ES2318616T3 - Metodos para la identificacion de moleculas que interactuan con zap-70 y para la purificacion de zap-70. - Google Patents
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Abstract
Un método para la identificación de un compuesto que interactúa con ZAP-70, que comprende las etapas de: a) proveer una preparación de proteína que contenga ZAP-70 fosforilada, b) poner en contacto la preparación de la proteína con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)- 1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada sobre un soporte sólido bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6 -dicloro-fenil)- 1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona, c) incubar el complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil- 1H-[1,6]naftiridin-2-ona con un compuesto dado, y d) determinar si el compuesto es capaz de separar a ZAP-70 fosforilada de la 7-(4-Aminometil-fenilamino)- 3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada.
Description
Métodos para la identificación de moléculas que
interactúan con ZAP-70 y para la purificación de
ZAP-70.
La presente invención se relaciona con métodos
para la identificación de moléculas que interactúan con
ZAP-70 y para la purificación de
ZAP-70 utilizando al ligando 24
aminopirido-pirimidina como un ligando para
ZAP-70. Además, la presente invención se relaciona
con composiciones farmacéuticas que incluyen a dichas moléculas que
interactúan, por ejemplo para el tratamiento de enfermedades
mediadas por células T tal como una enfermedad autoinmune,
inflamación y rechazo de trasplante.
Las proteínas quinasas participan en los eventos
de señalización que controlan la activación, el crecimiento y la
diferenciación de las células en respuesta a mediadores
extracelulares o a estímulos tales como factores de crecimiento,
citoquinas o quemoquinas. En general, estas quinasas se clasifican
en dos grupos, aquellas que preferencialmente fosforilan residuos
de cisteína y aquellas que preferencialmente fosforilan residuos de
serina y/o de treonina. Las tirosinas quinasas incluyen receptores
del factor de crecimiento que se extienden por la membrana tal como
el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y quinasas
citosólicas no receptoras tales como Src, Syk o
ZAP-70.
La actividad inapropiadamente alta de la
proteína quinasa está involucrada en muchas enfermedades incluido
cáncer y trastornos inflamatorios. Esto puede ser causado ya sea
directa o indirectamente por la falla de los mecanismos de control
debido a mutación, sobreexpresión o activación inapropiada de la
enzima. En todos estos casos, se espera que la inhibición selectiva
de la quinasa tenga un efecto benéfico.
Las proteínas tirosina quinasas -tanto las
tirosina quinasas receptoras como las quinasas no receptoras- son
esenciales para la activación y proliferación de las células del
sistema inmune. Entre los primeros eventos detectables por la
activación del inmunoreceptor en mastocitos, células T y células
está la estimulación de las tirosina quinasas no receptoras. Los
receptores inmunes tales como el receptor de alta afinidad para IgE
(Fc\varepsilonRI), el receptor del antígeno de células T (TCR) y
el receptor de células B, consisten de subunidades de enlazamiento
de antígeno y de subunidades de transducción de señal. La cadena de
transducción de señal contiene una o más copias de motivos de
activación en inmunoreceptores basados en tirosina (los ITAMS).
Para la activación de TCR, se fosforilan los ITAMS localizados en la
molécula CD3 por medio de Lck y Fyn, dos tirosina quinasas de la
familia Scr, seguido por reclutamiento y activación de
ZAP-70, un miembro de la familia Syk de tirosina
quinasas. Estas tirosina quinasas activadas fosforilan luego
secuencia abajo a moléculas adaptadoras tales como LAT (enlazador
para activación de células T) y SLP-76 (proteína del
leucocito que contiene al dominio SH2 de 76 kDa). Esta etapa
conduce a la activación de múltiples moléculas de señalización
secuencia abajo tales como la quinasa inducible de células T (ITK),
PLC\gamma1 y quinasa PI3 (Wong, 2005, Current Option in
Pharmacology 5, 1-8).
ZAP-70 (proteína asociada a zeta
de 70 kDa) pertenece a la familia Syk de tirosina quinasas y está
asociada con la subunidad zeta del receptor de células T (Chan y
colaboradores, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
9166-9170; Weiss, 1993, Cell 73,
209-212). ZAP-70 se expresa ante
todo en células T y en células Asesinas Naturales (NK) y juega un
papel esencial en la señalización a través del TCR. La activación
mediada por el TCR de las células T es crucial para la respuesta
inmune. La falla para regular adecuadamente la activación de las
células T puede conducir a enfermedades alérgicas y autoinmunes. Por
lo tanto, se considera a ZAP-70 como un objetivo
atractivo para el desarrollo de agentes inmunosupresores para
enfermedades mediadas por células T.
Se han reportado diferentes aproximaciones para
la identificación de inhibidores selectivos de
ZAP-70. Vu sugiere el diseño y la síntesis con base
en la estructura de antagonistas de los dominios en tándem de
homología 2 de Src (SH2) de ZAP-70 (Vu, 2000, Curr.
Med. Chem. 7(10), 1081-1100). Nishikawa
seleccionó una biblioteca del péptido por la habilidad para
enlazarse a ZAP-70 e identificó un péptido que
inhibió la actividad de la quinasa ZAP por competición con
sustratos de proteína (Nishikawa y colaboradores, 2000, Molecular
Cell 6, 969-974). Moffat utilizó un ensayo de la
quinasa ZAP-70 con el sustrato no fisiológico
poliGluTyr para identificar inhibidores de ZAP-70
(Moffat y colaboradores, 1999, Bioorg. Med. Chem. Letters 9,
3351-3356). Además, se reportó y sugirió la
estructura tridimensional del dominio de la quinasa
ZAP-70 en complejo con Estaurosporina como base
para el diseño con base en la estructura de los inhibidores (Jin y
colaboradores, 2004, J. Biol. Chem. 279(41),
42818-42825).
Annis, D. A., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126,
15495-15503 describe técnicas de espectrometría de
masas de selección por afinidad para la selección de alto
rendimiento del ligando de la proteína para la utilización
ZAP-70 usando enlazamiento competitivo de diferentes
ligandos.
Aunque ZAP-70 y su papel en la
señalización del TCR ya fue descubierta en 1991 (Chan y
colaboradores, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
9166-9170) y poco después reconocida como un
objetivo lógico para un fármaco para enfermedades mediadas por
células T, no se ha aprobado aún como fármaco los inhibidores de
ZAP-70. Una razón para el fracaso en la
identificación y desarrollo de inhibidores selectivos de
ZAP-70 es la carencia de métodos de ensayo
efectivos para identificar compuestos que interactúen con la forma
fisiológica de ZAP-70 como ocurre en las células T
activadas.
En vista de lo anterior, existe la necesidad de
proveer métodos efectivos para la identificación de los compuestos
que interactúan con ZAP-70 así como por métodos para
la purificación de ZAP-70.
Para cumplir con esta necesidad, la invención
provee en un primer aspecto un método para la identificación de un
compuesto que interactúa con ZAP-70, que comprende
las etapas de:
- a)
- proveer una preparación de proteína que contenga ZAP-70 fosforilada,
- b)
- poner en contacto la preparación de la proteína con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada sobre un soporte sólido bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona,
- c)
- incubar el complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona con un compuesto dado, y
- d)
- determinar si el compuesto es capaz de separar a ZAP-70 fosforilada de la 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada.
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En un segundo aspecto, la presente invención se
relaciona con un método para la identificación de un compuesto que
interactúa con ZAP-70, que comprende las etapas
de:
- a)
- proveer una preparación de proteína que contiene ZAP-70 fosforilada,
- b)
- poner en contacto a la preparación de la proteína con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada sobre un soporte sólido y con un compuesto dado bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona, y
- c)
- detectar al complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona formado en la etapa b).
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En un tercer aspecto, la invención provee un
método para la identificación de un compuesto que interactúa con
ZAP-70, que comprende las etapas de:
- a)
- proveer dos alícuotas de una preparación de una proteína que contiene ZAP-70 fosforilada,
- b)
- poner en contacto una alícuota con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada sobre un soporte sólido bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona,
- c)
- poner en contacto la otra alícuota con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada sobre un soporte sólido y con un compuesto dado bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona, y
- d)
- determinar la cantidad del complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona formado en las etapas b) y c).
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En un cuarto aspecto, la invención se relaciona
con un método para la identificación de un compuesto que interactúa
con ZAP-70, que comprende las etapas de:
- a)
- proveer dos alícuotas que contienen cada una al menos una célula que contiene ZAP-70 fosforilada,
- b)
- incubar una alícuota con un compuesto dado,
- c)
- recoger las células de cada alícuota,
- d)
- lisar las células con el propósito de obtener preparaciones de proteína,
- e)
- poner en contacto las preparación de proteína con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada sobre un soporte sólido bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona, y
- f)
- determinar la cantidad del complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona formado en cada alícuota en la etapa e).
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En el contexto de la presente invención, se ha
encontrado sorprendentemente que la
7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona
es un ligando de ZAP-70 que reconoce
preferiblemente ZAP-70 fosforilada (ver Figura 2).
Esto permite el uso de
7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona
en ensayos de detección, por ejemplo en ensayos competitivos de
detección así como en métodos para la purificación de
ZAP-70 fosforilada.
La estructura de la
7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona
también (ligando 24 de aminopirido-pirimidina) se
da en la Fig. 1. Este compuesto es un compuesto sustituido de
aminopirido-pirimidina. La
7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona
se puede acoplar en forma covalente a un material de soporte sólido
adecuado a través del grupo amino primario y ser usado para el
aislamiento de las proteínas de enlazamiento. La síntesis de
7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona
es descrita en el Ejemplo 1. De acuerdo con la invención, la
expresión
"7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona"
también incluye compuestos que tienen el núcleo idéntico pero que
tienen otro enlazador, preferiblemente acoplado al grupo amino no
siendo parte de las estructuras cíclicas, para enlazamiento con el
soporte sólido. Típicamente, los enlazadores tienen una columna
vertebral de 8, 9 ó 10 átomos. Los enlazadores pueden contener ya
sea un grupo carboxi, hidroxi o amino activo.
De acuerdo con la presente invención, la
expresión "ZAP-70" no significa únicamente la
proteína humana como la mostrada en la Figura 4, sino también un
derivado funcionalmente activo de la misma, o un homólogo de la
misma, o una variante codificada por un ácido nucleico que hibrida
hasta el ácido nucleico que codifica dicha proteína bajo
condiciones poco rigurosas. Preferiblemente, estas condiciones poco
rigurosas incluyen hibridación en un búfer que contiene 35% de
formamida, 5X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5
mM, 0,02% de PVP, 0,02% de BSA, 100 ug/ml de ADN desnaturalizado de
esperma de salmón, y 10% de sulfato de dextrano (p/v) durante
18-20 horas a 40ºC, lavando en un búfer que consiste
de 2X SSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM, y
0,1% de SDS durante 1-5 horas a 55ºC, y lavando en
un búfer que consiste de 2X SSC, Tris-HCl 25 mM (pH
7,4), EDTA 5 mM, y 0,1% de SDS durante 1,5 horas a 60ºC.
En algunos aspectos de la invención, se provee
primero una preparación de proteína que contiene
ZAP-70 fosforilada. Los métodos de la presente
invención se pueden llevar a cabo con cualquier preparación de
proteína como material de partida, siempre y cuando se solubilice
ZAP-70 fosforilada en la preparación. Los ejemplos
incluyen una mezcla líquida de varias proteínas, un lisado celular,
un lisado celular parcial que no contiene todas las proteínas
presentes en la célula original o una combinación con varios lisados
de células.
