CN106893726B - 一种启动子以及重组酵母菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种启动子以及重组酵母菌株。本发明所述启动子在酵母菌株ALD6启动子全长序列基础上，进行如下一项或多项的处理：(1)敲除一段或多段ALD6启动子上的保守序列；(2)敲除一段或多段ALD6启动子上的包含保守序列的序列；(3)对一段或多段ALD6启动子上的保守序列进行突变；(4)置换一段或多段ALD6启动子上的保守序列；(5)置换一段或多段ALD6启动子上的包含保守序列的序列。本发明通过对酵母菌株ALD6启动子的深入研究，发现其保守序列的缺失、置换、突变等情形能提高萜类化合物生产用酵母菌株的产量，可作为酵母工程菌合成路径的优化手段，构建出产能更加优异的重组工程菌。

Description

一种启动子以及重组酵母菌株

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种启动子以及重组酵母菌株。

背景技术

萜类化合物是所有异戊二烯聚合物及其衍生物的总称，根据其分子中包括异戊二烯单位的数目可分为：单萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜。萜类在植物界中普遍存在，具有重要的药用价值和经济价值，如抗肿瘤药物紫杉醇、抗疟疾药物青蒿素，强抗氧化剂类胡萝卜素，还有番茄红素、香叶醇、青蒿二烯等等。然而由于植物资源稀缺、活性物质含量低、化学合成难度大等因素，限制了萜类在医药等领域中的广泛应用。

合成生物细胞工厂针对宿主细胞(微生物等)和目标生物合成路径进行有目标地改造产生直接效益，能够降低生产成本、缩短生产周期，因此运用合成生物细胞工厂高效生产上述化合物，具有十分广阔的应用前景。酿酒酵母是公认安全的模式微生物，它生长周期短且容易高密度培养，可作食用、药用酵母，是上述物质合成的非常优秀的宿主。

目前合成生物细胞工厂存在的关键科学问题是宿主细胞与异源生物合成路径间的适配。一方面异源生物合成路径本身的代谢通量决定目标产物的产量，因此需要优化异源路径，包括优化异源基因的表达、基因来源的筛选、胞内前体物质供给等；另一方面来自宿主细胞固有的代谢和调控***也会影响目标生物合成路径的生产能力，这就需要对底盘细胞进行深入***的优化。

在酿酒酵母中，基因ALD6(由ALD6启动子控制)编码乙醛脱氢酶，催化细胞质中的乙醛生成乙酸。基因ALD6的表达水平会直接影响细胞中乙酸的积累，但尚未有任何该基因可影响萜类化合物产量的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种启动子，使得所述启动子能够提高所在酵母菌株的多种萜类化合物产量；

本发明的另外一个目的在于提供一种包含有上述启动子序列的重组酵母菌株，使其能够提高多种萜类化合物的产量。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种启动子，在酵母菌株ALD6启动子全长序列基础上，进行如下一项或多项的处理：

(1)敲除一段或多段ALD6启动子上的保守序列；

(2)敲除一段或多段ALD6启动子上的包含保守序列的序列；

(3)对一段或多段ALD6启动子上的保守序列进行突变；

(4)置换一段或多段ALD6启动子上的保守序列；

(5)置换一段或多段ALD6启动子上的包含保守序列的序列。

目前酵母菌株ALD6启动子功能的研究仅局限在乙酸积累方面，而其他方面的功能并未有相关报道，本发明针对目前现状，从多方面对ALD6启动子进行研究，发现ALD6启动子保守序列的缺失、置换、突变可提高萜类化合物生产酵母菌株的产量提高。

作为优选，本发明所述启动子在酵母菌株ALD6启动子全长序列基础上，为进行如下之一项处理后的启动子：

(1)敲除一段或多段ALD6启动子上的包含保守序列的序列；

(2)敲除一段ALD6启动子上的保守序列；

(3)对一段ALD6启动子上的保守序列进行突变；

(4)敲除一段或多段ALD6启动子上的包含保守序列的序列，对一段ALD6启动子上的保守序列进行突变；

(5)采用抗性标签置换一段或多段ALD6启动子上的包含保守序列的序列。

作为优选，本发明所述酵母菌株为酿酒酵母，可选自CEN.PK系列酿酒酵母，如酿酒酵母CEN.PK2-1C或酿酒酵母CEN.PK2-1D或酿酒酵母CEN.PK2，也可选自BY系列酿酒酵母，如BY4741酿酒酵母或BY4742酿酒酵母或BY4743酿酒酵母。所有已经被基因组测序的酿酒酵母的ALD6启动子具备相同的保守序列，并且也具备基本相同的非保守序列，从整体来说，所有酿酒酵母的ALD6启动子基本相同。其中，上述提及的酿酒酵母CEN.PK2-1C、酿酒酵母CEN.PK2-1D、BY4741酿酒酵母三者具备完全相同的ALD6启动子序列。

