CN111088177A

CN111088177A - 高温好氧条件下产甘油的耐热酵母工程菌的构建及其应用

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Publication number: CN111088177A
Application number: CN202010024754.6A
Authority: CN
Inventors: 张标; 任丽丽; 李峰; 徐大勇; 王一晴
Original assignee: Huaibei Normal University
Current assignee: Huaibei Normal University
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2020-05-01
Anticipated expiration: 2040-01-10
Also published as: CN111088177B

Abstract

本发明公开了一种高温好氧条件下产甘油的耐热酵母工程菌的构建及其应用，是以耐热性***克鲁维酵母为平台，利用基因工程、代谢工程等方法，构建一株磷酸丙糖异构酶(TPI1)缺失的菌株，所构建菌株具备高温好氧条件下高效利用葡萄糖、果糖、木糖高效生产甘油的能力。本发明获得的***克鲁维酵母菌株YZB115在42℃好氧条件下，分别利用80g/L葡萄糖、果糖和木糖产生40.32、41.84和18.64g/L甘油，其生产速率分别为0.84、0.50和0.22g/L/h，得率分别为0.50、0.50和0.23g/g，所构建工程菌株发酵过程不产生副产物乙醇，利用木糖发酵产甘油结束时不积累木糖醇。

Description

高温好氧条件下产甘油的耐热酵母工程菌的构建及其应用

技术领域

本发明属于微生物代谢工程以及微生物发酵工程领域，具体涉及高温好氧条件下产甘油的耐热酵母工程菌的构建及其应用。本发明耐热酵母工程菌株能够在较高温度下(42℃)利用三种单糖(葡萄糖、果糖和木糖)发酵生产甘油。

背景技术

甘油(学名丙三醇)是一种重要的轻化工原料，用途极广。在涂料工业中用于生产醇酸树脂和酚醛树脂；在医药工业中用作溶剂和润滑剂；在食品工业中用作甜味剂、保湿剂和甘油单脂；在烟草工业中用作溶剂和保湿剂；在国防工业中用作******油的原料、飞机汽车燃料的抗冻剂；在日用化工中用于牙膏、香精的生产。还广泛应用于造纸、皮革、玻璃和纺织工业中。它还是聚醚的成分，用于制造聚氨基甲酸酯泡沫塑料。在聚合物生产中用作某些单体聚合时的介质和添加剂。目前，已有大约十多个行业的1700多种产品使用甘油作为原料。从甘油的消费结构看，欧美、日本等发达国家主要用于合成醇酸树脂、医药和饮料等方面；国内精制甘油主要用于涂料和牙膏等方面，复合甘油主要用于油漆和造纸。

目前，按甘油的来源其生产方式主要可分为三种，一是天然甘油生产，主要从天然油脂裂解或肥皂生产的副产物中提取，它包括皂化法和油化法；二是化学合成法，主要原料是丙烯、环氧氯丙烷等化工产品，包括丙烯氯化法、丙烯过乙酸氧化法和环氧氯丙烷法等；三是微生物发酵法，即以淀粉类(谷物、玉米、红薯等)或糖蜜为原料，用微生物发酵生产甘油，其中利用耐高渗透压酵母发酵生产甘油的方法研究较为广泛，该方法的主要特点是酵母可在较高糖浓度及有氧条件下生长发酵，不需要加入转向剂，糖的转化率可高达60％。近年来经研究发现，在特定的培养条件下，许多微生物包括细菌、酵母、霉菌、原生动物和藻类等均能够合成甘油。目前国内外发酵法产甘油的研究生产现状如下：

1、厌氧发酵法生产甘油

在酵母发酵生产乙醇的过程中，总有少量甘油伴随产生，但要大量生产甘油就要阻遏乙醇的生成，改变其生物合成途径。厌氧发酵法的机理是酵母对蔗糖和葡萄糖等己糖进行厌氧酵解，把EMP途径中乙醛作为氢的受体，用亚硫酸钠固定或通过Cannizzaro反应由碱使乙醛形成乙酸和乙醇。同样的原理，己糖产生的其它丙糖作为主要的氢受体还原为甘油。在工业化生产中，因亚硫酸钠的使用量有限制，甘油的转化率在20～25％(理论产率是51％)。

