CN104046586A - 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株基因工程菌，该菌命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09，其已于2014年5月7日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为：CCTCC NO：M2014186。本发明还公开了所述基因工程菌在利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用。实验证明本发明菌株具有明显利用秸秆水解液高产(2R,3R)-2,3-丁二醇的能力，为工业上规模化开发利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及一株基因工程菌及其在生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用，尤其涉及一株基因工程阴沟肠杆菌及其在利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用。
背景技术
2,3-丁二醇广泛应用于化工、食品、燃料及航天航空等多个领域(Syu M J.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2001,55,10-18)。2,3-丁二醇在常温下是一种无色无味的液体，有三种同分异构体：meso-2,3-丁二醇、(2R,3R)-2,3-丁二醇和(2S,3S)-2,3-丁二醇；其中旋光性的(2R,3R)-2,3-丁二醇在手性化合物的不对称合成中有着重要作用，而且能够作为防冻剂使用(Celinska and Grajek,Biotechnol.Adv.2009,27,715–725)。
木质纤维素由于其可替代性和可循环性，被认为是利用微生物生产化学品的理想原料(Ji et al.,Biotechnol.Adv.2011,29,351–364)。因此，近年来关于利用源自木质纤维素的糖类生产2,3-丁二醇的生物技术得到广泛关注(Wang et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.2010,87,965–970)。木质纤维素水解液中主要含有葡萄糖和木糖，由于葡萄糖的存在会抑制2,3-丁二醇生产微生物对木糖的利用，往往会降低木质纤维素水解液原料的利用效率，从而造成2,3-丁二醇生产成本的提高。已有报道通过表达环磷酸腺苷受体蛋白(CRP)突变蛋白实现木糖和葡萄糖的同时利用来生产2,3-丁二醇(Ji et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.2011,89,1119–1125)，但由于产量和生产强度较低，无法满足工业生产需求。
目前报道的众多生产2,3-丁二醇的野生菌株中，仅多粘类芽孢杆菌产生光学纯的(2R,3R)-2,3-丁二醇，该菌株以葡萄糖为碳源，补料分批发酵能够产生111.0克/升的(2R,3R)-2,3-丁二醇，纯度达到98％，为目前报道(2R,3R)-2,3-丁二醇的最高产量，但其需要高浓度的有机氮源(et al.,Bioresour.Technol.2012,124,237–244)，增加了生产成本。在生产(2R,3R)-2,3-丁二醇基因工程菌方面，大肠杆菌工程菌能够利用葡萄糖产9.5克/升的(2R,3R)-2,3-丁二醇，产量较低(shen et al.,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2012,39,1725–1729)；而酿酒酵母能够补料分批发酵利用葡萄糖和半乳糖产生100.0克/升的(2R,3R)-2,3-丁二醇，纯度达到98％，其生产强度仅为0.33g/[L h](Lian et al.,Metab.Eng.2014,23,92–99)。并且上述菌株由于木糖利用能力较弱，不能有效的利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇。
基于此，迫切需要寻找更好的方法，以实现利用木质纤维素水解液来进行(2R,3R)-2,3-丁二醇的高效生产。
发明内容
针对上述现有技术中，菌株利用木质纤维素水解液困难，(2R,3R)-2,3-丁二醇的产量低，难以大规模生产的不足，本发明要解决的问题是提供一株可利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其在生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用。
本发明所述的基因工程菌为基因工程阴沟肠杆菌，该菌命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09，其已于2014年5月7日保藏于“中国典型培养物保藏中心”(中国.武汉.武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO：M2014186。
上述基因工程菌阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，该菌的较佳培养温度为30±1℃，可以在含有50毫克/升硫酸卡那霉素的LB培养基上生长。
上述基因工程菌阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09由以如下方法构建。
在阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM CGMCC No.4230中，利用基于同源重组的pK-bdh质粒，敲除E.cloacae SDM CGMCC No.4230中的bdh基因，得到的重组菌命名为菌株阴沟肠杆菌SDM01；利用PCR扩增得到短小芽孢杆菌的(2R,3R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bpbdh和E.cloacae SDM CGMCC No.4230中的Pb启动子，并通过重组PCR，酶切和连接，构建pET-Pb-bpbdh，其中Pb-bpbdh的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；为了消除碳代谢阻遏，利用pK-ptsG质粒，敲除阴沟肠杆菌SDM01中的ptsG基因，得到的重组菌命名为阴沟肠杆菌SDM03；利用PCR扩增得到E.cloacae SDM CGMCC No.4230中的半乳糖透性酶基因galP和Pb启动子，并通过重组PCR，酶切和连接，构建pET-Pb-galP，其中Pb-galP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，进一步通过重组pCR和酶切连接，得到同时表达bpbdh基因和galP基因的pETPb-bpbdh-PbgalP质粒，其中Pb-bpbdh-PbgalP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；利用pK-frdA和pK-ldhA敲除阴沟肠杆菌SDM03中的frdA和ldhA基因，得到的重组菌命名为阴沟肠杆菌SDM06；将pETPb-bpbdh-PbgalP质粒电转化入阴沟肠杆菌SDM06中，得到的重组菌命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09。
本发明所述基因工程菌在利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用。
选阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09CCTCC NO：M2014186，对其进行活化。
在无菌条件下，取活化好的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09CCTCC NO：M2014186菌液，以体积比为5～10％的接种量接种到发酵培养基中，在温度30±1℃，pH6.0～8.0、搅拌转速100～500rpm、通气量0.5～2.5vvm条件下培养36～72小时，其间，待检测培养基中葡萄糖的浓度降至20克/升以下时，补加木质纤维素水解液至培养基中葡萄糖的浓度为20～50克/升，当检测发酵液中(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度不再增加时，发酵结束，分离出培养液，按常规方式提取(2R,3R)-2,3-丁二醇；
其中，上述的发酵培养基配方为：1升蒸馏水中含：玉米浆干粉8克，无水乙酸钠5克，磷酸二氢钾6克，柠檬酸2.4克，氯化钾1克，七水硫酸镁0.5克，金属离子母液溶液10毫升，0.9％CaCl2溶液10毫升。金属离子母液的配方为：1升蒸馏水中含：七水硫酸亚铁2.25克，七水硫酸锌0.75克，一水硫酸锰0.38克。
上述应用中：所述pH范围优选6.0～7.0。
上述应用中：所述搅拌转速优选300～450rpm。
上述应用中：所述通气量优选1.0～2.0vvm。
上述应用中：所述阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09CCTCC NO：M2014186菌液的活化方法是：
(1)平板培养：将基因工程菌阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09CCTCC NO：M2014186菌株划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂的并含有50毫克/升硫酸卡纳霉素的LB培养基平板上，30±1℃培养12±2小时；
(2)种子培养：无菌条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到含有60克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的发酵培养基中，30±1℃摇床震荡培养12±2小时，得到阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09CCTCC NO：M2014186的活化菌液；
其中，上述步骤(1)中所述的LB培养基配方为：1升蒸馏水中含：酵母粉5克，蛋白胨10克，氯化钠10克，121℃灭菌15分钟。
上述应用中，底物葡萄糖的检测方法是：样品进行设定的稀释后，采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。测定原理为利用固定化葡萄糖氧化酶膜专一性测定葡萄糖含量。
上述应用中，发酵产物(2R,3R)-2,3-丁二醇的检测方法是：
每500毫升乙酸乙酯中加入0.7毫升异戊醇，作为萃取剂；利用该萃取剂，对发酵液中发酵产物样品进行等体积萃取，利用涡旋振荡器对萃取的样品震荡30秒钟，然后静置，取上层样品进行气相检测。具体的气相检测条件如下：
