CN106841451A - 基于超高效液相色谱‑轨道阱高分辨质谱的小鼠血液中香豆素及其代谢物的测定方法 - Google Patents
基于超高效液相色谱‑轨道阱高分辨质谱的小鼠血液中香豆素及其代谢物的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种基于超高效液相色谱‑轨道阱高分辨质谱的小鼠血液中香豆素及其代谢物的测定方法,其特征在于:以4‑甲基伞形酮为内标,样品用乙腈沉淀蛋白后,直接进入XDB‑C18色谱柱分离和质谱仪分析,质谱采用一级全扫描和数据依赖二级扫描(Full MS/ddMS2)模式。香豆素是小鼠细胞色素P450 2A5(cytochrome P450 2A5,CYP2A5)的特异性底物,通过液质联用技术测定小鼠血液中7‑羟基香豆素的生成来评估CYP2A5酶活性的改变。该方法选择性好,分析效率高,操作简单、稳定快速,灵敏度高,重复性好,适合于小鼠血液中香豆素及其代谢物的检测与分析。
Description
技术领域
本发明涉及动物血液复杂基质中香豆素的测定方法,具体是一种基于超高效液相色谱-轨道阱高分辨质谱(UPLC-Orbitrap HRMS)的小鼠血液中香豆素及其代谢物的测定方法,该方法采用内标法定量,通过超高效液相色谱-轨道阱高分辨质谱(UPLC-OrbitrapHRMS)对小鼠血液中香豆素及其代谢物进行检测,以此为基础用香豆素为探针药物评估细胞色素CYP2A5酶活性的变化。
背景技术
细胞色素P450(cytochromeP450,CYP)是在动植物、微生物的各组织中广泛存在的一类含有铁卟啉辅基的b族细胞色素,参与多种内、外源性物质的代谢,在药理学和毒理学方面具有十分重要的地位。通过添加抑制剂或诱导剂使关键代谢酶的活性发生改变,进而测定其特异性底物的代谢产物生成量变化,可以更直观的评估其活性。细胞色素酶P4502A6(cytochrome P450 2A6,CYP2A6)是人体重要的药物代谢酶,约占人类CYP450酶***的5%,参与环磷酰胺、丙戊酸钠、咖啡因及尼古丁等代谢,能将烟草中大量的亚硝胺致癌原如N-亚硝基二甲胺、NNK、NNN等激活为强致癌物。小鼠CYP2A5是与人类 CYP2A6起源相同的代谢酶,其氨基酸序列与CYP2A6有84%同源,结构和功能极为相似。香豆素是CYP2A5的特异性底物,能被CYP2A5代谢为7-羟基香豆素排出。将香豆素用作CYP2A5的探针底物,通过测定其特异性代谢产物7-羟基香豆素含量来评价其酶活性,是公认的CYP2A5酶活性检测方法。
文献报道过多种香豆素类化合物的检测方法,如传统检测方法荧光分光光度计法(Miles J S, McLAREN A W, Forrester L M, et al. Identification of the humanliver cytochrome P-450 responsible for coumarin 7-hydroxylase activity[J].Biochemical Journal, 1990, 267(2): 365-371.),该方法利用香豆素在香豆素羟基化酶即CYP2A5酶的催化下,转化为羟基香豆素后荧光峰值的变化来定性分析,利用荧光强度值来定量分析,但是该方法专一性灵敏度较低,稳定性较差,无法给出加合物的结构信息;随后的高效液相色谱(HPLC)法(Lake B G, Evans J G, Chapuis F, et al. Studies onthe disposition, metabolism and hepatotoxicity of coumarin in the rat andSyrian hamster[J]. Food Chem Toxicol, 2002, 40(6): 809-823)、高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)(Sotaniemi E A, Rautio A, Backstrom M, et al. CYP3A4 andCYP2A6 activities marked by the metabolism of lignocaine and coumarin inpatients with liver and kidney diseases and epileptic patients[J]. Britishjournal of clinical pharmacology, 1995, 39(1): 71-76.)