 546.8 10.47
1006.479 4902.3 93.86 y6
1007.481 3551.7 68
1008.481 642.4 12.3
1119.566 408.2 7.81 y7
Figure IDA0000487894270000011
Figure IDA0000487894270000021
Figure IDA0000487894270000031
Figure IDA0000487894270000041

Claims (24)

1.式(I)化合物或其药学上可接受的盐
Figure FDA0000487894170000011
其中
R是H或F；
ZA和ZB独立地选自CH、和N；
环A是苯基、萘基、芳香5至6元杂环基、或芳香9至11元杂双环基，其中环A任选被一个或多个R1取代；
每个R1独立地为卤素、CN、C(O)OR2、OR2、C(O)R2、C(O)N(R2R2a)、S(O)2N(R2R2a)、S(O)N(R2R2a)、S(O)2R2、S(O)R2、N(R2)S(O)2N(R2aR2b)、N(R2)S(O)N(R2aR2b)、SR2、N(R2R2a)、NO2、OC(O)R2、N(R2)C(O)R2a、N(R2)S(O)2R2a、N(R2)S(O)R2a、N(R2)C(O)N(R2aR2b)、N(R2)C(O)OR2a、OC(O)N(R2R2a)、T1、C1-6烷基、C2-6烯基、或C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R3取代；
R2、R2a、R2b独立地选自H、T1、C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R3取代；
R3是卤素、CN、C(O)OR4、OR4、C(O)R4、C(O)N(R4R4a)、S(O)2N(R4R4a)、S(O)N(R4R4a)、S(O)2R4、S(O)R4、N(R4)S(O)2N(R4aR4b)、N(R4)S(O)N(R4aR4b)、SR4、N(R4R4a)、NO2、OC(O)R4、N(R4)C(O)R4a、N(R4)S(O)2R4a、N(R4)S(O)R4a、N(R4)C(O)N(R4aR4b)、N(R4)C(O)OR4a、OC(O)N(R4R4a)、或T1；
R4、R4a、R4b独立地选自H、T1、C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；
T1是C3-7环烷基、饱和的4至7元杂环基、或饱和的7至11元杂双环基，其中T1任选被一个或多个相同或不同的R10取代；
Y是(C(R5R5a))n；
n是0、1、2、3或4；
R5、R5a独立地选自H、和未取代的C1-6烷基；或连接形成氧代(=O)；
任选地，R5、R5a连接形成未取代的C3-7环烷基；
X1是C(R6)或N、X2是C(R6a)或N、X3是C(R6b)或N、X4是C(R6c)或N、X5是C(R6d)或N，条件是最多两个X1、X2、X3、X4、X5是N；
R6、R6a、R6b、R6c、R6d独立地选自R6e、H、卤素、CN、C(O)OR7、OR7、C(O)R7、C(O)N(R7R7a)、S(O)2N(R7R7a)、S(O)N(R7R7a)、S(O)2R7、S(O)R7、N(R7)S(O)2N(R7aR7b)、N(R7)S(O)N(R7aR7b)、SR7、N(R7R7a)、NO2、OC(O)R7、N(R7)C(O)R7a、N(R7)S(O)2R7a、N(R7)S(O)R7a、N(R7)C(O)N(R7aR7b)、N(R7)C(O)OR7a、OC(O)N(R7R7a)、T2、C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R11取代；条件是一个R6、R6a、R6b、R6c、R6d是R6e；
R6e是N(R7)C(O)C(R11a)=C(R11bR11c)、N(R7)S(O)2C(R11a)=C(R11bR11c)、或N(R7)C(O)C≡C(R11a)；
任选地一对R6/R6a或R6a/R6b连接形成环T3；
R7、R7a、R7b独立地选自H、T2、C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R8取代；
R8是卤素、CN、C(O)OR9、OR9、C(O)R9、C(O)N(R9R9a)、S(O)2N(R9R9a)、S(O)N(R9R9a)、S(O)2R9、S(O)R9、N(R9)S(O)2N(R9aR9b)、N(R9)S(O)N(R9aR9b)、SR9、N(R9R9a)、NO2、OC(O)R9、N(R9)C(O)R9a、N(R9)S(O)2R9a、N(R9)S(O)R9a、N(R9)C(O)N(R9aR9b)、N(R9)C(O)OR9a、OC(O)N(R9R9a)、或T2；
R9、R9a、R9b独立地选自H、T2、C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R12取代；
R10是卤素、CN、C(O)OR13、OR13、氧代(=O)，其中该环至少部分饱和、C(O)R13、C(O)N(R13R13a)、S(O)2N(R13R13a)、S(O)N(R13R13a)、S(O)2R13、S(O)R13、N(R13)S(O)2N(R13aR13b)、N(R13)S(O)N(R13aR13b)、SR13、N(R13R13a)、NO2、OC(O)R13、N(R13)C(O)R13a、N(R13)S(O)2R13a、N(R13)S(O)R13a、N(R13)C(O)N(R13aR13b)、N(R13)C(O)OR13a、OC(O)N(R13R13a)、C1-6烷基、C2-6烯基、或C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R14取代；
