CN102448489A - 多肽和含有革兰氏阳性多肽的免疫组合物及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供可自葡萄球菌属分离的分离多肽。本发明亦提供包含一种或多种所述多肽的组合物、用于制备所述多肽的方法及用于使用所述多肽的方法。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求于2009年3月23日提交的美国专利临时申请序列号61/210,772的优先权。
背景
革兰氏阳性菌是引起多种人和动物疾病的种类繁多的生物群。公认在人和/或动物健康中重要的一些病原体包括属于以下科的细菌:棒杆菌科(Corynebacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcacae)、微球菌科(Micrococcaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)和消化球菌科(Peptococcaceae),它们包括诸如以下属等的细菌种类:放线菌属(Actinomyces spp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、棒杆菌属(Corynebacterium spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix spp.)、真杆菌属(Eubacterium spp.)、盖球菌属(Kytococcus spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、微球菌属(Micrococcus spp.)、动弯杆菌(Mobiluncus spp.)、分枝杆菌属(Mycobacteria spp.)、消化链球菌属(Peptostreptococcus spp.)、丙酸杆菌属(Propionibacterium spp.)和葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)。这些病原体在很多不同动物物种中引起多种临床表现。历史上对所述感染的治疗一直是攻击革兰氏阳性生物体的共有结构和功能的抗生素。然而,很多更普遍存在的革兰氏阳性生物体发展了对若干种类抗生素的抗性,使得感染的治疗变得困难。在人和产生食品的动物两者中广泛使用抗生素治疗细菌疾病,很可能是造成革兰氏阳性生物体很多种类耐受抗生素菌株的增殖的主要因素。因此,很有必要发现预防或消除革兰氏阳性生物体在动物以及人中的感染的不同治疗。
在农业动物中的葡萄球菌感染
在农业生产中,革兰氏阳性生物体引起多种重要疾病。由革兰氏阳性菌感染引起的临床病况实例包括:乳腺炎、败血症、肺炎、骨髓炎、脑膜脑炎、***炎、皮炎、生殖道感染、子宫炎、围生期疾病、垂体脓肿、关节炎、滑囊炎、***、膀胱炎和肾盂肾炎、干酪性***炎、结核病、溃疡性***炎、丹毒、蹄叶炎、tyzzer氏病、破伤风、肉毒中毒、肠炎、恶性水肿、羊炭疽、细菌性血红蛋白尿、肠原性毒血症。葡萄球菌属细菌尤其能感染很多农业动物的不同物种,并可引起巨大的经济损失。例如,估计因为常常由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的疾病乳腺炎,美国乳品业每头牛每年损失大约$185。因为美国有9.5百万头母牛,乳腺炎的年花费大约$18亿。这大约是农场牛奶销售总值的10%,该损失的约三分之二是由于亚临床感染的母牛降低产奶。其它损失是由于弃掉异常奶和因用抗生素治疗母牛而扣留的奶、早期更换受影响的母牛的花费、淘汰母牛的降低的销售值、药物花费和兽医服务及增加的人工成本。由革兰氏阳性球菌引起的乳腺炎除了在牛乳品业内流行外,亦在山羊和绵羊中常见。由金黄色葡萄球菌引起的另外的动物疾病包括:马的葡萄状菌病、家禽的脓性滑膜炎和骨髓炎、兔的鼻塞症、猪流产和羔羊的蜱脓毒症。葡萄球菌的其它种类是犬(中间葡萄球菌(S.intermedius))和猪(猪葡萄球菌(S.hycius))的主要皮肤病原体。在家禽类中,葡萄球菌病原体引起心内膜炎和败血症。
人中的葡萄球菌感染
葡萄球菌属亦为引起多种感染的人病原体。金黄色葡萄球菌这种常见的人粘膜和皮肤定植者(colonizer)种类,是可引起多种人感染的机会病原体。例如,金黄色葡萄球菌是几种皮肤感染的致病因子,所述皮肤感染包括脓疱病、疖病、蜂窝织炎和皮肤烫伤综合征以及潜在致命性的手术后伤口感染。另外,无免疫应答的个体在医院环境中暴露于金黄色葡萄球菌,导致器官感染,例如肺炎、***、骨髓炎、关节炎、菌血症和心内膜炎。金黄色葡萄球菌亦为中毒症(最著名的中毒性休克综合征和食物中毒)的致病因子。由葡萄球菌肠毒素B引起的食物中毒是食物传染疾病的最常见原因,甚至超过沙门氏菌病、弯曲菌病和利斯特菌病。葡萄球菌的其它种类亦引起人疾病;表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)和人葡萄球菌(S.hominis)通常感染植入的医疗设备,而腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)与妇女的***有关。
葡萄球菌的毒力机理
葡萄球菌感染多种宿主组织,并通过以下几方面来避开免疫***:产生数种类型的分泌性蛋白、表面表达的毒力因子及针对在有限资源中存活而设计的代谢***和与宿主环境有关的主动防卫。定植是建立感染的必不可少的第一步;包括荚膜、脂磷壁酸和磷壁酸在内的多种因子是造成定植的常见结构组分。另外,表面蛋白例如葡萄球菌纤连蛋白-结合蛋白和骨唾液蛋白结合蛋白特异性结合宿主组织组分。毒素常常常在葡萄球菌病原体中产生并且高度有害;包括食物中毒、中毒性休克综合征和剥脱性皮肤病况在内的几种人疾病,是细胞外分泌的毒素蛋白的直接结果。单个分离株可编码20-30种不同分泌性毒素的基因。某些分泌性蛋白产物是超抗原,其可与抗原呈递细胞的MHC II类分子非特异性结合,并同时与T细胞的T细胞受体结合。该结合诱导T细胞信号转导,导致释放高水平的促炎因子,最终由于压倒性免疫应答诱导宿主损伤。在表面表达的另一类毒力因子伪装细菌使其逃过宿主免疫***。例如,金黄色葡萄球菌表面表达的A蛋白通过结合宿主抗体的Fc组分抑制调理作用和吞噬作用。多种蛋白酶、溶血素(α、β、γ和δ)、核酸酶、脂肪酶、透明质酸酶和胶原酶亦有助于细菌从周围细胞提取营养,并保卫细菌抵抗宿主防御。葡萄球菌中的抗生素耐受性
CDC估计美国每年将近2百万人获得医院内感染,导致每年90,000起死亡。在这些致命感染中,70%是由抗生素耐受细菌引起的。微生物物种中抗生素耐受增加在皮肤及粘膜定植者例如金黄色葡萄球菌中尤其显著。例如,分离自医院环境中的绝大多数金黄色葡萄球菌耐受青霉素,50%亦耐受半合成青霉素,例如甲氧西林、萘夫西林和苯唑西林。这些被称为MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)的分离群首先在19世纪70年代出现,现在坚固地存在于医院环境中。最近有社区MRSA感染的数个病例,其中感染的个体先前未与医院或卫生保健人员接触。通过分离对用于治疗MRSA的糖肽万古霉素较不敏感的MRSA分离群,加剧了这种令人担忧的趋势。按照CDC对万古霉素耐受性的定义,极少菌株显示真正耐受万古霉素,但业已表征了几种MRSA菌株为由对万古霉素的易感性降低的亚群或VISA(万古霉素中度耐药性金黄色葡萄球菌)构成。因为分离万古霉素耐药性和万古霉素中度耐药性菌株是相对新发展,关于其在医院和/或社区流行的资料很少。偶尔地,亦从人中找到完全耐受万古霉素并携带很可能从肠球菌属获得的抗性质粒的VRSA(耐万古霉素的金黄色葡萄球菌)。
用于预防和治疗葡萄球菌感染的策略
耐受多种抗生素的众多革兰氏阳性病原体的出现,推动了旨在开发预防性疫苗以抵抗疾病的研究努力。将疫苗设计成给予患者以从免疫***引发长期记忆应答,使得若在将来遇到病原体,免疫***可更加快速有效地清除病原体。迄今为止,尚未获得抵抗与多种严重人疾病(尤其是与葡萄球菌感染有关的疾病)有关的革兰氏阳性病原体的广谱保护性疫苗。用于预防葡萄球菌感染的疫苗的开发方法包括以下方法:报道利用以下物质作为亚单位疫苗组合物的抗原的方法:识别粘附基质分子的微生物表面组分[MSCRAMMS(Nilsson等1998.JClin Invest 101:2640-9;Menzies等2002.J Infect Dis 185:937-43;Fattom等2004.Vaccine 22:880-7]、表面多糖(McKenney等2000;McKenney等1999.Science 284:1523-7;Maira-Litran等2002.InfectImmun 70:4433-40;Maira-Litran等2004.Vaccine 22:872-9;Maira-Litran等2005.Infect Immun 73:6752-62)和突变的胞外蛋白(exoprotein)(Lowell等1996.Infect Immun 64:4686-93;Stiles等2001.Infect Immun 69:2031-6;Gampfer等2002.Vaccine 20:3675-84);以及报道利用一种无毒活菌株的方法(Reinoso等2002.Can J Vet Res66:285-8);和几种DNA疫苗方法(Ohwada等1999.J AntimicrobChemother 44:767-74);Brouillette等2002.Vaccine 20:2348-57;Senna等2003.Vaccine 21:2661-6)。尽管这些组合物中很多显示某种程度的保护,但它们对多样化的葡萄球菌菌株几乎没有实现交叉保护,另外它们在无免疫应答的患者(医院内感染的重要风险群体)中也不能引发实质性免疫应答。
最严重的葡萄球菌疾病为由前述不依赖抗原呈递而非特异性刺激T细胞的超抗原性致热外毒素(supernantigenic pyrogenic exotoxin,SPE)介导的疾病。所述疾病包括中毒性休克综合征、剥脱性皮肤病和可能的川畸综合征。对于这些SPE介导的疾病,在活动性感染期间加强免疫***的免疫治疗剂通常比通常在感染之前给予的疫苗更有效。对SPE的免疫应答的压倒性性质需要将快速降低毒素活性作为治疗的第一目标。迄今为止,通过静脉内给予人免疫球蛋白(IVIG),已最有效地实现金黄色葡萄球菌介导的疾病中的毒素中和,所述人免疫球蛋白是从数千人供者中纯化浓缩的人抗体制品(Takei等1993.JClin Invest 91:602-7;Stohl和Elliot.1996.Clin Immunol Immunopathol79:122-33)。在大约30%的健康成人中定植的金黄色葡萄球菌的广泛分布,与大部分人群的高接触率一致,因此IVIG中的抗葡萄球菌抗毒素抗体的水平,通常足以中和毒素足够长时间,以使免疫应答稳定直到用抗生物降低细菌载量(Schlievert,2001.J Allergy Clin Immunol108(4 Suppl):S107-110)。来自多个厂商的IVIG制品显示:在人外周血单核细胞的增殖测定中中和毒素、体外抑制毒素诱导的人T细胞驱动的B细胞分化(Stohl和Elliot.1996.Clin Immunol Immunopathol79:122-33;Stohl和Elliott.1995.J Immunol 155:1838-50;Stohl等1994.J Immunol 153:117-27)和在用葡萄球菌肠毒素B刺激的PBMC中降低IL-4和IL-2分泌(Takei等1993.J Clin Invest 91:602-7;Darenberg等2004.Clin Infect Dis 38:836-42)。IVIG疗法因其经证明的中和SPE的能力,现为川畸综合征的推荐疗法,并作为用于葡萄球菌中毒性休克综合征的治疗方法获得偏爱(Schlievert 2001.J Allergy Clin Immunol108(4 Suppl):S107-110)。在小鼠中亦研究了用IVIG作为手术期间的免疫保护性伤口灌洗液(Poelstra等2000.Tissue Eng 6(4):401-411)。尽管标准IVIG在限制某些葡萄球菌SPE介导的疾病进展方面有效用,但从成千上万未经选择的人供者中产生的人IVIG制品的安全性、功效及一致性仍存在争议(Baker等1992.N Engl J Med 327:213-9;Miller等2001.J Allergy Clin Immunol 108:S91-4;Sacher,2001.JAllergy Clin Immunol 108:S139-46;Darenberg等2004.Clin Infect Dis38:836-42)。此外,IVIG在预防某些葡萄球菌感染中的益处未必真实(Baker等1992.N Engl J Med 327:213-9;Hill,H.R.2000.J Pediatr137:595-7;Darenberg等2004.Clin Infect Dis 38:836-42)。为了提高IVIG在治疗某些风险群体的葡萄球菌感染中的有效性,制备了经选择供者的血浆来源的多克隆抗葡萄球菌人IgG,其具有针对葡萄球菌MSCRAMMS聚集因子A(ClfA)和结合纤维蛋白原的G蛋白(SdrG)的高滴度抗体,并在极低出生体重婴儿中成功试验预防葡萄球菌脓毒症(Vernachio等2003.Antimicrob Agents Chemother 47:3400-6;Bloom等2005.Pediatr Infect Dis J 24:858-866;Capparelli等2005.AntimicrobAgents Chemother 49:4121-7)。亦正在开发针对金黄色葡萄球菌MSCRAMM聚集因子A的特异性人源化单克隆抗体。根据其以取消金黄色葡萄球菌结合人纤连蛋白的方式结合ClfA的能力,从成千上万的鼠抗ClfA抗体库中选择该抗体,随后通过使特定靶向残基突变来使其人源化,以模拟同源人种系亚群抗体(Hall等2003.InfectImmun 71:6864-70;Domanski等2005.Infect Immun 73:5229-32)。设计特异性抗体用于与抗生素联合用于治疗严重危及生命的金黄色葡萄球菌感染,但动物研究还显示预防性保护作用。
简述
在一方面,本发明提供包含两种或更多种分离的多肽的组合物。所述组合物中的分离多肽具有通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳测定的以下分子量:88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa。例如,组合物可包含88kDa和55kDa的分离的蛋白质。在一些方面,组合物可包含具有88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa和33kDa分子量的分离的多肽。可自当在包括铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌中分离所述多肽,并且当在不含铁螯合剂的培养基中生长时,不可分离所述多肽。组合物保护动物例如小鼠或母牛或人抵抗金黄色葡萄球菌菌株例如ATCC菌株19636的攻击。组合物可进一步包含药学上可接受的载体,并可进一步包含具有以下分子量并且可自当在不含铁螯合剂的培养基中生长时的金黄色葡萄球菌中分离的一种或多种分离的多肽:150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa或40kDa。在一些方面,组合物的多肽可自金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636分离。
在一些实施方案中,组合物中的每种多肽具有与由金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636表达的相同分子量多肽的多肽质量指纹有至少80%相似性的质量指纹,其中所述多肽可自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌中分离,并且当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离。例如,具有88kDa分子量的分离的多肽具有与由金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636表达的88kD多肽的质量指纹有至少80%相似性的质量指纹,具有55kDa分子量的分离的多肽具有与由金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636表达的55kD多肽的质量指纹有至少80%相似性的质量指纹。
在另一方面,本发明提供包含分离的多肽的组合物,所述分离的多肽具有与选自SEQ ID NO:408和SEQ ID NO:397的氨基酸序列至少80%的序列相似性。组合物可另外包含至少一种第二多肽,其中所述第二多肽可自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌中分离,并且当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离。在某些情况下,第二多肽可包括具有与选自SEQ ID NO:353、SEQID NO:364、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:386和SEQ ID NO:419的氨基酸序列有至少80%相似性的氨基酸序列。在其它情况下,所述第二多肽可具有通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳测定的以下分子量:88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa。组合物可进一步包含可自当在没有铁螯合剂的培养基中生长时的金黄色葡萄球菌中分离的一种或多种分离的多肽,且所述分离的多肽具有以下分子量:150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa,41kDa、40kDa。
本发明亦提供使用所述组合物的方法。在一个方面,所述方法用于治疗受试者的感染,并包括将有效量的本发明组合物给予具有由葡萄球菌属引起的感染或处于具有所述感染风险的受试者。在另一方面,所述方法用于治疗受试者的症状,并包括将有效量的本发明组合物给予具有由葡萄球菌属引起的感染的受试者。受试者可为哺乳动物,例如人、马或母牛。葡萄球菌属可为金黄色葡萄球菌。
本发明进一步提供使用诸如多克隆抗体等抗体的方法,所述抗体特异性结合本发明多肽。在一方面,所述方法用于治疗受试者的感染,并包括将有效量的组合物给予具有由葡萄球菌属引起的感染或处于具有所述感染风险的受试者,其中所述组合物包含抗体,所述抗体特异性结合至少一种本发明的分离多肽,并且在一些情况下特异性结合不止一种本发明的分离多肽。在另一方面,所述方法用于治疗受试者的症状,并包括将有效量的组合物给予具有由葡萄球菌属引起的感染的受试者,其中所述组合物包含抗体,所述抗体特异性结合至少一种本发明的分离多肽,并且在一些情况下特异性结合不止一种本发明的分离多肽。受试者可为哺乳动物,例如人、马或母牛。葡萄球菌属可为金黄色葡萄球菌。
本发明亦提供用于降低受试者中的定植的方法。在一方面,所述方法包括将有效量的本发明组合物给予葡萄球菌属定植的受试者。在另一方面,所述方法包括将有效量的组合物给予葡萄球菌属定植的受试者,其中所述组合物包含抗体,所述抗体特异性结合至少一种本发明的分离多肽,并在一些情况下特异性结合不止一种本发明的分离多肽。
本发明提供用于检测特异性结合多肽的抗体的试剂盒。所述试剂盒在分开的容器中包括本发明的分离多肽和检测特异性结合所述多肽的试剂。
附图简述
