CN103713066B - 一种奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的提取和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的提取和检测方法，包括待测样品制备、净化、检测和回收率实验；在婴幼儿奶粉中加入甲醇/水溶液，并经微波萃取得到待检液，并将其离心后经固相萃取，依次经水和甲醇/水溶液淋洗和洗脱溶剂洗脱得到洗脱液，将洗脱液蒸发浓缩后用甲醇溶剂稀释过滤得到待测样品溶液；配置阶梯浓度的标准工作溶液，将待测样品溶液和标准工作溶液在气相色谱-串联质谱仪(GC-MS/MS)上分别进样，获得工作曲线和质谱图，通过工作曲线和质谱图定性定量分析；然后称取4种香料含量确定的婴幼儿奶粉，依次经上述实验步骤测得4种香料浓度，将测定值与确定值计算得到回收率为83.6～107.8%。本发明具有提取效率高、准确定性定量测定、灵敏度高、结果准确的优点。
Description
技术领域
本发明属于食品检测领域，涉及微波萃取-固相萃取-气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)，具体是指一种奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的提取和检测方法，尤其适用于婴幼儿奶粉。背景技术
香料包括香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素是常用的日用化学品香料，也是重要的食品添加剂，广泛用作巧克力、冰淇淋、糕点的增香剂。但是，大剂量使用香兰素等香料将有害健康。近年来由于婴幼儿配方奶粉的质量优劣而频繁引发食品安全事件。因此, 建立准确、可靠地测定婴幼儿配方奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的含量非常重要。
婴幼儿配方奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素残留成分的检测方法主要包括从婴幼儿配方奶粉中提取残留的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素制成检样，以及对该检样进行测试分析两个步骤，其中检样制备至关重要，直接影响后续测试分析结果的准确性。分析方法可分为定性分析、定量分析和定性定量分析技术。定量分析一般采用色谱技术和色谱质谱联用技术，色谱技术有气相色谱和液相色谱等方法，色谱质谱联用技术有液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用等方法；定性定量分析则要兼具两种技术为一体，检测结果要同时提供目标物的结构信息和数量信息，根据欧盟委员会非强制执行法案2002/657/EC的规定，对禁用药物进行确证检测的方法必须能提供结构方面的信息，且要达到该法案规定的4个确证点。
目前，由于无相关标准可循，有关婴幼儿配方奶粉中香料或其他物质中的香料检测方法有液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-串联质谱法、毛细管电泳法，但目前还没有同时检测婴幼儿配方奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的微波萃取-固相萃取-气相色谱-串联质谱法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的提取和检测方法，该方法结合微波萃取-固相萃取-气相色谱-串联质谱法，能够对奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素同时进行测定，该方法具有准确、快速、灵敏度高的优点，为奶粉的快速检测提供了可靠的分析方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案是包括以下步骤：
（一）待测样品的制备：称取奶粉，配制同位素内标溶液，在奶粉中加入提取溶剂和同位素内标溶液，均匀搅拌后安装于微波萃取仪中，经微波萃取后，加提取溶剂定容得到待检液；
（二）待测样品的净化：将步骤（一）制备的待检液经离心得到净化液，将固定相萃取柱进行预处理，取净化液的上萃取柱，经水和甲醇/水溶液淋洗除去固体杂质，甲醇/水溶液中甲醇和水的体积比为1:9，再用洗脱溶剂洗脱萃取柱上的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素4种香料得到洗脱液，将洗脱液浓缩富集后，用甲醇溶剂稀释并经0.22μm微孔滤膜过滤后得到待测样品溶液；
（三）待测样品的检测：配制香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素4种香料溶液阶梯浓度的标准工作溶液，将步骤（二）中的待测样品溶液和标准工作溶液在气相色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以待测样品溶液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素4种香料的浓度和同位数内标溶液的浓度的比值为横坐标，再以待测样品溶液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素4种香料的峰面积和同位数内标溶液的峰面积的比值为纵坐标的工作曲线，还有获得可以确定母离子的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素4种香料和同位素的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用工作曲线对定量离子进行定量计算获得待测样品溶液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素4种香料浓度。
