CN106872629A - 一种测定乳制品中三氮脒含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定三氮脒含量的方法，其特征在于：采用有机溶剂固相萃取待测物中的三氮脒，采用液相色谱质谱联用法测定其含量。本发明提供的酸化乙腈振荡提取固相萃取柱净化的前处理方法具有快速，选择性强，污染小，检测限低的特点。本发明可以实现牛奶和奶粉中三氮脒含量的测定。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体地，涉及一种测定三氮脒含量的方法，更具体地，涉及一种乳制品(特别是牛奶)中三氮脒含量的测定方法。
背景技术
三氮脒是目前比较常用的新型抗血液原虫药，主要使用对象为泌乳期的奶牛，不合理的使用会造成生鲜乳中兽药残留，存在一定的安全风险。
目前国内没有该兽药对应的检测方法，国内外的文献中鲜有报道。但是国内外知名乳品企业已经开始在生鲜乳中检测该参数，以作为生鲜乳中风险监测的常规指标，故建立该参数的检测方法就非常迫切。
发明内容
针对上述缺陷，本发明提供的方法解决了测定待测物(特别是，乳制品)中三氮脒的问题。实现了分析待测物(特别是针对乳制品这类物质)中，是否存在有三氮脒的检测。本发明提供的酸化乙腈振荡萃取的方法快速，回收率高，对仪器不造成污染，并有效的降低了检出限。
本发明提供了一种测定三氮脒含量的方法，其特征在于：采用酸化乙腈振荡萃取待测物中的三氮脒，采用液相色谱质谱联用法测定其含量。
进一步地，本发明提供的一种测定三氮脒含量的方法，还具有如下特点：即、具体检测步骤如下所示：
步骤一、于待测物中加入酸化乙腈溶液，均质，提取0.5-5分钟后，离心2-20分钟；
酸化乙腈可以为甲酸乙腈、乙酸乙腈、丙酸乙腈等各类酸化乙腈溶液。
优选提取0.5-1.5分钟，离心3-6分钟。在步骤一中，该均质、和/或提取、和/或离心的过程可以为一次或多次，优选为2-3次。
在本发明的具体操作过程中，采用酸化的乙腈可以很好地沉淀乳制品的蛋白质，其分离效果极好。
步骤二、取上清液加载到固相萃取柱中，依次采用至少一次的碱液、至少一次的醇溶液、至少一次的酸化醇溶液洗脱，收集全部洗脱液；
固相萃取柱可以选自弱阳离子交换柱，当采用弱阳离子交换柱时，需用酸性溶液洗脱待测物品。在本发明的具体操作过程中发现，选用酸性溶液洗脱待测物较其他溶剂洗脱效果好。
该上清液的取用量为总量的50-90％。
该碱液、醇溶液和酸化醇溶液的用量为上清液的0.5-5倍。
该碱液、醇溶液和酸化醇溶液的体积比为1:0.8-1.5:0.8-1.5。
步骤三、洗脱液在30-60℃的温度下，经由保护气干燥浓缩(如：氮气等保护气吹干等方式)，用酸和乙腈的混合水溶液定容；
酸和乙腈的混合水溶液用量，按检测的需要进行配置，或按浓度比例进行配置。
步骤四、过滤后，采用液相色谱质谱联用法对其进行定量分析；
该过滤方式可以为膜过滤、以石英砂、硅胶、海藻砂、滤纸等为介质的过滤。
其中，上述步骤一的过程为至少一次。
进一步地，本发明提供的一种测定三氮脒含量的方法，还具有如下特点：即、上述酸化乙腈为0.8-1.5％的甲酸乙腈溶液。
即、由X ml的甲酸，溶解于(100-X)ml的乙腈中后，定容到100，即获得X％的甲酸乙腈溶液。
进一步地，本发明提供的一种测定三氮脒含量的方法，还具有如下特点：即、在步骤一中，上述提取的方式优选为涡旋震荡提取法；
每10g待测物中加入15-30ml的酸化乙腈溶液；
上述离心的转速>8000r/min。
进一步地，本发明提供的一种测定三氮脒含量的方法，还具有如下特点：即、在步骤二中，上述固相萃取柱为经醇溶液和水，活化平衡后的WCX固相萃取柱；其中，醇溶液和水的体积比例为1:0.5-2；优选为1:0.8-1.2。
上述碱液选自质量百分比浓度为0.1-1.5％的氨水；
上述醇溶液选自甲醇、乙醇、丙醇中的一种或几种；
上述酸化的醇溶液选自0.5-2％的甲酸甲醇、乙酸甲醇、甲酸乙醇、乙酸乙醇、乙酸丙醇中的一种或几种；
即为将Y ml的酸加入到(100-Y)ml的醇溶液中，即得到Y％的酸化醇溶液。
进一步地，本发明提供的一种测定三氮脒含量的方法，还具有如下特点：即、步骤三中，上述酸选自甲酸、乙酸和丙酸中的一种或几种；