图1.源自在含和不含铁(分别标记Fe++和DP的泳道)情况下生长的不同物种的不同菌株金黄色葡萄球菌的蛋白质的电泳概况。
图2.在用金黄色葡萄球菌进行同源和异源攻击后经疫苗接种和未经疫苗接种小鼠之间的死亡率差异。
图3.显示在用金黄色葡萄球菌ATCC 19636疫苗接种和同源攻击后的存活百分比的Kaplan-Meier存活曲线。
图4.显示在用金黄色葡萄球菌ATCC 19636疫苗接种和异源攻击后的存活百分比的Kaplan-Meier存活曲线。
图5.显示在用金黄色葡萄球菌ATCC 19636被动免疫和同源攻击后的存活百分比的Kaplan-Meier存活曲线。
图6.显示在用金黄色葡萄球菌菌株1477被动免疫和异源攻击后的存活百分比的Kaplan-Meier存活曲线。
图7.自金黄色葡萄球菌ATCC 19636获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:353)。
图8.自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:354)。
图9.自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:355)。
图10.自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:356)。
图11.自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:357)。
图12.自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:358)。
图13.自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:359)。
图14.自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:360)。
图15.自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:361)。
图16.自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:362)。
图17.自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:363)。
图18.自金黄色葡萄球菌ATCC19636获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:364)。
图19.自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:365)。
图20.自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:366)。
图21.自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:367)。
图22.自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:368)。
图23.自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:369)。
图24.自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:370)。
图25.自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:371)。
图26.自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:372)。
图27.自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:373)。
图28.自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:374)。
图29.自金黄色葡萄球菌ATCC19636获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:375)。
图30.自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:376)。
图31.自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:377)。
图32.自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:378)。
图33.自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:379)。
图34.自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:380)。
图35.自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:381)。
图36.自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:382)。
图37.自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:383)。
图38.自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:384)。
图39.自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:385)。
图40.自金黄色葡萄球菌ATCC19636获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:386)。
图41.自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:387)。
图42.自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:388)。
图43.自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:389)。
图44.自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:390)。
图45.自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:391)。
图46.自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:392)。
图47.自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:393)。
图48.自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:394)。
图49.自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:395)。
图50.自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:396)。
图51.自金黄色葡萄球菌ATCC19636获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:397)。
图52.自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:398)。
图53.自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:399)。
图54.自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:400)。
图55.自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:401)。
图56.自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:402)。
图57.自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:403)。
图58.自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:404)。
图59.自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:405)。
图60.自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:406)。
图61.自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:407)。
图62.自金黄色葡萄球菌ATCC19636获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:408)。
图63.自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:409)。
图64.自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:410)。
图65.自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:411)。
图66.自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:412)。
图67.自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:413)。
图68.自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:414)。
图69.自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:415)。
图70.自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:416)。
图71.自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:417)。
图72.自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:418)。
图73.自金黄色葡萄球菌ATCC19636获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:419)。
图74.自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:420)。
图75.自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:421)。
图76.自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:422)。
图77.自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:423)。
图78.自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:424)。
图79.自获金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:425)。
图80.自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:426)。
图81.自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:427)。
图82.自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:428)。
图83.自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:429)。
图84.编码自金黄色葡萄球菌ATCC 19636获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:430)。
图85.编码自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:431)。
图86.编码自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:432)。
图87.编码自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:433)。
图88.编码自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:434)。
图89.编码自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:435)。
图90.编码自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:436)。
图91.编码自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:437)。
图92.编码自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:438)。
图93.编码自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:439)。
图94.编码自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:440)。
图95.编码自金黄色葡萄球菌ATCC19636获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:441)。
图96.编码自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:442)。
图97.编码自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:443)。
图98.编码自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:444)。
图99.编码自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:445)。
图100.编码自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:446)。
图101.编码自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:447)。
图102.编码自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:448)。
图103.编码自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:449)。
图104.编码自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:450)。
图105.编码自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:451)。
图106.编码自金黄色葡萄球菌ATCC19636获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:452)。
图107.编码自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:453)。
图108.编码自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:454)。
图109.编码自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:455)。
图110.编码自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:456)。
图111.编码自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:457)。
图112.编码自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:458)。
图113.编码自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:459)。
图114.编码自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:460)。
图115.编码自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:461)。
图116.编码自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:462)。
图117.编码自金黄色葡萄球菌ATCC19636获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:463)。
图118.编码自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:464)。
图119.编码自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:465)。
图120.编码自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:466)。
图121.编码自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:467)。
图122.编码自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:468)。
图123.编码自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:469)。
图124.编码自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:470)。
图125.编码自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:471)。
图126.编码自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:472)。
图127.编码自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:473)。
图128.编码自金黄色葡萄球菌ATCC19636获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:474)。