本发明利用启动子保守序列预测网站UCSC Genome Browser(http://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat？hgsid＝471419258_3MF1PADILg7Od OMuaIJ15FmRtAai&command＝start)，对BY4741酿酒酵母ALD6启动子(序列如SEQ ID NO:1所示)进化保守性预测，结果获得9段保守序列，如图1所示中的A启动子(ALD6全长启动子)，所述保守序列为ALD6启动子全长序列中1-377bp(编号为IX)、630-654bp(编号为VIII)、701-787bp(编号为VII)、846-900bp(编号为VI)、916-925bp(编号为V)、941-1116bp(编号为IV)、1184-1205bp(编号为III)、1227-1313bp(编号为II)、1430-1469bp(编号为I)九段保守序列。

由于所述9段保守序列是解决问题的关键因素，因此在本发明中敲除包含保守序列在内的序列也可实现预期目的，而所述包含保守序列的序列可以是在保守序列上游、下游或上下游位置连接相邻的序列，这些相邻的序列中可以有非保守序列，也可以有其他保守序列，或者两者兼有，可以是非保守序列或其他保守序列的全部序列，也可以是部分序列。

按照上述描述，包含保守序列的序列有多种形式，在本发明具体实施方式中，可选自1-629bp序列、630-700bp序列、701-845bp序列、846-915bp序列、916-940bp序列、941-1183bp序列、1184-1226bp序列、1227-1429bp序列、1430-1479bp序列、378-654bp序列、655-787bp序列、787-900bp序列、788-900bp序列、901-925bp序列、926-1116bp序列、1117-1205bp序列、1117-1191bp序列、1206-1313bp序列、1314-1469bp序列。

在对相关序列的敲除处理中，本发明按照图1中A启动子从左至右的顺序，优选进行梯度敲除，即按照敲除IX序列、敲除IX序列+IX下游相邻的整段非保守序列、敲除IX序列+IX下游相邻的整段非保守序列+VIII序列、敲除IX序列+IX下游相邻的整段非保守序列+VIII序列+VIII下游相邻的整段非保守序列这种逐步叠加序列的方式进行多形式敲除，鉴于数量较多的原因，本发明在此并未全部列举出所有按照上述描述方式的梯度敲除形式，但本领域技术人员能够在上述描述的引导下实现其他未列举的梯度敲除形式，这也是本发明的保护范围。

在对保守序列的突变处理中，本发明对整段保守序列进行突变，并优选碱基置换突变，在具体实施过程中以碱基转化突变为例进行了说明，所谓碱基转换突变即将嘧啶碱基C与T互换、嘌呤碱基A与G互换。

在对相关序列的置换处理中，可选择不影响酵母菌株萜类化合物生产功能的序列进行置换，在本发明具体实施过程中，本发明结合实际筛选的方便选用抗性标签进行置换，如KanMX抗性标签。

为了便于理解本发明技术思路，本发明以举例但并非限制的方式进行说明，参见图1的B-L启动子，各启动子在全长的A启动子基础上进行了敲除、突变以及置换等多种处理方式获得了符合本发明条件的启动子。其中，A启动子为ALD6全长启动子，共1479bp；B启动子为敲除IX序列的启动子；C启动子为敲除包含IX的序列(1-629bp)的启动子；D启动子为敲除包含IX和VIII的序列(1-629bp、630-700bp)的启动子；E启动子为对VI整段序列进行碱基转换突变的启动子；F启动子为敲除包含IX、VIII和VII的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp)的启动子；G启动子为在F启动子基础上对VI整段序列进行碱基转换突变的启动子；H启动子为敲除包含IX、VIII、VII和VI的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp)的启动子；I启动子为敲除包含IX、VIII、VII、VI和V的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp、916-940bp)的启动子；J启动子为敲除包含IX、VIII、VII、VI、V和IV的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp、916-940bp、941-1183bp)的启动子；K启动子为敲除包含IX、VIII、VII、VI、V、IV和III的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp、916-940bp、941-1183bp、1184-1226bp)的启动子；L启动子为采用KanMX抗性标签置换包含VI、V、IV、部分III以及部分VII的序列(787-900bp、901-925bp、926-1116bp、1117-1191bp)的启动子。

本发明采用上述C、D、E、F、G、H、K、L启动子为试验对象，分别替换香叶醇、青蒿二烯、香叶基香叶醇、酵母固醇和番茄红素等生产用酿酒酵母菌株中的原有ADL6启动子，然后与原有菌株进行产量对比，结果显示，采用本发明启动子后，各菌株相比原有菌株在香叶醇、青蒿二烯、香叶基香叶醇、酵母固醇和番茄红素产量均得到提高。

