CN106834364A - 丙酮酸工业量产发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丙酮酸工业量产发酵工艺，该工艺包括光滑球拟酵母的平板培养、茄瓶培养、摇瓶培养、一级种子罐培养进而进行一百五十立方发酵罐进行工业化量产发酵工艺及培养基具体构成成分及比例；该工艺填补了丙酮酸工业量产发酵尤其适用于一百五十立方的大型发酵罐进行发酵生产的工艺空白，不仅发酵周期缩短至56h，产率也同样是获得较高收益，并有效的解决了菌种对发酵液饱和丙酮酸的内耗和转化，保证了产品收益和质量。

Description

丙酮酸工业量产发酵工艺
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种适用于一百五十立方的大型发酵罐的丙酮酸工业量产发酵工艺。
背景技术
丙酮酸作为重要的有机酸之一，又称2-氧化丙酸、α-酮基丙酸或乙酰基甲酸，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是合成多种有用化合物的前体，因此，它在制药、日用化工、农用化学品和食品等工业及科学研究中有着广泛的用途。
目前，相对于化学合成法生产的丙酮酸，发酵法生产丙酮酸具有成本低、高质量的优点；近些年，针对发酵法发酵丙酮酸工艺的研究随之进行，研究多采用光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸；由于光滑球拟酵母属的多重维生素营养缺陷型菌株是目前发酵法生产中最常用的和最具有竞争力的生产菌株，因此，采用发酵法生产丙酮酸在菌种、发酵条件优化等方面作为研发重点。
当前，针对光滑球拟酵母发酵生丙酮酸提供了如下参考文献：
(1)、2003年第23期《精细与专用化学品》.光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸.刘立明等；
(2)、《生物工程报》第16卷2期.营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响.2000.3.李寅等；
(3)、2012年第31卷第4期《中国酿造》.光滑球拟酵母适应进化改善丙酮酸生产.赵博等；如上参考文献中存在一定的技术缺陷：第一、发酵周期较长、产率低；第二、针对发酵现实中出现的丙酮酸的降解或者转化问题，没有进行有效解决；第三、中试与大生产一百五十立方的大型发酵罐在发酵工艺参数的变化不同，工艺控制点的范围也不同，进而实现工业量产。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的不足，提供了一种适用于一百五十立方的大型发酵罐的丙酮酸工业量产发酵工艺，该工艺发酵周期短、产率高、能较好抑制发酵过程中菌种对饱和的丙酮酸的降解或者转化问题。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
丙酮酸工业量产发酵工艺，具体工艺步骤如下：
(1)平板培养：
A.平板培养基(g/L)：葡糖糖浆3-4、大豆蛋白胨3-4、牛肉膏蛋白胨琼脂3-4、碳酸钙0.5-1、原水溶解，PH自然，121℃-124℃15min灭菌备用；
B.光滑球拟酵母于平板培养基内，平板倒置培养皿中28℃-30℃培养，培养时间15h-20h后；
(2)茄瓶培养：
a.茄瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆13-14、大豆蛋白胨11-12、牛肉膏蛋白胨琼脂10-12、碳酸钙2-2.5、氯化铵0.3-0.5、原水溶解，PH自然，121℃-124℃15min灭菌备用；
b.在无菌室内严格按无菌操作，从保存平板上挑单菌落涂布在茄瓶固体培养基上；
c.培养条件：28℃-30℃，培养时间15h-20h后；
d.将茄瓶放置1℃-4℃的冰箱内存储备用；
(3)种子摇瓶培养：
