CN112578038B - 一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法 - Google Patents

一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法 Download PDF

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Abstract

一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法，涉及一种药物分析检测方法，本发明以分析纯（阿拉丁@）的邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素与香兰素为标准样，建立工业邻位香兰素中杂质的分析检测方案；进行单一和混合样品的气相与液相色谱分析；以乙基香兰素为原料，以碳酸二甲酯为甲基化试剂，制备的到对‑甲氧基‑间‑乙氧基苯甲醛，作为第五种物质；本发明分析检测方法，追根溯源，从源头出发，首次制备得到五种有关物质，并以此对盐酸小檗碱中的有关物质进行了检测分析，建立了分析检测技术方案，确证了有关物质来源、结构、物种；检测分析表明盐酸小檗碱原料药中的五种有关物质的结构及含量。该技术填补了中国药典中盐酸小檗碱有关物质分析检测的空白。

Description

一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法
技术领域
本发明涉及一种药物分析检测方法，特别是涉及一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法。
背景技术
盐酸小檗碱作为抗炎等重点药物，其制备方法有两种，一种是黄连等植物提取法，一类是化学合成法，无论采用哪种方法生产盐酸小檗碱，其质量问题，尤其是原料药中的有关物质结构、种类、含量等已经显得至关重要。
根据«中国药典»2010版的盐酸小檗碱中的检查项目，盐酸黄连素药品质量需检测有关物质、氰化物、水分、炽灼残渣以及重金属等的含量，合成盐酸小檗碱的质量指标如表1所示。
表1 合成盐酸小檗碱质量标准2010版
Figure 889065DEST_PATH_IMAGE001
由表1可知，氰化物，由于工艺中使用了***，是可能的残留物。水分，由于产品结晶过程中与两个水分子结合生成二水合物，所以含有水的含量是确切的，也是可以确定的。炽灼残渣，有机物燃烧残渣是碳，无机物是渣。重金属，使用的催化剂为氯化铜，是可能的重金属来源。但是，表中对于盐酸小檗碱的有关物质，只给出了总含量小于或等于2%，而有关物质的来源不清，是什么不清，有多少种不清，是否有益或者有害不清，含量各多少不清。对有关物质的来源、结构及种类等进行研究显然对于盐酸小檗碱的产业发展具有重要意义，目前，对盐酸小檗碱中有关物质的研究未见报道。
«中华人民共和国药典»2010年版，二部中，关于盐酸小檗碱的有关物质的检查项目，规范测试按照如下进行：取本品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每lml中含l mg的溶液，作为供试品溶液；另取盐酸药根碱对照品和盐酸巴马汀对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每lml中含O.l mg的溶液，分别作为对照品溶液（1）和（2）；精密量取供试品溶液2ml和对照品溶液（1）和（2）各10ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液i取对照品溶液（2）1ml，用供试品溶液稀释至10 ml，摇匀，作为***适用性试验溶液。按照高效液相色谱法（附录VD ）试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.Ol mol/L 磷酸二氢铵溶液（用磷酸调节pH值至2.8）-乙腈（75:25）为流动相；检测波长为345 nm。取***适用性试验溶液lOpl，注入液相色谱仪，巴马汀峰与小檗碱峰间的分离度应符合要求。另取对照溶液l Ofxl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使小檗碱色谱峰的峰高约为满量程的25 % 。精密量取对照溶液与供试品溶液各10pl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的2倍。供试品溶液的色谱图中，如有与药根碱峰和巴马汀峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，均不得过1.0%；其他杂质峰面积的和不得大于对照溶液中小檗碱峰的峰面积（ 2.0 % ）。