R13、R13a、R13b独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R14取代；
R11、R12独立地选自卤素、CN、C(O)OR15、OR15、C(O)R15、C(O)N(R15R15a)、S(O)2N(R15R15a)、S(O)N(R15R15a)、S(O)2R15、S(O)R15、N(R15)S(O)2N(R15aR15b)、N(R15)S(O)N(R15aR15b)、SR15、N(R15R15a)、NO2、OC(O)R15、N(R15)C(O)R15a、N(R15)S(O)2R15a、N(R15)S(O)R15a、N(R15)C(O)N(R15aR15b)、N(R15)C(O)OR15a、OC(O)N(R15R15a)、和T2；
R11a、R11b、R11c独立地选自H、卤素、CN、OR15、C(O)N(R15R15a)、和C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的R14取代；
R15、R15a、R15b独立地选自H、T2、C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；
R14是卤素、CN、C(O)OR16、OR16、C(O)R16、C(O)N(R16R16a)、S(O)2N(R16R16a)、S(O)N(R16R16a)、S(O)2R16、S(O)R16、N(R16)S(O)2N(R16aR16b)、N(R16)S(O)N(R16aR16b)、SR16、N(R16R16a)、NO2、OC(O)R16、N(R16)C(O)R16a、N(R16)S(O)2R16a、N(R16)S(O)R16a、N(R16)C(O)N(R16aR16b)、N(R16)C(O)OR16a、或OC(O)N(R16R16a)；
R16、R16a、R16b独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；
T2是苯基、萘基、茚基、茚满基、C3-7环烷基、4至7元杂环基、或7至11元杂双环基，其中T2任选被一个或多个相同或不同的R17取代；
T3是苯基、C3-7环烷基、或4至7元杂环基，其中T3任选被一个或多个相同或不同的R18取代；
R17、R18独立地选自卤素、CN、C(O)OR19、OR19、氧代(=O)，其中该环至少部分饱和、C(O)R19、C(O)N(R19R19a)、S(O)2N(R19R19a)、S(O)N(R19R19a)、S(O)2R19、S(O)R19、N(R19)S(O)2N(R19aR19b)、N(R19)S(O)N(R19aR19b)、SR19、N(R19R19a)、NO2、OC(O)R19、N(R19)C(O)R19a、N(R19)S(O)2R19a、N(R19)S(O)R19a、N(R19)C(O)N(R19aR19b)、N(R19)C(O)OR19a、OC(O)N(R19R19a)、C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R20取代；
R19、R19a、R19b独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的R20取代；
R20是卤素、CN、C(O)OR21、OR21、C(O)R21、C(O)N(R21R21a)、S(O)2N(R21R21a)、S(O)N(R21R21a)、S(O)2R21、S(O)R21、N(R21)S(O)2N(R21aR21b)、N(R21)S(O)N(R21aR21b)、SR21、N(R21R21a)、NO2、OC(O)R21、N(R21)C(O)R21a、N(R21)S(O)2R21a、N(R21)S(O)R21a、N(R21)C(O)N(R21aR21b)、N(R21)C(O)OR21a、或OC(O)N(R21R21a)；
R21、R21a、R21b独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基，其中C1-6烷基、C2-6烯基、和C2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
2.权利要求1的化合物，其中在式(I)中，环A、ZA、ZB被定义以得到式(Ia)
Figure FDA0000487894170000041
其中环A是芳香5元杂环，其中Z1、Z2和Z3独立地选自C(R1)、N、N(R1)、O和S，条件是至少一个Z1、Z2、Z3是N；且其中R、Y、X1至X5和R1如权利要求1所定义。
3.权利要求1的化合物，其中在式(I)中，环A、ZA、ZB、R被定义以得到式(Ib)
Figure FDA0000487894170000051
其中环A是5元芳香杂环，其中Z1、Z2和Z3独立地选自C(R1)、N、N(R1)、O和S，条件是至少一个Z1、Z2、Z3是N；且其中Y、X1至X5和R1如权利要求1所定义。
4.权利要求1的化合物，其中在式(I)中，环A、ZA、ZB被定义以得到式(Ic)
Figure FDA0000487894170000052
其中环A是芳香的5元杂环，其中Z1、Z2、Z3和Z4独立地选自C(R1)、N、N(R1)、O和S，条件是至少一个Z1、Z2、Z3、Z4是N或N(R1)；且其中R、Y、X1至X5和R1如权利要求1所定义。
5.权利要求1的化合物，其中在式(I)中，A、ZA、ZB被定义以得到式(Id)
Figure FDA0000487894170000061
其中在环A中，Z1是C(R1)或N、Z2是C(R1)或N、Z3是C(R1)或N、Z4是C(R1)或N、Z5是C(R1)或N，条件是最多两个Z1、Z2、Z3、Z4、Z5是N；
任选地两个相邻的R1与包括Z1至Z5的环连接共同形成芳香双环T0；
T0是芳香的9至11元杂双环基、萘基、茚基、或茚满基，其中T0任选被一个或多个相同或不同的R1a取代；