图129.编码自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:475)。
图130.编码自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:476)。
图131.编码自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:477)。
图132.编码自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:478)。
图133.编码自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:479)。
图134.编码自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:480)。
图135.编码自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:481)。
图136.编码自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:482)。
图137.编码自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:483)。
图138.编码自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:484)。
图139.编码自金黄色葡萄球菌ATCC19636获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:485)。
图140.编码自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:486)。
图141.编码自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:487)。
图142.编码自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:488)。
图143.编码自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:489)。
图144.编码自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:490)。
图145.编码自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:491)。
图146.编码自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:492)。
图147.编码自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:493)。
图148.编码自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:494)。
图149.编码自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:495)。
图150.编码自金黄色葡萄球菌ATCC19636获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:496)。
图151.编码自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:497)。
图152.编码自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:498)。
图153.编码自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:499)。
图154.编码自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:500)。
图155.编码自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:501)。
图156.编码自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:502)。
图157.编码自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:503)。
图158.编码自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:504)。
图159.编码自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:505)。
图160.编码自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:506)。
图161.显示在用金黄色葡萄球菌ATCC 25904被动免疫和同源攻击后的存活百分比的Kaplan-Meier存活曲线。A,用rMntC疫苗接种后的静脉内攻击;B,进行以下疫苗接种后的腹膜内攻击:用SIRP提取物2x疫苗接种、用rSIRP7 2x疫苗接种或用rSIRP7 3x疫苗接种;C,用rSIRP7疫苗接种后的静脉内攻击。
图162.自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:543)。
图163.自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:544)。
图164.自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:545)。
图165.自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:546)。
图166.自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:547)。
图167.自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:548)。
图168.自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:549)。
图169.自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:550)。
图170.自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:551)。
图171.自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:552)。
图172.自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:553)。
图173.自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:554)。
图174.自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:555)。
图175.自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:556)。
图176.自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:557)。
图177.自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:558)。
图178.自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:559)。
图179.自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:560)。
图180.自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:561)。
图181.自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的氨基酸序列。(SEQ ID NO:562)。
图182.编码自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:563)。
图183.编码金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:564)。
图184.编码自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:565)。
图185.编码自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:566)。
图186.编码自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:567)。
图187.编码自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:568)。
图188.编码自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:569)。
图189.编码自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:570)。
图190.编码自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:571)。
图191.编码自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:572)。
图192.编码自金黄色葡萄球菌RF122获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:573)。
图193.编码自金黄色葡萄球菌Mu50获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:574)。
图194.编码自金黄色葡萄球菌MRSA252获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:575)。
图195.编码自金黄色葡萄球菌MW2获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:576)。
图196.编码自金黄色葡萄球菌Newman获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:577)。
图197.编码自金黄色葡萄球菌JH9获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:578)。
图198.编码自金黄色葡萄球菌USA300获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:579)。
图199.编码自金黄色葡萄球菌COL获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:580)。
图200.编码自金黄色葡萄球菌NCTC8325获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:581)。
图201.编码自金黄色葡萄球菌MSSA476获得的金属调节的多肽的核酸序列。(SEQ ID NO:582)。
图202.显示小鼠康复期血清与重组产生的金属调节的多肽结合的蛋白质印迹。
图203.显示来自健康人的血清与重组产生的金属调节的多肽结合的蛋白质印迹。
图204.显示来自康复期人的血清与重组产生的金属调节的多肽结合的蛋白质印迹。
图205.显示金黄色葡萄球菌DU5875表面表达金属调节的多肽的流式细胞术数据。
图206.在用rSIRP7疫苗接种并用SIRP提取物或rSIRP7再刺激后的细胞因子诱导。
本发明优选实施方案的详述
本发明提供多肽和包含多肽的组合物。本文所用“多肽”是指由肽键连接的氨基酸的聚合物。因而,例如,术语肽、寡肽、蛋白质和酶都包括在多肽定义中。该术语亦包括多肽的表达后修饰,例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。术语多肽不隐含氨基酸聚合物的具体长度。可直接自天然来源分离多肽,或可借助重组、酶学或化学技术制备多肽。在天然存在的多肽的情况下,所述多肽通常为分离的。
“分离的”多肽是已经从其自然环境中移出的多肽。例如,分离的多肽为从细胞的细胞质或从细胞膜移出的多肽,并且不再存在其天然环境中的很多多肽、核酸和其它细胞物质。
表征为自特定来源“可分离的”多肽,为在合适条件下由确定来源产生的多肽,但该多肽可自备选来源用本领域技术人员熟知的例如重组、化学或酶学技术获得。因而,将多肽表征为自特定来源“可分离的”,并不暗示多肽必须自其获得的任何特定来源,或多肽必须在其下获得的任何特定条件或过程。
“纯化的”多肽为不含至少60%、优选至少75%和最优选至少90%与其天然缔合的其它组分的多肽。按照定义认为在其天然存在的生物体外产生的多肽,例如通过化学或重组的手段产生的多肽,为分离和纯化的多肽,因为它们从来没有存在于自然环境中。
本文所用的“多肽片段”是指因用蛋白酶消化多肽而产生的多肽的部分。
除非另外规定,否则“一个”、“一种”、“该”和“至少一个”可互换使用,意指一个或不止一个。术语“包含”及其变型在这些术语出现在说明书及权利要求中时不具有限制性的含义。
可通过分子量、质量指纹、氨基酸序列、编码多肽的核酸、免疫学活性或两种或更多种所述特征的任何组合来表征本发明多肽。可用常规方法来测定通常用千道尔顿(kDa)来表示的多肽的分子量,所述方法包括例如凝胶过滤、包括十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)在内的凝胶电泳、毛细管电泳、质谱法、液相色谱法(包括HPLC)和根据所观察到的或预测的氨基酸序列计算分子量。除非另外指出,否则分子量是指在还原和变性条件下通过用具有约4%浓缩胶和约10%分离胶的SDS聚丙烯酰胺凝胶分离多肽测定的分子量。
本文所用的“质量指纹”是指自用蛋白酶消化后的多肽获得的多肽片段群。通常用质谱法分析因消化产生的多肽片段。将每一个多肽片段表征为质量或质量(m)与电荷(z)比率,后者被称为“m/z比率”或“m/z值”。用于产生多肽的质量指纹的方法为常规方法。所述方法实例揭示于实施例13中。
本发明多肽可为金属调节的多肽。本文所用的“金属调节的多肽”,为与同样的微生物在高金属条件下的生长相比,当微生物在低金属条件下生长时该微生物以更高水平表达的多肽。低金属和高金属条件如本文所述。例如,由葡萄球菌属产生的金属调节的多肽的一个种类,在微生物在高金属条件下生长期间并不以可检测水平表达,但在低金属条件下生长期间以可检测水平表达。
可自在低铁条件下生长后的金黄色葡萄球菌分离的金属调节的多肽的实例,具有88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa和33kDa的分子量。可自在低锌或低铜条件下生长后的金黄色葡萄球菌分离的金属调节的多肽的实例,具有115kDa、88kDa、80kDa、71kDa、69kDa、35kDa、30kDa、29kDa和27kDa的分子量。
金属调节的多肽的另外实例包括本文所述多肽的重组产生形式。重组产生的多肽可包括可自mRNA转录物翻译的完整氨基酸序列。或者,重组产生的金属调节的多肽可包括完整的可翻译氨基酸序列的片段或部分。例如,重组产生的金属调节的多肽可缺乏在多肽任一末端的可裂解序列,例如在多肽的氨基末端的可裂解信号序列。
因而,金属调节的多肽可包括在以下序列中描述的氨基酸序列的多肽:例如SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:364、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:408和SEQ ID NO:419。
本发明亦包括非金属调节的多肽。所述多肽在金属离子存在下(例如在氯化铁存在下)表达,亦在低铁条件下生长时表达。可自金黄色葡萄球菌分离的这类多肽的实例具有以下分子量:150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa和40kDa。
可通过可用于比较多肽存在情况的方法来测定多肽是否为金属调节的多肽,所述方法包括例如:凝胶过滤、包括十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在内的凝胶电泳、毛细管电泳、质谱法和包括HPLC在内的液相色谱法。让微生物的单独培养物在高金属条件下和低金属条件下生长,如本文所述分离本发明多肽,分离并比较存在于每一培养物中的多肽。通常使用等量的来自各培养物的多肽。优选用具有约4%浓缩胶和约10%分离胶的SDS聚丙烯酰胺凝胶在还原和变性条件下分离多肽。例如,可使用来自各个培养物的30微克(μg)总多肽,将其上样到凝胶孔中。在泳动凝胶和用考马斯亮蓝给多肽染色后,可比较两个泳道。当测定多肽是否以可检测水平表达时,利用本领域已知的方法,在SDS-PAGE凝胶上分离来自培养物的30μg总多肽,并用考马斯亮蓝染色。认为可目测的多肽为以可检测水平表达的,而认为不能目测的多肽为不以可检测水平表达的。
或者,可用基于微阵列的基因表达分析来测定多肽是否为金属调节的多肽。让微生物的单独培养物在高金属条件下和低金属条件下生长,从各个培养物的细胞提取RNA,检测并比较在高金属条件下生长的细胞中的RNA表达和在低金属条件下生长的细胞中的RNA表达的差异。例如,可自8-10μg细菌RNA用已建立的方案制备标记的cDNA。可将标记的cDNA施用到金黄色葡萄球菌基因组的微阵列。所述微阵列可市购,并用所述阵列的基因表达为常规的。
本发明多肽可具有免疫学活性。“免疫学活性”是指多肽引发动物的免疫应答的能力。多肽的免疫应答是在动物中发展的对多肽的基于细胞和/或抗体的免疫应答。通常免疫应答包括但不限于以下作用的一种或多种:针对多肽的一个或多个表位产生抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞。“表位”是指特异性B细胞和/或T细胞对其响应使得产生抗体的抗原上的位点。免疫学活性可为保护性。“保护性免疫学活性”是指多肽在动物中引发预防或抑制葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌)感染的免疫应答的能力。可通过本领域已知的方法测定多肽是否具有保护性免疫学活性,所述方法为例如实施例5、9或12中所述的方法。例如,本发明多肽或本发明多肽的组合保护诸如小鼠等啮齿动物抵抗葡萄球菌属的攻击。本发明多肽可具有血清活性活性(seroactive activity)。“血清活性活性”是指候选多肽与来自用葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌)感染的动物的康复期血清中存在的抗体反应的能力。在一些方面,康复期血清可来自用ATCC分离株19636、菌株SAAV1、菌株2176或菌株1477感染的动物。本发明多肽可具有免疫调节活性。“免疫调节活性”是指多肽以非特异性方式作用来提高对特定抗原的免疫应答的能力。用于测定多肽是否具有免疫调节活性的方法为本领域已知。