2、好氧发酵法

(1)耐高渗酵母法

1945年Nickerson研究了产酸接合酵母细胞一些性质，在高渗透压环境，对亚硫酸钠没有依赖的发酵基质中，该酵母细胞能分泌出甘油以及其它多元醇物质。采用通风发酵，培养基含糖达到30～40％，转化率可达到40～50％，另外一个显著特点是由于发酵液中含盐量非常少，极大地方便了后续的提取分离工作。在低接种量、低无机盐含量条件下，有利于提高甘油的产量，因为它有正反馈控制效应，导致发酵速度在此条件下受到负效应。如果控制好通风，同时跟踪好pH，则甘油产量会更高，且发酵速度较快，几乎不产生乙醇。

(2)藻类发酵法

某些藻类，当生存在高浓度的环境中时，在细胞里面会积累甘油。由于藻类的生长比较容易受到气候条件的限制，因此该方法一直没有得到重视。然而考虑到当今能源和资源紧缺，藻类发酵法则最为经济和最具有发展潜力。国外就有过一些研究，例如Ben-Amotz1研究NaCl对Dunaliella和Astermonas两种盐藻细胞里面甘油浓度积累的影响。Crizeau采用海藻酸钠固定Dunaliella，然后进行培养，获得甘油。

(3)其他方法

除上述两种方法外，Rohr发现，在利用黑曲霉进行柠檬酸发酵时，也会积累甘油和赤糖醇等，含量达到10g/L。另外，EI.Kadyl等人发现，Eurotium amstelodum以及另外一种丝状真菌Aspergi1lusw entii能利用奶酪乳清进行甘油发酵。目前，也有些用酒糟来生产甘油的报道。

天然菌株由于代谢途径多样、调控因素复杂，在发酵时对于发酵的条件要求较高，需要调节发酵液中各种营养元素的比例、温度以及供氧条件，增加了工业发酵中的费用。其次，筛选出的细胞的表型变化和细胞的遗传变化难以对应，为进一步的分析和改造这些菌株带来了困难。再次，这些菌株生产甘油的底物是淀粉或者糖蜜，目前还未有以菊粉(菊糖)为底物进行甘油生产的报道。

***克鲁维酵母(K.marxianus)是一种非常规耐热性酵母，俗称耐热酵母，具有较高的温度耐受性、生长迅速(最适条件下40min繁殖一代，酿酒酵母2h繁殖一代)以及能利用木糖、菊糖、甘油等多种酿酒酵母无法利用的碳源等优点。高温发酵相比中温发酵具有以下几个优点：①发酵过程是产热的过程，需要通过通水降温，高温发酵可以节省发酵中的冷却费用；②纤维素酶等的最适催化温度较高，通常为45-50℃，高温会提高以淀粉、纤维素等生物质为原料的同步糖化发酵(SSF)效率，促进糖化，减少在酶上的费用；③温度越高能生存的微生物越少，因此，高温会降低发酵过程中污染的风险。除此之外，***克鲁维酵母是一种GRAS(general regarding as safe)酵母，广泛的在乳制品、葡萄酒发酵制造中存在，对环境、动物及人类是安全的微生物。它能够在较高的温度下生长，最高达52℃，具有很高的生长速率(0.86–0.99h^-1,40℃)。由于***克鲁维酵母能利用多种廉价底物、耐热、高生长率等特点，使其被认为是替代酿酒酵母用来进行工业发酵和表达外源蛋白的候选者。***克鲁维酵母已经有多个菌株基因组信息公布，其遗传背景较为清楚，同时本研究组具有成熟的***克鲁维酵母基因工程和分子生物学操作方法。所以构建***克鲁维酵母工程菌株在高温下利用多种单糖发酵生产甘油具有非常重要的应用价值。