对药典中测试分析技术研究可以看出，采用液相色谱法分析是常用的检测手段，由于不清楚盐酸小檗碱中的有关物质情况，只好以药根碱和巴马汀为对照品进行分析，而药根碱和巴马汀是植物提取法制备黄连素中的有关物质，而对于合成盐酸小檗碱中的有关物质就有待商榷，由此可知，中国药典中盐酸小檗碱的有关物质的检测分析技术的准确性值得商榷。
可见，盐酸小檗碱原料药中有关物质的分析检测，从源头追查，追根溯源，理论与实验确证合成盐酸小檗碱中的有关物质，以及盐酸小檗碱中有关物质的种类、结构及含量的分析检测非常必要，该技术方法研究未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法，该方法从源头追查，追根溯源，理论与实验确证了合成盐酸小檗碱中的有关物质，彻底改变了中国药典关于盐酸小檗碱中有关物质的检测分析技术和方法，填补了盐酸小檗碱中有关物质的种类、结构及含量的分析检测技术和方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法，所述方法包括以下检测步骤：
第一步，以分析纯（阿拉丁@）的邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素与香兰素为标准样，建立工业邻位香兰素中杂质的分析检测方案；
第二步，取分析纯邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素与香兰素，配制标准液，进行单一和混合样品的气相与液相色谱分析；
第三步，气相色谱条件：色谱柱：Agilent 19091J-413；进样口：250℃；柱头压：12PSI；程序升温：120℃（4min）—250℃（5min）；升温速率：10℃/min；进样量1μl；分流比：10:1溶剂：无水乙醇；出峰顺序和停留时间：邻位香兰素15.854min、甲基香兰素17.752min、乙基香兰素19.211min、香兰素19.705min；
第四步，高效液相色谱条件：色谱柱：C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.02mol/l醋酸铵水溶液=3:7；流速：0.6ml/min；检测波长：280nm；柱温：30℃；进样量：5μl；检测器：紫外检测器；出峰顺序和停留时间：香草醛 5.96min、乙基香兰素9.79min、甲基香兰素10.60min、邻位香兰素12.06min；
第五步，以工业邻位香兰素为原料，采用上述方案条件进行气相和液相色谱分析，检测得到原料中含有邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香兰素；
第六步，以乙基香兰素为原料，以碳酸二甲酯为甲基化试剂，制备的到对-甲氧基-间-乙氧基苯甲醛，作为第五种物质；
第七步，以邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香兰素以及对-甲氧基-间-乙氧基苯甲醛为原料，分别与胡椒乙胺进行缩合反应得到五种盐酸盐缩合物；
第八步，分别以得到的五种盐酸盐缩合物为原料，与乙二醛进行环合反应，得到五种盐酸盐环合产物；
第九步，分别取盐酸盐环合产物，重结晶精制后，配制标准液，进行单一和混合样品的高效液相色谱分析；
第十步，采用HPLC分析手段对盐酸小檗碱中的有关物质进行测试分析，色谱条件：色谱柱：Spherigel C18色谱柱；流动相：0.02mol·L-1乙酸铵溶液-乙腈(70：30)；检测波长为265nm；流速：0.6ml·min-1；柱温：30℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器(UVD)；并对建立的HPLC进行了方法学验证，盐酸小檗碱原料药（96~99.6μg·mL-1）及其有关物质（1~10μg·mL-1）在线性范围内称峰面积成良好的线性关系，线性相关系数R2>0.99,专属性强，仅在碱溶液破坏下分离不完全，其精密度（RSD=0.58%），重复性(RSD<10%)，稳定性(RSD=0.72%)均比较良好，在规定范围内，符合标准；
第十一步，采用上述方法对企业和实验室制备的盐酸小檗碱进行分析，得到盐酸小檗碱的纯度在98~99%之间，并确证盐酸小檗碱原料药中含有香兰素衍生物（0.41%）、对-甲氧基-间-乙氧基苯甲醛衍生物（0.34%）、甲基香兰素衍生物（0.24%）、乙基香兰素衍生物（0.08%）、邻位香兰素衍生物（0.01%）。