所用气相色谱仪的型号为Agilent6820，氮气作为载气，进样器和检测器的温度均设为280℃，检测过程的柱温设定为：40℃保持3分钟；然后以每分钟1.5℃的速率升温到80℃；以每分钟0.5℃的速率升温到86℃；以每分钟30℃的速率升温到200℃。进样量1.5微升，进行气相检测。
本发明对一株高产2,3-丁二醇混合物的阴沟肠杆菌进行工程改造，成功实现了将其具有利用木质纤维素水解液高产(2R,3R)-2,3-丁二醇的能力，并以此重组菌株即阴沟肠杆菌SDM09发酵秸秆水解液获得高产(2R,3R)-2,3-丁二醇，为工业上规模化开发利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇提供基础。
本发明具有的突出特点是：
(1)该工程菌株阴沟肠杆菌SDM09，可同时利用木质纤维素中的木糖和葡萄糖，原料的利用率大大提高。
(2)本发明方法构建的工程菌株生产(2R,3R)-2,3-丁二醇，培养基的营养组成简单、生产成本低。
(3)本发明的工程菌能发酵秸秆水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇，最高产量可达到152克/升以上，纯度大于97％。
附图说明
图1载体pETPb-bpbdh-PbgalP构建过程。
图2阴沟肠杆菌SDM09发酵秸秆水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇过程曲线。●,葡萄糖；■,生物量；▲,木糖；◆,(2R,3R)-2,3-丁二醇；▼,乙偶姻。
图3阴沟肠杆菌SDM09发酵产物的气相色谱图。
其中：A：标准品气相色谱图，B：阴沟肠杆菌SDM09发酵产物的气相色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步阐明本发明，但不仅限于此。
实施例1：生产(2R,3R)-2,3-丁二醇阴沟肠杆菌工程菌的构建
1.敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh(GenBank:13167657)
采用常规的方法制备阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM CGMCC No.4230的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法；使用合成的引物Kbdh1-f和Kbdh1-r从上述基因组DNA中PCR扩增得到2,3-丁二醇合成基因的前段；使用合成的引物Kbdh2-f和Kbdh2-r从上述基因组中PCR扩增得到2,3-丁二醇合成基因的后段；利用酶切与经过EcoRI和BamHI进行双酶切的pKR6K质粒进行连接重组转化至大肠杆菌S17-1中，得到的菌株命名为大肠杆菌pK-bdh。
扩增重组引物设计如下：
Kbdh1-f:5’-AAAGAATTCCCAGGTGATGATCTCCAAC携带一个EcoRI位点
Kbdh1-r:5’-TATAAGCTTCAAAACCATCTTTCACCAGG携带一个HindIII位点
Kbdh2-f:5’-TTAAAGCTTGGAGATTGACCGTCAGGTGT携带一个HindIII位点
Kbdh2-r:5’-ATTTGGATCCATAGAGGTGTTTACTTTCCG携带一个BamHI位点。
1)培养需要敲除的目的菌阴沟肠杆菌SDM CGMCC No.4230与携带敲除质粒的大肠杆菌pK-bdh，同时生长到OD620nm0.5。将1毫升目的菌培养物离心，生理盐水洗两遍；将5毫升大肠杆菌培养物离心，生理盐水洗两遍。
2)将上述目的菌与大肠杆菌pK-bdh的菌体一共用100微升生理盐水重悬，将重悬液全部滴在LB平板(无任何抗性)中间，平板正面放置，过夜培养。
3)将上述平板中的菌落用生理盐水和刮刀刮下，生理盐水洗两遍，进行适当稀释(一般是10-2或10-3)，涂布M9+柠檬酸盐+Kana平板(阴沟肠杆菌SDM GMCC No.4230可利用柠檬酸盐为唯一碳源，质粒和基因组进行了单交换的目的菌，可在M9+柠檬酸盐+Kana平板生长；未发生单交换的目的菌，无法在Kana平板生长；带有质粒的大肠杆菌，无法在柠檬酸盐平板生长)，过夜培养。
4)挑取生长的单菌落，利用上下游引物进行PCR验证，单交换的目的菌，可同时PCR出长片段(原始基因)和短片段(构建的上下游同源臂)。
5)将正确的单交换目的菌，接种至LB摇管(无任何抗性)，过夜培养。
6)将上述培养液转接至含10％蔗糖的LB摇管中培养两代，适当稀释(一般是10-6或10-7)，涂布LB+12％蔗糖平板，过夜培养。
7)挑取生长的单菌，利用上下游引物进行PCR验证，双交换的目的菌，能PCR出短片段(构建的上下游同源臂)，挑选正确的双交换菌，进行表型验证，得到正确的敲除菌E.cloacae SDMΔbdh，命名为阴沟肠杆菌SDM01。
M9培养基配方为：1升蒸馏水中含：氯化钠0.5克，氯化铵1克，磷酸氢二钾3克，磷酸氢二钠3克，七水硫酸镁0.246克，柠檬酸三钠10克。
2.过表达(2R,3R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bpbdh
1)采用常规的方法制备菌株B.pumilus LN146的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取B.pumilusLN146的基因组DNA；使用合成的引物Bp-f和Bp-r从B.pumilus LN146基因组DNA中PCR扩增得到(2R,3R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bpbdh。使用合成的引物Pb-f和Pb-r从实施例1中E.cloacae SDM CGMCC No.4230基因组中PCR扩增得到Pb启动子，利用重组PCR进行重组得到Pb-bpbdh片段。