综上所述，甘油是重要的化工产品，广泛用于医药、日用化工、食品等工业及科学研究中，但其应用受限于工业生产的安全性与成本。

本发明通过基因工程遗传育种，获得菌株YZB115，可以在高温下利用葡萄糖、果糖、木糖等生物质水解主要产物为底物高效糖发酵生产甘油，发酵结束没有副产物积累。因此，本发明在利用生物质高效生物转化生产高附加值产品上有较大的应用前景。

发明内容

本发明旨在提供一种高温好氧条件下产甘油的耐热酵母工程菌的构建及其应用。本发明以耐热性***克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)为平台，利用基因工程、代谢工程等方法，构建了一种磷酸丙糖异构酶(TPI1)缺失的菌株YZB115，所构建的菌株YZB115具备高温好氧条件下高效利用葡萄糖、果糖、木糖高效生产甘油的能力，且在发酵过程不产生副产物乙醇，利用木糖发酵产甘油结束时不积累木糖醇。本发明的研究结果将有力拓展合成生物学和代谢工程技术在诸多领域的应用，同时为甘油利用不同底物的生物合成机制提供新的理解。

本发明耐热酵母工程菌株YZB115，其分类命名为：马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2019年12月16日，保藏编号：CGMCC NO.19134。

本发明耐热酵母工程菌株的构建方法，是以耐热酵母K.marxianus NBRC1777菌株作为宿主，构建磷酸丙糖异构酶缺失的重组菌株，使重组菌株失去将二羟丙酮磷酸向甘油醛-3-磷酸转化的途径，从而将二羟丙酮磷酸转化为甘油。

本发明耐热酵母工程菌株的构建方法，通过基因工程的方法，首先以耐热酵母NBRC1777为基础，敲除其URA3基因，得到可以用URA3作为营养缺陷筛选标签的重组菌株，命名为YZB040；然后将YZB040菌株的KU70基因敲除，构建具有高效同源重组能力的工程菌株，得到的菌株命名为YZB100；随后将YZB100中的URA3基因再次敲除，得到的菌株命名为YZB101；最后将YZB101菌株的磷酸丙糖异构酶(TPI1)基因敲除，得到磷酸丙糖异构酶功能缺失的耐热酵母工程菌株，命名为YZB115。

本发明耐热酵母工程菌株的构建方法，具体包括如下步骤：

步骤1：将融合PCR得到的KmURA3敲除片段导入NBRC1777野生菌株中，利用同源重组，敲除NBRC1777内的URA3基因，获得的菌株命名为YZB040；

步骤2：以质粒pZB061为模板，用引物KU70-F(序列15)和KU70-R(序列16)PCR扩增KU70-ScURA3基因片段，将KU70-ScURA3基因片段导入YZB040中，利用同源重组原理敲除KU70基因，同时使菌株恢复URA3基因的功能，得到的菌株命名为YZB100；

步骤3：以质粒pMD18T-ΔScURA3为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段，将ScURA3敲除片导入YZB100中，再次敲除菌株YZB100内的URA3基因作为筛选标签，获得的菌株命名为YZB101；

步骤4：以质粒pZB059为模板，用引物TPI1-F(序列17)和TPI1-R(序列18)PCR扩增TPI1-ScURA3基因片段，将TPI1-ScURA3基因片段导入YZB101中，使菌株YZB101内的TPI1被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能，得到的菌株命名为YZB115。

本发明制备过程中使用的质粒是通过包括如下步骤的方法制备获得：

①以***克鲁维酵母NBRC1777酵母的基因组DNA为模板，使用Fast Pfu聚合酶(滁州吐露港生物)进行PCR扩增，得到一段包含KmTPI1的DNA片段，将此基因片段连接到载体pUC19中，从而构建获得质粒pZB058；

②以YEUGAP为模板进行PCR扩增，得到ScURA3完整表达框并利用Sma I对ScURA3完整基因进行酶切；设计引物[TPI1-MF(序列5)和TPI1-MR(序列6)]扩增出pZB058的整个质粒，将这两个片段用平末端连接，从而获得质粒pZB059。