所述的一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法，所述五种盐酸盐盐缩合物，分别与乙二醛进行环合反应，分别得到五种盐酸盐环合产物，对其表征测试，确定结构。
所述的一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法，所述五种盐酸盐环合产物重结晶精制，分别配制标准液，建立盐酸小檗碱原料药中有关物质的分析检测方案。
所述的一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法，所述方法采用液相色谱分析，建立了色谱条件，检测得到盐酸小檗碱原料药中含有香兰素衍生物、间-乙氧基-对-甲氧基苯甲醛衍生物、甲基香兰素衍生物、乙基香兰素衍生物、邻位香兰素衍生物。
所述的一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法，所述采用液相色谱分析检测企业和实验样品，确证盐酸小檗碱中的有关物质来源于原料邻位香兰素的杂质以及甲基化产物。
本发明的优点与效果是：
本发明分析检测方法，追根溯源，从源头出发，首次制备得到五种有关物质，并以此对盐酸小檗碱中的有关物质进行了检测分析，建立了分析检测技术方案，确证了有关物质来源、结构、物种；检测分析表明盐酸小檗碱原料药中的五种有关物质的结构及含量。该技术填补了中国药典中盐酸小檗碱有关物质分析检测的空白。项目实施经济效益和社会效益显著。
1、本发明追根溯源，确证了有关物质的来源，起始物的结构、种类，为合成有关物质提供了理论依据。
2、本发明合成了五种有关物质，并确证了其结构，种类，为分析检测盐酸小檗碱中的有关物质提供了有力保证。
3、本发明建立了盐酸小檗碱中有关物质的分析检测技术和方法，可准确检测盐酸小檗碱中有关物质的种类、含量。
4、本发明检测分析结果表明，合成盐酸小檗碱中有关物质及其含量分别为香兰素衍生物（0.41%）、间-乙氧基-对-甲氧基苯甲醛衍生物（0.34%）、甲基香兰素衍生物（0.24%）、乙基香兰素衍生物（0.08%）、邻位香兰素衍生物（0.01%）。
5、本发明分析结果表明，盐酸小檗碱的纯度在98~99%之间，与生产实际一致。
附图说明
图1原料分析及甲基化反应；
图2有关物质合成、分析及样品检测
图3工业邻位香兰素原料中杂质的气相色谱分析；
图4工业邻位香兰素原料中杂质的高效液相色谱分析；
图5合成的间-乙氧基-对-甲氧基苯甲醛核磁谱图；
图6邻位香兰素衍生物的核磁谱图；
图7香兰素衍生物的核磁谱图；
图8甲基香兰素衍生物的核磁谱图；
图9乙基香兰素衍生物的核磁谱图；
图10间-乙氧基-对-甲氧基苯甲醛衍生物的核磁谱图；
图11***适用性试验的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
本发明一种盐酸小檗碱原料药中有关物质的分析检测方法，（1）以分析纯（阿拉丁@）的邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素与香兰素为标准样，建立工业邻位香兰素中杂质的分析检测方案；（2）取一定量的分析纯邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素与香兰素，配制标准液，进行单一和混合样品的气相与液相色谱分析；（3）气相色谱条件：色谱柱：Agilent 19091J-413；进样口：250℃；柱头压：12PSI；程序升温：120℃（4min）—250℃（5min）；升温速率：10℃/min；进样量1μl；分流比：10:1溶剂：无水乙醇。出峰顺序和停留时间：邻位香兰素15.854min、甲基香兰素17.752min、乙基香兰素19.211min、香兰素19.705min；（4）高效液相色谱条件：色谱柱：C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.02mol/l醋酸铵水溶液=3:7；流速：0.6ml/min；检测波长：280nm；柱温：30℃；进样量：5μl；检测器：紫外检测器。