同时，为了验证保守序列是否为主要影响因素，在本发明所述启动子基础上保留其相邻的非保守序列进行对比，结果显示，两者在萜类化合物产量上并不明显差异，表明保守序列在ALD6启动子上的缺失、置换、突变等为主要影响因素。

基于上述有益效果，本发明提供所述启动子在构建萜类化合物生产用酵母菌株以及在生产萜类化合物中的应用。其中，所述萜类化合物为香叶醇、青蒿二烯、香叶基香叶醇、酵母固醇、番茄红素中的一种或多种。

此外，根据试验结果和应用，本发明提供了一种重组的生产萜类化合物酵母菌株，采用本发明所述启动子替换原有ALD6启动子。在实际构建过程中，可以先行构建出需要的所述启动子，通过酵母的自身同源重组整合到基因组上，也可以在原有ALD6启动子基础上直接进行敲除、置换、突变等操作来实现。所述酵母菌株为酿酒酵母菌株，可选自CEN.PK系列酿酒酵母，如酿酒酵母CEN.PK2-1C或酿酒酵母CEN.PK2-1D，也可选自BY系列酿酒酵母，如BY4741酿酒酵母。

由以上技术方案可知，本发明通过对酵母菌株ALD6启动子的深入研究，发现其保守序列的缺失、置换、突变等情形能够提高萜类化合物生产用酵母菌株的产量，可作为酵母工程菌合成路径的优化手段，构建出产能更加优异的重组工程菌。

附图说明

图1所示为ALD6全长启动子以及本发明所述启动子示意图；其中，罗马数字表示ALD6启动子上的保守序列，英文字母表示各启动子编号，E和G启动子中的VI保守序列进行了碱基转换突变；

图2所示为基因片段1的基因元件模式图；其中，两端TRP1LHA、TRP1RHA分别表示酵母trp1位点上、下游同源序列；

图3所示为基因片段2的基因元件模式图；其中，两端LEU2LHA、LEU2RHA分别表示酵母leu2位点上、下游同源序列；

图4所示为基因片段3的基因元件模式图；其中，两端TRP1LHA、TRP1RHA分别表示酵母trp1位点上、下游同源序列；

图5所示为基因片段4的基因元件模式图；其中，两端LEU2LHA、LEU2RHA分别表示酵母leu2位点上、下游同源序列；

图6所示为基因片段5的基因元件模式图；其中，两端TRP1LHA、TRP1RHA分别表示酵母trp1位点上、下游同源序列；

图7所示为基因片段6的基因元件模式图；其中，两端LEU2LHA、LEU2RHA分别表示酵母leu2位点上、下游同源序列；

图8所示为不同重组菌株的香叶醇产量柱形图；其中，A表示含有全长启动子A的重组菌株，C、D、E、F、G、H、K、L表示含有对应编号启动子的重组菌株，横坐标为香叶醇产量，单位mg/L；

图9所示为不同重组菌株的青蒿二烯产量柱形图；其中，A表示含有全长启动子A的重组菌株，C、D、E、F、G、H、K、L表示含有对应编号启动子的重组菌株，横坐标为青蒿二烯产量，单位mg/L；

图10所示为不同重组菌株的香叶基香叶醇产量柱形图；其中，A表示含有全长启动子A的重组菌株，C、D、E、F、G、H、K、L表示含有对应编号启动子的重组菌株，横坐标为香叶基香叶醇产量，单位mg/L；

图11所示为不同重组菌株的酵母固醇产量柱形图；其中，A表示含有全长启动子A的重组菌株，C、D、E、F、G、H、K、L表示含有对应编号启动子的重组菌株，横坐标为酵母固醇产量，单位mg/g DCW；

图12所示为不同重组菌株的番茄红素产量柱形图；其中，A表示含有全长启动子A的重组菌株，C、D、E、F、G、H、K、L表示含有对应编号启动子的重组菌株，横坐标为番茄红素产量，单位mg/g DCW。

具体实施方式

本发明公开了一种启动子以及重组酵母菌株，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述启动子和菌株已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述启动子和菌株进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，为了便于摇瓶发酵试验的进行，本发明采用了酿酒酵母CEN.PK2-1C，其为四重营养缺陷型(亮氨酸、色氨酸、组氨酸、尿嘧啶)酿酒酵母，利于筛选正确菌株，同时为了保证酿酒酵母不消耗诱导剂半乳糖，本发明敲除了酿酒酵母中的gal1、gal7和gal10三个基因，上述的这些对酵母的改动只是为了方便验证试验的进行，对最终效果的实现无影响。

同时，酿酒酵母CEN.PK2-1C本身不具备生产萜类化合物的能力，缺少部分酶，需要构建外源基因元件导入其中成为生产菌株。其中，发酵生产香叶醇的酵母菌株需包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：