进一步设置是所述步骤（一）中的提取溶剂为甲醇/水溶液、乙醇/水溶液、甲醇、乙醇中的其中一种。优选，甲醇/水溶液的组分体积比为1:1；乙醇/水溶液的组分体积比也是1:1。
进一步设置是所述甲醇水溶液浓度为25%~90%。
进一步设置是所述步骤（一）中的微波萃取温度为60～80℃。
进一步设置是所述步骤（一）中的同位素内标溶液为13C6-香兰素、13C-甲基香兰素和D4-香豆素内标溶液。
进一步设置是所述步骤（二）中的萃取固定相为Waters Oasis HLB SPE柱，并通过甲醇、水对SPE柱进行活化处理。
进一步设置是所述步骤（二）中的洗脱溶剂为甲醇。
本发明的的原理和优点：
采用上述方案，首先，本发明通过微波萃取技术，以甲醇/水、乙醇/水、甲醇、乙醇为提取溶剂，在试样中加适量同位素内标溶液和提取溶剂浸泡，经涡旋振荡后，再在微波萃取仪中按一定温度、时间和功率进行萃取制得待检液。如果采用不加温的传统的超声萃取方法，有利于香料的稳定性，仅仅的超声作用施加不足以破坏香料与蛋白、脂肪等极性分子间形成的键合作用，造成香料解离溶出不彻底，影响提取效率，造成最终检测分析结果的准确性和重现性不好。本发明采用微波萃取，由于微波能是通过内部均匀加热加速分子运动破坏键合作用。因此在功率、温度、时间、压力可控的情况下，微波萃取可以使固体或半固体试样中的某些有机物成分与基体物质有效地分离，从而提高萃取效率，而且还能很好地重现萃取回收率。与传统的超声萃取、涡旋提取相比，本发明的提取方法提取效果好，回收率可以达到83.6～107.8%；远高于超声萃取的回收率74.6-83.2%和涡旋提取的回收率72.8-80.9%。而本发明的提取方法还具有快速、节能、节省溶剂、污染小，而且有利于萃取热不稳定物质的优点。
其次，本发明还对由微波萃取得到的待检液进行净化处理，该净化处理包括纯化和富集的过程。第一步纯化：先将待检液经离心初步净化，然后将离心后的净化液通过固相萃取分离的方法依次经过经水和甲醇/水溶液淋洗、甲醇洗脱；第二步富集：将第一步中纯化的待检液浓缩蒸干，然后加入甲醇溶液溶解、经0.22μm微孔滤膜过滤，得到净化的待检液。该净化后的待检液则不会对检测仪器造成污染。本发明中固相萃取的SPE柱为Waters Oasis HLB SPE柱，由于香料和其他杂质的极性大小存在差异，在固相萃取柱上吸附产生保留差异，然后通过优选的淋洗条件和洗脱条件，达到净化富集香料的目的。
再次，本发明对于婴幼儿配方奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素成分的定性定量检测分析是通过气相色谱-串联质谱仪(GC-MS/MS)分析。先配置一组阶梯形的标准工作溶液，然后将标准工作液和待检液在气相色谱-串联质谱仪上分别进样。待检液中出现的色谱峰保留时间与标准工作溶液一致，允许偏差小于±2.5 %，该色谱峰所对应的质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度一致，而且相对丰度偏差不超过规定，则可确定该待检液中含有香料。另外，在质谱定量分析中，有两种方法分别是内标法和外标法。内标法是将一定量的同位素标记物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。 选择内标物有4个要求：1.内标物应是该试样中不存在的纯物质；2.它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离；3.加入内标物的量应接近于被测组分；4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。外标法是用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法。由于内标法是通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差，其测定结果较为准确。而外标法虽然简便，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1为本发明具体实施例中的4种香料和3种同位素内标结构图；图1中，A：香兰素、B：甲基香兰素、C：乙基香兰素、D：香豆素E：13C6-香兰素、F：13C-甲基香兰素、G：D4-香豆素；
图2为本发明具体实施例中10 μg kg-1奶粉加标MRM色谱图；图2中，各小图分别对应：香兰素(A), 13C6-香兰素(B), 乙基香兰素 (C), 甲基香兰素 (D), 13C-甲基香兰素(E), 香豆素(F), D4-香豆素(G)；
图3为本发明具体实施例中4种香料和3种同位素内标GC-MS/MS扫描二级质谱图；图3中，各小图分别对应：香兰素(A), 13C6-香兰素(B), 乙基香兰素 (C), 甲基香兰素 (D), 13C-甲基香兰素(E), 香豆素(F), D4-香豆素(G) ；
图4为本发明具体实施例中4种香料和3种同位素内标GC-MS/MS扫描二级质谱图解析图谱；图4中，各小图分别对应：香兰素(A), 13C6-香兰素(B), 乙基香兰素 (C), 甲基香兰素 (D), 13C-甲基香兰素(E), 香豆素(F), D4-香豆素(G)；
图5为本发明具体实施例中内标标准曲线，图5中，各小图分别对应：香兰素(A), 甲基香兰素 (B), 乙基香兰素 (C),香豆素(D)；
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
包括以下步骤：