出峰顺序和停留时间：香草醛 5.96min、乙基香兰素9.79min、甲基香兰素10.60min、邻位香兰素12.06min；（5）以工业邻位香兰素为原料，采用上述方案条件进行气相和液相色谱分析，检测得到原料中含有邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香兰素；（6）以乙基香兰素为原料，以碳酸二甲酯为甲基化试剂，制备的到对-甲氧基-间-乙氧基苯甲醛，作为第五种物质；（7）以邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香兰素以及对-甲氧基-间-乙氧基苯甲醛为原料，分别与胡椒乙胺进行缩合反应得到五种盐酸盐缩合物；（8）分别以得到的五种盐酸盐缩合物为原料，与乙二醛进行环合反应，得到五种盐酸盐环合产物；（9）分别取一定量的盐酸盐环合产物，重结晶精制后，配制标准液，进行单一和混合样品的高效液相色谱分析；（10）采用HPLC分析手段对盐酸小檗碱中的有关物质进行测试分析，色谱条件：色谱柱：Spherigel C18色谱柱；流动相：0.02mol·L-1乙酸铵溶液-乙腈(70：30)；检测波长为265nm；流速：0.6ml·min-1；柱温：30℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器(UVD)。并对建立的HPLC进行了方法学验证，盐酸小檗碱原料药（96~99.6μg·mL-1）及其有关物质（1~10μg·mL-1）在线性范围内称峰面积成良好的线性关系，线性相关系数R2>0.99,专属性强，仅在碱溶液破坏下分离不完全，其精密度（RSD=0.58%），重复性(RSD<10%)，稳定性(RSD=0.72%)均比较良好，在规定范围内，符合标准。（11）采用上述方法对企业和实验室制备的盐酸小檗碱进行分析，得到盐酸小檗碱的纯度在98~99%之间，并确证盐酸小檗碱原料药中含有香兰素衍生物（0.41%）、对-甲氧基-间-乙氧基苯甲醛衍生物（0.34%）、甲基香兰素衍生物（0.24%）、乙基香兰素衍生物（0.08%）、邻位香兰素衍生物（0.01%）。
下面参照附图对本发明进行详细说明。
1.本发明的基本方案
第一步，以分析纯（阿拉丁@）的邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素与香兰素为标准样，建立工业邻位香兰素中杂质的分析检测方案；第二步，取一定量的分析纯邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素与香兰素，配制标准液，进行单一和混合样品的气相与液相色谱分析；第三步，气相色谱条件：色谱柱：Agilent 19091J-413；进样口：250℃；柱头压：12PSI；程序升温：120℃（4min）—250℃（5min）；升温速率：10℃/min；进样量1μl；分流比：10:1溶剂：无水乙醇。出峰顺序和停留时间：邻位香兰素15.854min、甲基香兰素17.752min、乙基香兰素19.211min、香兰素19.705min；第四步，高效液相色谱条件：色谱柱：C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.02mol/l醋酸铵水溶液=3:7；流速：0.6ml/min；检测波长：280nm；柱温：30℃；进样量：5μl；检测器：紫外检测器。出峰顺序和停留时间：香草醛5.96min、乙基香兰素9.79min、甲基香兰素10.60min、邻位香兰素12.06min；第五步，以工业邻位香兰素为原料，采用上述方案条件进行气相和液相色谱分析，检测得到原料中含有邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香兰素；第六步，以乙基香兰素为原料，以碳酸二甲酯为甲基化试剂，制备的到对-甲氧基-间-乙氧基苯甲醛，作为第五种物质；第七步，以邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香兰素以及对-甲氧基-间-乙氧基苯甲醛为原料，分别与胡椒乙胺进行缩合反应得到五种盐酸盐缩合物；第八步，分别以得到的五种盐酸盐缩合物为原料，与乙二醛进行环合反应，得到五种盐酸盐环合产物；第九步，分别取一定量的盐酸盐环合产物，重结晶精制后，配制标准液，进行单一和混合样品的高效液相色谱分析；第十步，采用HPLC分析手段对盐酸小檗碱中的有关物质进行测试分析，色谱条件：色谱柱：Spherigel C18色谱柱；流动相：0.02mol·L-1乙酸铵溶液-乙腈(70：30)；检测波长为265nm；流速：0.6ml·min-1；柱温：30℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器(UVD)。并对建立的HPLC进行了方法学验证，盐酸小檗碱原料药（96~99.6μg·mL-1）及其有关物质（1~10μg·mL-1）在线性范围内称峰面积成良好的线性关系，线性相关系数R2>0.99,专属性强，仅在碱溶液破坏下分离不完全，其精密度（RSD=0.58%），重复性(RSD<10%)，稳定性(RSD=0.72%)均比较良好，在规定范围内，符合标准。第十一步，采用上述方法对企业和实验室制备的盐酸小檗碱进行分析，得到盐酸小檗碱的纯度在98~99%之间，并确证盐酸小檗碱原料药中含有香兰素衍生物（0.41%）、对-甲氧基-间-乙氧基苯甲醛衍生物（0.34%）、甲基香兰素衍生物（0.24%）、乙基香兰素衍生物（0.08%）、邻位香兰素衍生物（0.01%）。