酵母trp1位点上游同源序列、GAL1启动子、香叶醇合成酶编码基因GES、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段1，示意图见图2，香叶醇合成酶编码基因GES来源于长春花(Catharanthusroseus)；

酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2，示意图见图3。

发酵生产青蒿二烯的酵母菌株需包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：

酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2；

酵母trp1位点上游同源序列、GAL1启动子、青蒿二烯合成酶编码基因ADS、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段3，示意图见图4，青蒿二烯合成酶编码基因ADS来源于青蒿(Artemisia annua)。

发酵生产香叶基香叶醇的酵母菌株需包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：

酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、香叶基香叶醇合成酶编码基因GGPPS、GPM1终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段4，示意图见图5，香叶基香叶醇合成酶编码基因GGPPS来源于曼地亚红豆杉(Taxus x media)。

发酵生产酵母固醇的酵母菌株需包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：

酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2。

发酵生产番茄红素的酵母菌株需包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：

CN105087406A中的基因片段1，在本发明中命名为基因片段5，示意图见图6，其中基因crtB的来源为成团泛菌(Pantoea agglomerans)，记为PacrtB，基因crtI的来源为三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)，记为Bt crtI：

CN105087406A中的基因片段2，在本发明中命名为基因片段6，示意图见图7，基因crtE的来源为成团泛菌(Pantoea agglomerans)，记为PacrtE，如SEQ ID NO:5所示：

如果需要同时发酵生产上述多种目标产物，按照需要引入的基因片段逐一引入即可。上述各基因元件、同源序列等均以酿酒酵母菌株BY4741的基因组为模板，设计并合成合适的引物，通过PCR扩增得到，具体可参照专利CN105087406A中的记载；异源基因均为经过密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点后通过人工合成得到，其中来源于长春花(Catharanthusroseus)的香叶醇合成酶编码基因GES序列如SEQ ID NO:2所示，来源于青蒿(Artemisia annua)的青蒿二烯合成酶编码基因ADS如SEQ ID NO:3所示，来源于曼地亚红豆杉(Taxus x media)的香叶基香叶醇合成酶编码基因GGPPS如SEQ ID NO:4所示。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：本发明所述启动子

在ALD6全长启动子基础上按照以下方式获得对应的启动子：

B启动子为敲除IX序列的启动子；

C启动子为敲除包含IX的序列(1-629bp)的启动子；

D启动子为敲除包含IX和VIII的序列(1-629bp、630-700bp)的启动子；

E启动子为对VI整段序列进行碱基转换突变的启动子；

F启动子为敲除包含IX、VIII和VII的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp)的启动子；

G启动子为在F启动子基础上对VI整段序列进行碱基转换突变的启动子；

H启动子为敲除包含IX、VIII、VII和VI的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp)的启动子；

I启动子为敲除包含IX、VIII、VII、VI和V的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp、916-940bp)的启动子；

J启动子为敲除包含IX、VIII、VII、VI、V和IV的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp、916-940bp、941-1183bp)的启动子；

K启动子为敲除包含IX、VIII、VII、VI、V、IV和III的序列(1-629bp、630-700bp、701-845bp、846-915bp、916-940bp、941-1183bp、1184-1226bp)的启动子；

L启动子为采用KanMX抗性标签置换包含VI、V、IV、部分III以及部分VII的序列(787-900bp、901-925bp、926-1116bp、1117-1191bp)的启动子。

上述中各启动子在获知其序列基础上可进行全合成获得，也可通过引物扩增获得ALD6启动子，并按照常规的敲除方法、置换方法和突变方法进行处理，获得对应启动子。

实施例2：摇瓶发酵试验(全长启动子与本发明启动子之间的对比)

1、试验菌株的构建

基础菌株：

参照专利CN105087406A中的记载，敲除酿酒酵母CEN.PK2-1C中gal1、gal7、gal10三个基因，构建得到重组酿酒酵母菌株A(对照菌株，对应于全长启动子A)；

参照专利CN105087406A中的记载，敲除酿酒酵母CEN.PK2-1C中gal1、gal7、gal10三个基因，将实施例1中的C、D、E、F、G、H、K、L启动子通过酵母同源重组替换原有ALD6启动子，构建得到重组酿酒酵母菌株C、D、E、F、G、H、K和L，对应于各自启动自编号；