La presencia de una especie de proteína
ZAP-70 fosforilada en una preparación de proteína de
interés se puede detectar sobre transferencias Western sondeadas
con anticuerpos que están específicamente dirigidos contra sitios
de fosforilación de ZAP-70, por ejemplo residuos
fosforilados de tirosina en las posiciones 126, 292, 319, 492 ó 493
(Watts y colaboradores, 1994, The Journal of Biological Chemistry
269(4), 29520-29529). Se pueden utilizar
también anticuerpos dirigidos contra serina o treonina fosforilada.
Tales anticuerpos fosfoespecíficos
anti-ZAP-70 se pueden obtener con
proveedores comerciales (por ejemplo, Upstate o Cell Signaling). El
uso de tales anticuerpos anti-fosfo junto con
análisis de transferencias Western para detectar
ZAP-70 fosforilada has sido descritos (Houtman y
colaboradores, 2005, The Journal of
Immunology-175(4),
2449-2458).
Se pueden obtener lisados de células o lisados
parciales de células por medio del aislamiento de organelos
celulares (por ejemplo núcleos, mitocondrias, ribosomas, Golgi etc.)
antes y después de la preparación de preparaciones de proteína
derivadas de esos organelos. Los métodos para el aislamiento de
organelos celulares son conocidos en el arte (Capítulo 4.2
Purificación de Organelos a partir de Células de Mamífero en
"Current Protocols in Protein Science", Editors: John.E.
Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T.
Wingfield; Wiley, ISBN:
0-471-14098-8).
Además, se pueden preparar preparaciones de
proteína por medio de fraccionamiento de extractos celulares
enriqueciendo así tipos específicos de proteínas tales como
proteínas citoplasmáticas o proteínas de membrana (Capítulo 4.3
Fraccionamiento Subcelular de Células de Cultivo de Tejido en
"Current Protocols in Protein Science", Editors: John.E.
Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T.
Wingfield; Wiley, ISBN:
0-471-14098-8).
Se pueden utilizar preparaciones adicionales de
proteína de fluidos corporales (por ejemplo, sangre, fluido
cerebroespinal, fluido peritoneal y orina).
Por ejemplo, se pueden utilizar lisados de
embriones completos derivados de etapas definidas de desarrollo o
etapas adultas de organismos modelo tales como C. elegans.
Además, órganos completos tales como corazones diseccionados de
ratones pueden ser la fuente de preparaciones de proteína. Estos
órganos pueden ser también sometidos a perfusión in vitro
con el propósito de obtener una preparación de proteína.
Además, la preparación de proteína puede ser una
preparación que contiene ZAP-70 fosforilada que ha
sido producida en forma recombinante. Los métodos para la
producción de proteínas recombinantes en células procariotas y
eucariotas están ampliamente establecidos (Capítulo 5, Producción de
Proteínas Recombinantes en "Current Protocols in Protein
Science", Editors: John. E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L.
Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield; Wiley, 1995, ISBN:
0-471-14098-8).
En modalidades preferidas de los métodos de la
invención, la provisión de preparaciones de proteína incluye las
etapas de recolectar al menos una de las células que contiene
ZAP-70 fosforilada y lisar la célula.
La proteína ZAP-70 se expresa
preferencialmente en linfocitos T y en células Asesinas Naturales
(NK). Por consiguiente, las células aisladas a partir de sangre
periférica representan un material biológico adecuado. Los
procedimientos para la preparación y el cultivo de linfocitos
humanos y de subpoblaciones de linfocitos obtenidas a partir de
sangre periférica (PBL) son ampliamente conocidos (W. E. Biddison,
Capítulo 2.2 "Preparation and culture of human lymphocytes" en
Current Protocols in Cell Biology, 1998, John Wiley & Sons,
Inc.). Por ejemplo, la centrifugación en gradiente de densidad es
un método para la separación de linfocitos a partir de otras
poblaciones de células sanguíneas (por ejemplo, eritrocitos y
granulocitos). Las subpoblaciones de linfocitos humanos se pueden
aislar a través de sus receptores específicos de la superficie de la
célula que pueden ser reconocidos por anticuerpos monoclonales. El
método de separación física involucra el acoplamiento de estos
reactivos anticuerpos con cuentas magnéticas que permiten el
enriquecimiento de células que son enlazadas por estos anticuerpos
(selección positiva). Las células de linfocito aisladas pueden ser
además cultivadas y estimuladas por medio de la adición de
anticuerpos dirigidos contra el receptor de células T o coreceptores
tales como CD-3 para iniciar la señalización del
receptor de células T y posteriormente la fosforilación de
ZAP-70 (Houtman y colaboradores, 2005, The Journal
of Immunology 175(4), 2449-2458).
Como una alternativa a las líneas celulares
cultivadas de células humanas primarias (por ejemplo, células
Jurkat) se pueden utilizar y estimular en forma análoga con
anticuerpos anti-CD3 para obtener
ZAP-70 fosforilada (Kim y White, 2006, The Journal
of Immunology 176(5): 2833-2843).
Alternativamente, también es posible incubar
dichos linfocitos o líneas celulares con inhibidores de fosfatasa
con el propósito de mantener a ZAP-70 en su estado
fosforilado. Tales métodos son conocidos en el arte (D. C. Weiser y
S. Shenolikar, Capítulo 18.10 en Current Protocols in Molecular
Biology, 2003, John Wiley & Sons, Inc.).
En una modalidad preferida, la célula es parte
de un sistema de cultivo celular y los métodos para la recolección
de una célula fuera del sistema de cultivo celular son conocidos en
el arte (ver literatura más arriba).
La escogencia de la célula dependerá
principalmente de la expresión de ZAP-70, ya que se
debe garantizar que la proteína está presente principalmente en la
célula escogida. Con el propósito de determinar si una célula dada
es un sistema de partida adecuado para los métodos de la invención,
pueden ser adecuados métodos tales como el de transferencias
Western, métodos para la detección de ácidos nucleicos con base en
PCR, métodos de microarreglos de ADN y de transferencias Northern
("chips de ADN") con el propósito de determinar si una proteína
dada de interés está presente en la célula.
La escogencia de la célula puede estar
influenciada también por el propósito del estudio. Si necesita
analizarse la eficacia in vivo para un fármaco dado entonces
se pueden seleccionar las células o los tejidos en los cuales tiene
lugar el efecto terapéutico deseado (por ejemplo, células T, células
NK o células CLL positivas para ZAP-70). Por el
contrario, para la elucidación de las proteínas objetivo que median
los efectos secundarios no deseados, se puede analizar la célula o
el tejido en el cual se observan los efectos secundarios (por
ejemplo, médula ósea, timo).
Además, está previsto dentro de la presente
invención que se puede obtener la célula que contiene
ZAP-70 fosforilada a partir de un organismo, por
ejemplo, por medio de una biopsia. Los métodos correspondientes son
conocidos en el arte. Por ejemplo, una biopsia es un procedimiento
de diagnóstico utilizado para obtener una pequeña cantidad de
tejido, que puede ser examinado luego al microscopio o con métodos
bioquímicos. Las biopsias son importantes no solamente para
diagnosticar, clasificar y conocer la fase en que se encuentra una
enfermedad, sino también para evaluar y vigilar el tratamiento
farmacológico.
Está incluido dentro de la presente invención
que por medio de la recolección de al menos una célula, se lleve a
cabo simultáneamente la lisis. Sin embargo, se prefiere igualmente
que la célula sea primero recogida y luego lisada en forma
separada.
Los métodos para la lisis de células son
conocidos en el arte (Karwa y Mitra: Sample preparation for the
extraction, isolation, and purification of Nuclei Acids; capítulo 8
en "Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry",
Wiley 2003, Editor: Somenath Mitra, ISBN impreso: 0471328456; ISBN
en línea: 0471457817). La lisis de diferentes tipos de células y de
tejidos se puede lograr por medio de homogenizadores (por ejemplo,
el homogenizador de Potter), desintegradores ultrasónicos, lisis
enzimática, detergentes (por ejemplo, NP-40, Triton
X-100, CHAPS, SDS), choque osmótico, procesos
repetidos de congelación y descongelación, o una combinación de
estos métodos.
De acuerdo con los métodos de la invención, se
pone en contacto a la preparación de la proteína que contiene
ZAP-70 fosforilada con el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina inmovilizado sobre un soporte
sólido bajo condiciones que permitan la formación del complejo de
ZAP-70 fosforilada con el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina.
En la presente invención, el término un
"complejo de ZAP-70 fosforilada con el ligando 24
de aminopirido-pirimidina" se refiere a un
complejo en donde el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina interactúa con
ZAP-70, por ejemplo, por medio de un enlace
covalente, o, más preferiblemente, por medio de un enlace no
covalente.
\newpage
La persona capacitada sabrá que condiciones se
pueden aplicar con el propósito de permitir la formación del
complejo de ZAP-70 fosforilada con el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina.
En el contexto de la presente invención, el
término "bajo condiciones que permitan la formación del
complejo" incluye todas las condiciones bajo las cuales es
posible tal formación, preferiblemente tal enlazamiento. Esto
incluye la posibilidad de tener el soporte sólido sobre una fase
inmovilizada y verter el lisado sobre él. En otra modalidad
preferida, también está incluido que el soporte sólido esté en forma
de partículas y mezclado con el lisado celular.
En el contexto del enlazamiento no covalente, el
enlazamiento entre el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina y ZAP-70
fosforilada es, por ejemplo, a través de puentes salinos, puentes de
hidrógeno, interacciones hidrófobas o una combinación de los
mismos.
En una modalidad preferida, las etapas de la
formación del complejo de ZAP-70 fosforilada con el
ligando 24 de aminopirido-pirimidina se llevan a
cabo bajo condiciones esencialmente fisiológicas. El estado físico
de la proteínas dentro de las células está descrito en Petty, 1998
(Howard R. Petty1, Capítulo 1, Unidad 1.5 en: Juan S. Bonifacino,
Mary Dasso, Joe B. Harford, Jennifer
Lippincott-Schwartz, y Kenneth M. Yamada (eds.)
Current Protocols in Cell Biology Copyright © 2003 John
Wiley & Sons, Inc. All rights reserved. DOI:
10.1002/0471143030.cb0101s00. Fecha de Publicación en Línea: Mayo,
2001. Fecha de Publicación Impresa: Octubre, 1998).
El contacto bajo condiciones esencialmente
fisiológicas tiene la ventaja de que las interacciones entre el
ligando, la preparación de la célula (esto es, la enzima que va a
ser caracterizada) y opcionalmente el compuesto, reflejan de la
mejor manera posible las condiciones naturales. "Condiciones
esencialmente fisiológicas" son entre otras, aquellas
condiciones que están presentes en el material original no procesado
de la muestra. Ellas incluyen la concentración fisiológica de la
proteína, el pH, la concentración de sal, la capacidad amortiguadora
y las modificaciones postraduccionales de las proteínas
involucradas. El término "condiciones esencialmente
fisiológicas" no requiere de condiciones idénticas a aquellas en
el organismo viviente original, a partir del cual se deriva la
muestra, sino de condiciones esencialmente como la de la célula o
condiciones cercanas a las condiciones celulares. La persona
capacitada en el arte, desde luego, se dará cuenta que pueden surgir
ciertas limitaciones debido al montaje experimental que
eventualmente conducirán a condiciones menos parecidas a las de la
célula. Por ejemplo, la ruptura eventualmente necesaria de las
paredes celulares o de las membranas celulares cuando se toma y se
procesa una muestra de un organismo viviente puede requerir de
condiciones que no son idénticas a las condiciones fisiológicas
encontradas en el organismo. Las variaciones adecuadas de las
condiciones fisiológicas para la práctica de los métodos de la
invención serán evidentes para aquellos capacitados en el arte y
están abarcadas por el término "condiciones esencialmente
fisiológicas" como se lo utiliza aquí. En resumen, se debe
entender que el término "condiciones esencialmente
fisiológicas" se relaciona con condiciones cercanas a las
condiciones fisiológicas, como por ejemplo las encontradas en las
células naturales, pero no se requiere necesariamente que esas
condiciones sean idénticas.