③以***克鲁维酵母NBRC1777酵母的基因组DNA为模板，使用Fast Pfu聚合酶(滁州吐露港生物)进行PCR扩增，得到一段包含KmKU70的DNA片段，将此基因片段连接到载体pUC19中，从而构建获得质粒pZB060。

④以YEUGAP为模板进行PCR扩增，得到ScURA3完整表达框并利用Sma I对ScURA3完整基因进行酶切；设计引物[TPI1-MF(序列9)和TPI1-MR(序列10)]扩增出pZB060的整个质粒，将这两个片段用平末端连接，从而获得质粒pZB061。

本发明制备过程中使用的pMD18T-ΔScURA3、YEUGAP以及pUC19均可由常规现有技术制备获得，如参考文献16、4、17。

本发明耐热酵母工程菌株的应用，是在高温(42℃)条件下利用多种单糖好氧发酵高效生产甘油，并且发酵结束没有乙醇和木糖醇等副产物的积累。发酵过程不需额外补充添加剂，发酵初始接种量为发酵体积的10％。

所述高温是指42℃。

所述单糖为葡萄糖、果糖或木糖等。

具体地说，本发明耐热酵母工程菌株YZB115在42℃好氧条件下，分别利用80g/L葡萄糖、果糖、木糖产生40.32、41.84和18.64g/L甘油，其生产速率分别为0.84、0.50和0.22g/L/h，得率分别为0.50、0.50和0.23g/g。

本发明耐热酵母工程菌株YZB115对于生物质水解单糖在高温下好氧发酵生产高附加值的甘油具有重要意义。

本发明的有益效果体现在：

本发明利用基因工程、代谢工程、分子生物学以及合成生物学的技术和方法，理性设计甘油生产路径，结合生物合成法高效无污染的特色和自然界发酵原料可持续获得的优势，以耐热酵母为平台，构建出有效的甘油生产工程菌株，从而研究耐热酵母高温发酵生产甘油的产物含量、生产速率及产率的关联机制，最终建立和示范一种低成本、高效率、利用可再生资源的绿色环保的新型合成生物学的工业化应用。这些努力将有力拓展合成生物学和代谢工程技术在诸多领域的应用，同时为利用不同底物的甘油生物合成机制提供新的理解。本发明获得的菌株YZB115可以在42℃好氧条件下，分别利用80g/L葡萄糖、果糖和木糖产生40.32、41.84和18.64g/L甘油，其生产速率分别为0.84、0.50和0.22g/L/h，得率分别为0.50、0.50和0.23g/g，发酵结束发酵液中没有乙醇和木糖醇等副产物积累。此菌株对于开发纤维素、菊粉和半纤维素生物质发酵生产高附加值的甘油具有重要的意义。

附图说明

图1是本发明质粒的图谱。其中A质粒pZB058；B质粒pZB059；C质粒pZB060；D质粒pZB061。

图2是本发明耐热酵母工程菌株YZB115分别利用80g/L葡萄糖、果糖和木糖发酵生产甘油的结果(42℃)。

图3是本发明制备流程示意图。

具体实施方式

试剂和菌株：本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上纯度。其中，葡萄糖、甘油、果糖、酵母基本氮源、尿嘧啶、木糖、木糖醇、胶回收试剂盒以及所有的限制性内切酶均来源于上海生工生物工程公司。T4 DNA连接酶购于大连宝生物公司。Fast Pfu和FastTaq DNA聚合酶购于滁州吐露港生物公司。大肠杆菌Escherichia coli XL10-gold菌株作为DNA操作时使用的宿主菌(美国加利福尼亚Stratagene公司)，包含100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用作培养E.coli。葡萄糖合成培养基(YNB葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶20mg/mL)主要用于转化。质粒YEUGAP、pUC19均由常规方法获得[4,17]。YPE培养基(10g/L酵母提取物,20g/L蛋白胨和20g/L乙醇)用于酵母的前培养。YPD(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，80g/L葡萄糖)、YPF(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，80g/L果糖)和YPX(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，80g/L木糖)用于发酵培养。