本发明多肽可具有由参考微生物表达的多肽(即参考多肽)的特性。所述特性可包括例如分子量、质量指纹、氨基酸序列或其任意组合。参考微生物可为革兰氏阳性的,优选微球菌科成员,优选葡萄球菌属,更优选金黄色葡萄球菌。菌株的优选实例详述于表1中。
表1细菌菌株
细菌细胞 | 实验室名称 |
金黄色葡萄球菌 | ATCC分离株19636 |
金黄色葡萄球菌 | 菌株SAAV1 |
金黄色葡萄球菌 | 菌株1477 |
金黄色葡萄球菌 | 菌株2176 |
当参考微生物为金黄色葡萄球菌ATCC分离株19636时,若候选多肽具有88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa 35kDa或33kDa的分子量,并具有以下质量指纹,所述质量指纹与由参考微生物表达并分别具有88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa分子量的金属调节的多肽的质量指纹相似,那么可认为候选多肽为本发明多肽。优选所述多肽为金属调节的多肽。例如,若候选多肽具有88kDa分子量并具有与由参考菌株金黄色葡萄球菌ATCC分离株19636产生的88kDa金属调节的多肽的质量指纹相似的质量指纹,则其可为本发明多肽。
或者,当参考微生物为金黄色葡萄球菌ATCC分离株19636时,若如以下所详述的,候选多肽具有与以下氨基酸序列结构上相似的氨基酸序列:SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:364、SEQ ID NO:375、SEQID NO:386、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:408或SEQ ID NO:419,则可认为其为本发明多肽。
或者,当参考微生物为金黄色葡萄球菌RF122时,若如以下所详述的,候选多肽具有与以下氨基酸序列结构上相似的氨基酸序列:SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:365、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:409或SEQ ID NO:420,则可认为其为本发明多肽。
或者,当参考微生物为金黄色葡萄球菌Mu50时,若如以下所详述的,候选多肽具有与以下氨基酸序列结构上相似的氨基酸序列:SEQ ID NO:355、SEQ ID NO:366、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:410或SEQ ID NO:421,则可认为其为本发明多肽。
或者,当参考微生物为金黄色葡萄球菌MRSA252时,若如以下所详述的,候选多肽具有与以下氨基酸序列结构上相似的氨基酸序列:SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:367、SEQ ID NO:378、SEQ IDNO:389、SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:411或SEQ ID NO:422,则可认为其为本发明多肽。
或者,当参考微生物为金黄色葡萄球菌MW2时,若如以下所详述的,候选多肽具有与以下氨基酸序列结构上相似的氨基酸序列:SEQ ID NO:357、SEQ ID NO:368、SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:412或SEQ ID NO:423,则可认为其为本发明多肽。
或者,当参考微生物为金黄色葡萄球菌Newman时,若如以下所详述的,候选多肽具有与以下氨基酸序列结构上相似的氨基酸序列:SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:369、SEQ ID NO:380、SEQ IDNO:391、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:413或SEQ ID NO:424,则可认为其为本发明多肽。
或者,当参考微生物为金黄色葡萄球菌JH9时,若如以下所详述的,候选多肽具有与以下氨基酸序列结构上相似的氨基酸序列:SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:370、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:414或SEQ ID NO:425,则可认为其为本发明多肽。
或者,当参考微生物为金黄色葡萄球菌USA300时,若如以下所详述的,候选多肽具有与以下氨基酸序列结构上相似的氨基酸序列:SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:371、SEQ ID NO:382、SEQ IDNO:393、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:415或SEQ ID NO:426,则可认为其为本发明多肽。
或者,当参考微生物为金黄色葡萄球菌COL时,若如以下所详述的,候选多肽具有与以下氨基酸序列结构上相似的氨基酸序列:SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:372、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:416或SEQ ID NO:427,则可认为其为本发明多肽。
或者,当参考微生物为金黄色葡萄球菌NCTC 8325时,若如以下所详述的,候选多肽具有与以下氨基酸序列结构上相似的氨基酸序列:SEQ ID NO:362、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:384、SEQ IDNO:395、SEQ ID NO:406、SEQ ID NO:417或SEQ ID NO:428,则可认为其为本发明多肽。
或者,当参考微生物为金黄色葡萄球菌MSSA476时,若如以下所详述的,候选多肽具有与以下氨基酸序列结构上相似的氨基酸序列:SEQ ID NO:363、SEQ ID NO:374、SEQ ID NO:385、SEQ IDNO:396、SEQ ID NO:407、SEQ ID NO:418或SEQ ID NO:429,则可认为其为本发明多肽。
当参考微生物为金黄色葡萄球菌分离株SAAV1时,若候选多肽具有88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa的分子量,并具有与由参考微生物表达并分别具有88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa分子量的多肽的质量指纹相似的质量指纹,则可认为其为本发明多肽。优选所述多肽为金属调节的多肽。例如,若候选多肽具有88kDa分子量并具有与由参考菌株金黄色葡萄球菌分离株SAAV1产生的88kDa的金属调节的多肽的质量指纹相似的质量指纹,则其可为本发明多肽。
当参考微生物为金黄色葡萄球菌菌株2176时,若候选多肽具有88kDa、80kDa、65kDa、55kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或32kDa的分子量,并具有与由参考微生物表达并分别具有88kDa、80kDa、65kDa、55kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或32kDa分子量的多肽的质量指纹相似的质量指纹,则可认为其为本发明多肽。优选所述多肽为金属调节的多肽。例如,若候选多肽具有88kDa分子量并具有与由参考菌株金黄色葡萄球菌分离株2176产生的88
kDa金属调节的多肽的质量指纹相似的质量指纹,则其可为本发明多肽。
当参考微生物为金黄色葡萄球菌菌株1477时,若候选多肽具有88kDa、80kDa、65kDa、55kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或32kDa的分子量,并具有与由参考微生物表达并分别具有88kDa、80kDa、65kDa、55kDa、37kDa、36kDa、35kDa、33kDa或32kDa分子量的多肽的质量指纹相似的质量指纹,则可认为其为本发明多肽。优选所述多肽为金属调节的多肽。例如,若候选多肽具有88kDa分子量并具有与由参考菌株金黄色葡萄球菌分离株1477产生的88kDa金属调节的多肽的质量指纹相似的质量指纹,则其可为本发明多肽。
如本文所用的,若多肽的氨基酸序列与参考多肽相比,具有规定量的序列相似性和/或序列同一性,则该多肽可为与参考多肽“结构上相似的”。若多肽与参考多肽的可类比的质量指纹相比,表现出具有规定量的同一性的质量指纹,则该多肽亦可为与参考多肽在“结构上相似的”。因而,若与参考多肽相比,多肽具有足够水平的氨基酸序列同一性、氨基酸序列相似性、质量指纹相似性或其任意组合,则其可为与参考多肽“结构上相似的”。
多肽序列相似性和多肽序列同一性
可通过沿着其序列长度比对两个多肽(例如本文所述的候选多肽和任何合适的参考多肽)的残基以使相同氨基酸的数目最优化,来测定两种多肽的结构相似性;在进行比对中为了让相同氨基酸的数目最优化,允许任一个或两个序列中有空位,但每一个序列的氨基酸仍然都必须保留其正确的次序。在合适时参考多肽可为本文所述多肽或任何已知的金属调节的多肽。候选多肽为与参考多肽比较的多肽。候选多肽可例如自微生物分离,或可用重组的技术或化学或酶学合成制备。
除非如本文另外所述地改变,否则可用GCG软件包(10.2版,Madison WI)中的BESTFIT算法进行氨基酸序列的配对比较分析。或者,可用BLAST 2搜寻算法的Blastp程序来比较多肽,所述Blastp程序如Tatiana等(FEMS Microbiol Lett,174,247-250(1999))所述并可在国家生物技术信息中心(NCBI)网站获得。对于所有BLAST 2搜寻参数可使用默认值,包括矩阵=BLOSUM62;空位开放罚分=11,空位延伸罚分=1,空位x_dropoff=50,期望值=10,字长=3,和过滤器打开。
在两个氨基酸序列的比较中,结构相似性可由“同一性”百分比来提及,或可由“相似性”百分比来提及。“同一性”是指存在相同氨基酸。“相似性”是指不仅存在相同的氨基酸,而且还存在保守取代。本发明多肽中氨基酸的保守取代可选自氨基酸所属类别的其它成员。例如,在蛋白质生物化学领域众所周知,属于具有特定大小或特性(例如电荷、疏水性和亲水性)的氨基酸群的氨基酸可被另一氨基酸取代而不改变蛋白质的活性,尤其是在不直接与生物学活性有关联的蛋白质区域。例如,非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。保守取代包括例如Lys取代Arg,反之亦然,以保持正电荷;Glu取代Asp,反之亦然,以保持负电荷;Ser取代Thr以使保持游离-OH;和Gln取代Asn以保持游离-NH2。同样,亦考虑多肽的生物活性类似物,其含有不消除多肽的功能活性(例如免疫学活性)的一个或多个相邻或不相邻氨基酸的缺失或添加。
因而,如本文所用,提及本发明多肽和/或提及一个或多个SEQID NO的氨基酸序列可包括与参考氨基酸序列有以下氨基酸序列相似性的多肽:至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。
或者,如本文所用,提及本发明多肽和/或提及一个或多个SEQID NO的氨基酸序列可包括与参考氨基酸序列有以下氨基酸序列同一性的多肽:至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。
因此,本发明多肽可包括某些变体,所述变体包括例如起源于(生物学和/或重组地)不同于所述多肽初始自其分离和/或鉴定的微生物物种或菌株的微生物物种或菌株的同源多肽。
例如,本发明多肽可包括通常称为甲酸乙酰转移酶(PflB)的多肽。该多肽的一个实施方案反映在SEQ ID NO:353中。变体实施方案反映在SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:355、SEQ ID NO:356、SEQ IDNO:357、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360、SEQ IDNO:361、SEQ ID NO:362和SEQ ID NO:363中。
作为另一实例,本发明多肽可包括通常称为寡肽通透酶肽结合蛋白(Opp1A)的多肽。该多肽的一个实施方案反映在SEQ ID NO:364中。变体实施方案反映在SEQ ID NO:365、SEQ ID NO:366、SEQ IDNO:367、SEQ ID NO:368、SEQ ID NO:369、SEQ ID NO:370、SEQ IDNO:371、SEQ ID NO:372、SEQ ID NO:373和SEQ ID NO:374中。
作为另一实例,本发明多肽可包括通常称为铁载体化合物ABC转运蛋白结合蛋白(SirA)的多肽。该多肽的一个实施方案反映在SEQID NO:375中。变体实施方案反映在SEQ ID NO:376、SEQ IDNO:377、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:380、SEQ IDNO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384和SEQID NO:385中。
作为另一实例,本发明多肽可包括本文有时称为SYN2的多肽。该多肽的一个实施方案反映在SEQ ID NO:386中。变体实施方案反映在SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ IDNO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393、SEQ IDNO:394、SEQ ID NO:395和SEQ ID NO:396中。
作为另一实例,本发明多肽可包括通常称为异羟肟酸铁结合脂蛋白(FhuD)的多肽。该多肽的一个实施方案反映在SEQ ID NO:397中。变体实施方案反映在SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:399、SEQ IDNO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ IDNO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406和SEQ ID NO:407中。
作为另一实例,本发明多肽可包括本文有时称作SYN1的多肽。该多肽的一个实施方案反映在SEQ ID NO:408中。变体实施方案反映在SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:410、SEQ ID NO:411、SEQ IDNO:412、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:415、SEQ IDNO:416、SEQ ID NO:417和SEQ ID NO:418中。
作为另一实例,本发明多肽可包括通常称为锰转运***膜蛋白(MntC)的多肽。该多肽的一个实施方案反映在SEQ ID NO:419中。变体实施方案反映在SEQ ID NO:420、SEQ ID NO:421、SEQ IDNO:422、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:424、SEQ ID NO:425、SEQ IDNO:426、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:428和SEQ ID NO:429中。
作为另一实例,本发明多肽可包括通常称为铁色素ABC转运脂蛋白(SstD)的多肽。该多肽的实施方案反映在SEQ ID NO:543、SEQID NO:544、SEQ ID NO:545、SEQ ID NO:546、SEQ ID NO:547、SEQID NO:548、SEQ ID NO:549、SEQ ID NO:550、SEQ ID NO:551和SEQ ID NO:552中。
作为另一实例,本发明多肽可包括通常称为铁化合物ABC转运蛋白(FhuD2)的多肽。该多肽的实施方案反映在SEQ ID NO:553、SEQID NO:554、SEQ ID NO:555、SEQ ID NO:556、SEQ ID NO:557、SEQID NO:558、SEQ ID NO:559、SEQ ID NO:560、SEQ ID NO:561和SEQ ID NO:562中。
亦可将本发明多肽设计为提供一种或多种额外的序列,例如加入编码添加的C-末端和/或N-末端氨基酸的序列,所述C-末端和/或N-末端氨基酸可促进通过柱上捕捉或使用抗体来纯化。所述标签包括例如,允许在镍柱上纯化多肽的富含组氨酸的标签。所述基因修饰技术和合适的另外的序列在分子生物学领域众所周知。
亦可设计本发明多肽以使C-末端和/或N-末端的某些氨基酸被缺失。例如,SEQ ID NO:364和SEQ ID NO:365氨基酸序列之间的一个差异,是SEQ ID NO:365拥有参考多肽氨基酸序列SEQ IDNO:364中不存在的N-末端29位氨基酸添加。当将例如参考肽氨基酸序列SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:364、SEQ ID NO:375、SEQ IDNO:386、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:408或SEQ ID NO:419与各个参考多肽的某些变体实施方案进行比较时,通常在约20个氨基酸-约35个氨基酸之间变化的类似示例性N-末端添加显而易见。在N-末端或C-末端的其它氨基酸添加和/或缺失是可能的。
本发明多肽的“修饰”包括在一个或多个组成氨基酸处化学或酶学衍生的多肽(或其类似物,例如其片段)。所述修饰可包括例如侧链修饰、主链修饰和N-和C-末端修饰,例如乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化和连接碳水化合物或脂质部分、辅因子等,及它们的组合。经修饰的本发明多肽可保留未经修饰的多肽的生物学活性例如免疫学活性,或可表现出降低或增加的生物学活性。
本发明多肽(包括其生物学活性类似物及其修饰)包括自然的(天然存在的)、重组的和化学或酶学合成的多肽。例如,本发明多肽可通过从天然来源分离多肽来制备,或可通过熟知方法重组制备,所述方法包括例如作为细菌或其它宿主细胞中的融合蛋白来制备。
可通过让参考微生物在低金属条件下生长,随后通过本文所揭示方法分离多肽,来获得由参考微生物表达的多肽。或者,可通过鉴定微生物在低金属条件下生长时以较高水平表达的基因(即金属调节的基因),来获得由参考微生物表达的多肽。可克隆并表达金属调节的基因,可通过本文所述方法来鉴定表达的金属调节的多肽。可自微生物分离或自微生物鉴定候选多肽,所述微生物优选为革兰氏阳性微生物,更优选微球菌科成员,优选葡萄球菌属,更优选金黄色葡萄球菌。
可自其分离和/或鉴别多肽的其它革兰氏阳性微生物,包括棒杆菌属、肠球菌属、丹毒丝菌属、盖球菌属和微球菌属、分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)和丹毒丝菌属。亦可用酶技术或化学技术产生候选多肽。
质量指纹相似性