Por ejemplo, "condiciones esencialmente
fisiológicas" pueden incluir NaCl o KCl 50-200
mM, pH 6,5-8,5, 20-45ºC y una
concentración de catión divalente de 0,001-10 mM
(por ejemplo, Mg^{++}, Ca^{++}); más preferiblemente
aproximadamente NaCl o KCl 150 mM, pH 7,2 a 7,6, una concentración
de catión divalente de 5 mM y a menudo incluye de 0,01 a 1,0
porciento de proteína no específica (por ejemplo, BSA). A menudo
puede estar presente un detergente no iónico (Tween,
NP-40, Triton-X100), usualmente
aproximadamente de 0,001 hasta 2%, típicamente
0,05-0,2% (volumen/volumen). Como guía general, se
pueden aplicar las siguientes condiciones acuosas amortiguadas:
NaCl 10-250 mM, Tris HCl 5-50 mM, pH
5-8, con la adición opcional de catión(es)
divalente(s) y/o de quelantes metálicos y/o de detergentes no
iónicos.
Preferiblemente, "condiciones esencialmente
fisiológicas" significa un pH de 6,5 hasta 7,5, preferiblemente
de 7,0 hasta 7,5, y/o una concentración de búfer de 10 hasta 50 mM,
preferiblemente de 25 hasta 50 mM, y/o una concentración de sales
monovalentes (por ejemplo, Na o K) de 120 hasta 170 mM,
preferiblemente 150 mM. Las sales divalentes (por ejemplo, Mg o Ca)
pueden estar presentes adicionalmente en una concentración de 1
hasta 5 mM, preferiblemente de 1 hasta 2 mM, en donde más
preferiblemente se selecciona el búfer del grupo que consiste de
Tris-HCl o HEPES.
En el contexto de la presente invención, se
inmoviliza al ligando 24 de aminopirido-pirimidina
sobre un soporte sólido. A través de toda la invención, el término
"soporte sólido" se relaciona con cada soporte no disuelto que
sea capaz de inmovilizar una pequeña molécula de ligando sobre su
superficie.
De acuerdo con una modalidad preferida
adicional, se selecciona el soporte sólido del grupo que consiste de
agarosa, agarosa modificada, bolitas de sefarosa (por ejemplo,
sefarosa activada con NHS), látex, celulosa, y partículas
ferromagnéticas o ferrimagnéticas.
Se puede acoplar el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina al soporte sólido ya sea en
forma covalente o en forma no covalente. El enlazamiento no
covalente incluye el enlazamiento a través del ligandos de afinidad
de biotina que se enlazan a matrices de estreptavidina.
Preferiblemente, el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina se acopla covalentemente con
el soporte sólido.
\newpage
Antes del acoplamiento, las matrices pueden
contener grupos activos tales como NHS, Carbodiimida, etc., para
permitir la reacción de acoplamiento con el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina. El ligando 24 de
aminopirido-pirimidina se puede acoplar al soporte
sólido por medio de acoplamiento directo (por ejemplo, utilizando
grupos funcionales tales como los grupos amino, sulfhidrilo,
carboxilo, hidroxilo, aldehído y cetona) y por medio de
acoplamiento indirecto (por ejemplo, a través de biotina, biotina
que está covalentemente unida a un ligando 24 de
aminopirido-pirimidina y enlazamiento no covalente
de biotina con estreptavidina que está unida directamente al soporte
sólido).
El enlazamiento al material sólido de soporte
puede involucrar enlazadores escindibles y no escindibles. Se puede
lograr la escisión por medio de rompimiento enzimático o por
tratamiento con métodos químicos adecuados.
Las interfaces preferidas de enlazamiento para
enlazar al ligando 24 de aminopirido-pirimidina a un
material sólido de soporte son enlazadores con una columna
vertebral de átomos de carbono. Típicamente los enlazadores tienen
una columna vertebral de 8, 9 ó 10 átomos. Los enlazadores contiene
ya sea a un grupo carboxilo o un grupo amino activo.
La persona capacitada se dará cuenta que entre
las etapas individuales de los métodos de la invención, pueden ser
necesarias etapas de lavado. Tal lavado es parte del conocimiento de
la persona capacitada en el arte. El lavado sirve para remover los
componentes no enlazados del lisado celular del soporte sólido. Las
interacciones no específicas de enlazamiento (por ejemplo, una
iónica simple) se pueden minimizar por medio de la adición de
niveles bajos de detergente o de por medio de ajustes moderados a
las concentraciones de sal en el búfer de lavado.
De acuerdo con los métodos de identificación de
la invención, el sistema de lectura es ya sea de detección o de
determinación de ZAP-70 fosforilada (primer aspecto
de la invención), la detección del complejo ZAP-70
fosforilada con el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina (segundo aspecto de la
invención), o la determinación de la cantidad del complejo
ZAP-70 fosforilada con el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina (segundo, tercero y cuarto
aspectos de la invención).
La detección del complejo ZAP-70
fosforilada con el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina de acuerdo con el segundo
aspecto de la invención se puede llevar a cabo por medio del uso de
anticuerpos marcados dirigidos contra ZAP-70
fosforilada y un sistema adecuado de lectura.
De acuerdo a una modalidad preferida del segundo
aspecto de la invención, se detecta el complejo
ZAP-70 fosforilada con el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina por medio de la determinación
de su cantidad.
En el trascurso del segundo, tercero y cuarto
aspectos de la invención se prefiere que se separe la
ZAP-70 fosforilada del ligando 24 de
aminopirido-pirimidina con el propósito de
determinar la cantidad del complejo ZAP-70
fosforilada con el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina.
De acuerdo con la invención, separación
significa cada acción que destruya las interacciones entre el
ligando 24 de aminopirido-pirimidina y la
ZAP-70 fosforilada. Esto incluye en una modalidad
preferida, la elución de la ZAP-70 fosforilada del
ligando 24 de aminopirido-pirimidina.
La elusión se puede lograr por medio del uso de
reactivos no específicos como se describe en detalle más abajo
(fuerza iónica, valor de pH, detergentes). Además se puede analizar
si un compuesto de interés puede eluir específicamente a la
ZAP-70 fosforilada del ligando 24 de
aminopirido-pirimidina. Tales compuestos que
interactúan con ZAP-70 son descritos adicionalmente
en las siguientes secciones.
Tales métodos no específicos para destruir la
interacción son principalmente conocidos en el arte y dependen de
la naturaleza de la interacción de la enzima con el ligando.
Principalmente, los cambios de fuerza iónica, del valor de pH, de
la temperatura o de la incubación con detergentes son métodos
adecuados para disociar las enzimas objetivo del ligando
inmovilizado. La aplicación de un búfer de elusión puede disociar a
los compañeros del enlace por medio de valores extremos de pH (pH
alto o bajo; por ejemplo, disminuyendo el pH por medio del uso de
citrato 0,1 M, pH 2-3), del cambio de fuerza iónica
(por ejemplo, alta concentración de sal utilizando NaI, KI,
MgCl_{2} o KCl), de agentes reductores de la polaridad que rompen
las interacciones hidrófobas (por ejemplo, dioxano o etilenglicol),
o de agentes de desnaturalización (sales caotrópicas o detergentes
tales como dodecil sulfato de sodio, SDS; Revisar: Subramanian A.,
2002, Immunoaffinity Chromatography).
En algunos casos, el soporte sólido tiene que
ser separado preferiblemente del material liberado. Los métodos
individuales para esto dependen de la naturaleza del soporte sólido
y son conocidos en el arte. Si el material de soporte está
contenido dentro de una columna se puede recolectar el material
liberado como un flujo directo de la columna. En el caso de que el
material de soporte esté mezclado con los componentes el lisado
(también llamado procedimiento por lotes) puede ser necesaria una
etapa adicional de separación tal como centrifugación suave y se
recolecta el material liberado como sobrenadante. Alternativamente
se pueden utilizar bolitas magnéticas como soporte sólido de tal
manera que se pueden eliminar las bolitas de la muestra por medio
del uso de un dispositivo magnético.
En la etapa d) del método de acuerdo con el
primer aspecto de la invención, se determina si la
ZAP-70 fosforilada ha sido separada del ligando 24
de aminopirido-pirimidina. Esto puede incluir la
detección de ZAP-70 fosforilada o la determinación
de la cantidad de ZAP-70 fosforilada.
Consecuentemente, al menos en modalidades
preferidas de todos los métodos de identificación de la invención,
se utilizan métodos para la detección de ZAP-70
fosforilada o para la determinación de su cantidad. Tales métodos
son conocidos en el arte e incluyen métodos fisicoquímicos tales
como secuenciación de proteína (por ejemplo, degradación de Edman),
métodos de análisis por medio de espectrometría de masas o métodos
de inmunodetección que emplean anticuerpos dirigidos contra
ZAP-70 fosforilada.
Preferiblemente, se detecta la
ZAP-70 fosforilada o se determina la cantidad de
ZAP-70 fosforilada por medio de espectrometría de
masas o por métodos de inmunodetección.
La identificación de proteínas por medio de
análisis espectrométrico de masas (espectrometría de masas) es
conocida en el arte (Shevchenko y colaboradores, 1996, Analytical
Chemistry 68: 850-858, (Mann y colaboradores, 2001,
Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry, Annual
Review of Biochemistry 70, 437-473) y está ilustrada
además en la sección d ejemplos.
Preferiblemente, el análisis por espectrometría
de masas se lleva a cabo en una forma cuantitativa, por ejemplo por
medio del uso de tecnología iTRAQ (etiquetas isobáricas para
cuantificación relativa y absoluta) o cCAT (etiquetas de afinidad
codificadas con isótopos escindibles) (Wu y colaboradores, 2006. J.
Proteome Res. 5, 651-658).
De acuerdo con una modalidad preferida adicional
de la presente invención, la caracterización por medio de
espectrometría de masas (MS) se realiza por medio de la
identificación de péptidos proteotípicos de ZAP-70
fosforilada. La idea es que se digiere ZAP-70
fosforilada con proteasas y se determinan los péptidos resultantes
por MS. Como resultado, las frecuencias de los péptidos para los
péptidos de la misma proteína fuente difieren en gran medida,
siendo llamados los péptidos más frecuentemente observados que
"típicamente" contribuyen a la identificación de esta proteína
"péptidos proteotípicos". Por lo tanto, un péptido proteotípico
como el utilizado en la presente invención es un péptido
experimentalmente fácilmente observable que únicamente identifica
una proteína específica o isoforma de proteína.
De acuerdo a una modalidad preferida, la
caracterización se realiza por medio de la comparación de los
péptidos proteotípicos obtenidos en el transcurso de la práctica de
los métodos de la invención con métodos proteotípicos conocidos. Ya
que, cuando se utilizan fragmentos preparados por medio de digestión
con una proteasa para la identificación de una proteína en MS,
usualmente se observan los mismos péptidos proteotípicos para una
enzima dada, es posible comparar los péptidos proteotípicos
obtenidos para una muestra dada con los péptidos proteotípicos ya
conocidos para enzimas de una clase dada de enzimas y por lo tanto
identificar la enzima que está presente en la muestra.