上述酸的质量百分比浓度为0.01-1％；
上述乙腈的质量百分比浓度为1-25％。
进一步地，本发明提供的一种测定三氮脒含量的方法，还具有如下特点：即、上述步骤四中的过滤为膜过滤。
进一步地，本发明提供的一种测定三氮脒含量的方法，还具有如下特点：即、在液相色谱质谱联用法的条件为：
色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱；
流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；
流速0.3ml/min；
梯度洗脱程序：0-0.1min，10％B；0.1-0.4min，95％B；0.4-0.5min,10％B；
质谱采集采用选择选择离子扫描方式。
进一步地，本发明提供的一种测定三氮脒含量的方法，还具有如下特点：即、上述离子扫描方式的扫描时间为5分钟；
定性离子对：282.3/119.1，254.2；
锥孔电压：12；
碰撞能量：34,20。
进一步地，本发明提供的一种测定三氮脒含量的方法，还具有如下特点：即、上述待测物为乳制品。更优选为牛奶。
本发明的作用和效果
本发明首次采用了液相色谱质谱联用的方法来实现待测物质(特别是乳制品)中的三氮脒含量的测定。此外，本发明提供的方法具有快速，回收率高，选择性强，污染小，检测限低的特点。
附图说明
附图1、三氮脒总离子流图。
具体实施方式
实施例一、测定
一、试样制备
称取约100g生牛乳，-4℃下保存。
二、提取
称取试样10g，加入1％甲酸乙腈(或替换为0.8％的甲酸乙腈、1.2％的乙酸乙腈、1.5％的甲酸乙腈)溶液20ml(或为15ml、25ml、30ml)，均质，涡旋震荡提取1min(根据浓度的不同，当浓度高时提取的时间略长，可达5min，当浓度低时提取的时间略短，可达0.5min，此外，在此提取过程中，可采用少量溶剂多次提取的方式来实现)，10000r/min高速离心5min(根据浓度的不同，当浓度高时提取的时间略长，可达20min，当浓度低时提取的时间略短，可达2min)。
三、净化
离心后呈固液分离装，取10ml(根据需要可采集5-30ml的上清液)的上清液直接加载到活化平衡(3mL甲醇，3mL水)好的WCX固相萃取柱中，用3ml 0.75％氨水(或0.1％、0.5％、1％、1.5％)，3ml甲醇(或乙醇)淋洗，3ml 1％甲酸甲醇(或0.5％甲酸甲醇、0.8％乙酸甲醇、1.5％甲酸乙醇、1.8％乙酸乙醇、2％乙酸丙醇)洗脱，收集全部洗脱液。
四、浓缩
洗脱液在40℃下氮气吹干，用0.1％甲酸10％乙腈水溶液(或0.01％乙酸25％乙腈、0.05％甲酸20％乙腈、1％乙酸1％乙腈)定容至1ml(或0.5-5ml)。过滤膜，GC-MS测定。
五、测定
色谱参考条件
色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；流速0.3mL/min；梯度洗脱程序：0-0.1min，10％B；0.1-0.4min，95％B；0.4-0.5min,10％B；
六、色谱分析
由自动进样器分别吸取5.0μL标准混合溶液和净化后的样品溶液注入色谱仪中，以保留时间、离子丰度比定性，以样品溶液峰面积与标准溶液峰面积比较定量。
实施例二、结果和分析
一、定性分析
每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合对照品基质标准溶液中对应的保留时间偏差在2.5％以内，且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的对照品基质标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
二、定量分析
色谱峰的测量
在仪器最佳工作条件下，混合对照品基质液配制标准工作曲线，外标法定量
计算
式中：
X——样品中被测药物的残留量，μg/kg；
C——被测样品的浓度，ng/ml；
f——稀释因子；
V——样品定容体积，ml；
m——样品称取质量，g；
三、精密度：