扩增重组引物设计如下：
Pb-f:5’-AAAGGATCCATCTAAAACGTCTCAAACCA携带一个BamHI位点
Pb-r:5’-TGCCAGCGTAGTGCTTTCATGCTCGTCCTCTTCAACTTTA
Bp-f:5’-TAAAGTTGAAGAGGACGAGCATGAAAGCACTACGCTGGCA
Bp-r:5’-AAACTCGAGTTATTCAGCACTAACTAAAA携带一个XhoI位点。
上述Pb-bpbdh片段的DNA序列长度为1143个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2)将重组后的Pb-bpbdh片段与pET28a进行BamHI和XhoI的双酶切和连接，得到pETPb-bpbdh质粒。
3)利用含有0.7毫摩尔每升EDTA的LB培养基培养阴沟肠杆菌SDM01到OD620nm0.5。将30毫升目的菌培养物离心，超纯水洗两遍，并用300微升的超纯水重悬，得到阴沟肠杆菌SDM01的感受态细胞。然后再2000伏，200欧姆，20微法拉条件下，将质粒pETPb-bpbdh电转化至阴沟肠杆菌SDM01，涂Kana抗性LB平板，挑取的转化子，然后提质粒酶切验证，得到正确的转化子E.cloacae SDMΔbdh/pETPb-bpbdh，命名为阴沟肠杆菌SDM02
实施例2：解除葡萄糖效应E.cloacae工程菌的构建
按照实施例1中的基因敲除方法，在阴沟肠杆菌SDM01的基础上进行ptsG基因的敲除，得到E.cloacae SDMΔbdhΔptsG。
1.敲除葡萄糖磷酸转移酶基因ptsG(GenBank:13169500)
以实施例1中提取的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM CGMCC No.4230的基因组DNA为模板；使用合成的引物KptsG1-f和KptsG1-r从E.cloacae SDM基因组DNA中PCR扩增得到ptsG的前段。使用合成的引物KptsG2-f和KptsG2-r从E.cloacae SDM基因组中PCR扩增得到ptsG合成基因的后段，利用重组PCR进行重组，使重组后的基因缺失中间部分。得到重组片段酶切与经过EcoRI和BamHI进行双酶切的pKR6K质粒进行连接重组转化大肠杆菌S17-1，得到大肠杆菌S17-1pK-ptsG。该菌株用于阴沟肠杆菌SDM01中的ptsG基因敲除，具体操作条件同实施例1，其中扩增重组引物设计如下：
KptsG1-f:5’-AAAGGATCCATGTTTAAGAATGCATTTGCT携带一个BamHI位点
KptsG1-r:5’-CAGAATCGCGTGGATAACGTATCACACCCGTGAAAATCGC
KptsG2-f:5’-GCGATTTTCACGGGTGTGAT ACGTTATCCACGCGATTCTG
KptsG2-r:5’-GTTGAATTCTTAGCTGTTGCGGATGTATTCATCCAT携带一个EcoRI位点。
得到的阴沟肠杆菌E.cloacae SDMΔbdhΔptsG命名为阴沟肠杆菌SDM03。
2.重组表达半乳糖透性酶基因galP
1)以实施例1中提取的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM CGMCC No.4230的基因组DNA为模板，使用合成的引物从E.cloacae SDM基因组DNA中PCR扩增得到galP合成基因。与Pb(2,3-丁二醇合成启动子，来源于E.cloacae SDM)进行重组得到Pb-galP片段，并利用BamHI和HindIII酶切连接至pET28a，得到pETPb-galP。
扩增重组引物设计如下：
Pb-f:5’-AAAGGATCCATCTAAAACGTCTCAAACCA,携带一个BamHI位点
Pg-r:5’-TGTTTATTATTGTCAGGCATGCTCGTCCTCTTCAACTTTA
G-f:5’-TAAAGTTGAAGAGGACGAGCATGCCTGACAATAATAAACA
G-r:5’-TTTAAGCTTTTAGTCGTGTGCGCCGATTT携带一个HindIII位点
上述Pb-galP片段的DNA序列长度为1500个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2)利用引物G-B-f和G-B-r，以pETPb-galP为模板PCR扩增得到Pb-galP的DNA片段，利用引物B-G-f和Bp-r，以pETPb-bpbdh为模板PCR扩增得到Pb-bpbdh。使用重组PCR将Pb-galP和Pb-bpbdh重组到一起，然后NcoI/XhoI双酶切，和表达载体pET28a连接，得到重组质粒pETPb-bpbdh-PbgalP。
G-B-f:5’-TAAGAAGGAGATATACCATGGATCTAAA携带一个NcoI位点
G-B-r:5’-TGAGACGTTTTAGATTTAGTCGTGTGCGCC
B-G-f:5’-GGCGCACACGACTAAATCTAAAACGTCTCA
Bp-r:5’-AAACTCGAGTTATTCAGCACTAACTAAAA携带一个XhoI位点。
上述Pb-bpbdh-PbgalP片段的DNA序列长度为2643个碱基，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