Como una alternativa para el análisis por
espectrometría de masas, se puede detectar la ZAP-70
fosforilada eluida (incluidos los compañeros de enlazamiento
eluidos conjuntamente o las proteínas de andamiaje) o se puede
determinar su cantidad por medio del uso de anticuerpos específicos
dirigidos contra la ZAP-70 fosforilada,
preferiblemente con un anticuerpo que reconoce una fosforilación de
Tirosina en la posición 493 de la ZAP-70
fosforilada. Tal anticuerpo es conocido en el arte (Tecnologías de
Señalización Celular, # 2704).
Ya que el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina reconoce preferencialmente a
la ZAP-70 fosforilada, es posible también utilizar
anticuerpos anti-ZAP-70 que
reconocen epítopos no fosforilados sobre ZAP-70.
Además, en otra modalidad preferida, una vez se
ha establecido la identidad del compañero de enlazamiento eluido
conjuntamente por medio de análisis de espectrometría de masas, se
puede detectar cada compañero de enlazamiento con anticuerpos
específicos dirigidos contra esta proteína.
Los ensayos con base en anticuerpos adecuados
incluyen pero no se limitan a transferencia Western, ensayos de
ELISA, ensayos sándwich de ELISA y arreglos de anticuerpos o una
combinación de los mismos. El establecimiento de tales análisis es
conocido en el arte (Capítulo 11, Immunology, páginas
11-1 hasta 11-30 en: Short
Protocols in Molecular Biology. Cuarta Edición, Editada por F. M.
Ausubel y colaboradores, Wiley, New York, 1999).
Estos ensayos se pueden configurar no únicamente
en una forma para detectar y cuantificar una proteína de interés
que interactúa con ZAP-70 (por ejemplo, otra quinasa
tal como LAT que es un sustrato de ZAP-70), sino
también para analizar patrones de modificación postraduccionales
tales como la modificación de la ubiquitina.
Además, los métodos de identificación de la
invención involucran el uso de compuestos que se prueban por su
habilidad para ser un compuesto que interactúa con
ZAP-70.
Principalmente, de acuerdo con la presente
invención, tal compuesto puede ser cada molécula que sea capaz de
interactuar con ZAP-70, por ejemplo, inhibiendo su
enlazamiento con el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina. Preferiblemente, el
compuesto tiene un efecto sobre ZAP-70, por ejemplo,
un efecto estimulador o inhibidor.
Preferiblemente, dicho compuesto se selecciona
del grupo que consiste de compuestos químicos de ocurrencia natural
o sintética o fármacos sintéticos orgánicos, más preferiblemente
moléculas pequeñas, fármacos orgánicos o compuestos naturales de
moléculas pequeñas. Preferiblemente, se identifica dicho compuesto
partiendo de una biblioteca que contiene tales compuestos. Luego,
en el transcurso de la presente invención, se selecciona tal
biblioteca.
Tales moléculas pequeñas de preferencia no son
proteínas o ácidos nucleicos. Preferiblemente, las moléculas
pequeñas exhiben un peso molecular de menos de 1000 Da, más
preferiblemente menos de 750 Da, lo más preferible menos de 500
Da.
Una "biblioteca" de acuerdo con la presente
invención se relaciona con una colección (la mayoría grandes) de
(numerosas) diferentes entidades químicas que son suministradas en
una forma clasificada que permite tanto un análisis funcional
rápido (detección) de las diferentes entidades individuales, como
proveer al mismo tiempo una identificación rápida de las entidades
individuales que forman la biblioteca. Los ejemplos son colecciones
de tubos o de pozos o de manchas sobre superficies que contienen
compuestos químicos que pueden ser añadidas dentro de reacciones
con uno o más patrones de interacción potencialmente definidos en
forma de alto rendimiento. Después de la identificación de una
interacción "positiva" deseada de ambos compañeros, se puede
identificar rápidamente el compuesto respectivo debido a la
construcción de la biblioteca. Las bibliotecas de origen sintético o
natural pueden o bien adquiridas o diseñadas por la persona
capacitada.
Los ejemplos de la construcción de bibliotecas
se encuentran, por ejemplo, en Breinbauer R, Manger M, Scheck M,
Waldmann H. Natural product guided compound library development.
Curr Med Chem. 2002 Dec. 9 (23): 2129-45, en donde
se describen productos naturales que son puntos de partida
biológicamente validados para el diseño de bibliotecas
combinatorias, ya que ellos tienen un registro probado de relevancia
biológica. Este papel especial de los productos naturales en
química médica y en biología química puede ser interpretado a la
luz de nuevos conocimientos profundos acerca de la arquitectura del
dominio de proteínas adquiridos a través de bioinformática y de
biología estructural. Con el propósito de satisfacer los
requerimientos específicos del bolsillo de enlazamiento individual
dentro de una familia de dominio puede ser necesario optimizar la
estructura del producto natural por medio de una variación química.
Se dice que la química en fase sólida se convertirá en una
herramienta eficiente para este proceso de optimización, y recientes
avances en este campo se destacan en este artículo de revista.
Otras referencias relacionadas incluyen Edwards P. J., Morrell A.
I. Solid-phase compound library synthesis in drug
design and development. Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 Jul; 5
(4): 594-605; Merlot C, Domine D, Church D. J.
Fragment analysis in small molecule discovery. Curr Opin Drug
Discov Devel. 2002 May; 5 (3): 391-9. Revista:
Goodnow R. A. Jr. Current practices in generation of small molecule
new leads. J Cell Biochem Suppl. 2001; Suppl 37:
13-21, que describe que el proceso actual de
descubrimiento de un fármaco en muchas compañías farmacéuticas
requiere de colecciones grandes y crecientes de alta calidad que
conducen a estructuras para uso en análisis de detección de alto
rendimiento. Las colecciones de moléculas pequeñas con diversas
estructuras y con propiedades "tipo fármaco" han sido
adquiridas, en el pasado, por diferentes medios: por medio del
archivo de esfuerzos internos previos que conducen a la
optimización, por medio de la adquisición a proveedores del
compuesto, y por medio de la unión de colecciones separadas después
de la fusión de las compañías. Aunque se describe a la química
combinatoria/de alto rendimiento por ser un importante componente
en el proceso de generación de nuevos candidatos, la selección de
diseños de bibliotecas para síntesis y el diseño posterior de
miembros de bibliotecas ha evolucionado hasta un nuevo nivel de
reto y de importancia. Los beneficios potenciales de la selección de
múltiples diseños de bibliotecas de compuestos de moléculas
pequeñas contra múltiples objetivos biológicos ofrecen una
oportunidad sustancial de descubrir nuevas estructuras
candidatas.
candidatas.
En una modalidad preferida del segundo aspecto
de la invención, se incuba primero ZAP-70
fosforilada con el compuesto y luego con el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina.
Preferiblemente, se incuba primero la
ZAP-70 fosforilada con el compuesto durante 10 a 60
minutos, más preferiblemente 30 a 45 minutos a una temperatura de
4ºC a 37ºC, más preferiblemente de 4ºC a 25ºC, lo más preferible de
4ºC. Preferiblemente, se utilizan los compuestos en concentraciones
en el rango desde 1 \muM hasta 1 mM, preferiblemente desde 10
hasta 100 \muM. La segunda etapa, poner en contacto con el ligando
inmovilizado, se lleva a cabo preferiblemente durante 10 a 60
minutos a 4ºC.
Además, las etapas a) hasta c) del segundo
aspecto de la invención se pueden llevar a cabo con varias
preparaciones de proteína con el propósito de analizar compuestos
diferentes. Esta modalidad es especialmente interesante en el
contexto de selecciones de medio o alto rendimiento (ver más
adelante).
En una modalidad preferida del método de la
invención de acuerdo con el tercero o cuarto aspecto, una cantidad
reducida del complejo de ZAP-70 fosforilada con el
ligando 24 de aminopirido-pirimidina formado en la
etapa c) en comparación con la etapa b) indica que
ZAP-70 fosforilada es un objetivo del compuesto.
Esto resulta del hecho de que en la etapa c) de este método de la
invención, el compuesto compite con el ligando para el enlazamiento
de ZAP-70 fosforilada. Si está presente menos
ZAP-fosforilada en la alícuota incubada con el
compuesto, esto significa preferiblemente que el compuesto ha
competido con el inhibidor por la interacción con la enzima y es,
por lo tanto, un objetivo directo de la enzima y viceversa.
Preferiblemente, se llevan a cabo los métodos de
identificación de la invención como una selección de medio o alto
rendimiento.
El compuesto de interacción identificado de
acuerdo con la presente invención se puede caracterizar
adicionalmente por medio de la determinación de si tiene un efecto
sobre la actividad de ZAP-70, por ejemplo sobre su
actividad como quinasa (Isakov y colaboradores, The Journal of
Biological Cheistry 271 (26), 15753-15761).
Los compuestos identificados de acuerdo con la
presente invención pueden ser optimizados adicionalmente
(optimización de candidatos). Esta optimización posterior de tales
compuestos a menudo se acelera debido a la información de la
relación actividad-estructura (SAR) codificada en
estas bibliotecas de generación de candidatos. La optimización
inducida se facilita a menudo debido a la fácil aplicabilidad de los
métodos químicos de alto rendimiento (HTC) para el seguimiento de la
síntesis.
Un ejemplo de tal biblioteca y de optimización
inducida es descrito en Wakeling A. E., Barker A. J., Davies D. H.,
Brown D. S., Green L. R., Cartlidge S. A., Woodburn J. R. Specific
inhibition of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase by
4-anilinoquinazolines. Breast Cancer Res Treat.
1996; 38(1): 67-73.
La memoria describe además un método para la
preparación de una composición farmacéutica que comprende las etapas
de:
- a)
- identificar un compuesto que interactúa con ZAP-70 como se describió anteriormente, y
- b)
- formular el compuesto que interactúa con una composición farmacéutica.
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, la memoria describe un método para
la preparación de composiciones farmacéuticas que pueden ser
administradas a un individuo en una cantidad efectiva. La
composición terapéutica puede ser sustancialmente pura. El
individuo que va a ser tratado puede ser un animal, incluyendo, pero
sin limitarse a animales tales como vacas, cerdos, caballos,
gallinas, gatos perros, etc., y puede ser un mamífero, por ejemplo
un mamífero humano o uno no humano.
Los compuestos identificados de acuerdo con la
invención son útiles para la prevención o el tratamiento de
enfermedades donde ZAP-70 juega un papel, por
ejemplo enfermedades inmunes o autoinmunes o trastornos mediados
por linfocitos T. Tales enfermedades o trastornos incluyen asma,
artritis reumatoide, soriasis, enfermedad inflamatoria intestinal
(por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa), esclerosis
múltiple, y rechazo agudo o crónico de órganos y tejidos de
individuos de la misma especie o de otra especie.
Además, se pueden utilizar los compuestos de la
invención para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica de
células B positivas para ZAP-70
(B-CLL).
En general, las composiciones farmacéuticas de
la presente invención incluyen una cantidad terapéuticamente
efectiva de un compuesto terapéutico, y de un portador
farmacéuticamente aceptable. En una modalidad específica, el
término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por
una agencia reguladora del gobierno Federal o estatal o enlistado
en la U.S. Pharmacopeia o en otras farmacopeas generalmente
reconocidas para uso en animales, y más particularmente, en
humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente,
adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra el
compuesto farmacéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser
líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos aquellos
originados en petróleo, animales, vegetales o sintéticos,
incluyendo pero sin limitarse a aceite de cacahuete, aceite de soja,
aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. El agua es un
portador preferido cuando se administra en forma oral la composición
farmacéutica. Se prefieren los portadores salinos o de dextrosa
acuosa cuando se administra la composición farmacéutica en forma
intravenosa. Las soluciones salinas y la dextrosa acuosa y las
soluciones de glicerol se emplean preferiblemente como portadores
líquidos para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos
adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina,
malta, arroz, harina, yeso, gel de sílice, estearato de sodio,
glicerol monoestearato, talco, cloruro de sodio, leche descremada
deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y
similares. La composición, si se desea, también puede contener
cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o
agentes amortiguadores de pH. Estas composiciones pueden tener la
forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, píldoras,
cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y
similares. La composición se puede formular como un supositorio, con
aglomerantes tradicionales y portadores tales como triglicéridos.