香叶醇生产菌株：

在重组酿酒酵母菌株A基础上整合基因片段1和基因片段2，得到香叶醇生产菌株A；

在重组酿酒酵母菌株C、D、E、F、G、H、K和L基础上整合基因片段1和基因片段2，得到香叶醇生产菌株C、D、E、F、G、H、K和L；

青蒿二烯生产菌株：

在重组酿酒酵母菌株A基础上整合基因片段3和基因片段2，得到青蒿二烯生产菌株A；

在重组酿酒酵母菌株C、D、E、F、G、H、K和L基础上整合基因片段3和基因片段2，得到青蒿二烯生产菌株C、D、E、F、G、H、K和L；

香叶基香叶醇生产菌株：

在重组酿酒酵母菌株A基础上整合基因片段4，得到香叶基香叶醇生产菌株A；

在重组酿酒酵母菌株C、D、E、F、G、H、K和L基础上整合基因片段4，得到香叶基香叶醇生产菌株C、D、E、F、G、H、K和L；

酵母固醇生产菌株：

在重组酿酒酵母菌株A基础上整合基因片段2，得到酵母固醇生产菌株A；

在重组酿酒酵母菌株C、D、E、F、G、H、K和L基础上整合基因片段2，得到酵母固醇生产菌株C、D、E、F、G、H、K和L；

番茄红素生产菌株：

在重组酿酒酵母菌株A基础上整合基因片段5和6，得到番茄红素生产菌株A；

在重组酿酒酵母菌株C、D、E、F、G、H、K和L基础上整合基因片段5和6，得到番茄红素生产菌株C、D、E、F、G、H、K和L；

采用醋酸锂法将上述相应基因片段分别转化到各菌株，通过trp1或leu2上、下游同源序列与酵母基因组上trp1或leu2位点发生重组而整合到基因组上。转化后采用SD-TRP或SD-LEU固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，单缺色氨酸或亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名。

2、基因片段的构建

基因片段1、基因片段3、基因片段5参照专利CN105087406A实施例3的方法，采用对应的基因元件制备获得；

基因片段2、基因片段4、基因片段6参照专利CN105087406A实施例4的方法，采用对应的基因元件制备获得；

3、发酵方法

种子培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；

发酵培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/L D-半乳糖。

(注：对于香叶醇、青蒿二烯、香叶基香叶醇生产菌株，发酵培养基还要添加20％的正十二烷)

将上述菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2转接于新鲜的25mL种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养至对数生长中期，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.5分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养，监测发酵过程中的菌体密度(OD₆₀₀)及产量。

4、产量检测

香叶醇、青蒿二烯、香叶基香叶醇：发酵48小时后，发酵液12000g离心5min后取上层有机相，用正己烷稀释后进行GC-MS检测。

酵母固醇：发酵48小时后，取两等份的发酵液，4000g离心2min收集菌体，并水洗两次。将其中一份菌体置于80℃烘干至恒重，称重计算细胞干重；另一份菌体用以产物提取，具体方法为：用1mL 2N NaOH重悬细胞，置于沸水浴中煮沸10min，然后立即冰浴3min；将破碎的细胞12000rpm、4℃离心4min弃上清，加入300uL含1.5M NaOH的甲醇溶液，60℃皂化4h，加入300uL正己烷涡旋振荡10min，离心收集有机相；水相再加300uL正己烷涡旋继续振荡10min，最后离心收集有机相。将收集的有机相真空冷冻干燥后，加入100ul衍生化试剂MSTFA 30℃孵育2h，最后用正己烷稀释后进行GC-MS检测。

番茄红素：发酵48小时后，取两等份的发酵液，4000g离心2min收集菌体，并水洗两次。将其中一份菌体置于80℃烘干至恒重，称重计算细胞干重；另一份菌体用以产物提取，具体方法为：用3N HCl重悬细胞，置于沸水浴中煮沸2min，然后立即冰浴3min；将破碎的细胞12000rpm、4℃离心4min弃上清，水洗2次后加入丙酮，并涡旋5min；最后离心收集丙酮相，用2μm滤膜过滤后上紫外液相检测，番茄红素检测波长为471nm。

5、结果

结果见图8-图12，可以明显看出，原有菌株中含有ALD6全长启动子，即A启动子，其在香叶醇、青蒿二烯、香叶基香叶醇、酵母固醇、番茄红素各萜类物质产量中较低，而替换为本发明各启动子后，各萜类物质产量得到提高。

实施例3：摇瓶发酵试验(去除保守序列以及去除含有该保守序列的序列启动子之间的对比)

为了验证保守序列是主要影响因素，本发明提供如下几组区别仅在于是否有非保守序列的启动子，并按照实施例2中的方式构建重组菌株进行各萜类物质产量的对比，结果见表1。

第1组：启动子B和启动子C，区别在于启动子B比启动子C多出一段378-629bp的非保守序列；

第2组：启动子I和启动子I+926-940bp非保守序列；

第3组：启动子J和启动子J+1117-1183bp非保守序列；

表1

由表1可以看出，各组之间的产量差异并不明显，说明对保守序列进行处理能够实现萜类物质产量的提高，而非保守序列对此无显著影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大学