实施例1：菌株的制备

1、提取酵母基因组的具体操作步骤为：

①挑取单克隆，接入5mL液体YPD中，37℃，250rpm，培养24h。

②常温下12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。

③500μL蒸馏水重悬菌体，12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。

④取200μL实验室自配1x breaking缓冲液(TritonX-100(2％(w/v))，SDS(1％(w/v))，NaCl(100mM)，Tris-Cl(10mM,pH8.0)，EDTA(1mM))重悬菌体，并将菌液转入到含有0.3g玻璃珠(425-600um，sigma，美国)的EP管内。

⑤加入200μL酚氯仿溶液后，高速震荡3min，加入200μL 1x TE(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)，轻微震荡。

⑥12000rpm，离心5min，取最上层清液转入新的EP管内，加入1mL预冷的无水乙醇。

⑦12000rpm、4℃，离心10min，弃上清，室温下干燥沉淀，并用400μL 1x TE重悬沉淀。

⑧加入2μL RNase(RNA水解酶，中国上海生工生物)，2mg/mL)到EP管内，混匀，37℃，酶切1h。

⑨取40μL 3M醋酸钠(pH 5.2)加入到管内，混匀并加入1mL预冷的无水乙醇。

⑩12000rpm，4℃，离心30min，弃上清室温下干燥。用100μL无菌水重悬沉淀，此即酵母基因组DNA。

2、pZB058和pZB059的构建：

以耐热酵母NBRC1777基因组为模板，以TPI1-P-SMAI-F(序列1)，TPI1-T-SMAI-R(序列2)为引物，PCR扩增得到包含基因KmTPI1的片段，然后将基因片段和pUC19载体用SmaI平末端酶切，然后连接从而得到pZB058载体。然后以YEUGAP为模板，以SCURA3-SMAI-F(序列3)，SCURA3-SMAI-R(序列4)为引物，进行PCR扩增得到ScURA3表达框。利用Sma I对ScURA3完整基因进行酶切。然后以pZB058为模板，以TPI1-MF(序列5)，TPI1-MR(序列6)为引物，进行PCR扩增得到pZB058整个质粒。将ScURA3完整基因表达框酶切产物和pZB058质粒PCR产物连接，从而获得质粒pZB059(图1)。

具体操作如下：

(1)以耐热酵母NBRC1777基因组为模板，使用Fast Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增得到TPI1基因片段；然后将TPI1基因片段***pUC19载体，从而得到pZB058载体。

TPI1基因片段的PCR体系：

PCR程序

对TPI1基因片段和pUC19质粒用SmaI平末端酶进行酶切和连接。

TPI1基因片段的酶切体系：

pUC19质粒的酶切体系：

TPI1基因片段和pUC19质粒的连接体系：

将获得的质粒pUC19-TPI1命名为pZB058。

(2)以YEUGAP为模板，使用Fast Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，得到ScURA3表达框。

利用Sma I对ScURA3表达框进行酶切，与pZB058 PCR扩增产物连接，从而获得质粒pZB059。

ScURA3表达框的PCR体系：

对应PCR程序：

PCR程序

ScURA3表达框的酶切体系：

pZB058完整质粒的PCR体系：

对应PCR程序：

PCR程序

ScURA3表达框和pZB058载体的连接体系：

将获得的质粒pUC19-TPI1-ScURA3命名为pZB059。

3、pZB060和pZB061的构建：

以耐热酵母NBRC1777基因组为模板，以KU70-SMAI-F(序列7)，KU70-SMAI-R(序列8)为引物，PCR扩增得到包含基因KmTPI1的片段，然后将基因片段和pUC19载体用SmaI平末端酶切，然后连接从而得到pZB060载体。然后以YEUGAP为模板，以SCURA3-SMAI-F(序列3)，SCURA3-SMAI-R(序列4)为引物，进行PCR扩增得到ScURA3表达框。利用Sma I对ScURA3完整基因进行酶切。然后以pZB060为模板，以KU70-MF(序列9)，KU70-MR(序列10)为引物，进行PCR扩增得到pZB060整个质粒。将ScURA3完整基因表达框酶切产物和pZB060质粒PCR产物连接，从而获得质粒pZB061(图1)。