I.摇瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆17-18.5、大豆蛋白胨13.5-15.5、碳酸钙2.5-4.5、氯化铵0.5-0.8、氯化镁0.32-0.48、磷酸氢二钾0.2-0.4、原水溶解并用浓度为1.5mol/LHCL调节培养基初始PH为5-6，121℃-124℃15min灭菌备用；
II.3000ml或5000ml的三角瓶或钢瓶二十至三十个，在无菌室内用灭过菌的接种铲，从培养好的茄瓶内铲取菌台接到500ml的三角瓶或钢瓶中；接种量为600ml/瓶-1000ml/瓶；培养温度为28℃-30℃，培养时间22h-24h；
(4)一级种子培养：
①一级种子培养基(g/L)：葡糖糖浆20-25、大豆蛋白胨16.5-18.5、碳酸钙6.5-8.5、氯化铵1.5-2.8、氯化镁1.32-3.48、磷酸氢二钾1.2-2.4、原水溶解并用浓度为1.5mol/L HCL调节培养基初始PH为5-6，121℃-124℃15min灭菌备用；
②采用800L种子罐3-5个；种子摇瓶的合拼至三角钢瓶内，在无菌环境下对种子罐进行接种操作，接种量为2000ml/罐-3000ml/罐；
③培养条件：培养温度28℃-30℃，1-6h通气量比1∶1，6h以后至种子成熟通气量比：1∶4，罐压维持在0.03MPa-0.05MPa；
④种子成熟的标准：OD值在40-50之间；
(5)发酵罐培养：
第一.发酵培养基(g/L)：葡萄糖150-200、磷酸氢二钾5-10、氯化镁0.9-1.5、氯化铵8.5-9.5、碳酸钙20-25、醋酸钠6-8、消泡剂0.01-0.02、微量元素液3-5mL、维生素液3-5mL，PH用浓度为40mol/I HCL调至5.0-5.5，121℃-125℃连续灭菌；
第二.培养条件：培养温度28℃-30℃，1-6h通气量比1∶1，搅拌转速100r/min-150min；6h-12h通气量比：1∶2，搅拌转速200r/min-350min；12h-30h通气量比：1∶3，搅拌转速400r/min-500min；30h 以后通气量为1∶4，搅拌转速500r/min-700min；40h-56h搅拌转速800r/min-1000r/min；罐压维持在：0.03MPa-0.05MPa；
进一步说明地是，所述微量元素液(g/L)：氯化锌3-6、氯化铁15-18、氯化铜0.2-0.3、氯化锰15-18，浓度为1.5mol/L HCL调节PH为5.0-5.5定容至1L-1.5L，121℃-125℃连续灭菌；
进一步说明地是，所述维生素液(g/L)：维生素D 0.03-0.04、维生素E 0.003-0.005、维生素B10.2-0.3、维生素PP 6-8，浓度为1.5mol/L HCL调节PH为5.0-5.5定容至1L-1.5L，121℃-125℃连续灭菌；
进一步说明地是，所述发酵培养基的连消顺序：微量元素溶液、发酵培养基。
进一步说明地是，所述一级种子培养中，④种子成熟的标准：波长660nm条件下的分光光度计，进行检测细胞浓度，成熟标准为：42-45
进一步说明地是，所述发酵罐在发酵期间的PH环境采用浓度为8-10mol/L NaOH控制为5.0-5.5；
进一步说明地是，所述种子成熟的标准的OD值高于50，进行二级种子培养；
进一步说明地是，所述二级种子培养基(g/L)：i葡糖糖浆10-15、大豆蛋白胨13.5-15.5、碳酸钙3.5-5.5、氯化铵0.5-1.8、氯化镁0.32-1.48、磷酸氢二钾0.8-1.2、原水溶解并用浓度为1.5mol/L HCL调节培养基初始PH为5-6，121℃-124℃15min灭菌备用；
ii采用800L种子罐；一级种子罐内种子液转入二级罐内进行再培养，接种量15L/罐-20L/罐；
iii培养条件：培养温度28℃-30℃，1-6h通气量比1∶1，6h以后至种子成熟通气量比：1∶2，罐压维持在0.03MPa-0.05MPa；
iv种子成熟的标准：OD值在80-120之间；
v二级种子成熟后接入所述发酵培养基内进行发酵；