可通过质谱分析来评估候选多肽,以测定候选多肽是否具有与由参考微生物表达并按照分子量在上文提及的多肽之一相似的质量指纹。通常可例如通过凝胶电泳分离候选多肽并切下含有候选多肽的凝胶部分来分离候选多肽。可使用基于不同特性分离多肽的任何凝胶电泳方法,包括1维或2维凝胶电泳以及基于例如疏水性、pI或大小的液相色谱分离。可例如通过用蛋白酶消化来使候选多肽片段化。优选蛋白酶可切割氨基酸赖氨酸及氨基酸精氨酸的羧基末端侧的肽键,但当赖氨酸或精氨酸后面的氨基酸为脯氨酸时除外。所述蛋白酶的实例为胰蛋白酶。用胰蛋白酶消化多肽的方法为常规方法并为本领域已知。所述方法实例揭示于实施例13中。
用于多肽的质谱分析的方法为常规方法并为本领域已知,包括但不限于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。通常让含有自候选多肽获得的多肽片段的混合物与基质混合,所述基质的功能是将激光能量转移到样品并产生电离的多肽片段优选单同位素的多肽片段。可使用的基质实例包括例如芥子酸或氰基-4-羟基肉桂酸。用于通过MALDI-TOF MS分析多肽的方法实例阐述于实施例13中。按照其m/z比率分离电离的多肽片段,并检测以产生m/z比率对比强度的光谱。光谱包括代表源自候选多肽的多肽片段的m/z值。对于任何既定多肽而言,因胰蛋白酶消化而产生的每一种多肽片段的量应该是等摩尔的。然而,已知胰蛋白酶消化并不总是100%有效,例如,某些位点被更有效切割。因而,当用MALDI-TOF MS来测定m/z值时,每一个m/z值的强度通常并不相同。通常光谱具有存在于大部分x-轴(即具有m/z比率值的轴)的背景噪声水平。该背景噪声水平视运行条件及所用机器而定,易于由目视检查光谱来鉴别。当强度为背景噪声水平的至少2倍大、至少3倍大或至少4倍大时,通常认为m/z值代表多肽片段。光谱通常包括其它m/z值,所述其它m/z值是因例如以下原因而产生的人为产物:不完全消化、过度消化、可存在于混合物或用于消化所述多肽的蛋白酶中的其它多肽,包括因蛋白酶自溶而产生的m/z值。本领域公认用蛋白酶消化多肽的该方法为导致产生极具特异性的质量指纹,所述特异性可用于准确表征多肽及将其与其它多肽区别开。
在本发明该方面,当通过质谱分析来分析候选多肽时,优选一起制备并分析候选多肽和来自参考微生物的多肽二者,藉此减少因样品处理和运行条件不同而产生的任何可能的人为产物。优选用于制备及分析两种多肽的所有试剂都是一样的。例如,在基本上相同的条件下分离来自参考微生物的多肽和候选多肽,在基本上相同的条件下使其片段化,并在同一机器上在基本上相同的条件下通过MALDI-TOFMS分析。若候选多肽表现出拥有至少80%、至少90%、至少95%或基本上全部存在于参考微生物多肽光谱中的m/z值的质量指纹,并且以上背景噪音水平亦存在于候选多肽光谱中,则可认为候选多肽与参考多肽“结构上相似”。(参见例如美国专利申请公开号2006/0233824A1)。
在另一方面,若多肽具有表2、3、4或5中所述的参考多肽的分子量,并具有包括以下亚群的质量指纹,所述亚群包括至少规定百分比的表2、3、4或5中所列参考多肽的多肽片段的,则可将其认为是本发明多肽。例如,本发明多肽包括88kDa的多肽和包括规定百分比的具有以下质量的多肽片段的质量指纹:HVDVR(SEQ ID NO:1)、YSYER(SEQ ID NO:2)、IIGDYRR(SEQ ID NO:3)、IFTDYRK(SEQ ID NO:4)、ELKELGQK(SEQ ID NO:5)、YAQVKPIR(SEQ IDNO:6)、QMQFFGAR(SEQ ID NO:7)、SMQPFGGIR(SEQ ID NO:8)、VSGYAVNFIK(SEQ ID NO:9)、NHATAWQGFK(SEQ ID NO:10)、LWEQVMQLSK(SEQ ID NO:11)、SLGKEPEDQNR(SEQ ID NO:12)、DGISNTFSIVPK(SEQ ID NO:13)、AGVITGLPDAYGR(SEQ IDNO:14)、TSTFLDIYAER(SEQ ID NO:15)、SMQPFGGIRMAK(SEQID NO:16)、THNQGVFDAYSR(SEQ ID NO:17)、KAGVITGLPDAYGR(SEQ ID NO:18)、TLLYAINGGKDEK(SEQ IDNO:19)、IEMALHDTEIVR(SEQ ID NO:20)、AGEPFAPGANPMHGR(SEQ ID NO:21)、VALYGVDFLMEEK(SEQ ID NO:22)、KTHNQGVFDAYSR(SEQ ID NO:23)、YGFDLSRPAENFK(SEQ IDNO:24)、TSSIQYENDDIMR(SEQ ID NO:25)、KAGEPFAPGANPMHGR(SEQ ID NO:26)、RVALYGVDFLMEEK(SEQ ID NO:27)、LWEQVMQLSKEER(SEQ ID NO:28)、MLETNKNHATAWQGFK(SEQ ID NO:29)、MHDFNTMSTEMSEDVIR(SEQ ID NO:30)、YGNNDDRVDDIAVDLVER(SEQ ID NO:31)、ETLIDAMEHPEEYPQLTIR(SEQ ID NO:32)、YAQVKPIRNEEGLVVDFEIEGDFPK(SEQ ID NO:33)。
可由质谱方法例如由MALDI-TOF MS测定候选多肽的质量指纹。候选多肽的质量指纹通常具有另外的多肽片段,并因此可具有不同于表2、3、4或5中对多肽所列的那些m/z值的其它m/z值。当让候选多肽与表2、3、4或5的多肽比较时,可自微生物分离候选多肽,优选革兰氏阳性微生物,更优选微球菌科的成员,优选葡萄球菌属,更优选金黄色葡萄球菌。其它革兰氏阳性微生物包括棒杆菌属、肠球菌属、丹毒丝菌属、盖球菌属、利斯特氏菌属(Listeria spp.)、微球菌属和分枝杆菌属以及丹毒丝菌属。
可通过使微生物生长在低金属条件下,随后通过本文所述方法分离多肽,来获得候选多肽。或者,可通过重组表达编码候选多肽的多核苷酸来获得候选多肽。
本领域众所周知,在样品处理期间可偶然地引入氨基酸修饰,例如氧化及形成脲基甲基衍生物。另外,这些修饰类型改变多肽片段的m/z值。例如,若多肽片段含有被氧化的甲硫氨酸,则相对于不含有被氧化的甲硫氨酸的同一片段,m/z值将增加16。因此,表2、3、4或5中的那些具有符号“氧化(M)”的多肽片段,相对于不含有被氧化的甲硫氨酸的同一片段,具有增加16的m/z值。应该理解,在样品处理期间可修饰表2、3、4或5的多肽片段。
多核苷酸序列相似性和多核苷酸序列同一性
亦可根据编码多肽的多核苷酸来鉴定本发明多肽。因而,本发明包括编码本发明多肽或在标准杂交条件下与编码本发明多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸及所述多核苷酸序列的互补序列。
如本文所用,提及本发明多核苷酸和/或提及一个或多个SEQ IDNO的核酸序列,可包括与经鉴定的参考多核苷酸序列具有以下序列同一性的多核苷酸:至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性。
在本上下文中“序列同一性”是指两个多核苷酸序列之间的同一性。通常通过沿着其序列长度比对两个多核苷酸(例如比对候选序列的核苷酸序列和包括例如SEQ ID NO:474或SEQ ID NO:485核苷酸序列的核苷酸序列)的碱基,以优化相同核苷酸的数目,来测定序列同一性;在进行比对中为了使共有的核苷酸数目最优化,允许任一个或两个序列都有空位,但每一序列中的核苷酸仍然必须保留其正确的次序。候选序列为与已知序列比较的序列,所述已知序列为例如包括例如SEQID NO:474或SEQ ID NO:485核苷酸序列的核苷酸序列。例如,可用BLAST 2搜寻算法的Blastn程序来比较两个多核苷酸序列,所述Blastn程序如Tatiana等(FEMS Microbiol Lett,1999;174,247-250)所述并可在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/万维网上获得。对于所有BLAST 2搜寻参数可使用默认值,包括配对奖分=1,错配罚分=-2,空位开放罚分=5,空位延伸罚分=2,空位x_dropoff=50,期望值=10,字长=3,和过滤器打开。
例如,本发明多核苷酸可包括编码通常称为甲酸乙酰转移酶(PflB)的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸的一个实施方案反映在SEQID NO:430中。变体实施方案反映在SEQ ID NO:431、SEQ ID NO:432、SEQ ID NO:433、SEQ ID NO:434、SEQ ID NO:435、SEQ ID NO:436、SEQ ID NO:437、SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:439和SEQ ID NO:440。
作为另一实例,本发明多核苷酸可包括编码通常称为寡肽通透酶肽结合蛋白(Opp1A)的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸的一个实施方案反映在SEQ ID NO:441中。变体实施方案反映在SEQ ID NO:442、SEQ ID NO:443、SEQ ID NO:444、SEQ ID NO:445、SEQ ID NO:446、SEQ ID NO:447、SEQ ID NO:448、SEQ ID NO:449、SEQ ID NO:450和SEQ ID NO:451中。
作为另一实例,本发明多核苷酸可包括编码通常称为铁载体化合物ABC转运蛋白结合蛋白(SirA)的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸的一个实施方案反映在SEQ ID NO:452中。变体实施方案反映在SEQ IDNO:453、SEQ ID NO:454、SEQ ID NO:455、SEQ ID NO:456、SEQ IDNO:457、SEQ ID NO:458、SEQ ID NO:459、SEQ ID NO:460、SEQ IDNO:461和SEQ ID NO:462中。
作为另一实例,本发明多核苷酸可包括编码本文称为SYN2的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸的一个实施方案反映在SEQ ID NO:463中。变体实施方案反映在SEQ ID NO:464、SEQ ID NO:465、SEQ IDNO:466、SEQ ID NO:467、SEQ ID NO:468、SEQ ID NO:469、SEQ IDNO:470、SEQ ID NO:471、SEQ ID NO:472和SEQ ID NO:473中。
作为另一实例,本发明多核苷酸可包括编码通常称为FhuD的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸的一个实施方案反映在SEQ ID NO:474中。变体实施方案反映在SEQ ID NO:475、SEQ ID NO:476、SEQ IDNO:477、SEQ ID NO:478、SEQ ID NO:479、SEQ ID NO:480、SEQ IDNO:481、SEQ ID NO:482、SEQ ID NO:483和SEQ ID NO:484中。
作为另一实例,本发明多核苷酸可包括编码本文称为SYN1的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸的一个实施方案反映在SEQ ID NO:485中。变体实施方案反映在SEQ ID NO:486、SEQ ID NO:487、SEQ IDNO:488、SEQ ID NO:489、SEQ ID NO:490、SEQ ID NO:491、SEQ IDNO:492、SEQ ID NO:493、SEQ ID NO:494和SEQ ID NO:495中。
作为另一实例,本发明多核苷酸可包括编码通常称为MntC的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸的一个实施方案反映在SEQ ID NO:496中。变体实施方案反映在SEQ ID NO:497、SEQ ID NO:498、SEQ IDNO:499、SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:501、SEQ ID NO:502、SEQ IDNO:503、SEQ ID NO:504、SEQ ID NO:505和SEQ ID NO:506中。
作为另一实例,本发明多核苷酸可包括编码通常称为铁色素ABC转运脂蛋白(SstD)的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸的实施方案反映在SEQ ID NO:563、SEQ ID NO:564、SEQ ID NO:565、SEQ IDNO:566、SEQ ID NO:567、SEQ ID NO:568、SEQ ID NO:569、SEQ IDNO:570、SEQ ID NO:571和SEQ ID NO:572中。
作为另一实例,本发明多核苷酸可包括编码通常称为铁化合物ABC转运蛋白(FhuD2)的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸的实施方案反映在SEQ ID NO:573、SEQ ID NO:574、SEQ ID NO:575、SEQ IDNO:576、SEQ ID NO:577、SEQ ID NO:578、SEQ ID NO:579、SEQ IDNO:580、SEQ ID NO:581和SEQ ID NO:582中。
本发明还提供微生物的完整细胞制剂,其中微生物表达一种或多种本发明多肽。存在于完整细胞制剂中的细胞优选失活,使得所述细胞不能复制,但保留由微生物表达的本发明多肽的免疫学活性。通常细胞通过与诸如戊二醛、***或甲醛等作用剂接触而被杀死。
组合物
本发明组合物可包含至少一种本文所述的分离多肽,或大于一的整数种多肽(例如至少两种、至少三种、至少四种)。例如,组合物可包含包括SEQ ID NO:408氨基酸序列的分离多肽,和/或包括SEQ IDNO:397氨基酸序列的分离多肽。除非序列相似性和/或同一性的具体水平在本文明确指出(例如至少80%序列相似性、至少90%序列同一性,等),否则提及已鉴定的SEQ ID NO的氨基酸序列,包括具有在本文标题为“多肽序列相似性和多肽序列同一性”的章节中所述的序列相似性水平和/或序列同一性水平的变体。
在一些实施方案中,组合物可包含一种或多种另外的分离的多肽。在一些实施方案中,一种或多种另外的分离的多肽可包括一种或多种金属调节的多肽。因而,组合物可包含至少一种分离的金属调节的多肽,其包括在SEQ ID NO:353到SEQ ID NO:429中的一个或多个中描述的氨基酸序列,和/或在SEQ ID NO:543到SEQ ID NO:562中的一个或多个中描述的氨基酸序列。另外或作为备选,组合物可包含至少一种分离的金属调节的多肽,所述多肽具有88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa的分子量。另外或作为备选,组合物可包括至少一种分离的金属调节的多肽,所述多肽包括由多核苷酸编码的氨基酸序列,所述多核苷酸包括在SEQ ID NO:430到SEQID NO:506中的一个或多个中描述的核苷酸序列,和/或在SEQ IDNO:563到SEQ ID NO:582中的一个或多个中描述的核苷酸序列。
在一个实施方案中,组合物包含以下多肽,其包括在SEQ IDNO:397中描述的氨基酸序列(或其变体,例如,在SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406或SEQ ID NO:407中描述的氨基酸序列中的任一个)。
在另一实施方案中,组合物包含以下多肽,其包括在SEQ IDNO:408中描述的氨基酸序列(或其变体,例如,在SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:410、SEQ ID NO:411、SEQ ID NO:412、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:415、SEQ ID NO:416、SEQ ID NO:417或SEQ ID NO:418中描述的氨基酸序列中的任一个)。
在另一实施方案中,组合物包含以下多肽,其包括在SEQ IDNO:419中描述的氨基酸序列(或其变体,例如,在SEQ ID NO:420、SEQ ID NO:421、SEQ ID NO:422、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:424、SEQ ID NO:425、SEQ ID NO:426、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:428或SEQ ID NO:429中描述的氨基酸序列中的任一个)。
在另一实施方案中,组合物包含以下多肽,其包括在SEQ IDNO:375中描述的氨基酸序列(或其变体,例如,在SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384或SEQ ID NO:385中描述的氨基酸序列中的任一个)。
在另一实施方案中,组合物包含以下多肽,其包括在SEQ IDNO:386中描述的氨基酸序列(或其变体,例如,在SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:395或SEQ ID NO:396中描述的氨基酸序列中的任一个)。
在另一实施方案中,组合物包含以下多肽,其包括在SEQ IDNO:364中描述的氨基酸序列(或其变体,例如,在SEQ ID NO:365、SEQ ID NO:366、SEQ ID NO:367、SEQ ID NO:368、SEQ ID NO:369、SEQ ID NO:370、SEQ ID NO:371、SEQ ID NO:372、SEQ ID NO:373或SEQ ID NO:374中描述的氨基酸序列中的任一个)。
在另一实施方案中,组合物包含以下多肽,其包括在SEQ IDNO:353中描述的氨基酸序列(或其变体,例如,在SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:355、SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:357、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:362或SEQ ID NO:363中描述的氨基酸序列中的任一个)。
在另一实施方案中,组合物包含以下多肽,其包括在SEQ IDNO:543、SEQ ID NO:544、SEQ ID NO:545、SEQ ID NO:546、SEQ IDNO:547、SEQ ID NO:548、SEQ ID NO:549、SEQ ID NO:550、SEQ IDNO:551或到SEQ ID NO:552中描述的氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列或其变体。
在另一实施方案中,组合物包含以下多肽,其包括在SEQ IDNO:553、SEQ ID NO:554、SEQ ID NO:555、SEQ ID NO:556、SEQ IDNO:557、SEQ ID NO:558、SEQ ID NO:559、SEQ ID NO:560、SEQ IDNO:561或SEQ ID NO:562中描述的氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列或其变体。
在一些实施方案中,组合物可包含选自以下的两种或更多种多肽的组合:SYN1多肽、MntC多肽、FhuD多肽、SYN2多肽、SirA多肽、Opp1A多肽和Pflb多肽。