Una formulación oral puede incluir portadores estándar tales como
grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de
magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc.
Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados están descritos
en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin.
Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente
efectiva del compuesto terapéutico, preferiblemente en forma pura,
junto con una cantidad adecuada de portador a fin de proporcionar
la forma para una administración adecuada al paciente. La
formulación debe adaptarse a la forma de administración.
En una modalidad preferida, se formula la
composición de acuerdo con procedimientos de rutina, como una
composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a
seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración
intravenosa son soluciones en búfer isotónico acuoso. Cuando sea
necesario, la composición puede incluir también un agente de
solubilización y un anestésico local tal como lidocaína para
adormecer la zona de la inyección. Generalmente, se suministran los
ingredientes ya sea separadamente o mezclados en forma de una dosis
unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un
concentrado libre de agua en un contenedor herméticamente sellado
tal como una ampolleta o un sobrecito que indica la cantidad de
agente activo. Cuando se administra la composición para infusión,
se la puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua
o una solución salina estéril grado farmacéutico. Cuando se
administra la composición en forma inyectable, se puede suministrar
una ampolleta de agua estéril o solución salina para la inyección de
tal manera que se puedan mezclar los ingredientes antes de su
administración.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se pueden formular como formas neutras o salinas. Las sales
farmacéuticamente aceptables incluyen a aquellas formadas con grupos
carboxilo libres tal como aquellas derivadas de isopropilamina,
trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina,
procaína, etc., y aquellas derivadas de hidróxidos de sodio,
potasio, amonio, calcio, e hidróxido férrico, etc.
La cantidad del compuesto terapéutico de la
invención que será efectiva en el tratamiento de un trastorno
particular o condición, dependerá de la naturaleza del trastorno o
condición, y se puede determinar por medio de técnicas clínicas
estándar. Además, se pueden emplear opcionalmente ensayos in
vitro para ayudar a la identificación de los rangos óptimos de
dosis. La dosis precisa que se va a emplear en la formulación
dependerá también de la vía de administración, y de la seriedad de
la enfermedad o trastorno, y se debe decidir de acuerdo al juicio
del médico tratante y de las circunstancias de cada paciente. Sin
embargo, los rangos adecuados de dosis para administración
intravenosa son generalmente aproximadamente de
20-500 microgramos de compuesto activo por
kilogramo de peso corporal. Los rangos adecuados de dosis para
administración intranasal están generalmente alrededor de 0,01
pg/kg de peso corporal hasta 1 mg/kg de peso corporal. Las dosis
efectivas se pueden extrapolar a partir de curvas de respuesta a
las dosis derivadas de sistemas de análisis in vitro o de
modelos animales. En general, los supositorios pueden contener
ingrediente activo en el rango de 0,5% hasta un 10% en peso; las
formulaciones orales contienen preferiblemente de 10% hasta 95% de
ingrediente activo.
Se conocen diferentes sistemas de suministro que
pueden ser utilizados para administrar un compuesto terapéutico de
la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas,
micropartículas, y microcápsulas; el uso de células recombinantes
capaces de expresar al compuesto terapéutico, el uso de endocitosis
mediada por un receptor (por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem.
262: 4429-4432); la construcción de un ácido
nucleico terapéutico como parte de un vector retroviral o de otro
vector, etc. Los métodos de introducción incluyen pero no se
limitan a la vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal,
intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, y oral. Los
compuestos se pueden administrar por medio de cualquier ruta
conveniente, por ejemplo por infusión, por inyección de bolo, por
absorción a través del recubrimiento epitelial o mucocutáneo (por
ejemplo, mucosa oral, rectal e intestinal), y se pueden administrar
junto con otros agentes biológicamente activos: la administración
puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir
las composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema
nervioso central por medio de cualquier ruta adecuada, incluida una
inyección intraventricular e intratecal; la inyección
intraventricular se puede facilitar por medio de un catéter
intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un
depósito Ommaya. También se puede emplear administración pulmonar,
por ejemplo, por medio del uso de un inhalador o nebulizador, y una
formulación con un agente atomizador.
En una modalidad específica, puede ser deseable
administrar las composiciones farmacéuticas de la invención
localmente en el área que requiere del tratamiento. Esto se puede
lograr, por ejemplo, y no como una forma de limitación, por medio
de infusión local durante una cirugía, una aplicación tópica, por
ejemplo, junto con un apósito después de una cirugía, por medio de
una inyección, por medio de un catéter, por medio de un
supositorio, o por medio de un implante, siendo dicho implante de un
material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluidas membranas, tal
como membranas que son mezcla de silicona y plástico, o fibras. En
una modalidad, la administración se puede hacer por medio de
inyección directa en el sitio (o sitio antiguo) de un tumor maligno
o neoplásico o tejido pre-neoplásico.
En otra modalidad, se puede administrar el
compuesto terapéutico en una vesícula, en particular un liposoma
(Langer, 1990, Science 249: 1527-1533).
En aún otra modalidad, se puede administrar el
compuesto terapéutico a través de un sistema de liberación
controlada. En una modalidad, se puede utilizar una bomba (Langer,
ver más arriba). En aún otra modalidad, se puede colocar un sistema
de liberación controlada en proximidades del objetivo terapéutico,
esto es, el cerebro, requiriendo por lo tanto únicamente una
fracción de la dosis sistémica.
La invención se relaciona además con un método
para la purificación de ZAP-70 fosforilada, que
comprende las etapas de
- a)
- proveer una preparación de proteína que contiene ZAP-70 fosforilada,
- b)
- poner en contacto la preparación de la proteína con ligando 24 de aminopirido-pirimidina inmovilizado sobre un soporte sólido bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de ZAP-70 fosforilada con ligando 24 de aminopirido-pirimidina, y
- c)
- separar la ZAP-70 fosforilada del ligando 24 de aminopirido-pirimidina inmovilizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se mencionó anteriormente, se ha encontrado
sorprendentemente que el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina es un ligando que reconoce la
ZAP-70 fosforilada. Esto permite métodos de
purificación eficientes para ZAP-70 fosforilada.
Con respecto a ZAP-70
fosforilada, la preparación de proteína que contiene
ZAP-70 fosforilada, las condiciones para poner en
contacto con el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina, el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina inmovilizado, el complejo de
ZAP-70 fosforilada con el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina, la separación de
ZAP-70 fosforilada del ligando 24 de
aminopirido-pirimidina inmovilizado, y la detección
de ZAP-70 fosforilada o la determinación de su
cantidad, las modalidades como las definidas anteriormente para los
métodos de identificación de la invención también aplican para el
método de purificación de la invención.
En una modalidad preferida, el método de
purificación de la invención comprende además después de la etapa
c) la identificación de proteínas que son capaces de enlazarse con
ZAP-70 fosforilada. Esto es especialmente
interesante cuando se lleva a cabo la formación del complejo bajo
condiciones esencialmente fisiológicas, porque es posible preservar
después preservar la condición natural de la enzima que incluye la
existencia de compañeros de enlazamiento, subunidades de enzimas o
modificaciones postraduccionales, que pueden luego ser identificadas
con la ayuda de espectrometría de masas (MS).
Consecuentemente, en una modalidad preferida, el
método de purificación de la invención comprende después de la etapa
c) la determinación de si la ZAP-70 fosforilada está
modificada postraduccionalmente adicionalmente, por ejemplo por
modificación de la ubiquitina.
La invención se relaciona además con el uso del
ligando 24 de aminopirido-pirimidina para la
identificación de compuestos y para la purificación de
ZAP-70 fosforilada. Las modalidades como las
definidas anteriormente también aplican para los usos de la
invención.
Se ha descrito que ZAP-70 es un
marcador pronosticador para leucemia linfocítica crónica (CLL) que
representa una neoplasia maligna de células B (Hamblin y Hamblin,
2005, Expert Opinion in Therapeutic Targets 9 (6):
1165-1178). Los subtipos de CLL fueron reconocidos
originalmente por el estatus mutacional de los genes para la región
variable de la inmunoglobulina, pero se ha establecido ahora que se
puede identificar un subtipo de CLL por medio de la expresión de
ZAP-70. La ZAP-70 quinasa se expresa
normalmente en células T en vez de en células B, pero se expresa en
forma anormal en el subtipo más agresivo de CLL. Por lo tanto, el
ligando 24 de aminopirido-pirimidina es una
herramienta importante para el diagnóstico de subtipos de CLL o para
pronosticar el progreso de una enfermedad por medio de la
determinación de la probabilidad de que un paciente con CLL sufrirá
de la enfermedad en una etapa avanzada.
Por lo tanto, en un aspecto adicional, la
memoria también describe el uso del ligando 24 de
aminopirido-pirimidina para la preparación de un
diagnóstico para leucemia linfocítica crónica (CLL).
La memoria describe además un método para el
diagnóstico/pronóstico de CLL, que comprende la etapa de determinar
la presencia/cantidad de ZAP-70 fosforilada en una
muestra con relación con la cantidad total de
ZAP-70, en donde una cantidad mayor de
ZAP-70 fosforilada en comparación con la cantidad
total de ZAP-70 (ZAP no fosforilada más
ZAP-70 fosforilada) en una muestra de un paciente
con CLL es indicativa de tener una mayor probabilidad de una forma
agresiva de CLL.
En este contexto, una muestra es una preparación
de proteína derivada del individuo. Consecuentemente, todas las
modalidades discutidas anteriormente con respecto a la preparación
de la proteína derivada de individuos también se aplican a este
aspecto de la invención.
De acuerdo con esta invención, "individuo"
significa cualquier mamífero, preferiblemente un ser humano.
Se puede determinar la cantidad de
ZAP-70 fosforilada como se describió
anteriormente.
En el contexto de la presente invención,
"diagnóstico" significa tanto el diagnóstico de una enfermedad
ya existente como el pronóstico de que un individuo dado tenga una
probabilidad de más del 50% de desarrollar la respectiva
enfermedad.
Se ilustra además la invención por medio de las
siguientes figuras y ejemplos, que no se considera que sean
limitantes para el alcance de la protección conferida por las
reivindicaciones de la presente solicitud.
Figura 1: Estructura del ligando 24 de
aminopirido-pirimidina.
Se puede utilizar el grupo amino primario para
el acoplamiento covalente a un material sólido de soporte.
Figura 2: Experimento para destruir un fármaco
con ligando 24 de aminopirido-pirimidina
inmovilizado y análisis de transferencias Western. Como lisados
celulares de material biológico se utilizaron preparados de células
Jurkat tratadas o no tratadas con pervanadato. Se llevó a cabo el
experimento para destruir un fármaco como se describe en el Ejemplo
2 con muestras lisadas que contienen 50 mg de proteína. Ingreso del
lisado, flujo (fracción no enlazada) y se separaron los eluatos en
SDS (fracción enlazada) sobre gel de
poliacrilamida-SDS y se los transfirió a una
membrana. Se probó primero la transferencia con un anticuerpo
anti-ZAP-70 general (2A) y luego con
un anticuerpo antifosfo-ZAP-70 (2B).
Los anticuerpos para detección secundaria fueron marcados con
colorantes fluorescentes para detección con el sistema infrarrojo de
formación de imágenes Odyssey.