以及高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-RF)(王二豪,郭延垒,张有金,石亮,张远冬,王应雄,杨竹,于超. HPLC-RF测定小鼠肝微粒体中CYP2A5的酶活性 [J]. 中国临床药理学杂志, 2013, 29(9): 692-624.),虽然在引入高效液相色谱之后在检测灵敏度方面有了很大提高,但是同样不能给出待测物的准确结构信息,专一性也没有得到改善;超高效液相色谱-轨道阱高分辨质谱法(UPLC-Orbitrap HRMS)具有检测限低、选择性好、灵敏度高、稳定性强等优点,近年来已多应用于药物分析及复杂生物基质检测领域(安卓玲, 史忱, 赵瑞, 等. 基于超高效液相色谱-质谱的药物性肝损伤患者血清代谢组学研究[J]. 分析化学, 2015, 43(9): 1408-1414.),但是对于检测小鼠体内香豆素及其代谢物方面还没有研究。
发明内容
本发明的目的正是基于上述现有技术状况而采用UPLC-Orbitrap HRMS法建立的一种简单、快速、灵敏度高的测定小鼠血液中香豆素及其代谢物的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种基于UPLC-Orbitrap HRMS的小鼠血液中香豆素及其代谢物的测定方法,通过样品的采集及前处理、收集血液样品于离心管中,加入内标溶液,沉淀蛋白混匀离心后,采用超高效液相色谱-高分辨质谱分析检测小鼠血液中香豆素及其代谢物,根据试验结果测定香豆素及其代谢物并绘制相应的时间-浓度曲线进行药代动力学分析。
本发明包括以下具体步骤:
a、样品采集:小鼠通过腹腔注射CYP2A5探针药物香豆素溶液后眼眦取血约0.5 mL,置于1.5 mL离心管中,立即于4 ℃、6 000 rpm下离心10 min;
b、样品前处理:取100 μL上清血清至1.5 mL离心管内,加入20 μL浓度为100 ng/mL的4-甲基伞形酮溶液和280 μL乙腈,涡旋30 s以充分混匀,超声10 min,于4 ℃、12 000 rpm下离心10 min,取上清液,用0.22 μm有机相针式滤器过滤,装入色谱瓶中待测;
c、标准工作液的配制:使用甲醇溶解、乙腈定容,配制一系列浓度的香豆素、7-羟基香豆素的混合标准工作溶液;
d、定量分析:使用超高效液相色谱-轨道阱高分辨质谱(UPLC-Orbitrap HRMS)对混合标准工作溶液进行分析,得到线性回归方程,再对待测样品进行测定测得分析物与内标峰面积的比值,代入一元线性回归方程,求得样品中目标物的含量;
色谱条件: Agilent Zorbax Eclipse XDB–C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,3.5 µm),柱温25 ℃,进样量2 μL,流速0.2 mL/min;流动相A:0.1%甲酸水溶液,B:乙腈(A:B=70:30)。
质谱条件:使用Q-Exactive轨道阱高分辨质谱***的电加热喷雾离子源(HESI),喷雾电压3.5 kV,毛细管加热温度320 ℃,加热器温度300 ℃。鞘气(Sheath gas)流速1.67L/min,辅助气(Aux gas)流速1 L/min。扫描采用Full MS/ddMS2正离子模式,一级全扫描范围200±100 amu,分辨率7×104,离子最大注入时间50 ms,自动增益控制(AGC)1×106;使用数据依赖扫描(Data dependent)为二级扫描模式,分辨率为1.75×104,自动增益控制1×105,最大注入时间50 ms,归一化碰撞能量(NCE)60%。
各目标化合物质量数和主要二级子离子见表一。
。
本发明方法的线性范围和检出限:
香豆素、7-羟基香豆素、4甲基伞形酮分别使用甲醇溶解,乙腈定容配制浓度为100 μg/mL的标准储备液,加入小鼠空白血清,配制一系列不同浓度的标准溶液,其中7-羟基香豆素和香豆素的浓度依次为0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL,内标4-甲基伞形酮浓度始终为5 ng/mL。采用内标定量法,以目标物与内标的色谱峰面积之比(Y)对相应的目标物浓度(X)进行线性回归,即可得到各目标物的工作曲线方程及相关系数。重复进样最低浓度的标准使用液10次,计算其标准偏差,以标准偏差的3倍和10倍值为方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。结果如表2所示,香豆素及其代谢物在0.2 ng/mL~1 000 ng/mL范围内线性良好,方法检出限在0.011~0.016 ng/mL之间,定量限在0.036~0.052 ng/mL之间。