需要更进一步说明地是，所述平板培养基(g/L)：葡糖糖浆2-6、大豆蛋白胨1-3、牛肉膏蛋白胨琼脂3-4、酵母膏1-3。
需要再次说明地是，所述发酵培养基(g/L)：葡萄糖150-200、磷酸氢二钾5-10、氯化镁0.9-1.5、氯化铵8.5-9.5、氯化钙20-25、醋酸钠6-8、氯化钾2-3。
需要再次说明地是：所述发酵过程中用浓度为60％的葡萄糖浆液对发酵罐进行补糖操作；所述补糖操作具体如下：20h补糖速率20L/h，30min；50h补糖速率20L/h，10min。
本发明的有益效果：
(一)本工艺实现了对丙酮酸生物发酵的发酵周期缩短至56h，丙酮酸含量达到了89.10g/L；
(二)工艺通过了我厂发酵车间的130立方大型发酵罐的发酵验证，发酵产物的质量和工艺稳定，收率较 高，实现了对丙酮酸工业化量产；
(三)本工艺通过添加维生素液和微量元素液针对发酵现实中出现的丙酮酸的降解或者转化问题，进行了较好的解决或者说克服，进而保证了产品质量的稳定和丙酮酸得率地提高。
具体实施方式
下面结合实验数据图表和实施例对本发明进一步说明。
实施例1
丙酮酸工业量产发酵工艺，具体工艺步骤如下：
(1)平板培养：
A.平板培养基(g/L)：葡糖糖浆3、大豆蛋白胨3、牛肉膏蛋白胨琼脂3、碳酸钙0.5、原水溶解，PH自然，121℃15min灭菌备用；
B.光滑球拟酵母于平板培养基内，平板倒置培养皿中30℃培养，培养时间20h后；
(2)茄瓶培养：
a.茄瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆13、大豆蛋白胨11、牛肉膏蛋白胨琼脂10、碳酸钙2、氯化铵0.3、原水溶解，PH自然，121℃15min灭菌备用；
b.在无菌室内严格按无菌操作，从保存平板上挑单菌落涂布在茄瓶固体培养基上；
c.培养条件：30℃，培养时间20h后；
d.将茄瓶放置1℃的冰箱内存储备用；
(3)种子摇瓶培养：
I.摇瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆17、大豆蛋白胨13.5、碳酸钙2.5、氯化铵0.5、氯化镁0.32、磷酸氢二钾0.2、原水溶解并用浓度为1.5mol/L HCL调节培养基初始PH为5.5，121℃15min灭菌备用；
II.3000ml或5000ml的三角瓶或钢瓶二十至三十个，在无菌室内用灭过菌的接种铲，从培养好的茄瓶内铲取菌台接到500ml的三角瓶或钢瓶中；接种量为600ml/瓶或1000ml/瓶；培养温度为30℃，培养时间24h；
(4)一级种子培养：
①一级种子培养基(g/L)：葡糖糖浆20、大豆蛋白胨16.5、碳酸钙6.5、氯化铵1.5、氯化镁1.32、磷酸氢二钾1.2、原水溶解并用浓度为1.5mol/L HCL调节培养基初始PH为5，121℃15min灭菌备用；
②采用800L种子罐3个；种子摇瓶的合拼至三角钢瓶内，在无菌环境下对种子罐进行接种操作，接种量为2000ml/罐；
③培养条件：培养温度28℃，1-6h通气量比1∶1，6h以后至种子成熟通气量比：1∶4，罐压维持在0.03MPa；
④种子成熟的标准：OD值在40-42.5
结合图表进行说明：
培养时间 PH OD 细胞数(个) 芽生％ 显微镜镜检
0h 5.0 10.5 10 菌种整齐健壮
6h 4.13 26.8 23 菌种整齐健壮
12h 3.35 41.3 38 菌种整齐健壮
通过检测发现一级种子罐的OD值的增长区间超过14，至菌种OD值达到40-42.5之间时候，考虑转种至发酵罐内进行发酵培养。
(5)发酵罐培养：
第一.发酵培养基(g/L)：葡萄糖150、磷酸氢二钾5、氯化镁0.9、氯化铵8.5、碳酸钙20、醋酸钠6、消泡剂0.01、微量元素液3mL、维生素液3mL，PH用浓度为40mol/L HCL调至5.5，121℃连续灭菌；