因而,组合物可包含至少一种以下多肽或包括至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或全部七种以下多肽在内的任何组合,:SYN1多肽、MntC多肽、FhuD多肽、SYN2多肽、SirA多肽、Opp1A多肽和Pflb多肽。包含多肽组合的例示性组合物在表6中确认。
组合物 | SYN1 | MntC | FhuD | SYN2 | SirA | Opp1A | Pflb |
2种pPeptides* | |||||||
1 | X | X | |||||
2 | X | X | |||||
3 | X | X | |||||
4 | X | X | |||||
5 | X | X | |||||
6 | X | X | |||||
7 | X | X | |||||
8 | X | X | |||||
9 | X | X | |||||
10 | X | X | |||||
11 | X | X | |||||
12 | X | X | |||||
13 | X | X | |||||
14 | X | X | |||||
15 | X | X | |||||
16 | X | X | |||||
17 | X | X | |||||
18 | X | X | |||||
19 | X | X | |||||
20 | X | X | |||||
21 | X | X | |||||
3种pPeptides* | |||||||
22 | X | X | X | ||||
23 | X | X | X | ||||
24 | X | X | X | ||||
25 | X | X | X | ||||
26 | X | X | X | ||||
27 | X | X | X | ||||
28 | X | X | X | ||||
29 | X | X | X | ||||
30 | X | X | X | ||||
31 | X | X | X | ||||
32 | X | X | X | ||||
33 | X | X | X | ||||
34 | X | X | X | ||||
35 | X | X | X | ||||
36 | X | X | X | ||||
37 | X | X | X | ||||
38 | X | X | X | ||||
39 | X | X | X | ||||
40 | X | X | X | ||||
41 | X | X | X | ||||
42 | X | X | X | ||||
43 | X | X | X | ||||
44 | X | X | X | ||||
45 | X | X | X | ||||
46 | X | X | X | ||||
47 | X | X | X | ||||
48 | X | X | X | ||||
49 | X | X | X | ||||
50 | X | X | X | ||||
51 | X | X | X | ||||
52 | X | X | X | ||||
53 | X | X | X | ||||
54 | X | X | X | ||||
55 | X | X | X | ||||
56 | X | X | X | ||||
4种pPeptides* | X | X | X | X | |||
57 | X | X | X | X | |||
58 | X | X | X | X | |||
59 | X | X | X | X | |||
60 | X | X | X | X | |||
61 | X | X | X | X | |||
62 | X | X | X | X | |||
63 | X | X | X | ||||
64 | X | X | X | X | |||
65 | X | X | X | X | |||
67 | X | X | X | X | |||
68 | X | X | X | X | |||
69 | X | X | X | X | |||
70 | X | X | X | X | |||
71 | X | X | X | X | |||
72 | X | X | X | X | |||
73 | X | X | X | X | |||
74 | X | X | X | X | |||
75 | X | X | X | X | |||
76 | X | X | X | X | |||
77 | X | X | X | X | |||
78 | X | X | X | X | |||
79 | X | X | X | X | |||
80 | X | X | X | X | |||
81 | X | X | X | X | |||
82 | X | X | X | X | |||
83 | X | X | X | X | |||
84 | X | X | X | X | |||
85 | X | X | X | X | |||
86 | X | X | X | X | |||
87 | X | X | X | X | |||
88 | X | X | X | X | |||
89 | X | X | X | X | |||
90 | X | X | X | X | |||
91 | X | X | X | X | |||
5种pPeptides* | |||||||
92 | X | X | X | X | X | ||
93 | X | X | X | X | X | ||
94 | X | X | X | X | X | ||
95 | X | X | X | X | X | ||
96 | X | X | X | X | X | ||
97 | X | X | X | X | X | ||
98 | X | X | X | X | X | ||
99 | X | X | X | X | X | ||
100 | X | X | X | X | X | ||
101 | X | X | X | X | X | ||
102 | X | X | X | X | X | ||
103 | X | X | X | X | X | ||
104 | X | X | X | X | X | ||
105 | X | X | X | X | X | ||
106 | X | X | X | X | X | ||
107 | X | X | X | X | X | ||
108 | X | X | X | X | X | ||
109 | X | X | X | X | X | ||
110 | X | X | X | X | X | ||
111 | X | X | X | X | X | ||
112 | X | X | X | X | X | ||
6种pPeptides* | |||||||
113 | X | X | X | X | X | X | |
114 | X | X | X | X | X | X | |
115 | X | X | X | X | X | X | |
116 | X | X | X | X | X | X | |
117 | X | X | X | X | X | X | |
118 | X | X | X | X | X | X | |
119 | X | X | X | X | X | X |
*pPeptides=多肽
“X”确认包含在特定组合物中的多肽。
在整个本说明中,SYN1多肽可表征为以下一种或多种:包括SEQ ID NO:408、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:410、SEQ ID NO:411、SEQ ID NO:412、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:415、SEQ ID NO:416、SEQ ID NO:417或SEQ ID NO:418中任一个所描绘的氨基酸序列的氨基酸序列;由包括SEQ ID NO:485、SEQ IDNO:486、SEQ ID NO:487、SEQ ID NO:488、SEQ ID NO:489、SEQ IDNO:490、SEQ ID NO:491、SEQ ID NO:492、SEQ ID NO:493、SEQ IDNO:494、SEQ ID NO:495中任一个所描绘的核酸序列的多核苷酸编码;和/或约33.1kDa的计算分子量。
在整个本说明中,MntC多肽可表征为以下一种或多种:具有通过SDS-PAGE测定的33kDa的分子量;与由参考菌株金黄色葡萄球菌ATCC分离株19636产生的33kDa金属调节的多肽的质量指纹至少80%相似的质量指纹;包括SEQ ID NO:419、SEQ ID NO:420、SEQID NO:421、SEQ ID NO:422、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:424、SEQID NO:425、SEQ ID NO:426、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:428或SEQID NO:429中任一个所描绘的氨基酸序列的氨基酸序列;由包括SEQID NO:496、SEQ ID NO:497、SEQ ID NO:498、SEQ ID NO:499、SEQID NO:500、SEQ ID NO:501、SEQ ID NO:502、SEQ ID NO:503、SEQID NO:504、SEQ ID NO:505或SEQ ID NO:506中任一个所描绘的核酸序列的多核苷酸编码;和/或约34.6kDa的计算分子量。
在整个本说明中,FhuD多肽可表征为以下一种或多种:包括SEQID NO:397、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:400、SEQID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:404、SEQID NO:405、SEQ ID NO:406或SEQ ID NO:407中任一个所描绘的氨基酸序列的氨基酸序列;由包括SEQ ID NO:474、SEQ ID NO:475、SEQ ID NO:476、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:478、SEQ ID NO:479、SEQ ID NO:480、SEQ ID NO:481、SEQ ID NO:482、SEQ ID NO:483或SEQ ID NO:484中任一个所描绘的核酸序列的多核苷酸编码;和/或约35.4kDa的计算分子量。
在整个本说明中,SYN2多肽可表征为以下一种或多种:具有通过SDS-PAGE测定的36kDa的分子量;与由参考菌株金黄色葡萄球菌ATCC分离株19636产生的36kDa金属调节的多肽的质量指纹至少80%相似的质量指纹;包括SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQID NO:392、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:395或SEQID NO:396中任一个所描绘的氨基酸序列的氨基酸序列;由包括SEQID NO:463、SEQ ID NO:464、SEQ ID NO:465、SEQ ID NO:466、SEQID NO:467、SEQ ID NO:468、SEQ ID NO:469、SEQ ID NO:470、SEQID NO:471、SEQ ID NO:472或SEQ ID NO:473中任一个所描绘的核酸序列的多核苷酸编码;和/或约36.5kDa的计算分子量。
在本说明中,SirA多肽可表征为以下一种或多种:具有通过SDS-PAGE测定的37kDa的分子量;与由参考菌株金黄色葡萄球菌ATCC分离株19636产生的37kDa金属调节的多肽的质量指纹至少80%相似的质量指纹;包括SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:376、SEQ IDNO:377、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:380、SEQ IDNO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384或SEQ IDNO:385中任一个所描绘的氨基酸序列的氨基酸序列;由包括SEQ IDNO:452、SEQ ID NO:453、SEQ ID NO:454、SEQ ID NO:455、SEQ IDNO:456、SEQ ID NO:457、SEQ ID NO:458、SEQ ID NO:459、SEQ IDNO:460、SEQ ID NO:461或SEQ ID NO:462中任一个所描绘的核酸序列的多核苷酸编码;和/或约36.6kDa的计算分子量。
在整个本说明中,Opp1A多肽可表征为以下一种或多种:具有通过SDS-PAGE测定的55kDa的分子量;与由参考菌株金黄色葡萄球菌ATCC分离株19636产生的55kDa金属调节的多肽的质量指纹至少80%相似的质量指纹;包括SEQ ID NO:364、SEQ ID NO:365、SEQ ID NO:366、SEQ ID NO:367、SEQ ID NO:368、SEQ ID NO:369、SEQ ID NO:370、SEQ ID NO:371、SEQ ID NO:372、SEQ ID NO:373或SEQ ID NO:374中任一个所描绘的氨基酸序列的氨基酸序列;由包括SEQ ID NO:441、SEQ ID NO:442、SEQ ID NO:443、SEQ ID NO:444、SEQ ID NO:445、SEQ ID NO:446、SEQ ID NO:447、SEQ ID NO:448、SEQ ID NO:449、SEQ ID NO:450或SEQ ID NO:451中任一个所描绘的核酸序列的多核苷酸编码;和/或约59.9kDa的计算分子量。
在整个本说明中,PflB多肽可表征为以下一种或多种:具有通过SDS-PAGE测定的88kDa的分子量;与由参考菌株金黄色葡萄球菌ATCC分离株19636产生的88kDa金属调节的多肽的质量指纹至少80%相似的质量指纹;包括SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:354、SEQ IDNO:355、SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:357、SEQ ID NO:358、SEQ IDNO:359、SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:362或SEQ IDNO:363中任一个所描绘的氨基酸序列的氨基酸序列;由包括SEQ IDNO:430、SEQ ID NO:431、SEQ ID NO:432、SEQ ID NO:433、SEQ IDNO:434、SEQ ID NO:435、SEQ ID NO:436、SEQ ID NO:437、SEQ IDNO:438、SEQ ID NO:439或SEQ ID NO:440中任一个所描绘的核酸序列的多核苷酸编码;和/或约84.7kDa的计算分子量。
在另一特定实施方案中,组合物可包含诸如MntC多肽、FhuD多肽、SirA多肽和SYN2多肽等多肽的组合(表6中的组合物77),每一种多肽的特征皆如刚才上面所述。
在一些实施方案中,组合物可包含一种或多种重组产生的多肽。例如,组合物可包含重组产生的Pflb多肽,例如包括SEQ ID NO:353中所描绘的氨基酸序列的多肽,但重组产生的Pflb多肽除了为重组产生的外,还可以以如上所述可表征Pflb多肽的任何方式来表征。所述组合物可包含一种或多种重组产生的多肽,一种或多种分离自金黄色葡萄球菌的多肽或其任意组合。
作为另一实例,组合物可包含重组产生的Opp1A多肽,例如包括SEQ ID NO:364中所描绘的氨基酸序列的多肽,但重组产生的Opp1A多肽除了为重组产生的外,还可以以如上所述可表征Opp1A多肽的任何方式来表征。所述组合物可进一步包含一种或多种重组产生的多肽,一种或多种分离自金黄色葡萄球菌的多肽或其任意组合。
作为另一实例,组合物可包含重组产生的SirA多肽,例如包括SEQ ID NO:375中所描绘的氨基酸序列的多肽,但重组产生的SirA多肽除了为重组产生的外,还可以以如上所述可表征SirA多肽的任何方式来表征。所述组合物可进一步包含一种或多种重组产生的多肽,一种或多种分离自金黄色葡萄球菌的多肽或其任意组合。
作为另一实例,组合物可包含重组产生的SYN2多肽,例如包括SEQ ID NO:386中所描绘的氨基酸序列的多肽,但重组产生的SYN2多肽除了为重组产生的外,还可以以如上所述可表征SYN2多肽的任何方式来表征。所述组合物可进一步包含一种或多种重组产生的多肽,一种或多种分离自金黄色葡萄球菌的多肽或其任意组合。
作为另一实例,组合物可包含重组产生的FhuD多肽,例如包括SEQ ID NO:397中所描绘的氨基酸序列的多肽,但重组产生的FhuD多肽除了为重组产生的外,还可以以如上所述可表征FhuD多肽的任何方式来表征。所述组合物可进一步包含一种或多种重组产生的多肽,一种或多种分离自金黄色葡萄球菌的多肽或其任意组合。
作为另一实例,组合物可包含重组产生的SYN1多肽,例如包括SEQ ID NO:408中所描绘的氨基酸序列的多肽,但重组产生的SYN1多肽除了为重组产生的外,还可以以如上所述可表征SYN1多肽的任何方式来表征。所述组合物可进一步包含一种或多种重组产生的多肽,一种或多种分离自金黄色葡萄球菌的多肽或其任意组合。
作为另一实例,组合物可包含重组产生的MntC多肽,例如包括SEQ ID NO:419中所描绘的氨基酸序列的多肽,但重组产生的MntC多肽除了为重组产生的外,还可以以如上所述可表征MntC多肽的任何方式来表征。所述组合物可进一步包含一种或多种重组产生的多肽,一种或多种分离自金黄色葡萄球菌的多肽或其任意组合。
在一些实施方案中,重组产生的多肽可代表多肽的天然形式的免疫学活性片段。免疫学活性片段可包括在免疫学活性片段核心的氨基末端和/或羧基末端的氨基酸添加(例如SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:364、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:408或SEQ ID NO:419的氨基酸序列)。在某些实施方案中,与多肽的较长的形式例如野生型或其它天然形式相比,免疫学活性片段核心的氨基末端的任何添加可包括一种或多种氨基酸添加、缺失、取代(统称为“修饰”)或修饰的任何组合。因而,例如在其中免疫学活性片段包括SEQ ID NO:397的实施方案中,与例如SEQ ID NO:399的1-26位氨基酸相比,对SEQ ID NO:397的氨基末端的添加可在氨基末端添加中包括以下修饰:至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25或至少26种修饰。作为另一实例,在其中免疫学活性片段包括SEQ ID NO:408的实施方案中,与例如SEQ ID NO:415的1-26位氨基酸相比,对SEQ ID NO:408的氨基末端的添加可在氨基末端添加中包括至少1、至少2、至少3、至少4或至少5种修饰。
当比较不同长度的参考多肽和候选多肽(例如参考多肽的免疫学活性片段)的氨基酸序列相似性和/或氨基酸序列同一性时,可在较长多肽的全长内计算相似性和/或同一性,计算促成为错配的较长多肽中更长长度的每一个氨基酸残基。