将所得的重组质粒pETPb-bpbdh-PbgalP电转进入阴沟肠杆菌阴沟肠杆菌SDM03中，得到E.cloacae SDMΔbdhΔptsG/pETPb-bpbdh-PbgalP，将其命名为阴沟肠杆菌SDM04。
实施例3：敲除副产物代谢途径E.cloacae工程菌的构建
1.敲除乳酸脱氢酶基因ldhA(GenBank:13166930)
以实施例1中提取的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM CGMCC No.4230的基因组DNA为模板，使用合成的引物KldhA1-f和KldhA1-r从E.cloacae SDM基因组DNA中PCR扩增得到ldhA基因的前段。使用合成的引物KldhA2-f和KldhA2-r从E.cloacae SDM基因组中PCR扩增得到ldhA基因的后段，利用重组PCR进行重组，使重组后的基因缺失中间部分。得到重组片段酶切与经过EcoRI和SmaI进行双酶切的pKR6K质粒进行连接重组转化。
扩增重组引物设计如下：
KldhA1-f:5’-GCTGAATTCATCGATGAGCCCCGCGTTAA携带一个EcoRI位点
KldhA1-r:5’-GCTGAAGGTGGTTGGGGGTTGATTGACTCTCAG
KldhA2-f:5’-AGAGTCAATCAACCCCGAACCACCTTCAGCCCCA
KldhA2-r:5’-GCTACCCGGGTATCCTGATTTAGCGAGAGA携带一个SmaI位点。
按照实施例1中的双亲杂交方法，在阴沟肠杆菌E.cloacae SDM03的基础上进行双亲杂交双交换得到E.cloacae SDMΔbdhΔptsGΔldhA，将其命名为阴沟肠杆菌SDM05。
2.敲除琥珀酸脱氢酶基因frdA(GenBank:13168818)
以实施例1中提取的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM CGMCC No.4230的基因组DNA为模板，使用合成的引物KfrdA1-f和KfrdA1-r从阴沟肠杆菌E.cloacae SDM基因组DNA中PCR扩增得到frdA基因的前段。使用合成的引物KfrdA2-f和KfrdA2-r从阴沟肠杆菌E.cloacae SDM基因组中PCR扩增得到frdA基因的后段，利用重组PCR进行重组，使重组后的基因缺失中间部分。得到重组片段酶切与经过EcoRI和SmaI进行双酶切的pKR6K质粒进行连接重组转化。
扩增重组引物设计如下：
KfrdA1-f:5’-CCGAATTCGTGCAAACTTTTCAAGCCGA携带一个EcoRI位点
KfrdA1-r:5’-GACGTCAGTGACCGTCATCGACCAGAAT
KfrdA2-f:5’-CGGTCACTGACGTCGAGAAACGACTGAA
KfrdA2-r:5’-TTTCCCGGGTCAGCCATTCGCCTTCTCCT携带一个SmaI位点。
按照实施例1中的双亲杂交方法，在阴沟肠杆菌E.cloacae SDM05的基础上进行双亲杂交双交换得到阴沟肠杆菌E.cloacae SDMΔbdhΔptsGΔldhAΔfrdA，将其命名为阴沟肠杆菌SDM06。
将实施例2构建好的质粒pETPb-bpbdh-PbgalP电转到E.cloacae SDM06中，即得到最终目的工程菌株E.cloacae SDMΔbdhΔptsGΔldhAΔfrdA/pETPb-bpbdh-PbgalP，命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09。
上述得到的工程菌阴沟肠杆菌(E.cloacae)SDM09已于2014年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，保藏中心编号为：CCTCC NO：M2014186。
上述重组阴沟肠杆菌(E.cloacae)SDM09CCTCC NO：M2014186为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，可以用于发酵生产(2R,3R)-2,3-丁二醇。
上述重组阴沟肠杆菌(E.cloacae)SDM09CCTCC NO：M2014186的较佳培养温度为30±1℃，可以在含有50毫克/升硫酸卡纳霉素的LB培养基上生长。
实施例4：制备阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09菌株的细胞液体培养物
1、平板培养：将实施例3中所得阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09划线到含有质量体积比为1.5％琼脂的并含有50毫克/升硫酸卡那霉素的LB平板上，30℃培养12小时；
2、种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5毫升的含有50毫克/升硫酸卡那霉素的LB培养基中，30℃摇床震荡培养12小时；
3、摇瓶：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比1～3％的接种量，接种到30～150毫升含有60克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的发酵培养基中，30±1℃摇床震荡培养12±1小时，即获得阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09菌株的细胞液体培养物；