Lisados de las células Jurkat no tratadas
(sendas 1 a 3):
- Senda 1: Lisado de control, no sometido al experimento de destrucción del fármaco
- Senda 2: Flujo (fracción no enlazada)
- Senda 3: Eluato (fracción enlazada eluida en SDS)
Lisados de células Jurkat tratadas con
pervanadato (sendas 4 a 6):
- Senda 4: Lisado de control, no sometido al experimento de destrucción del fármaco
- Senda 5: Flujo (fracción no enlazada)
- Senda 6: Eluato (fracción enlazada eluida en SDS)
2A: Se probó la transferencia superior con el
anticuerpo general ZAP-70 (L1E5, anticuerpo
monoclonal de ratón dirigido contra los residuos que rodean a la
parte aminoterminal de ZAP-70 humana, Señalización
Celular # 2709).
2B: Se probó la transferencia inferior con el
anticuerpo fosfo-ZAP-70
(Fosfo-ZAP-70 Tyr493, Señalización
Celular # 2704).
Figura 3: Experimento para destrucción de un
fármaco con ligando 24 de aminopirido-pirimidina
inmovilizado para análisis por espectrometría de masas de proteínas
y fosfopéptidos.
Se eluyeron las proteínas enlazadas al ligando
24 de aminopirido-pirimidina con búfer de la muestra
en SDS y se analizó por medio de electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). Se
muestra un gel de proteína después de coloración con Azul de
Coomassie. Se cortaron las áreas indicadas del gel como rebanadas de
gel y se sometieron las proteínas a análisis por medio de
espectrometría de masas. La posición de ZAP-70 está
en las rebanadas 10 y 10a.
Figura 4: Péptidos identificados de
ZAP-70.
Los péptidos que fueron identificados por medio
de análisis de espectrometría de masas de la secuencia de
ZAP-70 humana (IPI00329789.5, 628 aminoácidos) son
mostrados en negrilla y subrayados.
Figura 5: Ensayo para la identificación de los
compuestos que interactúan con ZAP-70.
El experimento fue realizado como se describe en
el ejemplo 3. Se capturó la proteína ZAP-70 por
medio del ligando 24 de aminopirido-pirimidina
inmovilizado de lisados de células Jurkat (células Jurkat tratadas
con pervanadato) y se eluyeron los compuestos como se indicó. Se
transfirieron los eluatos a una membrana de nitrocelulosa y se
detectó ZAP-70 con el sistema infrarrojo de
formación de imágenes de Odyssey. Primer anticuerpo:
anti-fosfo-ZAP-70
(Tyr493). Segundo anticuerpo: Irdye800CW anticonejo de cabra. Se
muestran unidades relativas de Odyssey. Compuestos utilizados para
la elución: SDS, control positivo para máxima elución; DMSO, control
del solvente; ligando 24,
ligando 24 de aminopirido-pirimidina; Estaurosporina; inhibidor SP600125 de la JNK; inhibidor SB 202190 de p38.
ligando 24 de aminopirido-pirimidina; Estaurosporina; inhibidor SP600125 de la JNK; inhibidor SB 202190 de p38.
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Este ejemplo ilustra la preparación de una
matriz de afinidad para la captura por afinidad de quinasas de los
lisados celulares. Se inmovilizó covalentemente un ligando de
captura sobre un soporte sólido a través de enlazamiento covalente
utilizando un grupo funcional amino. Se utilizó una matriz de
afinidad en el ejemplo 2 y en el ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo las siete primeras etapas de
la síntesis como se describe en Klutchko, S. R. y colaboradores,
1998, Journal of Medicinal Chemistry 41, 3276-3292.
El resto de las etapas se llevaron acabo como se describe más
abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapas
1-7
Se sintetizó
6-(2,6-Diclorofenil)-2-metanosulfonil-8-metil-8H-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona
a partir del éster etílico de
4-cloro-2-metilsulfanil-5-pirimidincarboxilato
siguiendo el procedimiento reportado en J. Med. Chem. 1998, 41,
3276-3292.
Etapa
8
Se mezclaron
6-(2,6-Diclorofenil)-2-metanosulfonil-8-metil-8H-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona
(0,100 g, 0,2 mmol) y
3-(N-Boc-metilamino)anilina
(0,421 g, 2,0 mmol) como sólidos y se calentó hasta 140ºC durante 30
minutos. Se disolvió la mezcla de reacción cruda en diclorometano y
se lavó con HCl 2 N (acuoso) x 2. Se secó la capa orgánica con
sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró. Se
recristalizó el producto crudo a partir de acetato de etilo caliente
para producir el éster tert-butílico del ácido
{4-[3-(2,6-Dicloro-fenil)-1-metil-2-oxo-1,2-dihidro-[1,6]naftiridin-7-ilamino]bencil}-carbámico
como un sólido de color amarillo (0,031 g-25%). RMN
^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 10.18 (s, 1H); 8.83 (s, 1H);
7.76 (d, 2H); 7.58 (d, 2H); 7.46 (dd, 1H); 7.32 (brt, 1H); 7.23 (d,
2H); 4.10 (d, 2H); 3.66 (s, 3H); 1.40 (s, 9H). LCMS: método A, RT =
5,60 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
9
Se disolvió en metanol el éster
tert-butílico del ácido
{4-[3-(2,6-Dicloro-fenil)-1-metil-2-oxo-1,2-dihidro-[1,6]naftiridin-7-ilamino]bencil}-carbámico
(0,026 g, 0,05 mmol). Se añadieron (3 ml) y ácido clorhídrico (4 N
en dioxano, 1,2 ml). Se agitó la reacción a temperatura ambiente
durante 1,5 horas cuando la HPLC mostró que no quedaba material de
partida. Se removió el solvente al vacío. Se disolvió el residuo en
agua y se tornó básica la solución con carbonato d sodio (acuoso,
saturado). Se recolectó el precipitado resultante y se lo secó para
producir
7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona
(0,021 g-100%) como un sólido de color amarillo. RMN
^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 10.20 (bid, 1H); 8.83 (d,
1H); 7.90 (d, 1H); 7.76 (d, 1H); 7.72 (d, 1H); 7.60 (dd, 2H); 7.47
(ddd, 1H); 7.33 (d, 1H); 7.24 (d, 1H); 4.07 (d, 2H); 3.66 (s, 3H).
LCMS: método A, RT = 4,44 min, [MH^{+} = 426].
Todas las reacciones se llevaron a cabo bajo una
atmósfera inerte. Los espectros de RMN fueron obtenidos en un Bruker
dpx400. LCMS se realizó en un Agilent 1100 utilizando una columna
zorbax SBC-18, 4,6 mm x 150 mm-5P.
El flujo de columna fue de 1 ml/min y los solventes utilizados
fueron agua y acetonitrilo (0,1% de TFA) con un volumen de inyección
de 10 ul. Las longitudes de onda fueron de 254 y 210 nm. A
continuación se da una descripción de los métodos utilizados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se equilibró la Sefarosa 4 Fast Flow activada
con NHS (Amersham Biosciences,
17-0906-01) con DMSO anhidro
(Dimethylsulfoxid, Fluka, 41648, H20 <= 0,005%). Se colocó 1 ml
de bolitas sedimentadas en un tubo Falcon de 15 ml, se añadió una
solución patrón del compuesto (usualmente 100 mM en DMF o DMSO)
(concentración final de 0,2-2 \mumol/ml de
bolitas) así como 15 \mul de trietilamina (Sigma,
T-0886, 99% de pureza). Se incubaron las bolitas a
temperatura ambiente en la oscuridad sobre un agitador de rotación
completa (Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.) durante
16-20 horas. Se determina la eficiencia del
acoplamiento por medio de HPLC. Se bloquearon los grupos de NHS que
no reaccionaron por medio de incubación con amino etanol a
temperatura ambiente sobre el agitador de rotación completa durante
la noche. Se lavaron las bolitas con 10 ml de DMSO y se las
almacenó en isopropanol a -20ºC. Se utilizaron estas bolitas como la
matriz de afinidad en el ejemplo 2 y en el ejemplo 3. Se generaron
bolitas de control (sin ligando inmovilizado) bloqueando los grupos
NHS por medio de incubación con amino etanol como se describió
anteriormente.
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Este ejemplo demuestra el uso del ligando 24 de
aminopirido-pirimidina inmovilizado para la
identificación de ZAP-70 a partir de lisados de una
línea de células T humanas (células Jurkat). Con este propósito se
puso en contacto un lisado de células Jurkat tratadas y no tratadas
con la matriz de afinidad descrita en el ejemplo 1. Se
identificaron las proteínas enlazadas al ligando 24 de
aminopirido-pirimidina por medio de análisis de
transferencias Western y de espectrometría de masas (MS).
Para el análisis de las transferencias Western
se eluyeron las proteínas enlazadas de la matriz de afinidad y
posteriormente se las separó por medio de electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS. Se detectó
ZAP-70 por medio del enlazamiento de un anticuerpo
monoclonal general con la parte aminoterminal fosforilada de la
proteína y además con un anticuerpo fosfo-específico
(Figura 2).
Los resultados de los análisis de las
transferencias Western muestran que el ligando 24 de
aminopirido-pirimidina inmovilizado destruye
preferencialmente una forma fosforilada de ZAP-70.
La ZAP-70 fosforilada fue únicamente
significativamente detectada a partir de lisados tratados de células
Jurkat comparados con lisados no tratados.
Para la identificación de proteínas y de
fosfopéptidos por medio del análisis de espectrometría de masas, se
eluyeron las proteínas capturadas por la matriz de afinidad y
posteriormente se las separó por medio de electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS. Se cortaron las bandas adecuadas
del gel y se las sometió a una digestión proteolítica en el gel con
tripsina. Se enriquecieron luego los péptidos fosforilados a través
de cromatografía de afinidad por metal inmovilizado (IMAC). Se
analizaron separadamente los péptidos no enlazados y los
fosfo-péptidos retenidos por medio de espectrometría
de masas LC-MS/MS.
El alcance de la secuencia del péptido de
ZAP-70 se muestra en la Figura 4. Se identificaron
en total 9 fosfopéptidos ZAP-70 por medio de
espectrometría de masas (Tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron las células Jurkat (clon
E6-1 del ATCC, número TIB-152) en
frascos de 1 litro de Spinner (Integra Biosciences, #182101) en
suspensión en medio RPMI 1640 (Invitrogen, #
21875-034) suplementado con Suero Fetal Bovino al
10% (Invitrogen) con una densidad entre 0,15 x 10^{6} y 1,2 x
10^{6} células/ml. Para los experimentos de estimulación se
trataron las células con pervanadato 30 \muM (concentración final)
con una densidad de aproximadamente 1,0 x 10^{6} células/ml
durante una hora y posteriormente se las recolectó por medio de
centrifugación. Después de un lavado intensivo con amortiguador 1 x
PBS (Invitrogen, # 14190-094) se congelaron los
precipitados celulares en nitrógeno líquido y posteriormente se los
almacenó a -80ºC.
Para los experimentos de estimulación se
trataron las células con ortovanadato sódico tratado con
H_{2}O_{2} con el propósito de inhibir a las proteínas tirosina
fosfatasas (D. C. Weiser y S. Shenolikar, Capítulo 18.10 en Current
Protocols in Molecular Biology, 2003, John Wiley & Sons, Inc.).
Para el tratamiento de las células se añadieron 30 ml de la mezcla
3 a 10 litros del medio de cultivo resultando en una concentración
final de pervanadato de 30 \muM. Se mantuvieron las células
Jurkat con una densidad entre 0,8 y 1,2 x 10^{6} células/ml
durante una hora y luego se las recogió.