（一）待测样品的制备：称取婴幼儿配方奶粉1.0g，加入0.5mL13C6-香兰素、13C-甲基香兰素和D4-香豆素内标混合溶液(浓度均为400 ng mL-1)，再加入15mL甲醇/水混合溶液，均匀搅拌后安装于微波萃取仪中，经微波萃取后，萃取温度为70◦C，取出静置，取上层清液，用纯水定容至50mL容量瓶得到待检液；
（二）固相萃取净化：取HLB SPE柱，依次用甲醇和水活化SPE柱，取4～6mL待净化液至SPE柱，再依次用4～6mL水和4～6mL甲醇/水混合溶液(v/v, 1/9)淋洗SPE柱，将SPE柱真空抽干，用6～8mL的甲醇对SPE柱进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液浓缩后，用甲醇稀释过微孔滤膜后得到待测样品溶液；
（三）标准溶液的配置：取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素、13C6-香兰素、13C-甲基香兰素和D4-香豆素，用甲醇/水混合溶液分别配制成质量浓度为200 mg/L的单标储备液，进行测定使用时，用甲醇稀释上述标准储备液，将香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素分别配制成1.0，2.0，4.0，10.0，20.0 ng/mL的混合标准工作溶液，同时每个标准溶液里含有的13C6-香兰素、13C-甲基香兰素和D4-香豆素内标溶液均为10ng/mL；
（四）待测样品的检测：将步骤（二）（三）中的待测样品溶液和标准工作溶液在气相色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以标准工作溶液中每个香料的浓度和同位数内标溶液的浓度的比值为横坐标，再以标准工作溶液中每个香料的的峰面积和同位数内标溶液的峰面积的比值为纵坐标的工作曲线，还有获得可以确定母离子的香料和同位素的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用工作曲线对定量离子进行定量计算获得待测样品溶液中每个香料浓度。
参见表1，其为4种香料和3种同位素GC-MS/MS检测条件
参见表2为本发明实施例1的4种香料添加回收率、精密度及定量限
Claims (5)
1.一种奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的提取和检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（一）待测样品的制备：称取奶粉，配制同位素内标溶液，在奶粉中加入提取溶剂和同位素内标溶液，均匀搅拌后安装于微波萃取仪中，经微波萃取后，加提取溶剂定容得到待检液；
（二）待测样品的净化：将步骤（一）制备的待检液经离心得到净化液，取HLB SPE柱，依次用甲醇和水活化SPE柱，取4～6mL待净化液至SPE柱, 再依次用4～6mL水和4～6mL且体积比为1/9的甲醇/水混合溶液淋洗SPE柱, 将SPE柱真空抽干，用6～8mL的甲醇对SPE柱进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液浓缩后，用甲醇稀释过0.22μm微孔滤膜后得到待测样品溶液；
（三）待测样品的检测：配制香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素4种香料溶液阶梯浓度的标准工作溶液，将步骤（二）中的待测样品溶液和标准工作溶液在气相色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以标准工作溶液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素4种香料的浓度和同位数内标溶液的浓度的比值为横坐标，再以标准工作溶液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素4种香料的峰面积和同位数内标溶液的峰面积的比值为纵坐标的工作曲线，还有获得可以确定母离子的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素4种香料和同位素的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用工作曲线对定量离子进行定量计算获得待测样品溶液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素4种香料浓度。
2.根据权利要求1所述的一种奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的提取和检测方法，其特征在于：所述步骤（一）中的提取溶剂为甲醇/水溶液、乙醇/水溶液、甲醇、乙醇中的其中一种。
3.根据权利要求2中的一种奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的提取和检测方法，其特征在于：所述甲醇水溶液浓度为25%~90%。
4.根据权利要求1所述的一种奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的提取和检测方法，其特征在于：所述步骤（一）中的微波萃取温度为60～80℃。
5.根据权利要求1所述的一种奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的提取和检测方法，其特征在于：所述步骤（一）中的同位素内标溶液为13C6-香兰素、13C-甲基香兰素和D4-香豆素内标溶液。
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