<120> 一种启动子以及重组酵母菌株

<130> MP1701567

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

accaagttcc cgctcgattt gattcatgaa gaaggacaaa agaactattt aatgttcatg 60

aagatgattg aggaagaaaa ggaaaaaatt agaatacagc aggagcaaat gggcgggcaa 120

acatttacgc tgaaagacta tgttgaaggt aacttgcctt cgccagaaga acaaatgaaa 180

atacaattgg agaagcagaa ggaggtagac gccttatttg aagaggaaaa gaaaaagaag 240

aagattgctg aatccaaata attttcatgt aaaccctctt ctcatgtatc tacgtatcta 300

tgtgtgtatg taaatgtacc tgtacactcc ccacaccctc attttgttac tgtcatgtga 360

ataaaactta tgtatattgc taacttacta ccactgcacc tcctaacatc accatactac 420

gtacaaacac gcctatttat tttttctatg ttaaatttta acgatgtaga cacacctaat 480

gatctgatgc gctttgcata tctcatattc cttcactagc ataaaaatcc aaaaaaaaag 540

aatatttagg ccgaatggaa ttattcgtaa cgtcatacga aaaaagtttc aattcgtaca 600

atgcctggca tgttcattcg aatataaggc cgccgccttc cagtcagggt agccaaaagt 660

ataatcccgg gtggaaacta aactaaaaac cgtactcaca actttccgcg gacgctaaca 720

gacaaataga cacactatca ggtcaggaac tgccgtcaca tacgacactg cccctcacgt 780

aagggcatga tagaattgga ttatgtaaaa ggtgaagata ccattgtaga agcaaccagc 840

acgtcgccgt ggctgatgag gtctcctctt gcccgggccg cagaaaagag gggcagtggc 900

ctgtttttcg acataaatga ggggcatggc cagcaccgag acgtcattgt tgcatatggc 960

gtatccaagc cgaaacggcg ctcgcctcat ccccacggga ataaggcagc cgacaaaaga 1020

aaaacgaccg aaaaggaacc agaaagaaaa aagagggtgg gcgcgccgcg gacgtgtaaa 1080

aagatatgca tccagcttct atatcgcttt aactttaccg ttttgggcat cgggaacgta 1140

tgtaacattg atctcctctt gggaacggtg agtgcaacga atgcgatata gcaccgacca 1200

tgtgggcaaa ttcgtaataa attcggggtg agggggattc aagacaagca accttgttag 1260

tcagctcaaa cagcgattta acggttgagt aacacatcaa aacaccgttc gaggtcaagc 1320

ctggcgtgtt taacaagttc ttgatatcat atataaatgt aataagaagt ttggtaatat 1380

tcaattcgaa gtgttcagtc ttttacttct cttgttttat agaagaaaaa acatcaagaa 1440

acatctttaa catacacaaa cacatactat cagaataca 1479

<210> 2

<211> 1146

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcttact ctgctatggc aactatgggt tataatggta tggctgcatc ttgtcatact 60

ttgcatccaa catcaccatt aaaaccattt catggtgcat ctacatcatt ggaagctttt 120

aatggtgaac atatgggttt gttgagaggt tactctaaga gaaagttgtc ttcatacaag 180

aacccagctt caagatcttc aaatgctact gttgcacaat tgttgaatcc accacaaaag 240

ggtaaaaagg cagttgaatt cgatttcaat aagtacatgg attctaaagc tatgacagtt 300

aatgaagcat tgaataaggc tattccatta agatatccac aaaagatata tgaatctatg 360

agatactcat tgttagctgg tggtaaaaga gttagaccag ttttgtgtat tgctgcatgt 420

gaattagttg gtggtactga agaattggct attccaacag cttgtgcaat cgaaatgatc 480

catactatgt ctttgatgca tgatgatttg ccatgtatcg ataacgatga tttgagaaga 540

ggtaaaccaa caaaccataa gatcttcggt gaagatactg ctgttacagc tggtaatgct 600

ttgcattcat acgcattcga acatatcgct gtttctactt caaaaacagt tggtgcagat 660

agaatcttga gaatggtttc tgaattaggt agagctactg gttcagaagg tgttatgggt 720

ggtcaaatgg ttgatattgc atctgaaggt gacccatcaa tcgatttgca aactttggaa 780

tggatccata tccataagac agctatgttg ttggaatgtt ctgttgtttg tggtgcaatt 840

attggtggtg cttcagaaat cgttatcgaa agagcaagaa gatacgctag atgtgttggt 900

ttgttgttcc aagttgttga tgatatctta gatgttacta agtcttcaga tgaattgggt 960

aaaacagctg gtaaagattt gatctctgat aaggctacat acccaaagtt gatgggttta 1020

gaaaaggcaa aggaattttc tgatgaattg ttgaacagag ctaagggtga attgtcatgt 1080

tttgatccag ttaaagctgc accattgtta ggtttggcag attacgttgc ttttagacaa 1140

aattaa 1146

<210> 3

<211> 1641

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtctttga ctgaagaaaa gccaatcaga ccaatcgcta acttcccacc atctatctgg 60