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Disolver ortovanadato sódico (Sigma, # 6508)
hasta una concentración final de 100 mM en agua destilada estéril y
se ajustó el valor del pH de la solución hasta un pH de 10,0 con
NaOH 0,1 M. Colocar la solución en un baño de agua en ebullición
hasta que se aclare la solución o se haga translúcida. Si es
necesario, ajuste nuevamente el pH en 10,0 y almacene la solución
patrón a -20ºC. Evite repetir ciclos de congelación y descongelación
de la solución patrón.
Mezcle 500 \mul de H_{2}O_{2} al 30%
(Sigma Cat. No. H1009) y 375 \mul de 1 x PBS (Mezcla 1).
Mezcle 650 \mul de la Mezcla 1 y 32,5 ml de la
Mezcla 2 (Mezcla 3). Incube la Mezcla 3 durante 10 minutos a
temperatura ambiente antes de aplicar al cultivo de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Se homogenizaron las células Jurkat en un
homogenizador Potter S en amortiguador para lisis:
Tris-HCl 50 mM, NP40 al 0,8%, glicerol al 5%, NaCl
150 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, NaF 25 mM, vanadato sódico 1 mM, DTT 1
mM, pH 7,5. Se añadió una tableta completa libre de EDTA (coctel
inhibidor de la proteasa, Roche Diagnostics, 1 873 580) por 25 ml
de amortiguador. Se homogenizó 10 veces el material utilizando un
homogenizador POTTER S mecanizado, se transfirió a tubos Falcón de
50 ml, se incubó durante 30 minutos sobre hielo y se centrifugó
durante 10 minutos a 20.000 g a 4ºC (10.000 rpm en Sorvall SLA600,
preenfriado). Se transfirió el sobrenadante a un tubo de
policarbonato de una ultracentrífuga (UZ) (Beckmann, 355654) y se
centrifugó durante 1 hora a 100.000 g a 4ºC (33.500 rpm en Ti50.2,
preenfriado). Se transfirió nuevamente el sobrenadante a un tubo
Falcón fresco de 50 ml, se determinó la concentración de la
proteína por medio de un ensayo de Bradford (BioRad) y se prepararon
muestras que contenían 50 mg de proteína por alícuota. Se
utilizaron inmediatamente las muestras para los experimentos o se
las congeló en nitrógeno líquido y se las almacenó congeladas a
-80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se equilibraron bolitas de sefarosa con
compuesto inmovilizado (100 \mul de bolitas por experimento de
destrucción) en amortiguador de lisis y se incubó con una muestra
de lisado celular que contenía 50 mg de proteína sobre un agitador
de rotación completa (Roto Shake Genie, Scientific Industries, Inc.)
durante 2 horas a 4ºC. Se recolectaron las bolitas, se las
transfirió a columnas Mobicol (MoBi Tech 10055) y se las lavó con 10
ml de amortiguador de lisis que contenía detergente NP40 al 0,5%,
seguido por 5 ml de amortiguador de lisis con detergente al 0,25%.
Para eluir la proteína enlazada, se añadieron 60 \mul de
amortiguador pata la muestra 2 x SDS, se calentó la columna durante
30 minutos a 50ºC y se transfirió el eluato a un tubo de
microcentrífuga por centrifugación. Se separaron luego las proteínas
por medio de electroforesis en poliacrilamida-SDS
(SDS-PAGE).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron las transferencias Western de
acuerdo con procedimientos estándar y se detectó la proteína
ZAP-70 y se la cuantificó por medio del uso de un
anticuerpo específico anti-fosfo
ZAP-70 (primer anticuerpo), un anticuerpo
secundario marcado en forma fluorescente y el sistema Infrarrojo de
Formación de Imágenes Odyssey de LI-COR Biosciences
(Lincoln, Nebraska, EUA) de acuerdo con las instrucciones
suministradas por el fabricante
(Schutz-Geschwendener y colaboradores, 2004.
Quantitative, two-color Western blot detection with
infrared fluorescence. Publicado en mayo de 2004 por
LI-COR Biosciences, www.licor.com).
El anticuerpo
fosfo-ZAP-70 (pTyr493, policlonal de
conejo, Señalización Celular # 2704) detecta ZAP-70
únicamente cuando está fosforilada en el residuo 493 de tirosina. El
anticuerpo general ZAP-70 (L1E5, anticuerpo
monoclonal de ratón, Señalización celular # 2709) está dirigido
contra el amino terminal de ZAP-70 humana.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas separadas del gel fueron
reducidas, alquiladas y digeridas en el gel siguiendo esencialmente
el procedimiento descrito por Shevchenko y colaboradores, 1996,
Anal. Chem. 68: 850-858. En resumen, se cortaron
las proteínas separadas del gel utilizando un escalpelo limpio, se
las redujo utilizando DTT 10 mM (en bicarbonato de amonio 5 mM,
54ºC, 45 min) y posteriormente se las alquiló con Yodoacetamida 55
mM (en bicarbonato de amonio 5 mM) a temperatura ambiente en la
oscuridad (30 minutos). Se digirieron las proteínas alquiladas y
reducidas en gel con tripsina porcina (Promega) con una
concentración de proteasa de 12,5 ng/\mul en bicarbonato de
amonio 5 mM. Se permitió que la digestión prosiguiera durante 4
horas a 37ºC y se detuvo posteriormente la reacción utilizando 5
\mul de ácido fórmico al 5%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajeron porciones dos veces con 20 \mul
de TFA al 1% y se las reunió con sobrenadantes digeridos
acidificados. Se secaron las muestras en una centrífuga al vacío y
se las resuspendió en 10 \mul de ácido fórmico al 0,1%. Se
resuspendieron las muestras secas en 30 \mul de agua que contenía
ácido acético 250 mM, acetonitrilo al 30% y 4 \mul de bolitas de
Afinidad con Hierro seleccionadas con PHOS (Sigma, P9740; material
IMAC) y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente bajo
agitación horizontal suave. Posteriormente, se cargó la suspensión
sobre una punta cargadora de gel que contenía una restricción para
retener el material IMAC. Se le permitió a las bolitas sedimentarse
durante un minuto, luego se empujó el solvente a través de la
columna utilizando una pipeta P10 y se recogió en un tubo
Eppendorf. Se lavó la columna IMAC dos veces con 20 \mul de una
solución acuosa que contenía ácido acético 250 mM, acetonitrilo al
30%. Se combinaron las fracciones eluidas y se las secó en una
centrífuga al vacío. Esta fracción es denominada como la fracción no
enlazada (NBF). Se eluyeron los fosfopéptidos de la columna IMAC
utilizando 20 \mul de una solución acuosa que contenía amoniaco
400 mM y acetonitrilo al 30%. Se repitió la elución dos veces y se
combinaron las fracciones eluidas y se las secó en una centrífuga
al vacío (fracción enlazada, BF). Ambas fracciones (NBF y BF) fueron
resuspendidas en 10 \mul de ácido fórmico al 0,1% antes el
análisis por LC/MS-MS (Pozuelo Rubio y
colaboradores, 2005, Biochemical Journal 392 (Parte 1),
163-172).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectaron muestras de péptidos en un sistema
LC nano (CapLC, Waters o Ultimate, Dionex) que se acopló
directamente o bien a un cuadrupolo TOF (QTOF2, QTOF Ultima, QTOF
Micro, Micromass) o a un espectrómetro de masas con una trampa de
iones (LCQ Deca XP). Se separaron los péptidos sobre el sistema de
LC utilizando un gradiente de solventes orgánicos y acuosos (ver más
abajo).
El solvente A era de acetonitrilo al 5% en ácido
fórmico al 0,5% y el solvente B era de acronitrilo al 70% en ácido
fórmico al 0,5%.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos de la masa del péptido y de la
fragmentación generados en los experimentos de
LC-MS/MS fueron utilizados para búsqueda en las
bases de datos de secuencias de nucleótidos y de proteínas en
formato FASTA, mantenidas y actualizadas regularmente en la NCBI
(para la NCBInr, dbEST y los genomas de humano y de ratón) y el
Instituto Europeo de Bioinformática (EBI, para las bases de datos
del proteoma humano, de ratón, de D. melanogaster y C.
elegans). Se identificaron las proteínas por medio de la
correlación de la masa medida del péptido y los datos de
fragmentación con los mismos datos computados a partir de las
entradas en las bases de datos utilizando como herramienta de
software Mascot (Matrix Science; Perkins y colaboradores, 1999.
Probability-based protein identification by
searching sequence databases using mass spectrometry data.
Electrophoresis 20, 3551-3567). Los criterios de
búsqueda variaron dependiendo de qué espectrómetro de masas se
utilizó para el análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se logró la identificación de los péptidos
fosforilados permitiendo la fosforilación en los residuos de Serina,
Treonina y Tirosina como modificaciones variables en los parámetros
de búsqueda de Mascot seguido por inspección manual del espectro
para asignación de secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La preparación de la matriz de afinidad del
ligando 24 de aminopirido-pirimidina se hizo como se
describe en el ejemplo 1. Para seleccionar máximo 80 compuestos en
una placa de 96 pozos, se llevó a cabo el experimento de elución
como se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se lavó la matriz de afinidad (1600 \mul de
bolitas) 2 x con 30 ml 1 x de amortiguador DP. Después de cada
etapa de lavado se recolectaron las bolitas por medio de
centrifugación durante 4 minutos a 1300 rpm a 4ºC en una centrífuga
Heraeus. Se descartaron los sobrenadantes. Finalmente, se
equilibraron las bolitas en 50 ml de amortiguador de enlazamiento
(1 x con amortiguador DP/NP40 al 0,4%) y se rotó durante 30 a 45
minutos sobre un ROTO SHAKE GENIE (Scientific Industries, Inc.) a
4ºC. Después de este período de incubación se recolectaron las
bolitas y se las mezcló con 45 ml de lisado de células Jurkat
aclaradas y activadas con pervanadato con una concentración de
proteína de 5 mg/ml. La preparación del lisado se hizo como se
describe en el ejemplo 2. Se incubaron las bolitas y el lisado
durante 2 horas a 4ºC. Después de la incubación con el lisado, se
recogieron las bolitas por medio de centrifugación como se describió
y se lavó tres veces con 25 ml de amortiguador de enlazamiento.
Durante cada etapa de lavado se incubaron las bolitas durante 8
minutos sobre un ROTO SHAKE GENIE (Scientific Industries, Inc.) a
4ºC. Después del tercer lavado se transfirieron las bolitas a
columnas de 2 ml (MoBiTec, # S10129) y se lavó con 20 ml 1 x con
amortiguador DP/NP40 al 0,2%. Una vez que corrió completamente el
amortiguador de lavado a través de la columna, se calculó el volumen
de bolitas que quedó en la columna (aproximadamente 100 \mul). Se
resuspendieron las bolitas en un exceso de 4 veces del amortiguador
DP 1 x/NP40 al 0,2% (4 ml) para generar una suspensión 1:4. Para los
ensayos de la elusión del compuesto, se añadieron 50 \mul de esta
suspensión a cada pozo de una placa de 96 pozos (Millipore
MultiScreenHTS, MSBVN1210, con tapa y una membrana Durapore poco
hidrofílica de 1,2 \mum para enlazamiento de la proteína). Para
remover el amortiguador residual se montó una placa de 96 pozos con
un filtro de montaje y una placa de recolección y se centrifugo
este montaje en sándwich durante 10 segundos a 800 rpm en una
centrífuga. Luego se añadieron 40 \mul de amortiguador de elusión
(1 x con amortiguador DP/NP40 al 0,2%) suplementado con el
compuesto de prueba, a las bolitas. Se prepararon compuestos de
prueba diluyéndolos en amortiguador de dilución comenzando con una
solución patrón concentrada 40 veces en DMSO. Se ensambló la placa
sobre la placa de recolección, se la fijó sobre una incubadora
Eppendorf y se incubó durante 30 minutos a 4ºC con una agitación de
650 rpm. Para recolectar el eluato, se centrifugó la placa filtrante
de 96 pozos ensamblada sobre la placa de recolección de 96 pozos
durante 1 minuto a 800 rpm en una centrífuga de mesa a 4ºC
(Heraeus). El volumen típico del eluato es aproximadamente de 35
\mul. Se almacenaron los eluatos a -80ºC. Se revisaron los eluatos
por la presencia de ZAP-70 por medio del uso de un
procedimiento de transferencia de manchas.