具体操作如下：

(1)以耐热酵母NBRC1777基因组为模板，使用Fast Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增得到KU70基因片段；然后将KU70基因片段***pUC19载体，从而得到pZB060载体。

KU70基因片段的PCR体系：

PCR程序

对KU70基因片段和pUC19质粒用SmaI平末端酶进行酶切和连接。

KU70基因片段的酶切体系：

pUC19质粒的酶切体系：

KU70基因片段和pUC19质粒的连接体系：

将获得的质粒pUC19-KU70命名为pZB060。

利用Sma I对ScURA3表达框进行酶切，与pZB060 PCR扩增产物连接，从而获得质粒pZB061。

ScURA3表达框的PCR体系：

对应PCR程序：

PCR程序

ScURA3表达框的酶切体系：

pZB061完整质粒的PCR体系：

对应PCR程序：

PCR程序

ScURA3表达框和pZB060载体的连接体系：

将获得的pUC19-KU70-ScURA3质粒命名为pZB061。

4、将外源DNA导入耐热酵母：

(1)酵母化学转化步骤:

①各种改造菌株在YPD平板上划线，37℃培养24h。

②取5mL液体YPD，并分别在YPD平板上挑取单克隆，37℃，250rpm，培养18h。

③取1mL培养物转接于装入9mL液体YPD的50mL三角瓶内，37℃，250rpm，摇床培养5h。

④取出培养物，常温下离心5000rpm，3min，弃上清液，保留菌体。

⑤配制1mL转化缓冲液：800μL 50％PEG4000；50μL 4M醋酸锂；50μL ddH₂O；100μL1M DTT(溶于10mM醋酸钠,pH 5.2)。

⑥使用200μL转化缓冲液重悬菌体，5000rpm，离心3min，去上清。

⑦用100μL转化缓冲液重悬浮菌体，加入5μL(1-10μg)线性化的质粒,轻微震荡30sec。

⑧在47℃条件下水浴15min。

⑨将菌体涂布于含有亮氨酸(Leu)或尿嘧啶(Ura)的合成培养基，37℃培养2天。

⑩挑取板上单菌落在液体YPD中培养，提取基因组，并通过PCR鉴定转化结果。

(2)本发明中构建各种耐热酵母敲除菌株的具体过程:

用融合PCR的方法得到耐热酵母KmURA3基因敲除片段。先用引物URA3-F(序列11)和URA3-R1(序列12)以NBRC1777基因组为模板扩增得到URA3基因上游片段，再用引物URA3-F1(序列13)和URA3-R(序列14)以NBRC1777基因组为模板扩增得到URA3基因下游片段。最后用引物URA3-F(序列13)和URA3-R(序列16)融合上游片段和下游片段得到URA3敲除片段。

URA3上游片段的PCR体系：

对应PCR程序：

PCR程序

URA3下游片段的PCR体系：

对应PCR程序：

PCR程序

URA3上下游片段融合的PCR体系：

对应PCR程序：

PCR程序

将KmURA3敲除片段导入NBRC1777中，同源重组后，使菌株NBRC1777内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/mL，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选KmURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZB040。

以pZB061敲除片段为模板，用引物KU70-F(序列15)和KU70-R(序列16)PCR扩增KU70-ScURA3基因片段。将KU70-ScURA3基因片段导入YZB040中，经过同源重组后，使菌株YZB040内的KU70被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，命名为YZB100。

以pMD18T-ΔScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片导入YZB100中，同源重组后，使菌株YZB100内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/mL，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZB101。

以pZB059敲除片段为模板，用引物TPI1-F(序列17)和TPI1-R(序列18)PCR扩增TPI170-ScURA3基因片段。将TPI1-ScURA3基因片段导入YZB101中，经过同源重组后，使菌株YZB101内的TPI1被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，命名为YZB115。