因此,在一些实施方案中,本发明的分离多肽可包括与SEQ IDNO:397氨基酸序列具有以下序列相似性和/或同一性的多肽:至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,条件是若分离的多肽在氨基末端包括一个或多个另外的氨基酸,则与SEQ ID NO:399的1-26位氨基酸相比,所述一个或多个另外的氨基酸包括至少一种氨基酸缺失或至少一种氨基酸取代。
在其它实施方案中,本发明的分离多肽可包括与SEQ ID NO:408氨基酸序列具有至少98%或至少99%序列相似性和/或同一性的多肽,条件是若分离的多肽在氨基末端包括一个或多个另外的氨基酸,则与SEQ ID NO:415的1-5位氨基酸相比,所述一个或多个另外的氨基酸包括至少一种氨基酸缺失或至少一种氨基酸取代。
如上在标题为多肽序列相似性和多肽序列同一性的章节中所述,通过提及特定SEQ ID NO的氨基酸序列所确认的多肽,可包括与参考氨基酸序列(例如在具体SEQ ID NO:中提供的氨基酸序列)具有以下氨基酸序列相似性的多肽:至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,和/或可包括与参考氨基酸序列(例如在具体SEQ ID NO:中提供的氨基酸序列)具有以下氨基酸序列同一性的多肽:至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。
重组产生的多肽可自当将载体引入合适宿主细胞时允许表达该多肽的载体表达。可构建宿主细胞以产生一种或多种重组产生的本发明多肽,因此宿主细胞可包括一种或多种载体,所述载体包括至少一种编码本发明多肽的多核苷酸。因而,每一种载体可包括一种或多种本发明多核苷酸,即编码本发明多肽的多核苷酸。
某些组合物例如包含重组产生的多肽的组合物,可包含最大数目的多肽。在一些实施方案中,多肽的最大数目可指多肽的最大总数目。某些组合物可包含例如不超过50种多肽、例如不超过40种多肽、不超过30种多肽、不超过25种多肽、不超过20种多肽、不超过15种多肽、不超过10种多肽、不超过8种多肽、不超过7种多肽、不超过6种多肽、不超过5种多肽、不超过4种多肽、不超过3种多肽、不超过2种多肽或不超过1种多肽。在其它实施方案中,可以以相似方式来规定重组产生的多肽的最大数目。在再另外的实施方案中,可以以相似方式来规定非重组产生的多肽的最大数目。
组合物可包含可自一种微生物分离的多肽,或可自两种或更多种微生物的组合分离。例如,组合物可包含可自以下微生物分离的多肽:两种或更多种葡萄球菌属,或葡萄球菌属和不是葡萄球菌属成员的不同的微生物。本发明亦提供包含全细胞制剂的组合物,其中所述全细胞表达一种或多种本发明多肽。例如,全细胞可为葡萄球菌属。在一些方面,组合物可包含来自2、3、4、5或6种菌株的全制剂。
任选本发明多肽可与载体多肽共价结合或缀合,以改进多肽的免疫学特性。有用的载体多肽为本领域已知。可用已知及常规方法实施本发明多肽的化学偶联。例如,可使用各种同双功能和/或异双功能交联试剂,例如辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯、双(重氮联苯胺)(bis(diazobenzidine))、己二酰亚胺酸二甲酯(dimethyl adipimidate)、庚二酰亚胺酸二甲酯、辛二酰亚氨酸二甲酯(dimethyl superimidate)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯、戊二醛、间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺、磺基-间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯、4-(对-马来酰亚胺-苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯和(1-乙基-3-(二甲基-氨基丙基)碳二亚胺(参见例如,Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,通常第5章,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,NY(1988))。
本发明组合物任选进一步包含药学上可接受的载体。“药学上可接受的”是指与组合物的其它成分相容并对其受者没有有害作用的稀释剂、载体、赋形剂、盐等。通常当组合物如本文所述使用时其包含药学上可接受的载体。可将本发明组合物调配到适合所选择的给药途径的多种形式的药物制剂中,所述给药途径包括适于刺激对抗原的免疫应答的途径。因而,可经由已知途径给予本发明组合物,所述途径包括例如:口服;胃肠外,包括皮内、透皮和皮下;肌内、静脉内、腹膜内等;和局部,例如鼻内、肺内、***内、叶鞘内、子宫内、皮内、透皮和直肠等。预料到可将组合物给予粘膜表面,例如通过给予到鼻或呼吸道粘膜(例如经由喷雾剂或气雾剂),以便刺激粘膜免疫,例如在动物的整个身体中产生分泌性的IgA抗体。
亦可经由缓释或延迟释放埋植剂来给予本发明组合物。已知适用于本发明应用的埋植剂,包括例如Emery和Straub(WO 01/37810(2001))和Emery等(WO 96/01620(1996))中所公开的那些埋植剂。可以以小到足以通过气雾剂或喷雾剂给予的大小来制备埋植剂。埋植剂亦可包括纳米球和微球。
可以以足以治疗本文所述的某些病况的量来给予本发明组合物。存在于本发明组合物中的多肽或全细胞的量可变化。例如,多肽剂量可介于0.01微克(μg)-300mg,通常0.1mg-10mg。当组合物为全细胞制剂时,细胞可以以例如以下浓度存在:102个细菌/ml、103个细菌/ml、104个细菌/ml、105个细菌/ml、106个细菌/ml、107个细菌/ml、108个细菌/ml或109个细菌/ml。对于注射用组合物(例如皮下、肌内等),多肽可以以使得给予的组合物的总体积为0.5ml-5.0ml、通常1.0-2.0ml的量存在于组合物中。当组合物为全细胞制剂时,优选细胞以使得给予的组合物的总体积为0.5ml-5.0ml、通常1.0-2.0ml的量存在于组合物中。给予的量将视多种因素而变化,所述因素包括但不限于所选择的特定多肽、动物的体重、身体状况及年龄和给药途径。因而,包括在既定单位剂型中的多肽的绝对重量可大范围变化,视诸如动物的物种、年龄、体重和身体状况及给药方法等因素而定。所述因素可由本领域技术人员来确定。适于本发明的其它剂量实例揭示于Emery等(美国专利6,027,736)中。
制剂可合宜地在单位剂型中提供,可通过制药领域熟知的方法制备。用药学上可接受的载体制备组合物的方法包括让活性化合物(例如本发明多肽或全细胞)与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。一般而言,通过让活性化合物与液体载体、细碎固体载体或二者均一紧密结合,然后必要时让产物形成所期需的制剂来制备制剂。
包含药学上可接受的载体的组合物亦可包含佐剂。“佐剂”是指这样的作用剂,其可以以非特异性方式起作用以提高对特定抗原的免疫应答,从而潜在地减少任何既定免疫组合物中所需的抗原量,和/或减少为产生足够的针对目的抗原的免疫应答所需的注射频次。佐剂可包括例如IL-1、IL-2、乳化剂、胞壁酰二肽、溴化二甲基双十八烷基铵(DDA)、阿夫立定、氢氧化铝、油类、皂苷、α-生育酚、多糖、乳化石蜡(包括例如可自MVP Laboratories,Ralston,Nebraska购得的商品名为EMULSIGEN的乳化石蜡)、ISA-70、RIBI和本领域已知的其它物质。预期本发明多肽具有免疫调节活性,并且所述多肽可作为直接作为T和/或B细胞激活剂或对特定细胞类型起作用的佐剂,所述特定细胞类型提高各种细胞因子的合成或激活细胞内信号传导途径。预期所述多肽提高免疫应答以增加已有组合物的保护指数。
在另一实施方案中,包含药学上可接受的载体的本发明组合物可包含生物学反应调节剂,例如IL-2、IL-4和/或IL-6、TNF、IFN-α、IFN-γ和影响免疫细胞的其它细胞因子。免疫组合物亦可包含本领域已知的其它组分,例如抗生素、防腐剂、抗氧化剂或螯合剂。
制备方法
本发明亦提供用于获得本文所述多肽的方法。可自微球菌科成员(优选葡萄球菌属,更优选金黄色葡萄球菌)分离本发明多肽和全细胞。多肽可自其分离的其它革兰氏阳性微生物包括棒杆菌属、丹毒丝菌属、分枝杆菌属和丹毒丝菌属。可用于获得本发明多肽和制备全细胞制剂的微生物可自例如美国典型培养物保藏所(ATCC)等保藏处市购。另外,可通过本领域常规和已知的技术易于获得所述微生物。微生物可作为野生分离株源自受感染的动物,并用于获得本发明多肽和/或全细胞制剂,或储存用于将来使用,例如在含有20%甘油的细菌培养基及其它类似培养基中于-20℃到-95℃或-40℃到-50℃冷冻存放。
当本发明多肽自微生物获得时,该微生物可在低金属条件下培养。本文所用短语“低金属条件”,是指含有引起微生物以可检测水平表达金属调节的多肽的量的游离金属的环境,通常为细菌培养基。本文所用短语“高金属条件”是指以下环境,其含有以下量的游离金属,所述量引起微生物不以可检测水平表达一种或多种本文所述的金属调节的多肽,或引起微生物与在低金属条件下金属调节的多肽的表达相比,以降低的水平表达所述多肽。在某些情况下,“高金属条件”可包括富含金属的自然环境和/或没有金属螯合剂的富含金属的培养基中的培养物。与此相反,在某些情况下,“低金属条件”可包括在包括金属螯合剂的培养基中的培养物,如以下更详细描述的。金属为存在于周期表中1到17族的金属(IUPAC记号;在CAS记号中亦分别被称为I-A、II-A、III-B、IV-B、V-B、VI-B、VII-B、VIII、I-B、II-B、III-A、IV-A、V-A、VI-A和VII-A)。优选金属为2到12族的金属,更优选3-12族。甚至更优选金属为铁、锌、铜、镁、镍、钴、锰、钼或硒,最优选铁。
低金属条件通常是向细菌培养基中加入金属螯合化合物、使用含有低量金属的细菌培养基或其组合的结果。当培养基中不存在螯合剂、向培养基中加入金属或其组合时,通常存在高金属条件。金属螯合剂实例包括天然的和合成的化合物。天然化合物实例包括植物酚类化合物,例如黄酮类(flavenoids)。黄酮类实例包括铜螯合剂儿茶素和柚皮素、铁螯合剂杨梅黄酮和槲皮素。合成的铜螯合剂实例包括例如四硫钼酸盐,合成的锌螯合剂实例包括例如N,N,N’,N’-四(2-吡啶基甲基)-乙二胺。合成的铁螯合剂实例包括2,2’-联吡啶(本领域亦称为α,α’-联吡啶)、8-羟基喹啉、乙二胺-二-O-羟基苯基乙酸(EDDHA)、甲磺酸去铁胺(去铁敏(desferol))、转铁蛋白、乳铁蛋白、卵转铁蛋白、生物学铁载体,所述生物学铁载体为例如儿茶酚盐(catecholate)和氧肟酸盐和柠檬酸盐。通用二价阳离子螯合剂实例为CHELEX树脂。优选将2,2’-联吡啶用于螯合铁。通常将2,2’-联吡啶以至少300微克/毫升(μg/ml)、至少600μg/ml或至少900μg/ml的浓度加入到培养基中。高水平的2,2’-联吡啶可为1200μg/ml、1500μg/ml或1800μg/ml。
金黄色葡萄球菌基因组编码三种Fur同源物:Fur、PerR和Zur。尽管Zur和PerR蛋白似乎主要分别参与调节锌稳态和过氧化物应激基因,但业已证明Fur蛋白因响应铁限制而调节数种铁-铁载体摄取***。Fur蛋白在氧化应激抗性及毒力中亦起作用。预期具fur基因突变的革兰氏阳性生物体(优选金黄色葡萄球菌),将导致很多(如果不是全部)本发明金属调节的多肽的组成型表达。可用常规方法产生革兰氏阳性菌(优选金黄色葡萄球菌)中的fur突变,所述常规方法包括例如可用于在革兰氏阳性菌中产生基因敲除突变的转座子、化学或定向诱变。
用于培养微生物的培养基及用于培养微生物的培养基的体积可变化。当评估某微生物产生一种或多种本文所述多肽的能力时,可让该微生物生长在合适的体积中,例如10毫升到1升培养基。当让微生物生长以获得用于例如给予动物的多肽时,可让微生物在发酵罐中生长,使得可分离较大量的多肽。用于在发酵罐中让微生物生长的方法对本领域为常规及已知方法。用于让微生物生长的条件优选包括:金属螯合剂,更优选铁螯合剂,例如2,2’-联吡啶;6.5-7.5的pH,优选6.9-7.1;和37℃的温度。
在本发明一些方面,可在生长后收获微生物。收获包括将微生物浓缩成较小的体积,悬浮在不同于生长培养基的培养基中。用于浓缩微生物的方法在本领域为常规及已知的方法,包括例如过滤或离心。通常将浓缩的微生物悬浮于合适缓冲液中。可使用的缓冲液的实例含有Tris-碱(7.3克/升),pH为8.5。任选最终缓冲液亦使蛋白水解降解最小化。这可通过使最终缓冲液的pH大于8.0、优选至少8.5和/或包括一种或多种蛋白酶抑制剂(例如苯基甲磺酰氟)来实现。任选并优选将浓缩的微生物冷冻在-20℃或更低直到破碎。
当微生物待用作全细胞制剂时,可用常规且已知的方法处理收获的细胞来使细胞失活。或者,当微生物待用来制备本发明多肽时,可用本领域常规且已知的化学、物理或机械方法来破碎微生物,所述方法包括例如煮沸、弗氏压碎器、超声、消化肽聚糖(例如通过用溶菌酶消化)或匀浆。可用于匀浆的合适设备实例为C500-B AVESTIN型匀浆仪(Avestin Inc,Ottawa Canada)。本文所用的“破碎”是指使细胞破裂。可用本领域常规且已知的方法来测定微生物的破碎,包括例如光密度改变。通常微生物经受破碎到当测量1∶100的稀释液时,透光率百分比增加20%。当使用物理或机械方法时,破碎期间通常保持低温,优选在4℃,以进一步使蛋白水解降解最小化。当使用化学方法时,温度可升高以使细胞破碎最优化。亦可将化学、物理及机械方法组合用于溶解微生物细胞壁。本文所用的术语“溶解”,是指让细胞物质(例如多肽、核酸、碳水化合物)溶解到微生物在其中破碎的缓冲液水相中,并形成不可溶的细胞物质聚集物。不希望受理论的限制,认为溶解条件为导致本发明多肽聚集为大至足以允许通过例如离心容易分离的不溶性聚集物。
可通过本领域常规且已知的方法分离包括一种或多种本发明多肽的不溶性聚集物。优选通过离心分离不溶性聚集物。通常可通过100,000x g的离心力来完成多肽例如膜多肽的离心。所述离心力的使用需要使用超速离心机,放大到处理大体积样品通常很难,用这些类型的离心机不经济。本文所述方法提供产生大至足以允许使用连续流离心机的不溶性聚集物,所述离心机为例如T-1 Sharples(Alfa LavalSeparations,Warminster,PA),其可以以250ml/分钟的流速在17psi时以46,000x g-60,000x g的离心力使用。可使用其它大规模的离心机,例如管式、室式及圆盘式结构。这类离心机在本领域中常规使用且已知,可自诸如Pennwalt、Westfalia和alfa-Laval等厂商市购。
用本领域已知的方法针对合适缓冲液洗涤和/或透析最终收获的蛋白质,所述方法例如渗滤、沉淀、疏水色谱、离子交换色谱或亲和色谱或超滤和例如通过在醇中渗滤来洗涤多肽。分离后让多肽悬浮在缓冲液中并储存于低温,例如-20℃或更低。
在其中待制备全细胞制剂的本发明那些方面,微生物生长后,可通过加入足以使培养物中的细胞失活的浓度的作用剂(例如戊二醛、***或甲醛)来杀死微生物。例如,可加入0.3%(体积∶体积)浓度的***。在经过足以使细胞失活的时间后,可通过例如渗滤和/或离心和洗涤来收获细胞。
在其它方面,可重组制备本发明的分离多肽。当重组制备时,可鉴定编码多肽的多核苷酸并克隆到合适的表达宿主,如以下实施例14所述。可让重组的表达宿主生长在合适培养基中,破碎,并按以上所述分离多肽。
使用方法
本发明的一个方面进一步涉及使用本发明组合物的方法。所述方法包括给予动物有效量的本发明组合物。动物可为例如禽类(包括例如鸡或火鸡)、牛科动物(包括例如牛)、山羊类(包括例如山羊)、绵羊类(包括例如绵羊)、猪类(包括例如猪)、野牛类(包括例如水牛)、马类(包括例如马)、伴侣动物(包括例如狗或猫)、鹿科成员(包括例如鹿、麋鹿、驼鹿、北美驯鹿及驯鹿)或人。
在一些方面,所述方法可进一步包括将所述组合物额外给予动物(例如一次或多次加强给予),以加强或刺激再次免疫应答。加强可在第一次给予后的某个时间给予,例如第一次给予组合物后的1-8周,优选2-4周。随后的加强可每年给予1次、2次、3次、4次或更多次。不希望受理论的限制,预期在本发明一些方面无需每年都加强,因为动物会通过与表达以下多肽的微生物接触在野外受到攻击,所述多肽存在于组合物中并具有与给予动物的组合物的多肽上存在的表位同一或结构上相关的表位。
在一方面,本发明涉及用于例如通过诱导动物产生抗体或通过重组技术制备抗体的方法。产生的抗体包括特异性结合至少一种存在于组合物中的多肽的抗体。在本发明该方面,“有效量”为在动物中有效引起抗体产生的量。可如本文所述确定用于测定动物是否已产生特异性结合本发明组合物中存在的多肽的抗体的方法。本发明进一步包括特异性结合本发明多肽的抗体和包含所述抗体的组合物。
所述方法可用于产生特异性结合多肽的抗体,所述多肽由不同于组合物的多肽从其中分离的微生物的微生物表达。本文所用可“特异性结合”多肽的抗体,为与诱导抗体合成的抗原表位互相作用的抗体,或与结构上相关的表位互相作用的抗体。存在于本发明组合物中的至少一些多肽,通常包括在微生物的不同物种和不同属的多肽中保守的表位。因此,预期用源自一种微生物的组合物产生的抗体,结合由其它微生物表达的多肽,并提供针对革兰氏阳性生物体的广谱保护。抗体可特异性结合的革兰氏阳性微生物的实例为:微球菌科,优选葡萄球菌属,更优选金黄色葡萄球菌;链球菌科家族成员,优选酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、***链球菌(Streptococcusuberis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、马链球菌(Streptococcus equi)或停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae);和芽孢杆菌属(Bacillusspp.)、梭菌属(Clostridium spp.)、棒杆菌属、肠球菌属、丹毒丝菌属、利斯特氏菌属、微球菌属和分枝杆菌属、盖球菌属和丹毒丝菌属。因此,可将用本发明多肽组合物产生的抗体用于鉴别并表征本发明多肽,而不管起源、来源和/或获得多肽的方式。
本发明亦涉及利用所述抗体来靶向微生物,所述微生物表达本发明多肽,或表达具有结构上与本发明多肽上存在的表位相关的表位的多肽。化合物可与抗体共价结合,其中所述化合物可为例如毒素。同样,所述化合物可与细菌铁载体共价结合来靶向微生物。可用已知且常规的方法进行本发明抗体或其部分(例如Fab片段)的化学偶联或缀合。
在一个方面,本发明亦涉及治疗动物包括人的感染,所述感染由革兰氏阳性微生物、优选由以下微生物引起:微球菌科成员,优选葡萄球菌属,更优选金黄色葡萄球菌;链球菌科成员,优选酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、***链球菌、牛链球菌、马链球菌或停乳链球菌;芽孢杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、肠球菌属、丹毒丝菌属、盖球菌属、利斯特氏菌属、微球菌属、分枝杆菌属和丹毒丝菌属。本文所用术语“感染”是指动物体内存在革兰氏阳性微生物,其可以有或可以没有临床表现。由没有临床表现的葡萄球菌属成员感染的动物,通常被称为无症状携带者。
治疗感染可为预防性,或作为选择可在动物受微生物感染后开始。预防性治疗(例如在受试者受微生物感染之前开始或在任何感染保持亚临床时开始)本文称为治疗处于感染“风险中”的受试者。本文所用术语“处于风险中”,是指可实际上具有或可实际上不具有所述风险的动物。因而,通常处于微生物感染“风险中”的动物为处于这样的区域的动物,在此区域中动物业已被鉴定为受到微生物感染,和/或很可能会与微生物接触,即使动物尚未表现出受到该微生物感染的任何可检测指征并且不管该动物是否可能荷有亚临床量的微生物。因此,可在动物首次与微生物接触之前、期间或之后给予组合物。在动物首次与微生物接触后开始的治疗,与未给予组合物的动物相比,可导致降低微生物感染的症状和/或临床体征的严重程度,完全去掉微生物和/或降低经历临床明显感染的可能性。所述方法包括将有效量的本发明组合物,给予具有由革兰氏阳性微生物引起的感染或处于具有所述感染风险中的动物,并测定引起感染的微生物的数量是否减少。在本发明该方面,“有效量”为与未给予组合物的动物相比,有效降低动物中特定微生物的数量或降低动物经历临床明显感染可能性的量。用于确定感染是否由革兰氏阳性微生物引起的方法为本领域常规且已知的方法,用于测定感染是否降低的方法亦是如此。