第二.培养条件：培养温度30℃，1-6h通气量比1∶1，搅拌转速150min；6h-12h通气量比：1∶2，搅拌转速200r/min；12h-30h通气量比：1∶3，搅拌转速400r/min；30h以后通气量为1∶4，搅拌转速500r/min；40h-56h搅拌转速800r/min；罐压维持在：0.03MPa；
结合检测数据整理图表进行说明
需要说明是RD代表残糖，在配制发酵培养基时，进行取样检测了发酵培养基的空白样PH：5.23、RD：12.2g/100ml。
实施例2
冰箱内1℃保存的茄瓶进行摇瓶接种，摇瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆17.5、大豆蛋白胨14.5、碳酸钙3.0、氯化铵0.55、氯化镁0.38、磷酸氢二钾0.28、原水溶解并用浓度为1.5mol/L HCL调节培养基初始PH为5.5，121℃15min灭菌备用；
II.3000ml或5000ml的三角瓶或钢瓶二十至三十个，在无菌室内用灭过菌的接种铲，从培养好的茄瓶内铲取菌台接到500ml的三角瓶或钢瓶中；接种量为600ml/瓶或1000ml/瓶；培养温度为30℃，培养时间24h；
一级种子培养：
①一级种子培养基(g/L)：葡糖糖浆21、大豆蛋白胨17.5、碳酸钙6.8、氯化铵1.8、氯化镁1.50、磷酸氢二钾1.56、原水溶解并用浓度为1.5mol/L HCL调节培养基初始PH为5.5，121℃15min灭菌备用；
②采用800L种子罐3个；种子摇瓶的合拼至三角钢瓶内，在无菌环境下对种子罐进行接种操作，接种量为2000ml/罐；
③培养条件：培养温度28℃，1-6h通气量比1∶1，6h以后至种子成熟通气量比：1∶4，罐压维持在0.03MPa；
结合实验结果的检测数据进行说明
培养时间 PH OD 细胞数(个) 芽生％ 显微镜镜检
0h 5.0 13.5 12 菌种整齐健壮
6h 4.36 28.8 25 菌种整齐健壮
12h 5.02 52.3 40 菌种整齐健壮
经检测发现12h时，一级种子罐内的OD值为52.3，超过了50，需要进行二次培养至菌种OD值到达100再进行转入发酵罐培养基。
二级种子培养
葡糖糖浆10、大豆蛋白胨13.5、碳酸钙3.5、氯化铵0.5、氯化镁0.32、磷酸氢二钾0.8、原水溶解并用浓度为1.5mol/L HCL调节培养基初始PH为5，121℃15min灭菌备用；
ii采用800L种子罐；一级种子罐内种子液转入二级罐内进行再培养，接种量20L/罐；
iii培养条件：培养温度28℃，1-6h通气量比1∶1，6h以后至种子成熟通气量比：1∶2，罐压维持在0.03MPa；
结合实验结果的检测数据进行说明
培养时间 PH OD 细胞数(个) 芽生％ 显微镜镜检
0h 5.13 43.5 19.36 菌种整齐健壮
6h 5.10 60.5 30.11 菌种整齐健壮
12h 5.0 78.5 46.5 菌种整齐健壮
18h 4.98 99.5 57.5 菌种整齐健壮
根据二级种子检测指标，符合转种要求后，转入发酵罐内进行培养；所述发酵培养基和发酵具体步骤如下：
第一.发酵培养基(g/L)：葡萄糖200、磷酸氢二钾10、氯化镁1.5、氯化铵9.5、碳酸钙25、醋酸钠8、消泡剂0.02、微量元素液5mL、维生素液5mL，PH用浓度为40mol/L HCL调至5.5，121℃连续灭菌30min；
第二.培养条件：培养温度30℃，1-6h通气量比1∶1，搅拌转速150min；6h-12h通气量比：1∶2，搅拌转速350min；12h-30h通气量比：1∶3，搅拌转速500min；30h以后通气量为1∶4，搅拌转速700min；40h-56h搅拌转速1000r/min；罐压维持在：0.03MPa；
微量元素液(g/L)：氯化锌6、氯化铁18、氯化铜0.3、氯化锰18，浓度为1.5mol/LHCL调节PH为5.5定容至1.5L，121℃连续灭菌15min；
维生素液(g/L)：维生素D 0.04、维生素E 0.005、维生素B10.3、维生素PP 8，浓度为1.5mol/L HCL调节PH为5.5定容至1.5L，121℃连续灭菌15min；