2.本发明的技术方法
本发明以工业邻位香兰素为原料，采用分析纯（阿拉丁@）的邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素与香兰素为标准样，采用气相和液相色谱分析确证工业邻位香兰素中的杂质；以乙基香兰素为原料，甲基化得到间-乙氧基-对-甲氧基苯甲醛；以邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香兰素以及间-乙氧基-对-甲氧基苯甲醛为原料，采用盐酸小檗碱合成工艺制备得到五种衍生物；以五种衍生物为标准样，建立HPLC分析检测条件；采用HPLC分析手段对盐酸小檗碱及其可能存在的有关物质进行测试分析。
3.本发明具体的实施方案
3.1 工业邻位香兰素中杂质分析
3.1.1高效液相色谱分析
（1）标准储备液的配制
精密称取邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香草醛标准品各25mg，分别置于25ml容量瓶中，用色谱纯乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，得到相应标准储备液，浓度为1mg/ml，于4℃冰箱保存。
（2）混合标准中间溶液的配制
①精密量取甲基香兰素、乙基香兰素和香草醛标准储备液适量，置于10ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，得到混合标准中间溶液，浓度分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001μg/ml，于4℃冰箱保存。
②精密量取邻位香兰素标准储备液适量，置于10ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，得到混合标准中间溶液，浓度分别为500、100、50、10μg/ml，于4℃冰箱保存。
（3）混合标准工作溶液的配制
分别精密量取混合标准中间溶液适量，置于10ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，得到系列线性混合标准工作溶液，供高效液相色谱仪测定。
（4）测试条件
高效液相色谱（型号：LCQ Deca XP，美国热电-菲尼根公司），色谱柱：C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.02mol/l醋酸铵水溶液(30：70)；流速：0.6ml/min；检测波长：280nm；柱温：30℃；进样量：5μl；检测器：紫外检测器(PDA)。
3.1.2 气相色谱分析
（1）标准储备液的配制
精密称取邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香草醛标准品各5.0g，分别置于25ml容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到相应标准储备液，浓度为0.2g/ml，于4℃冰箱保存。
（2）混合标准中间溶液的配制
精密量取甲基香兰素、乙基香兰素和香草醛标准储备液适量，置于10ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，得到混合标准中间溶液，浓度分别为200、20、2、0.2、0.02、0.002、0.0002μg/ml，于4℃冰箱保存。
（3）混合标准工作溶液的配制
分别精密量取混合标准中间溶液适量，置于10ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，得到系列线性混合标准工作溶液，供气相色谱仪测定。测试条件（4）气相色谱仪（型号：GC-7890，上海天美公司），色谱柱：Agilent 19091J-413（30m*320μm*0.25μm）；载气：N2和H2；进样口：250℃；柱头压：12PSI；程序升温：120℃（4min）—250℃（5min）；升温速率：10℃/min；进样量1μl；分流比：10:1。
3.2 间-乙氧基-对-甲氧基苯甲醛制备
以碳酸钾和苄基三乙基氯化铵为催化剂，n（乙基香兰素）：n（碳酸二甲酯）：n（无水碳酸钾）：n（苄基三乙基氯化铵）=1：1.3：0.02：0.03，在150℃下反应9h，收率为83.3%。