Como compuestos de prueba, se utilizaron el
ligando 24 de aminopirido-pirimidina (ver Ejemplo
1), Estaurosporina (Sigma S4400), el inhibidor SP600125 de JNK
(Calbiochem 420119) y el inhibidor SB 202190 de p38 (Tocris 1264).
Típicamente, se disolvieron todos los compuestos en DMSO al 100%
(Fluka, Cat. No. 41647) con una concentración de 100 mM.
Alternativamente, se puede utilizar DMF al 100% (Fluka, Cat. No.
40228) para aquellos compuestos que no se puedan disolver en DMSO.
Se almacenan los compuestos a -20ºC. Dilución de los compuestos de
prueba para los experimentos de elusión: Preparar un patrón 50 mM
por medio de la dilución 1:1 del patrón de 100 mM con DMSO al 100%.
Para los experimentos de elusión se diluye adicionalmente el
compuesto con amortiguador de elusión (1 x con amortiguador DP, NP40
al 0,2%).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se filtró el amortiguador DP 5 x a través de un
filtro de 0,22 \mum y se almacenó en alícuotas de 40 ml a -80ºC.
Se obtuvieron estas soluciones a partir de los siguientes
proveedores: Tris/HCl 1,0 M pH 7,5 (Sigma, T-2663),
Glicerol al 87% (Merck, catálogo número 04091.2500); MgCl_{2} 1,0
M (Sigma, M-1028); NaCl 5,0 M (Sigma,
S-5150).
\vskip1.000000\baselineskip
Se detectó la proteína ZAP-70
eluida y se la cuantificó por medio de un procedimiento de
transferencia de manchas utilizando un anticuerpo específico
anti-fosfo-ZAP-70
(primer anticuerpo, un anticuerpo secundario marcado en forma
fluorescente y el sistema Infrarrojo de Formación de Imágenes
Odyssey de LI-COR Biosciences (Lincoln, Nebraska,
EUA) de acuerdo con las instrucciones suministradas por el
fabricante (Schutz-Geschwendener y colaboradores,
2004. Quantitative, two-color Western blot detection
with infrared fluorescence. Publicado en mayo de 2004 por
LI-COR Biosciences, www.licor.com).
Se trataron membranas de nitrocelulosa con
etanol al 20% durante 5 segundos y posteriormente se las lavó con
amortiguador PBS 1 x. Se combinaron los eluatos (como se describió
anteriormente) con 10 \mul de amortiguador de carga SDS 4 x
(Tris-HCl 200 mM pH 6,8, SDS al 8%, glicerol al 40%,
azul de bromofenol al 0,04%) y se los aplicó a la membrana de
nitrocelulosa con un aparato para transferencias de manchas de
BioRad (BioRad, # 170-6545) y se lavó una vez con
amortiguador PBS 1 x.
Para la detección de la proteína
ZAP-70, se bloquearon primero las membranas por
medio de incubación con amortiguación de bloqueo de Odyssey durante
1 hora. Se incubaron las membranas bloqueadas durante 16 horas a 4ºC
con el primer anticuerpo, un anticuerpo
anti-fosfo-ZAP-70 de
conejo que reconoce al residuo 493 de Tirosina fosforilada
(pTyr493, policlonal de conejo, Señalización Celular # 2704) diluido
1:1000 en el amortiguador de bloqueo de Odyssey suplementado con
Tween 20 al 0,1% y SDS al 0,02%.
Después de lavar la membrana cuatro veces
durante 5 minutos con amortiguador PBS 1 x que contenía Tween 20 al
0,01%, se incubó la membrana durante 1 hora con el anticuerpo de
detección (anticuerpo IRDye 800CW anticonejo de cabra de
LI-COR, diluido 1:10.000 en Amortiguador de Bloqueo
de Odyssey suplementado con Tween 20 al 0,1% y SDS al 0,02%).
Después de eso se lavó la membrana cuatro veces durante 5 minutos
con amortiguador PBS 1 x/Tween 20 al 0,01% y una vez durante 5
minutos con amortiguador PBS 1 x. Después de eso se escaneó la
membrana con el lector Odyssey y se analizaron los datos.
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
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moléculas que interactúan con ZAP-70 y para la
purificación de ZAP-70
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<130> CEL64295EP
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<160> 10
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<170> PatentIn versión 3.3
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<210> 1
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<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> artificial
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<220>
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<223> fragmento de péptido
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> artificial
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<220>
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<223> fragmento de péptido
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<400> 2
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<210> 3
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<212> PRT
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<213> artificial
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<223> fragmento de péptido
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<400> 3
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<210> 4
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<212> PRT
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<213> artificial
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<223> fragmento de péptido
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<212> PRT
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<223> fragmento de péptido
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<212> PRT
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<213> homo sapiens
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<110> Cellzome AG
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<120> Métodos pata la identificación de
moléculas que interactúan con ZAP-70 y para la
purificación de ZAP-70
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de péptido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de péptido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> fragmento de péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de péptido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 629
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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Claims (25)
1. Un método para la identificación de un
compuesto que interactúa con ZAP-70, que comprende
las etapas de:
- a)
- proveer una preparación de proteína que contenga ZAP-70 fosforilada,
- b)
- poner en contacto la preparación de la proteína con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada sobre un soporte sólido bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6 -dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona,
- c)
- incubar el complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona con un compuesto dado, y
- d)
- determinar si el compuesto es capaz de separar a ZAP-70 fosforilada de la 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de la reivindicación 1, en donde la
etapa d) incluye la detección de ZAP-70 fosforilada
separada o la determinación de la cantidad de ZAP-70
fosforilada separada.
3. El método de la reivindicación 2, en donde se
detecta la ZAP-70 fosforilada separada o se
determina la cantidad de ZAP-70 fosforilada separada
por medio de espectrometría de masas o de métodos de
inmunodetección.
4. El método de la reivindicación 3, en donde se
detecta la ZAP-70 fosforilada separada con un
anticuerpo dirigido contra ZAP-70 fosforilada.
5. El método de la reivindicación 4, en donde se
detecta la ZAP-70 fosforilada separada con un
anticuerpo que reconoce una fosforilación en la posición 493 de
ZAP-70 fosforilada.
6. Un método para la identificación de un
compuesto que interactúa con ZAP-70, que comprende
las etapas de:
- a)
- proveer una preparación de proteína que contiene ZAP-70 fosforilada,
- b)
- poner en contacto a la preparación de la proteína con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada sobre un soporte sólido y con un compuesto dado bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona, y
- c)
- detectar al complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona formado en la etapa b).
\vskip1.000000\baselineskip
7. El método de la reivindicación 6, en donde en
la etapa c) dicha detección se lleva a cabo por medio de la
determinación de la cantidad del complejo de ZAP-70
fosforilada con
7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 6 ó 7, en donde las etapas a) a c) se llevan a cabo
con diferentes preparaciones de proteína con el propósito de
analizar diferentes compuestos.
9. Un método para la identificación de un
compuesto que interactúa con ZAP-70, que comprende
las etapas de:
- a)
- proveer dos alícuotas de una preparación de una proteína que contiene ZAP-70 fosforilada,
- b)
- poner en contacto una alícuota con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada sobre un soporte sólido bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona,
- c)
- poner en contacto la otra alícuota con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada sobre un soporte sólido y con un compuesto dado bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona, y
- d)
- determinar la cantidad del complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona formado en las etapas b) y c).
\vskip1.000000\baselineskip
10. Un método para la identificación de un
compuesto que interactúa con ZAP-70, que comprende
las etapas de:
- a)
- proveer dos alícuotas que contienen cada una al menos una célula que contiene ZAP-70 fosforilada,
- b)
- incubar una alícuota con un compuesto dado,
- c)
- recoger las células de cada alícuota,
- d)
- lisar las células con el propósito de obtener preparaciones de proteína,
- e)
- poner en contacto las preparación de proteína con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada sobre un soporte sólido bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona, y
- f)
- determinar la cantidad del complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona formado en cada alícuota en la etapa e).
\vskip1.000000\baselineskip
11. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 9 ó 10, en donde una cantidad reducida del complejo
de ZAP-70 fosforilada con
7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona
formado en la alícuota incubada con el compuesto en comparación con
la alícuota no incubada con el compuesto indica que
ZAP-70 es un objetivo del compuesto.
12. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 11, en donde la cantidad del complejo de
ZAP-70 fosforilada con
7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona
se determina por medio de la separación de la ZAP-70
fosforilada de la
7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona
inmovili -zada y la posterior detección de la ZAP-70
fosforilada separada o la posterior determinación de la cantidad de
la ZAP-70 fosforilada separada.
13. El método de la reivindicación 12, en donde
se detecta la ZAP-70 fosforilada o se determina la
cantidad de ZAP-70 por medio de espectrometría de
masas o de métodos de inmunodetección, preferiblemente con un
anticuerpo dirigido contra ZAP-70 fosforilada,
preferiblemente con un anticuerpo que reconoce una fosforilación en
posición 493 de ZAP-70 fosforilada.
14. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, llevado a cabo como una selección de medio
o de alto rendimiento.
15. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en donde dicho compuesto se selecciona del
grupo que consiste de compuestos sintéticos, o de fármacos
sintéticos orgánicos, más preferiblemente fármacos orgánicos de
molécula pequeña, y compuestos naturales de molécula pequeña.
16. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en donde el compuesto que interactúa con
ZAP-70 es un inhibidor de
ZAP-70.
17. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en donde el soporte sólido se selecciona
del grupo que consiste de agarosa, agarosa modificada, bolitas de
sefarosa (por ejemplo, sefarosa activada con NHS), látex, celulosa,
y partículas ferromagnéticas o ferrimagnéticas.
18. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en donde la
7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona
está covalentemente acoplada al soporte sólido.
19. Un método para la purificación de
ZAP-70 fosforilada, que comprende las etapas de:
- a)
- proveer una preparación de proteína que contenga ZAP-70 fosforilada,
- b)
- poner en contacto la preparación de la proteína con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada sobre un soporte sólido bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de ZAP-70 fosforilada con 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6 -dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona, y
- c)
- separar la ZAP-70 fosforilada de la 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona inmovilizada.
\vskip1.000000\baselineskip
20. El método de la reivindicación 19, que
comprende además después de la etapa c) la identificación de las
proteínas que son capaces de enlazarse con ZAP-70
fosforilada.
21. El método de la reivindicación 19, que
comprende además después de la etapa c) la determinación de
modificaciones postraduccionales de ZAP-70
fosforilada.
22. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, en donde después de la etapa c) ya sea la
ZAP-70 fosforilada y/o las proteínas que son capaces
de enlazarse con ZAP-70 fosforilada se
caracterizan por métodos de espectrometría de masas o de
inmunodetección.
23. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22, en donde la provisión de una preparación de
proteína incluye las etapas de recolectar al menos una célula que
contenga ZAP-70 fosforilada y lisar la célula.
24. El uso de la
7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona
para la identificación de los compuestos que interactúan con
ZAP-70 in vitro.
25. El uso de la
7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona
para la purificación de ZAP-70 fosforilada.
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