R1a是卤素、CN、C(O)OR2、OR2、氧代(=O)，其中所述环至少部分饱和、C(O)R2、C(O)N(R2R2a)、S(O)2N(R2R2a)、S(O)N(R2R2a)、S(O)2R2、S(O)R2、N(R2)S(O)2N(R2aR2b)、N(R2)S(O)N(R2aR2b)、SR2、N(R2R2a)、NO2、OC(O)R2、N(R2)C(O)R2a、N(R2)S(O)2R2a、N(R2)S(O)R2a、N(R2)C(O)N(R2aR2b)、N(R2)C(O)OR2a、OC(O)N(R2R2a)、T1、或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的R3取代；和
其中R、R1、R2、R2a、R2b、R3、Y、X1至X5和R1如权利要求1所定义。
6.权利要求1至5任一项的化合物，其中R是H。
7.权利要求1至6任一项的化合物，其中Y是CH2。
8.权利要求1至7任一项的化合物，其中没有或有一个R6、R6a、R6b、R6c、R6d是N。
9.权利要求1至8任一项的化合物，其中R6、R6a、R6b、R6c、R6d独立地选自R6e、H、卤素、和C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代，条件是一个R6、R6a、R6b、R6c、R6d是R6e。
10.权利要求1至9任一项的化合物，其中R7、R11a、R11b、R11c独立地选自H、和C1-4烷基，其中C1-4烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
11.权利要求1至10任一项的化合物，其中R6a是R6e。
12.权利要求1至11任一项的化合物，其中R6e是NHC(O)CH=CH2、NHC(O)C(CH3)=CH2、NHC(O)CH=C(CH3)2、NHS(O)2CH=CH2、或NHC(O)C≡CH。
13.权利要求1至12任一项的化合物，其中环A是吡唑、
Figure FDA0000487894170000071
唑、异唑、***、苯基或吡啶基环。
14.权利要求1至13任一项的化合物，其中0、1或2个相同或不同的R1不是H。
15.权利要求1至14任一项的化合物，其中R1是C1-4烷基，其任选被1或2个相同或不同的R3取代。
16.权利要求1至15任一项的化合物，其中R3是卤素、CN、OR4、C(O)N(R4R4a)、或C(O)T1。
17.权利要求1至16任一项的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物选自
N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酰胺；
N-(2-氟-5-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酰胺；
N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)丙炔酰胺；
N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)乙烯磺酰胺；
N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)甲基丙烯酰胺；
3-甲基-N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)丁-2-烯酰胺；
N-(3-((2-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)苯基)乙烯磺酰胺；
N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酰胺；
N-(3-((2-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)苯基)丙烯酰胺；和
N-(3-((6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酰胺。
18.药物组合物，其包含权利要求1至17任一项的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体，任选地组合一种或多种其它药物组合物。
19.用作药物的权利要求1至17任一项的化合物或其药学上可接受的盐。
20.权利要求1至17任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其用在治疗或预防与JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC相关的疾病或病症的方法中。
21.权利要求1至17任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其用在治疗或预防免疫性、炎性、自身免疫性或变应性病症或疾病或移植排斥或移植物抗宿主病的方法中。
22.权利要求1至17任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其用在治疗或预防增生性疾病的方法中。
23.权利要求1至17任一项的化合物或其药学上可接受的盐用于制备治疗或预防与JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC相关的疾病和病症的药物中的用途。
24.一种用于在需要其的哺乳动物患者中治疗、控制、延迟或预防一种或多种选自与JAK3、BTK、BLK、ITK或TEC相关的疾病或病症的病状的方法，其中该方法包括对所述患者给予治疗有效量的权利要求1至17任一项的化合物或其药学上可接受的盐。
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