3.3 衍生物制备
（1）缩合反应
将备好的胡椒乙胺分别与缩合原料（邻位香兰素、香兰素、甲基香兰素以、乙基香兰素以及间-乙氧基-对-甲氧基苯甲醛）（质量比1:1.041）放入250ml四口烧瓶中，搅拌升温至70℃，恒温反应2h，缩合产物制备完成。
（2）加氢反应
先将制备好的缩合产物和甲醇（90或180ml）倒入高压反应釜中，再加入骨架镍（0.3g或0.6g），排出釜内空气，在釜内氢压3Mp的情况下，升温至70℃，升压至4Mp，温度升至110℃，关闭氢气阀门，直至压力表示数不在下降为止，补压至4Mp，在4Mp下保温、保压50min，降温静止，得到缩合氢化液，清洗反应釜。
（3）环合反应
用量筒量取冰乙酸（分析纯）71.25ml、醋酐（药厂提供）18.75ml，电子天平称取无水氯化铜（药厂提供）12.6g加入到250ml三口烧瓶内，***搅拌浆，转速控制150r/min；打开恒温水浴锅，升温至85℃，冷凝回流，滴加预热好的乙二醛（含量64～66%，）5.1ml，继续升温至117℃，加入盐酸盐缩合物30g，控制转速在250r/min，在114℃～118℃保温反应2小时。环合反应部分结束。
（4）常减压蒸醋酸
将环合反应后的三口烧瓶连接上蒸馏装置，加入转子，调节水浴锅温度在80℃，转速控制在200r/min，反应在一小时后，水浴锅温度调节至55℃，蒸馏装置连接上真空泵，压力控制在0.3个大气压，减压蒸醋酸；两个小时反应完成，收集到醋酸液体55ml，蒸酸结束。
（5）产物氧化除铜
蒸酸结束后向三口烧瓶中加入30ml水，调节温度在85℃，转速控制在200r/min，搅拌40分钟，搅拌结束后，加水至150ml，降温至30℃以下准备脱铜。用量筒量取12.5ml盐酸（含量37%，纯量29g）加入三口烧瓶中。如体积不够185ml，补水至185～190ml，关闭恒温水浴锅，降温，温度降至30℃以下，打开搅拌器，转速控制在200r/min，开始缓慢滴加已备好的双氧水（纯量4.5g，含量30%，密度1.11g/cm，约6.75ml），温度降至30℃以下过滤，用pH=2的酸水洗涤滤渣。
（6）产物水洗除铜
将产物移至3L三口烧瓶中加蒸馏水2000ml，转速控制在200r/min，搅拌30min，加入氨水10ml，搅拌40min，升温至85℃，加入洗干炭1.5g，在85℃～90℃保温40min，过滤，用热水洗涤滤渣，将滤液移至3L三口烧瓶中，转速控制在200r/min，搅拌30min，加入氨水5ml，搅拌40min，升温至85℃，加入洗干炭1.5g，在85℃～90℃保温40min，过滤，用热水洗涤滤渣，在3L三口烧瓶中加入浓盐酸（37%）25ml，将滤液转移至三口烧瓶中。搅拌降温，结晶至30℃以下为止，过滤，干燥。
（7）衍生物的表征分析，分别对产物进行红外、核磁以及热重的表征及分析。
3.4 盐酸小檗碱中有关物质的检测分析
3.4.1 溶液的配制
（1）盐酸小檗碱对照品溶液：取盐酸小檗碱对照品0.01g，置于量瓶中，加入流动相（醋酸铵水溶液和乙腈的混合溶液）溶解并稀释成每1ml含有0.001g的溶液.
（2）五种衍生物对照品溶液：取甲基香兰素衍生物、乙基香兰素衍生物、香兰素衍生物、间-乙氧基-对-甲氧基苯甲醛衍生物、邻位香兰素衍生物各0.01g，分别置于量瓶中，加入流动相（醋酸铵水溶液和乙腈的混合溶液）溶解并稀释成每1ml含有0.001g的溶液.
（3）供试品溶液：取盐酸小檗碱原料药#1和盐酸小檗碱原料药#2各0.01g，将其分别放入10ml的容量瓶中，加入流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得到所需供试品溶液。
（4）供试品对照溶液：取供试品溶液1ml，置于10ml容量瓶中，加入流动相溶解并稀释到刻度，摇匀，得到供试品对照溶液。
3.4.2 检测波长的确定
取上述的盐酸小檗碱对照品溶液及五种有关物质对照品溶液各1ml，用流动相稀释至0.1mg / ml，各样品溶液取10微升注射，并在波长范围为200-600nm内进行测试。记录下各个物质的特征波长，分析各个物质在哪一波长下有较强吸收，确定实验的检测波长。
3.4.3 ***适用性实验
选择乙酸铵与乙腈作为流动相测试在不同比例（乙酸铵：乙腈(V/V)=75：25，72.5：27.5，70：30，67.5：32.5，65：35，60：40）下的分离效果，分别取上述条件下的盐酸小檗碱及各有关物质对照品溶液各1ml加入到10ml的容量瓶中加流动相稀释、定容得到盐酸小檗碱及各有关物质混合对照品溶液，在上述乙酸铵与乙腈不同比例下依次进样并且记录色谱图，分析图谱，确定色谱条件。
3.4.4 杂质峰定位