发酵培养基的连消顺序：微量元素溶液、发酵培养基(混溶维生素液)。
结合检测数据整理图表进行说明
进一步地，将发酵56h后的发酵液通过无菌接种空钢瓶，导出发酵液5L至中试20L的实验罐内进行发酵再培养，通风按照1∶1，不开搅拌，并获得检测实验数据如下：
培养时间 ph RD(g/L) 丙酮酸含量(g/L)
2h 4.96 0.2 89.10
4h 4.95 0.0 89.08
6h 4.90 1.0(补糖30s) 89.07
进一步地，通过本配方的维生素液和微量元素液起到了对丙酮酸的降解或者转化问题进行了有效的解决，稳定了产品质量和产量。
上述是对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (11)

1.丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述工艺包括以下步骤：
(1)平板培养：
A.平板培养基(g/L)：葡糖糖浆3-4、大豆蛋白胨3-4、牛肉膏蛋白胨琼脂3-4、碳酸钙0.5-1、原水溶解，PH自然，121℃-124℃15min灭菌备用；
B.光滑球拟酵母于平板培养基内，平板倒置培养皿中28℃-30℃培养，培养时间15h-20h后；
(2)茄瓶培养：
a.茄瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆13-14、大豆蛋白胨11-12、牛肉膏蛋白胨琼脂10-12、碳酸钙2-2.5、氯化铵0.3-0.5、原水溶解，PH自然，121℃-124℃15min灭菌备用：
b.在无菌室内严格按无菌操作，从保存平板上挑单菌落涂布在茄瓶固体培养基上；
c.培养条件：28℃-30℃，培养时间15h-20h后；
d.将茄瓶放置1℃-4℃的冰箱内存储备用；
(3)种子摇瓶培养：
I.摇瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆17-18.5、大豆蛋白胨13.5-15.5、碳酸钙2.5-4.5、氯化铵0.5-0.8、氯化镁0.32-0.48、磷酸氢二钾0.2-0.4、原水溶解并用浓度为1.5mol/L HCL调节培养基初始PH为5-6，121℃-124℃15min灭菌备用；
II. 3000ml或5000ml的三角瓶或钢瓶二十至三十个，在无菌室内用灭过菌的接种铲，从培养好的茄瓶内铲取菌台接到500ml的三角瓶或钢瓶中；接种量为600ml/瓶-1000ml/瓶；培养温度为28℃-30℃，培养时间22h-24h；
(4)一级种子培养：
①一级种子培养基(g/L)：葡糖糖浆20-25、大豆蛋白胨16.5-18.5、碳酸钙6.5-8.5、氯化铵1.5-2.8、氯化镁1.32-3.48、磷酸氢二钾1.2-2.4、原水溶解并用浓度为1.5mol/L HCL调节培养基初始PH为5-6，121℃-124℃15min灭菌备用；
②采用800L种子罐3-5个；种子摇瓶的合拼至三角钢瓶内，在无菌环境下对种子罐进行接种操作，接种量为2000ml/罐-3000ml/罐；
③培养条件：培养温度28℃-30℃，1-6h通气量比1∶1，6h以后至种子成熟通气量比：1∶4，罐压维持在0.03MPa-0.05MPa；
④种子成熟的标准：OD值在40-50之间；
(5)一百五十立方发酵罐培养：
第一.发酵培养基(g/L)：葡萄糖150-200、磷酸氢二钾5-10、氯化镁0.9-1.5、氯化铵8.5-9.5、碳酸钙20-25、醋酸钠6-8、消泡剂0.01-0.02、微量元素液3-5mL、维生素液3-5mL，PH用浓度为40mol/LHCL调至5.0-5.5，121℃-125℃连续灭菌；
第二.培养条件：培养温度28℃-30℃，1-6h通气量比1∶1，搅拌转速100r/min-150min；6h-12h通气量比：1∶2，搅拌转速200r/min-350min；12h-30h通气量比：1∶3，搅拌转速400r/min-500min；30h以后通气量为1∶4，搅拌转速500r/min-700min；40h-56h搅拌转速800r/min-1000r/min；罐压维持在：0.03MPa-0.05MPa。