。
本发明方法的回收率和重复性:
取空白血清,加入目标物标准溶液,制备高、中、低3种浓度的质控样品,香豆素及其代谢物浓度为1、50和500 ng/mL,内标浓度为5 ng/mL,采用上述方法进行前处理和内标法定量分析。于同一天内,对高、中、低3个浓度的质控样品分别进行6次重复进样分析,定量测定目标物含量,进而计算出3个浓度水平下目标物的日内精密度和回收率,如表3所示,3种浓度的质控样品回收率为90.2%~110.4%,精密度(RSD)在1.86%~7.08%之间,说明该方法准确度较高,重复性较好,能够满足复杂基质中痕量目标物检测的方法学要求。
。
本发明的方法是一种新的血液中香豆素及其代谢物的检测方法,针对血液样品优化了前处理方法,并对液相色谱串联质谱的相关检测条件进行了优化,与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果:
①与传统检测方法荧光分光光度法、HPLC 、HPLC-UV、HPLC-RF等相比,UPLC-OrbitrapHRMS法分析效率和灵敏度更高。
②本方法具有前处理简便,操作快速准确,灵敏度高重复性好的优点。
附图说明
图1 标准溶液中(1)和给药0.5 h后样品血液中(2)香豆素及其代谢物色谱图(A.7-羟基香豆素 B. 4-甲基伞形酮 C. 香豆素)。
图2 小鼠腹腔注射香豆素后,对照组(■)、5-MOP组(●)血浆中香豆素及其代谢物的浓度-时间曲线。
具体实施方式
本发明以下结合实例做进一步描述,但并不是限制本发明。
实例1:
1.仪器与材料:
Ultimate超高效液相色谱仪,Q-Exactive轨道阱高分辨质谱仪(美国ThermoScientific);Milli-Q Advantage A10型超纯水仪(美国Millipore);Agilent ZorbaxEclipse XDB-C18(2.1×150 mm, 3.5 μm)。
雌性小鼠(SPF级C57BL/6,7±1周龄,体质量17±1 g,常州卡文斯实验动物有限公司提供)。甲醇、乙腈(色谱纯,德国Merck);甲酸(色谱纯,德国Serva);香豆素(>98%,加拿大TRC);7-羟基香豆素、4-甲基伞形酮、5-甲氧基补骨脂素(>99%,美国Aldrich);氯化钠(分析纯,郑州派尼试剂)。
2.样品处理:小鼠通过腹腔注射CYP2A5探针药物香豆素溶液(100 mg/kg,1 mL/100 g 体质量)0.5 h之后,眼眦取血0.5 mL注入1.5 mL离心管离心处理(条件:4℃、6000rpm)10 min;之后取其100 μL上清血清注入盛有20 μL、100 ng/mL的内标溶液和280 μL乙腈的1.5 mL离心管中,涡旋30 s混合均匀,并超声10 min;最后于4℃、12 000 rpm下离心处理10 min后,用0.22 μm有机相针式滤器过滤其上清液,进样分析。
3.测定方法:吸取不同浓度的标准溶液和前处理之后的血液样品各5 µL,注入UPLC-Orbitrap HRMS***进行分离分析,测得样品中香豆素及其代谢物的含量。
实例2:按实施例1所述,使用本研究建立的分析方法检测对照组和CYP2A5酶活性抑制小鼠血液中香豆素及其代谢物的含量。
1.取C57BL/6小鼠100只,随机分为对照组和5-甲氧基补骨脂素(5-MOP)组各50只,两组分别再以每组5只随机分为10个小组,并且每组对应一个相同时间点。每日上午9时,5-MOP组灌胃5-MOP溶液(溶于玉米油,25 mg/kg,1 mL/100 g 体质量),对照组则灌胃等体积生理盐水。连续给药三次,每次间隔24小时。第三次给药12小时前,将小鼠饲料移除。实验期间小鼠可自由饮水。