其中，上述步骤1中所述的LB培养基配方为：1升蒸馏水中含：蛋白胨10克，酵母粉5克，氯化钠10克，121℃灭菌15分钟。
实施例5：阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09工程菌以葡萄糖和木糖为碳源发酵生产(2R,3R)-2,3-丁二醇
将通过实施例4的方法获得的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09菌株的细胞液体培养物，以体积比为5％的接种量接种到含有60克/升葡萄糖、20克/升木糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的发酵培养基中，在30℃、pH6.5、300rpm、1.5vvm通气量条件下发酵。发酵中每隔3小时取样，样品以8,000×g离心10分钟，检测上清中(2R,3R)-2,3-丁二醇和葡萄糖的浓度，根据葡萄糖浓度补加比例为3:1的葡萄糖和木糖干粉混合物，使葡萄糖浓度维持在20～50克/升；对上清进行气相色谱分析测定发酵液中(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度，当(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度不再增加时，停止发酵。
其中，上述步骤中所述的发酵培养基1配方为：1升蒸馏水中含：玉米浆干粉8克，乙酸钠5克，磷酸二氢钾6克，柠檬酸2.4克，氯化钾1克，硫酸镁0.5克，金属离子母液溶液10毫升，0.9％CaCl2溶液10毫升。金属离子母液的配方为：1升蒸馏水中含：七水硫酸亚铁2.25克，七水硫酸锌0.75克，一水硫酸锰0.38克。
44小时后检测结果显示：(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度为152克/升。
实施例6：阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09工程菌以秸秆水解液为碳源发酵生产(2R,3R)-2,3-丁二醇
将通过实施例4的方法获得的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09菌株的细胞液体培养物，以体积比为5％的接种量接种到含有550克/升总糖(葡萄糖和木糖比例为3：1)的秸秆水解液和50毫克/升硫酸卡那霉素的发酵培养基中，在30℃、pH7.0、450rpm、2.0vvm通气量条件下发酵。发酵中每隔3小时取样，样品以8,000×g离心10分钟，检测上清中(2R,3R)-2,3-丁二醇和葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度补加浓缩的秸秆水解液，使葡萄糖浓度维持在20～50克/升；对上清进行气相色谱分析测定发酵液中(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度，当(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度不再增加时，停止发酵。
51小时后检测结果显示：(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度为119.4克/升。
实施例7：阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09工程菌以葡萄糖为碳源发酵生产(2R,3R)-2,3-丁二醇
将通过实施例4的方法获得的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09菌株的细胞液体培养物，以体积比为5％的接种量接种到含有80克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的发酵培养基中，在30℃、pH6.0、400rpm、1.0vvm通气量条件下发酵。发酵中每隔3小时取样，样品以8,000×g离心10分钟，检测上清中(2R,3R)-2,3-丁二醇和葡萄糖的浓度，根据葡萄糖浓度补加葡萄糖干粉，使葡萄糖浓度维持在20～50克/升；对上清进行气相色谱分析测定发酵液中(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度，当(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度不再增加时，停止发酵。
52小时后检测结果显示：(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度达到155.0克/升。
Claims (2)
1.一株基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌为基因工程阴沟肠杆菌，该菌命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09，其已于2014年5月7日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为：CCTCC NO：M2014186。
2.权利要求1所述基因工程菌在利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用。
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