取上述中盐酸小檗碱对照品溶液及五种有关物质对照品溶液各1ml，分别置于10ml容量瓶中，加入流动相稀释至刻度处，摇匀，得到0.1mg·mL-1的六种进样溶液。在确定的色谱条件下分别进样，记录六种色谱图，确定盐酸小檗碱及五种有关物质的保留时间。
3.4.5 破坏实验
（1）酸破坏试验
精密称取盐酸小檗碱原料药20mg，置于20ml量瓶中，加 0.5mol·L-1的盐酸5ml混合搅拌均匀放置12小时，然后加入0.5mol·L-1的氢氧化钠溶液5ml中和呈中性，加流动相稀释到刻度线处，摇匀，即得酸破坏溶液。将所得溶液滤过，滤液在确定的色谱条件下进行测定。记录色谱图。
（2）碱破坏试验
精密称取盐酸小檗碱原料药20mg，置于20ml容量瓶中，加0.5mol·L-1的氢氧化钠溶液5ml混合搅拌均匀放置12小时，然后加入0.5mol·L-1的盐酸5ml中和呈中性，加流动相稀释到刻度线处，摇匀即得碱破坏溶液。将所得溶液滤过，滤液在确定的色谱条件下进行测定，记录色谱图。
（3）氧化破坏试验
精密称取盐酸小檗碱原料药20mg，置于20ml容量瓶中，加过氧化氢溶液5ml混合均匀，室温下放置20min，加流动相稀释到刻度线处，摇匀即得氧化破坏溶液。将所得溶液滤过，滤液在确定的色谱条件下进行测定，记录色谱图。
（4）高温破坏试验
精密称取盐酸小檗碱原料药两份各20mg，分别置于20ml容量瓶中，加流动相稀释到刻度线处，摇匀，将两份溶液分别放于50℃，80℃的烘箱中12h后取出，冷却到室温得到两份高温破坏溶液。将所得的两份溶液滤过，滤液在确定的色谱条件下进行测定，记录色谱图。
3.4.6 线性实验
精密称取盐酸小檗碱对照品100mg，置100ml的容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得到盐酸小檗碱贮备液，精密移取一定的盐酸小檗碱贮备液，用流动相稀释得到0.96、0.97、0.98、0.99、0.996mg·mL-1的溶液。精密称取有关物质各10mg，置10ml的容量瓶中，加流动相溶解至刻度，摇匀，得到有关物质贮备液，各精密量取一定的有关物质贮备液，用流动相稀释制得1、2、4、6、8μg·mL-1的溶液（相当于供试品溶液浓度的0.1%~1%），以高效液相色谱法测定各个浓度下各个物质的峰面积,以各物质溶液浓度c（μg·mL-1）为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，计算回归方程及其回归系数（R2）。
3.4.7 精密度实验
精密称取盐酸小檗碱原料药1mg，置100ml量瓶中，加流动相溶解、稀释并定容至刻度，得到1%稀溶液（10μg·mL-1），取1%稀释溶液，连续进样6次，记录色谱图并积分。
3.4.8 稳定性实验
精密称取东北制药公司提供的盐酸小檗碱原料药5mg，各六份，置于烧杯中，加流动相溶解，转移至容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。在室温25℃且无光照条件下封闭放置0h、4h、8h、12h、24h.取10μl进样，记录色谱图并对盐酸小檗碱进行积分，计算相对标准偏差。
3.4.9 重复性实验
精密称取同一批次盐酸小檗碱原料药10mg共六份，分别置10ml量瓶中，加流动相溶解，定容至刻度处，摇匀，得到六份1mg·mL-1的盐酸小檗碱溶液，按照确定的色谱条件进行进样，记录色谱图并计算最大杂质峰面积。
3.5 盐酸小檗碱原料药样品测试
（1）取上述条件下供试品对照溶液，在确定的色谱条件下进行进样，记录色谱图，并对色谱图中各峰面积进行积分计算。
（2）盐酸小檗碱混合样品测试
取上述条件下盐酸小檗碱对照品溶液及有关物质对照品溶液适量，加入容量瓶稀释定容，配制成盐酸小檗碱含量：衍生物含量为98：2，将配置好的溶液在确定的色谱条件下进行进样，记录色谱图。
（3）盐酸小檗碱样品测试
精密称取盐酸小檗碱样品1mg，置10ml的容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得到0.1mg·mL-1的盐酸小檗碱溶液，在确定的色谱条件下进行进样，记录色谱图。
(4) 色谱条件：色谱柱：Spherigel C18色谱柱；流动相：0.02mol·L-1乙酸铵溶液-乙腈(70：30)；检测波长为265nm；流速：0.6ml·min-1；柱温：30℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器(UVD)