ggtgaccaat tcttgatcta cgaaaagcaa gttgaacaag gtgttgaaca aatcgttaac 120

gacttgaaga aggaagttag acaattgttg aaggaagctt tggacatccc aatgaagcac 180

gctaacttgt tgaagttgat cgacgaaatc caaagattgg gtatcccata ccacttcgaa 240

agagaaatcg accacgcttt gcaatgtatc tacgaaactt acggtgacaa ctggaacggt 300

gacagatctt ctttgtggtt cagattgatg agaaagcaag gttactacgt tacttgtgac 360

gttttcaaca actacaagga caagaacggt gctttcaagc aatctttggc taacgacgtt 420

gaaggtttgt tggaattgta cgaagctact tctatgagag ttccaggtga aatcatcttg 480

gaagacgctt tgggtttcac tagatctaga ttgtctatca tgactaagga cgctttctct 540

actaacccag ctttgttcac tgaaatccaa agagctttga agcaaccatt gtggaagaga 600

ttgccaagaa tcgaagctgc tcaatacatc ccattctacc aacaacaaga ctctcacaac 660

aagactttgt tgaagttggc taagttggaa ttcaacttgt tgcaatcttt gcacaaggaa 720

gaattgtctc acgtttgtaa gtggtggaag gctttcgaca tcaagaagaa cgctccatgt 780

ttgagagaca gaatcgttga atgttacttc tggggtttgg gttctggtta cgaaccacaa 840

tactctagag ctagagtttt cttcactaag gctgttgctg ttatcacttt gatcgacgac 900

acttacgacg cttacggtac ttacgaagaa ttgaagatct tcactgaagc tgttgaaaga 960

tggtctatca cttgtttgga cactttgcca gaatacatga agccaatcta caagttgttc 1020

atggacactt acactgaaat ggaagaattc ttggctaagg aaggtagaac tgacttgttc 1080

aactgtggta aggaattcgt taaggaattc gttagaaact tgatggttga agctaagtgg 1140

gctaacgaag gtcacatccc aactactgaa gaacacgacc cagttgttat catcactggt 1200

ggtgctaact tgttgactac tacttgttac ttgggtatgt ctgacatctt cactaaggaa 1260

tctgttgaat gggctgtttc tgctccacca ttgttcagat actctggtat cttgggtaga 1320

agattgaacg acttgatgac tcacaaggct gaacaagaaa gaaagcactc ttcttcttct 1380

ttggaatctt acatgaagga atacaacgtt aacgaagaat acgctcaaac tttgatctac 1440

aaggaagttg aagacgtttg gaaggacatc aacagagaat acttgactac taagaacatc 1500

ccaagaccat tgttgatggc tgttatctac ttgtgtcaat tcttggaagt tcaatacgct 1560

ggtaaggaca acttcactag aatgggtgac gaatacaagc acttgatcaa gtctttgttg 1620

gtttacccaa tgtctatcta a 1641

<210> 4

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggcttata ccgcaatggc agcaggaact cagtcattgc agttgaggac agtcgcctct 60

taccaggagt gcaactcaat gaggtcttgc ttcaagttga ccccattcaa gtcattccac 120

ggtgtcaact tcaacgttcc ttctttaggt gccgccaact gcgaaatcat gggtcacttg 180

aaattgggtt ctttgccata caaacagtgt tcagtatcat ctaagtcaac taagactatg 240

gcccagttgg tagatttggc agagaccgag aaagccgagg gaaaggatat cgagttcgat 300

tttaacgagt atatgaagtc taaggctgtc gctgttgatg cagccttgga taaggccatc 360

cctttggagt atccagagaa gatccatgag tctatgaggt actcattgtt ggccggagga 420

aaaagggtca gacctgcatt atgcatcgct gcttgcgagt tagtaggtgg ttctcaggac 480

ttggccatgc caaccgcatg tgccatggaa atgattcata ccatgtcatt gattcacgat 540

gatttgcctt gcatggacaa cgacgacttc agaaggggaa agcctaccaa tcacaaggtt 600

ttcggagagg acactgctgt tttagccggt gacgcattgt tatctttcgc ttttgaacac 660

atcgccgttg ccacatcaaa aactgtccca tctgacagga ccttgagagt catttctgag 720

ttgggtaaaa ccatcggttc acagggattg gtcggaggtc aggtagtcga catcacttct 780

gagggagacg ccaacgtcga cttaaagaca ttggagtgga ttcacattca caagactgcc 840

gtcttgttgg aatgctctgt tgtttctgga ggaatcttgg gtggagctac cgaggatgag 900

attgctagaa taagaagata cgccaggtgc gtcggtttgt tgttccaggt tgtcgacgac 960

attttggatg tcaccaagtc ttcagaggaa ttgggaaaga ccgccggtaa agacttattg 1020

accgacaagg ctacctaccc taagttgatg ggtttggaga aggccaaaga gtttgcagca 1080

gaattagcta ccagggcaaa ggaagagttg tcatcattcg accagatcaa ggcagcccct 1140

ttgttaggat tggccgatta catcgctttc aggcaaaact aa 1182

<210> 5

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggtttctg gttctaaggc tggtgtctca ccacacaggg agattgaggt catgaggcag 60