本方法批内标准偏差<20％，批间标准偏差<20％。
四、准确度和灵敏度：
准确度：回收率80％～120％之间，具体请参看相应记录。
灵敏度：检出限为1.0μg/kg。
五、质控
(1)检测样品每做20个平行需要带1个质控样。
(2)实验之前确认加标水平是否能达到检出限要求。在阴性样品中加入检出限水平的标准物质，按标准方法测定，计算信噪比，信噪比应该≥3。
(3)如筛选出阳性样品，必须进行复测。定量时必须注意样品提取液中浓度与标样浓度相近。如条件许可，可以针对农药性质采用其他定量准确的检测手段来进一步定量测定。
实施例三、验证试验：
三氮脒
标准物质名称：三氮脒含量：87.5％有效期：2016-07-12来源：Dr.E
定性离子对：282.3/119.1,254.2锥孔电压：12碰撞能量：34,20
1.标准曲线
| 浓度C(μg/L) | 1、2、3、5、10、20 |
| 线性方程 | y＝105.004X+22.3277 |
| 相关系数r | 0.992 |
2.检出限
空白样品中添加1μg/ml标准溶液10μl于10.0g(即加标浓度为：1.0μg/kg)，经样品前处理，仪器测定后，被测物的信噪比S/N>3，表明方法的检出限可至1.0μg/kg。
3.回收率及变异系数
样品基质：牛奶
Claims (10)
1.一种测定三氮脒含量的方法，其特征在于：采用酸化乙腈提取待测物中的三氮脒后，采用液相色谱质谱联用法对其进行定量分析。
2.如权利要求1所述的一种测定三氮脒含量的方法，其特征在于，具体检测步骤如下所示：
步骤一、于待测物中加入酸化乙腈溶液，均质，提取0.5-5分钟后，离心2-20分钟；
步骤二、取上清液加载到固相萃取柱中，依次采用至少一次的碱液、至少一次的醇溶液、至少一次的酸化醇溶液洗脱，收集全部洗脱液；
步骤三、洗脱液在30-60℃的温度下，经由保护气干燥浓缩，用酸和乙腈的混合水溶液定容；
步骤四、过滤后，采用液相色谱质谱联用法对其进行定量分析；
其中，所述步骤一的过程为至少一次。
3.如权利要求2所述的一种测定三氮脒含量的方法，其特征在于：
所述酸化乙腈为0.8-1.5％的甲酸乙腈溶液。
4.如权利要求2所述的一种测定三氮脒含量的方法，其特征在于：
在步骤一中，所述提取的方式为涡旋震荡提取法；
每10g待测物中加入15-30ml的酸化乙腈溶液；
所述离心的转速>8000r/min。
5.如权利要求2所述的一种测定三氮脒含量的方法，其特征在于：
在步骤二中，所述固相萃取柱为经醇溶液和水，活化平衡后的WCX固相萃取柱；
所述碱液选自质量百分比浓度为0.1-1.5％的氨水；
所述醇溶液选自甲醇、乙醇、丙醇中的一种或几种；
所述酸化的醇溶液选自0.5-2％的甲酸甲醇、乙酸甲醇、甲酸乙醇、乙酸乙醇、乙酸丙醇中的一种或几种。
6.如权利要求2所述的一种测定三氮脒含量的方法，其特征在于：
步骤三中，所述酸选自甲酸、乙酸和丙酸中的一种或几种；
所述酸的质量百分比浓度为0.01-1％；
所述乙腈的质量百分比浓度为1-25％。
7.如权利要求2所述的一种测定三氮脒含量的方法，其特征在于：
所述步骤四中的过滤为膜过滤。
8.如权利要求2所述的一种测定三氮脒含量的方法，其特征在于：
在液相色谱质谱联用法的条件为：
色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱；
流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；
流速0.3mL/min；
梯度洗脱程序：0-0.1min，10％B；0.1-0.4min，95％B；0.4-0.5min,10％B；
质谱采集采用选择选择离子扫描方式。
9.如权利要求2所述的一种测定三氮脒含量的方法，其特征在于：
所述离子扫描方式的扫描时间为5分钟；
定性离子对：282.3/119.1，254.2；
锥孔电压：12；
碰撞能量：34,20。
10.如权利要求1-9任一所述的一种测定三氮脒含量的方法，其特征在于：
所述待测物为乳制品；
所述待测物优选为牛奶。
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