测定法：精密称取盐酸小檗碱原料药及各有关物质对照品各10mg，置10ml量瓶中，加流动相溶解、定容，摇匀，即得盐酸小檗碱及各有关物质对照品贮备液，精密量取各贮备液1.0mL，置10ml量瓶中，加流动相稀释定容，摇匀，即得到盐酸小檗碱原料药及各有关物质混合对照品溶液。在上述色谱条件下进样测定，记录色谱图。结果显示，盐酸小檗碱峰与各有关物质峰分离度均大于1.5，理论板数按盐酸小檗碱峰计大于5×103。符合测定要求。

Claims (4)

1.一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法，其特征在于，所述方法包括以下检测步骤：
第一步，以分析纯的邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素与香兰素为标准样，建立工业邻位香兰素中杂质的分析检测方案；
第二步，取分析纯邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素与香兰素，配制标准液，进行单一和混合样品的气相与液相色谱分析；
第三步，气相色谱条件：色谱柱：Agilent 19091J-413；进样口：250℃；柱头压：12PSI；程序升温：120℃保持4min，升温到250℃，保持5min；升温速率：10℃/min；进样量1μl；分流比：10:1；溶剂：无水乙醇；出峰顺序和保留时间：邻位香兰素15.854min、甲基香兰素17.752min、乙基香兰素19.211min、香兰素19.705min；
第四步，高效液相色谱条件：色谱柱：C18柱 150mm×4.6mm，5μm；流动相：乙腈-0.02mol/l醋酸铵水溶液=3:7；流速：0.6ml/min；检测波长：280nm；柱温：30℃；进样量：5μl；检测器：紫外检测器；出峰顺序和保留时间：香草醛5.96min、乙基香兰素9.79min、甲基香兰素10.60min、邻位香兰素12.06min；
第五步，以工业邻位香兰素为原料，采用上述色谱条件进行气相和液相色谱分析，检测得到原料中含有邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香兰素；
第六步，以乙基香兰素为原料，以碳酸二甲酯为甲基化试剂，制备得到对-甲氧基-间-乙氧基苯甲醛，作为第五种物质；
第七步，以邻位香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香兰素以及对-甲氧基-间-乙氧基苯甲醛为原料，分别与胡椒乙胺进行缩合反应得到五种盐酸盐缩合物；
第八步，分别以得到的五种盐酸盐缩合物为原料，与乙二醛进行环合反应，得到五种盐酸盐环合产物；
第九步，分别取盐酸盐环合产物，重结晶精制后，配制标准液，进行单一和混合样品的高效液相色谱分析；
第十步，采用HPLC分析手段对盐酸小檗碱中的有关物质进行测试分析，色谱条件：色谱柱：Spherigel C18色谱柱；流动相：0.02mol·L-1乙酸铵溶液-乙腈=70：30；检测波长为265nm；流速：0.6ml·min-1；柱温：30℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器；并对建立的HPLC进行了方法学验证，盐酸小檗碱原料药96~99.6μg·mL-1及其有关物质1~10μg·mL-1在线性范围内称峰面积成良好的线性关系，线性相关系数R2>0.99,专属性强，仅在碱溶液破坏下分离不完全，其精密度RSD=0.58%，重复性RSD<10%，稳定性RSD=0.72%均比较良好，在规定范围内，符合标准；
第十一步，采用第十步的方法对企业和实验室制备的盐酸小檗碱进行分析，得到盐酸小檗碱的纯度在98~99%之间，并确证盐酸小檗碱原料药中含有小檗红碱、香兰素盐酸黄连素、甲基盐酸黄连素、乙基盐酸黄连素、3-乙基，4-甲氧基苯甲醛盐酸黄连素。
2.根据权利要求1所述的一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法，其特征在于，所述五种盐酸盐缩合物，分别与乙二醛进行环合反应，分别得到五种盐酸盐环合产物，对其表征测试，确定结构。
3.根据权利要求2所述的一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法，其特征在于，所述五种盐酸盐环合产物重结晶精制，分别配制标准液，建立盐酸小檗碱原料药中有关物质的分析检测方案。
4.根据权利要求1所述的一种盐酸小檗碱原料药分析检测方法，其特征在于，所述采用第十步的方法对企业和实验室制备的盐酸小檗碱进行分析，确证盐酸小檗碱中的有关物质来源于原料邻位香兰素的杂质以及甲基化产物。
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