tctattgacg atcacttggc tggtttgttg cctgagactg actctcagga cattgtctca 120

ttggcaatga gggagggtgt catggctcca ggtaagagga taaggccttt gttgatgttg 180

ttggcagcta gggacttgag gtaccagggt tctatgccta ctttgttgga cttggcttgc 240

gctgtcgaat tgactcacac tgcatcattg atgttggacg acatgccttg catggacaac 300

gcagaattaa ggaggggtca gccaacaaca cacaagaagt tcggtgagtc agtcgcaatt 360

ttggcatcag ttggtttgtt atcaaaggct ttcggattga ttgctgcaac tggtgactta 420

ccaggtgaga ggagggcaca ggctgtcaac gagttgtcta ctgctgtcgg agtccaggga 480

ttggtcttgg gtcagttcag ggacttgaac gacgcagctt tggacaggac tccagacgct 540

atattgtcta caaaccactt aaagacagga attttgttct ctgctatgtt gcagatagtc 600

gctattgcat ctgcttcttc tccatctaca agggagactt tgcacgcttt cgcattggac 660

ttcggtcagg ctttccagtt gttggacgac ttgagggacg atcacccaga gacaggaaag 720

gacaggaaca aggatgcagg taaatcaact ttggtcaaca ggttaggtgc agacgctgct 780

aggcagaagt taagggagca cattgactct gctgacaagc acttgacttt cgcttgccca 840

cagggaggtg ctattaggca gttcatgcac ttgtggttcg gtcaccactt agctgactgg 900

tcacctgtca tgaagatagc ttaa 924

Claims (7)

1.一种启动子，其特征在于，在酵母菌株ALD6启动子全长序列基础上，序列如SEQ IDNO:1所示，进行如下一项或多项的处理：

（1）敲除一段或多段ALD6启动子上的保守序列；

（2）敲除一段或多段ALD6启动子上的包含保守序列的序列；

（3）对ALD6启动子上的846-900bp保守序列进行碱基转换突变；

（4）敲除一段或多段ALD6启动子上的包含保守序列的序列，对ALD6启动子上的846-900bp保守序列进行碱基置换突变；

（5）置换一段或多段ALD6启动子上的保守序列；

（6）置换一段或多段ALD6启动子上的包含保守序列的序列；

所述保守序列选自ALD6启动子全长序列中1-377bp、630-654bp、701-787bp、846-900bp、916-925bp、941-1116bp、1184-1205bp、1227-1313bp、1430-1469bp九段保守序列；

所述包含保守序列的序列是在保守序列上游、下游或上下游位置连接相邻的序列，选自1-629bp序列、630-700bp序列、701-845bp序列、846-915bp序列、916-940bp序列、941-1183bp序列、1184-1226bp序列、1227-1429bp序列、1430-1479bp序列、378-654bp序列、655-787bp序列、787-900bp序列、788-900bp序列、901-925bp序列、926-1116bp序列、1117-1205bp序列、1117-1191bp序列、1206-1313bp序列、1314-1469bp序列；

在对相关序列的置换处理中，可选择不影响酵母菌株萜类化合物生产功能的序列进行置换。

2.根据权利要求1所述启动子，其特征在于，在酵母菌株ALD6启动子全长序列基础上，为进行如下之一项处理后的启动子：

（1）敲除一段或多段ALD6启动子上的包含保守序列的序列；

（2）敲除一段ALD6启动子上的保守序列；

（3）采用抗性标签置换一段或多段ALD6启动子上的包含保守序列的序列。

3.根据权利要求2所述启动子，其特征在于，所述抗性标签为KanMX抗性标签。

4.权利要求1-3任意一项所述启动子在构建萜类化合物生产用酵母菌株以及在生产萜类化合物中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述萜类化合物为香叶醇、青蒿二烯、香叶基香叶醇、酵母固醇、番茄红素中的一种或多种。

6.一种重组的生产萜类化合物酵母菌株，其特征在于，采用权利要求1-3任意一项所述启动子替换原有ALD6启动子。

7.根据权利要求6所述酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株为酿酒酵母菌株。

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