(3)提取基因组，通过PCR鉴定酵母转化的阳性菌株。

鉴定酵母转化的阳性菌株的PCR体系：

对应PCR程序：

实施例2：构建的工程菌株发酵情况

本实施例用于测试工程菌株利用葡萄糖、果糖和木糖发酵生产甘油的效果。结果表明通过改造耐热酵母得到的工程菌株可以在高温下(42℃)好氧发酵高效生产甘油，发酵结束发酵液中几乎不含副产物。

1、在YPD培养基平板上复苏菌株YZB115，37℃培养1天。

2、挑取单克隆，接于5mL液体YPE培养基，37℃、250rpm，过夜。

3、种子培养。将5mL液体YPE培养基转接到250mLYPE，37℃，250rpm，培养48h。

4、配制2.5LYPD、YPF和YPX培养基于5L发酵罐中，灭菌待用。

5、将250mL种子培养基接入2.5L发酵培养基中，42℃、转速400rpm，通气量1vvm发酵。

6、在0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h取样，并取上清通过HPLC检测分析(图2)。

7、从图2可知，YZB115利用葡萄糖、果糖和木糖在高温好氧条件下都可以有效生产甘油，其中利用葡萄糖发酵速率最快，果糖次之，木糖最慢。葡萄糖和果糖的产率为0.5g/g，为理论值的98％，发酵过程无乙醇等副产物产生。最终，本发明中的YZB115菌株，在42℃和好氧条件下，分别利用80g/L葡萄糖、果糖和木糖产生40.32、41.84和18.64g/L甘油，其生产速率分别为0.84、0.50和0.22g/L/h，得率分别为0.50、0.50和0.23g/g。

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序列1-18为引物

序列1 TPI1-P-SMAI-F

5′-TCCCCCGGGGCCATTCCATCCATCAAGCC-3′

序列2 TPI1-T-SMAI-R

5′-TCCCCCGGGTACTGTGTGGCTGAAATTG-3′

序列3 SCURA3-SMAI-F

5′-TCCCCCGGGTATTTAGAAAAATAAACAAATAG-3′

序列4 SCURA3-SMAI-R

5′-TCCCCCGGGAATGCGTACTTATATGCGTC-3′

序列5 TPI1-MF

5′-GACAAGACCAAGTTCGCTTTG-3′

序列6 TPI1-MR

5′-AGCAAATGAATTCATCGGTTTC-3′

序列7 KU70-SMAI-F

5′-TCCCCCGGGATGTCTGATCAAAAACCGGAC-3′

序列8 KU70-SMAI-R

5′-TTCCCCCGGGTATATATTAAATTTACTCCG-3′

序列9 KU70-MF

5′-AAGCTTATATATGATAATGG-3′

序列10 KU70-MR

5′-CGATGCAGGAATCTCATGAG-3′

序列11 URA3-F

5′-ATGTCGACTAAGAGTTACTC-3′

序列12 URA3-R1

5′-ACGTGTATTGTAATTTAAC-3′

序列13 URA3-F2

5′-GTTAAATTACAATACACGTAAGACCGTGGAAATTGCCAAGAG-3′

序列14 URA3-R

5′-TTAAGCGGATCTGCCTACTC-3′

序列15 KU70-F

5′-CTTTTTAAAGAGCCAGTTGTC-3′

序列16 KU70-R

5′-TTCTGTTTTGGTTTTGATTC-3′

序列17 TPI1-F

5′-CTCGGGTATACCATACCACAC-3′

序列18 TPI1-R

5′-ACCATTTGTTCTTATGGCAG-3′

SEQUENCE LISTING

<110> 淮北师范大学

<120> 高温好氧条件下产甘油的耐热酵母工程菌的构建及其应用

<130> 2020.1.2

<160> 18

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tcccccgggg ccattccatc catcaagcc 29

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tcccccgggt actgtgtggc tgaaattg 28

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tcccccgggt atttagaaaa ataaacaaat ag 32

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tcccccggga atgcgtactt atatgcgtc 29