2.根据权利要求1所述的丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述微量元素液(g/L)：氯化锌3-6、氯化铁15-18、氯化铜0.2-0.3、氯化锰15-18，浓度为1.5mol/LHCL调节PH为5.0-5.0定容至1L-1.5L，121℃-125℃连续灭菌。
3.根据权利要求2所述的丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述维生素液(g/L)：维生素D 0.03-0.04、维生素E 0.003-0.005、维生素B1 0.2-0.3、维生素PP 6-8，浓度为1.5mol/L HCL调节PH为5.0-5.5定容至1L-1.5L，121℃-125℃连续灭菌。
4.根据权利要求1或3所述的丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述发酵培养基的连消顺序：微量元素溶液、发酵培养基。
5.根据权利要求4述的丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述一级种子培养中，④种子成熟的标准：波长660nm条件下的分光光度计，进行检测细胞浓度，成熟标准为：42-45。
6.根据权利要求1或5所述的丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述发酵罐在发酵期间的PH环境采用浓度为8-10mol/L NaOH控制为5.0-5.5。
7.根据权利要求1所述的丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述种子成熟的标准的OD值高于50，进行二级种子培养。
8.根据权利要求7所述的丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述二级种子培养基(g/L)：i葡糖糖浆10-15、大豆蛋白胨13.5-15.5、碳酸钙3.5-5.5、氯化铵0.5-1.8、氯化镁0.32-1.48、磷酸氢二钾0.8-1.2、原水溶解并用浓度为1.5mol/L HCL调节培养基初始PH为5-6，121℃-124℃15min灭菌备用；
ii采用800L种子罐；一级种子罐内种子液转入二级罐内进行再培养，接种量15L/罐-20L/罐；
iii培养条件：培养温度28℃-30℃，1-6h通气量比1∶1，6h以后至种子成熟通气量比：1∶2，罐压维持在0.03MPa-0.05MPa；
iv种子成熟的标准：OD值在80-120之间；
v二级种子成熟后接入所述发酵培养基内进行发酵。
9.根据权利要求1所述的丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述平板培养基(g/L)：葡糖糖浆2-6、大豆蛋白胨1-3、牛肉膏蛋白胨琼脂3-4、酵母膏1-3。
10.根据权利要求9所述的丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述发酵培养基(g/L)：葡萄糖150-200、磷酸氢二钾5-10、氯化镁0.9-1.5、氯化铵8.5-9.5、氯化钙20-25、醋酸钠6-8、氯化钾2-3。
11.根据权利要求1或权利要求10所述的丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述发酵过程中用浓度为60％的葡萄糖浆液对发酵罐进行补糖操作；所述补糖操作具体如下：20h补糖速率20L/h，30min；50h补糖速率20L/h，10min。
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