最后一次给药1小时后,每只小鼠通过腹腔注射CYP2A5探针药物香豆素溶液(100mg/kg,1 mL/100 g 体质量)。首先于不同时间(5、10、15、30、45、60、90、120、180、240 min)下,眼眦取血0.5 mL注入1.5 mL离心管离心处理(条件:4℃、6 000 rpm)10 min;之后取其100 μL上清血清注入盛有20 μL、100 ng/mL的内标溶液和280 μL乙腈的1.5 mL离心管中,涡旋30 s混合均匀,并超声10 min;最后于4℃、12 000 rpm下离心处理10 min后,用0.22 μm有机相针式滤器过滤其上清液,进样分析。
2. 数据处理:实验数据采用SPSS 11.0 软件进行统计分析,并通过非房室模型的统计矩原理计算药代动力学参数。
以香豆素及其代谢物的浓度为纵坐标,以采样时间为横坐标,对照组和5-MOP组小鼠血液中香豆素及代谢物浓度随时间的变化曲线如图2所示。
由图2可以看出,5-MOP组各时间点香豆素的平均血药浓度均明显高于对照组,且7-羟基香豆素的平均血药浓度均明显低于对照组。对小鼠血液中香豆素及代谢物浓度随时间变化的数据进行非房室模型分析,其主要药代动力学参数见表4。结果表明,5-MOP组的最大血药浓度C max为对照组的1.42倍(P<0.01),药时曲线下面积AUC0-∞为1.59倍(P<0.05),香豆素半衰期t 1/2为1.05倍(P<0.01),由于香豆素代谢与CYP2A5酶活性诱导相关,由此表明5-MOP使小鼠体内CYP2A5酶活性明显降低,与文献一致(王二豪. 芹菜提取物对CYP2A6酶活性的影响[D]. 重庆医科大学, 2014.)。
。
Claims (3)
1.一种基于超高效液相色谱-轨道阱高分辨质谱的小鼠血液中香豆素及其代谢物的测定方法,其特征在于:通过样品的采集及前处理、收集血液样品于离心管中,加入内标溶液,沉淀蛋白混匀离心后,采用超高效液相色谱-轨道阱高分辨质谱UPLC-Orbitrap HRMS分析检测小鼠血液中香豆素及其代谢物,根据试验结果测定香豆素及其代谢物并绘制相应的时间-浓度曲线进行药代动力学分析,具体包括一些步骤:
a、样品采集:小鼠通过腹腔注射CYP2A5探针药物香豆素溶液后眼眦取血约0.5 mL,置于1.5 mL离心管中,立即于4 ℃、6000 rpm下离心10 min;
b、样品前处理:取100 μL上清血清至1.5 mL离心管内,加入20 μL浓度为100 ng/mL的内标溶液以及280 μL乙腈,涡旋30 s以充分混匀,超声10 min,于4 ℃、12 000 rpm下离心10 min,取上清液,用0.22 μm有机相针式滤器过滤,装入色谱瓶中待测;
c、标准工作液的配制:使用甲醇溶解、乙腈定容,配制一系列浓度的香豆素、7-羟基香豆素的混合标准工作溶液;
d、定量分析:使用超高效液相色谱-轨道阱高分辨质谱(UPLC-Orbitrap HRMS)对混合标准工作溶液进行分析,得到线性回归方程,再对待测样品进行测定测得分析物与内标峰面积的比值,代入一元线性回归方程,求得样品中目标物的含量;
色谱条件: Agilent Zorbax Eclipse XDB–C18色谱柱,规格150 mm×2.1 mm,3.5 µm;柱温25 ℃,进样量2 μL,流速0.2 mL/min;流动相A:0.1%甲酸水溶液,B:乙腈,A:B=70:30;
质谱条件:使用Q-Exactive轨道阱高分辨质谱***的电加热喷雾离子源,喷雾电压3.5kV,毛细管加热温度320 ℃,加热器温度300 ℃,鞘气流速1.67 L/min,辅助气流速1 L/min;扫描采用Full MS/ddMS2正离子模式,一级全扫描范围200±100 amu,分辨率7×104,离子最大注入时间50 ms,自动增益控制1×106;使用数据依赖扫描为二级扫描模式,分辨率为1.75×104,自动增益控制1×105,最大注入时间50 ms,归一化碰撞能量60%。
2.根据权利要求1所述的测定方法,其特征在于:所述内标为4-甲基伞形酮。
3.根据权利要求1所述的测定方法,其特征在于:所述混合标准工作溶液的配置方法具体如下:香豆素、7-羟基香豆素、4-甲基伞形酮分别使用甲醇溶解,乙腈定容配制浓度为100μg/mL的标准储备液,加入小鼠空白血清,配制一系列不同浓度的标准溶液,其中的7-羟基香豆素和香豆素的浓度依次为0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL,内标4-甲基伞形酮的浓度始终为5 ng/mL。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20170613 |