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gacaagacca agttcgcttt g 21

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

agcaaatgaa ttcatcggtt tc 22

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tcccccggga tgtctgatca aaaaccggac 30

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ttcccccggg tatatattaa atttactccg 30

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

aagcttatat atgataatgg 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cgatgcagga atctcatgag 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

atgtcgacta agagttactc 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

acgtgtattg taatttaac 19

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<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gttaaattac aatacacgta agaccgtgga aattgccaag ag 42

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ttaagcggat ctgcctactc 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

ctttttaaag agccagttgt c 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

ttctgttttg gttttgattc 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

ctcgggtata ccataccaca c 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

accatttgtt cttatggcag 20

Claims

1.一种高温好氧条件下产甘油的耐热酵母工程菌，其特征在于：

所述耐热酵母工程菌为耐热酵母工程菌株YZB115，其分类命名为：马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2019年12月16日，保藏编号：CGMCC NO.19134。

2.一种权利要求1所述的耐热酵母工程菌的构建方法，其特征在于：

首先以耐热酵母NBRC1777为基础，敲除其URA3基因，得到可以用URA3作为营养缺陷筛选标签的重组菌株，命名为YZB040；然后将YZB040菌株的KU70基因敲除，构建具有高效同源重组能力的工程菌株，得到的菌株命名为YZB100；随后将YZB100中的URA3基因再次敲除，得到的菌株命名为YZB101；最后将YZB101菌株的磷酸丙糖异构酶TPI1基因敲除，得到磷酸丙糖异构酶功能缺失的耐热酵母工程菌株，命名为YZB115。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤2：以质粒pZB061为模板，用引物KU70-F和KU70-R PCR扩增KU70-ScURA3基因片段，将KU70-ScURA3基因片段导入YZB040中，利用同源重组原理敲除KU70基因，同时使菌株恢复URA3基因的功能，得到的菌株命名为YZB100；

步骤4：以质粒pZB059为模板，用引物TPI1-F和TPI1-R PCR扩增TPI1-ScURA3基因片段，将TPI1-ScURA3基因片段导入YZB101中，使菌株YZB101内的TPI1被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能，得到的菌株命名为YZB115。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：

上述制备过程中使用的质粒是通过包括如下步骤的方法制备获得：

①以***克鲁维酵母NBRC1777酵母的基因组DNA为模板，使用Fast Pfu聚合酶进行PCR扩增，得到一段包含KmTPI1的DNA片段，将此基因片段连接到载体pUC19中，从而构建获得质粒pZB058；

②以YEUGAP为模板进行PCR扩增，得到ScURA3完整表达框并利用Sma I对ScURA3完整基因进行酶切；设计引物扩增出pZB058的整个质粒，将这两个片段用平末端连接，从而获得质粒pZB059；

③以***克鲁维酵母NBRC1777酵母的基因组DNA为模板，使用Fast Pfu聚合酶(滁州吐露港生物)进行PCR扩增，得到一段包含KmKU70的DNA片段，将此基因片段连接到载体pUC19中，从而构建获得质粒pZB060；

④以YEUGAP为模板进行PCR扩增，得到ScURA3完整表达框并利用Sma I对ScURA3完整基因进行酶切；设计引物扩增出pZB060的整个质粒，将这两个片段用平末端连接，从而获得质粒pZB061。

5.一种权利要求1所述的耐热酵母工程菌的应用，其特征在于：

所述耐热酵母工程菌在高温条件下利用单糖好氧发酵高效生产甘油，并且发酵结束没有乙醇和木糖醇等副产物的积累。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述高温为42℃。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述单糖为葡萄糖、果糖或木糖。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

发酵过程不需额外补充添加剂，发酵初始接种量为发酵体积的10％。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述耐热酵母工程菌YZB115在42℃好氧条件下，分别利用80g/L葡萄糖、果糖、木糖产生40.32g/L、41.84g/L、18.64g/L甘油，生产速率分别为0.84、0.50和0.22g/L/h，得率分别为0.50、0.50、0.23g/g。