在另一方面,本发明涉及用于治疗动物中的某些病况的一种或多种症状或临床体征的方法,所述病况可由革兰氏阳性微生物感染引起,所述微生物优选微球菌科成员,优选葡萄球菌属,更优选金黄色葡萄球菌;链球菌科成员,优选酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、***链球菌、牛链球菌、马链球菌或停乳链球菌;芽孢杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、肠球菌属、丹毒丝菌属、盖球菌属、利斯特氏菌属、微球菌属、分枝杆菌属和丹毒丝菌属。所述方法包括将有效量的本发明组合物给予具有病况或处于具有病况风险中或者表现出病况的症状和/或临床体征的动物,并测定所述病况的至少一种症状和/或临床体征是否变化,优选降低。由微生物感染引起的病况和/或临床体征的实例包括:例如乳腺炎、败血症、肺炎、脑膜脑炎、***炎、皮炎、生殖道感染、腺疫、子宫炎、围生期疾病、垂体脓肿、关节炎、滑囊炎、***、膀胱炎和肾盂肾炎、干酪性***炎、结核病、溃疡性***炎、利斯特菌病、丹毒、蹄叶炎、炭疽、tyzzer氏病、破伤风、肉毒中毒、肠炎、恶性水肿、羊炭疽、细菌性血红蛋白尿、肠原性毒血、坏死性皮肤损伤和医院内感染。由金黄色葡萄球菌引起的病况实例亦包括例如:马葡萄状菌病、家禽脓性滑膜炎和骨髓炎、猪流产和羔羊的蜱脓毒症。由链球菌属引起的病况实例亦包括例如:喉咙痛、猩红热、脓疱病、溃疡性心内膜炎、风湿热以及人的链球菌性肾小球肾炎后的子***、马和猪的子***以及猪脑膜炎和猪下颌脓肿。
治疗与这些病况有关的症状和/或临床体征可为预防性的,或作为备选可在发展了本文所述病况之后开始。本文所用术语“症状”是指由患者经受并由微生物感染引起的疾病或病况的主观证据。本文所用术语“临床体征”或简单说“体征”,是指由微生物感染引起的疾病或病况的客观证据。与本文提及的病况相关的症状和/或临床体征及对所述症状的评估在本领域为常规并已知。例如在受试者显现由微生物引起的病况的症状或体征之前开始的预防性治疗,本文称为治疗处于发展所述病况“风险中”的受试者。因而,通常处于发展病况“风险中”的动物为存在于这样的区域的动物,其中业已诊断出具有所述病况的动物,和/或动物很可能与引起所述病况的微生物接触,即使动物尚未显现由微生物引起的任何病况的症状或体征。因此,可在出现本文所述病况之前、期间或之后给予组合物。在发展病况后开始的治疗可导致降低所述病况之一的症状的严重程度,或完全除去所述症状。在本发明该方面,“有效量”是以下量,其有效预防疾病症状显现、降低疾病症状的严重程度和/或完全除去症状。实施例5中揭示了对动物中革兰氏阳性微生物感染的成功治疗,这证明在小鼠模型中通过给予本发明组合物,针对由金黄色葡萄球菌引起的疾病提供保护。这些小鼠模型为公认的研究由这些微生物引起的人疾病的模型。实施例10-12中亦揭示对动物中革兰氏阳性微生物感染的成功治疗,这证明给予本发明组合物在牛中针对由金黄色葡萄球菌引起的疾病提供保护。
本发明亦提供用于降低革兰氏阳性微生物定植的方法,所述方法例如封阻革兰氏阳性微生物的附着位点,所述位点包括以下***中的组织:骨骼***(例如骨、软骨、腱和韧带)、肌肉***(例如骨骼肌和平滑肌)、循环***(例如心脏、血管、毛细血管和血液)、神经***(例如脑、脊髓和外周神经)、呼吸***(例如鼻、气管肺、支气管、细支气管扩大、肺泡)、消化***(例如口、唾液腺、食道、肝、胃、大肠和小肠)、******(例如肾、输尿管、膀胱和尿道)、内分泌***(例如下丘脑、垂体、甲状腺、胰腺及肾上腺)、生殖***(例如卵巢、输卵管、子宫、***、乳腺、睾丸和精囊)、淋巴/免疫***(例如淋巴、***和***、单核细胞或白血细胞,例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞,包括T细胞和B细胞);和特殊细胞谱系(例如祖细胞、上皮细胞、干细胞)等等。优选革兰氏阳性微生物为:微球菌科成员,优选葡萄球菌属,更优选金黄色葡萄球菌;链球菌科成员,优选酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、***链球菌、牛链球菌、马链球菌或停乳链球菌;芽孢杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、肠杆菌属、丹毒丝菌属、盖球菌属、利斯特菌属、微球菌属、分枝杆菌属和丹毒丝菌属。
降低在动物中的定植可预防性地进行,或作为备选可在微生物定植动物后开始。预防性治疗(例如在微生物定植于受试者之前或仍然未检测到任何定植时开始)本文称为治疗处于微生物定植“风险中”的受试者。因而,通常处于微生物定植“风险中”的动物为存在于这样的区域的动物,其中动物业已被鉴定为被微生物定植,和/或很可能与所述微生物接触,即使动物尚未显现微生物定植的任何可检测指征并且不管动物是否可能荷有亚定植(subcolonization)数量的微生物。因此,可在动物首次与微生物接触之前、期间或之后给予组合物。在动物首次与微生物接触后开始的治疗可导致与未给予组合物的动物相比,降低所述微生物的定植程度,完全除去微生物,和/或降低微生物定植于动物的可能性。因而,所述方法包括将有效量的本发明组合物给予革兰氏阳性微生物定植的动物或处于受革兰氏阳性微生物定植风险中的动物。在本发明该方面,“有效量”是足以降低动物被微生物定植的量,其中降低定植是指一种或多种以下情况:与未给予组合物的动物相比,降低微生物的定植程度,完全除去微生物,和/或降低微生物定植于动物的可能性。用于评估微生物对动物的定植的方法为本领域常规且已知的方法。例如,可通过测量动物粪便中微生物的存在情况来测定微生物对动物肠道的定植。预期降低微生物对动物的定植将降低微生物对人的传播。
可将本发明组合物用于提供针对细菌感染的主动或被动免疫。通常可将组合物给予动物以提供主动免疫。然而,亦可将组合物用于诱导产生免疫产物,例如抗体,可自产生抗体的动物收集所述抗体,并给予另一动物以提供被动免疫。可自血清、血浆、血液、初乳等收集免疫组分例如抗体来制备组合物(优选含有抗体),用于被动免疫疗法。亦可用已知方法制备包含单克隆抗体和/或抗独特型的抗体组合物。嵌合抗体包括人来源的重链和轻链两者的恒定区及抗原特异性的鼠来源的可变区(Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1984,81(21):6851-5;LoBuglio等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86(11):4220-4;Boulianne等,Nature,1984,312(5995):643-6.)。人源化抗体用人对应物取代鼠恒定区和(可变区的)框架(FR)(Jones等,Nature,1986,321(6069):522-5;Riechmann等,Nature,1988,332(6162):323-7;Verhoeyen等,Science,1988,239(4847):1534-6;Queen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86(24):10029-33;Daugherty等,Nucleic AcidsRes.,1991,19(9):2471-6.)。或者,可使用经遗传改造成产生几乎全部是人来源的抗体的某些小鼠品系;免疫接种后收获这些小鼠的B细胞,并使其永生化用于产生人单克隆抗体(Bruggeman和Taussig,Curr.Opin.Biotechnol.,1997,8(4):455-8;Lonberg和Huszar,Int.Rev.Immunol.,1995;13(1):65-93;Lonberg等,Nature,1994,368:856-9;Taylor等,Nucleic Acids Res.,1992,20:6287-95.)。可将被动抗体组合物及其片段例如scFv、Fab、F(ab’)2或Fv或其其它经修饰的形式,以血清、血浆、血液、初乳等形式给予受者。然而,亦可用已知方法自血清、血浆、血液、初乳等分离抗体,以浓缩或再构成形式用于以后使用,例如灌洗液、浸渍敷料(impregnated dressing)和/或局部作用剂等等。被动免疫制剂可在用于治疗急性全身性疾病或未通过母体初乳接受到足够水平的被动免疫的年轻动物的被动免疫中尤其有利。可用于被动免疫的抗体亦可用于与各种药物或抗生素缀合,所述药物或抗生素可直接靶向在全身或局部感染期间表达本发明多肽或具有在结构上与本发明多肽上存在的表位有关的表位的多肽的细菌。
动物模型尤其是小鼠模型可用于实验性评估本发明组合物。这些小鼠模型为公认用于研究由金黄色葡萄球菌属成员尤其是金黄色葡萄球菌引起的人疾病的模型。在其中葡萄球菌属成员引起动物例如母牛疾病的情况中,可将天然宿主用于实验性评估本发明组合物。
然而,在小鼠模型中的保护不是评估组合物是否可赋予动物抵抗葡萄球菌属感染的保护的唯一方法。过继性免疫应答由两个主要类别组成:体液(抗体)应答及细胞(T细胞)应答。在细菌病原体感染后,感染位点的树突细胞遇到微生物抗原并因响应与特定细菌有关的保守分子模式而产生信号传导分子例如表面受体和细胞因子。这些信号根据病原体的性质形成,理想情况下导致产生保护宿主免患疾病的合适抗体和T细胞应答。尽管一些细菌疾病主要通过抗体功能来控制,但其它的需要T细胞应答或抗体和T细胞应答二者来保护。疫苗生物学的目标是鉴别提供保护的免疫应答,然后设计疫苗以在人中再生一种或多种这些应答。
抗体在提供针对感染的保护方面可具有很多不同功能,例如补体结合、调理作用、中和作用和/或凝集作用。此外,在特定功能方面抗体的一些亚类可能比另一些更好;例如,对于补体结合存在以下人IgG亚类的层次体系:IgG3>IgG1>IgG2>IgG4。
可以以多种方式来研究抗体的免疫学功能。例如,基于分离蛋白质的大小用蛋白质印迹来鉴别抗原特异性的结合,而用标准酶联免疫吸附测定(ELISA)产生关于血清内抗体滴度的量化信息。用抗体表面结合研究来测定血清中的抗体是否能够识别完整细菌表面的抗原,这是抗体是否具有在体内发挥作用的潜能的重要指标。因而,本领域技术人员认识到,抗体结合测定例如蛋白质印迹、ELISA(例如用人抗血清)和/或表面结合,与提供针对葡萄球菌属细菌感染的免疫学活性的特异性结合的抗原正相关(Vytvytska等2002,Proteomics 2:580-590;Kuklin等2006,Infect.Immun.74(4):2215-2223;Dryla等2005,Clin.Diag.Lab.Immunol.12(3):387-398)。然而,本领域技术人员进一步认识到,在诸如蛋白质印迹、ELISA或表面结合测定等测定中缺乏抗体结合,并不意味着所测定的抗原不能提供针对葡萄球菌属感染的免疫学活性(Kim HK等IsdA and IsdB antibodies protect mice againstStaphylococcus aureus abcess formation and lethal challenge(IsdA和IsdB抗体保护小鼠免形成金黄色葡萄球菌脓肿及致命的攻击)。Vaccine(2010),doi:10.1016/j.Vaccine.2010.02.097)。
图202显示康复期小鼠血清至少结合:重组产生的MntC(SEQ IDNO:419)、重组产生的SYN2(SEQ ID NO:386)、重组产生的SirA(SEQID NO:375)和重组产生的Opp1A(SEQ ID NO:364),这表明每一种被结合的重组产生的多肽可诱导针对葡萄球菌属感染的免疫学活性。
图204显示康复期人血清结合:重组产生的PflB(SEQ IDNO:353)、重组产生的Opp1A(SEQ ID NO:364)、重组产生的SirA(SEQID NO:375)、重组产生的SYN2(SEQ ID NO:386)、重组产生的FhuD(SEQ ID NO:397)、重组产生的SYN1(SEQ ID NO:408)和重组产生的MntC(SEQ ID NO:419),这表明每一种重组产生的多肽可诱导针对葡萄球菌属细菌的免疫学活性。
图205显示针对重组产生的FhuD(SEQ ID NO:397)、重组产生的Opp1A(SEQ ID NO:364)和重组产生的PflB(SEQ ID NO:353)产生的抗体,与葡萄球菌属细胞表面结合,这表明结合细胞的抗体的多肽靶标中的每一个可诱导针对葡萄球菌属感染的免疫学活性。
诸如调理吞噬测定(OPA)等技术可用于研究抗体功能,在调理吞噬测定中,抗体和结合补体的细菌与人或小鼠的吞噬细胞结合以测定细菌杀伤水平。小鼠模型中阳性OPA结果与疫苗诱导的保护相关(Stranger-Jones等2006,Proc.Natl.Acad.Sci.103(45):16942-16947)。可将相似的氧化爆发测定(oxidative burst assay)用于评估在与抗体及结合补体的细菌相互作用后由新鲜人或小鼠嗜中性粒细胞的活性氧类别(ROS)水平。
在一些情况下,人们可测定候选多肽拥有细胞介导的免疫学活性,因此,候选多肽可在不诱导产生抗体的情况下表现出免疫学活性。(Spellberg等2008,Infect.Immun.76(10):4575-4580)。细胞毒性或CD8T细胞主要直接通过各种效应机制杀死感染的细胞,而辅助CD4T细胞以细胞因子的方式起提供重要信号转导的作用。可基于它们产生的细胞因子将这些T细胞种类进一步再分,不同亚类对不同细菌病原体有效。通常通过用流式细胞术评估其表型来研究T细胞,其中用抗体来显现特定表面标记的水平,所述表面标记能够将T细胞分类为例如新近激活的CD4+T细胞、记忆CD8+T细胞等。另外,可通过从淋巴组织中分离T细胞,并用同源抗原刺激它们,来研究T细胞的细胞因子及其它产物。在抗原刺激后,T细胞产生细胞因子,其可通过例如与流式细胞术联合的细胞内细胞因子染色来显现,或通过收集细胞上清液并用Luminex珠粒技术来同时测量15-25种细胞因子来显现。
图206显示组合物(rSIRP7)诱导与由SIRP提取物诱导的细胞因子概况相似的细胞因子概况,业已证明所述SIRP提取物提供针对葡萄球菌属感染的免疫学活性,所述组合物包含重组产生的PflB(SEQID NO:353)、重组产生的Opp1A(SEQ ID NO:364)、重组产生的SirA(SEQ ID NO:375)、重组产生的SYN2(SEQ ID NO:386)、重组产生的FhuD(SEQ ID NO:397)、重组产生的SYN1(SEQ ID NO:408)和重组产生的MntC(SEQ ID NO:419)。rSIRP7组合物诱导产生例如IL-2、IL-6、IL-17、IFN-γ、MIP-2和GM-CSF。
因而,本领域一般人员应认识到,除了小鼠模型外,与本文所述方法相称的免疫学活性可与以下任何一种或多种相关:蛋白质印迹数据,其显示来自与葡萄球菌属接触的动物的血清含有与候选多肽特异性结合的抗体;细胞表面结合测定,所述测定显示与候选多肽特异性结合的抗体与葡萄球菌属特异性结合;调理吞噬数据;和细胞因子诱导。
本发明另一方面提供用于检测特异性结合本发明多肽的抗体的方法。这些方法可用于例如:检测动物是否具有特异性结合本发明多肽的抗体;和诊断动物是否可能有由表达本文所述多肽或表达与本文所述多肽共享表位的多肽的微生物引起的病况。所述诊断***可呈试剂盒形式。所述方法包括让抗体与包括本发明多肽的制剂接触以产生混合物。所述抗体可存在于生物学样品中,例如血液、牛奶或初乳。所述方法进一步包括在允许抗体特异性结合多肽以形成多肽:抗体复合物的条件下孵育所述混合物。本文所用术语“多肽:抗体复合物”是指抗体特异性结合多肽时产生的复合物。包括本发明多肽的制剂亦可包括提供适合形成多肽:抗体复合物的条件的试剂,例如缓冲液。然后检测多肽:抗体复合物。抗体检测为本领域已知,可包括例如免疫荧光或过氧化物酶。用于检测特异性结合本发明多肽的抗体的存在情况的方法,可在业已用于检测抗体的各种形式中使用,所述形式包括放射免疫测定和酶联免疫吸附测定。
本发明亦提供用于检测特异性结合本发明多肽的抗体的试剂盒。所检测的抗体可自怀疑具有由革兰氏阳性微生物引起的感染的动物获得,所述革兰氏阳性微生物更优选为微球菌科成员,优选葡萄球菌属,更优选金黄色葡萄球菌;链球菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、肠杆菌属、丹毒丝菌属、盖球菌属、利斯特氏菌属、微球菌属、分枝杆菌属和丹毒丝菌属。
试剂盒在合适包装材料中以足以用于至少一次测定的量包括至少一种本发明多肽(例如一种、至少两种、至少三种等)。任选还包括实施本发明所需的其它试剂,例如缓冲液和溶液。例如,试剂盒亦可包括允许检测特异性结合本发明多肽的抗体的试剂,例如设计成特异性结合自动物获得的抗体的可检测标记的第二抗体。通常亦包括包装的多肽的使用说明书。本文所用短语“包装材料”是指用于收容试剂盒内容物的一种或多种物理结构。通常用熟知方法来构造包装材料,以提供无菌无污染的环境。包装材料可具有标记,其指出该多肽可用于检测特异性结合本发明多肽的抗体。另外,包装材料含有指出怎样使用试剂盒内的物质来检测抗体的说明书。本文所用术语“包装”是指能够将多肽及其它试剂(例如第二抗体)保存在固定界限内的容器,例如玻璃、塑料、纸、铝箔等等。因而,例如,包装可为附加微克量的多肽的微量滴定板孔。包装亦可含有第二抗体。“使用说明书”通常包括明确表达,其阐述:试剂浓度或至少一种测定方法参数,例如待混合的试剂和样品的相对量、试剂/样品混合物的保持时期、温度、缓冲条件等等。
本发明由以下实施例阐明。应该理解,应按照本文所提出的本发明的范围和精神广泛地理解特定实施例、材料、量和程序。
实施例
实施例1
铁调节蛋白的制备
实验室规模
在小鼠中评估组合物针对毒力攻击的功效,所述组合物源自金黄色葡萄球菌的不同菌株,包含在铁受限和/或金属离子螯合的其它程度下表达的新型蛋白质。通过收集以下参数的数据来评估组合物的功效:(1)每种组合物在小鼠中提供针对活毒攻击的同源及异源保护的功效;(2)每种组合物降低坏死性皮肤损伤的功效;和(3)源自生长在富铁及贫铁条件中的葡萄球菌的组合物提供保护的功效。
在本研究中评估的金黄色葡萄球菌菌株来自三种动物物种:禽、人和牛。禽分离株SAAV1是野生分离株,其源自有高度骨髓炎和滑膜炎的患病火鸡群。牛分离株(菌株1477和菌株2176)分离自具有高临床乳腺炎发病率的两个不同商业乳畜群。人分离株获自ATCC(菌株19636),源自具有临床骨髓炎的患者。
通过将合适分离株接种到含有300μM 2,2-联吡啶(Sigma-AldrichSt.Louis,MO)的200ml的胰蛋白酶大豆肉汤(Tryptic Soy Broth)(TSB,Difco Laboratories,Detroit,MI)中,来制备各分离株的主种子储液。让培养物在37℃生长6小时,同时以200rpm搅拌,然后通过以10,000x g离心收集。将细菌沉淀重新悬浮到含有20%甘油的100ml TSB肉汤中,并无菌分发到2ml深低温小瓶(每小瓶1ml)中,储存在-90℃直到使用。
将每种主种子储液扩繁为工作种子。将一小瓶的每种主种子分离株接种到含有1000μM 2,2-联吡啶(Sigma-Aldrich St.Louis,MO)的200ml的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB,Difco Laboratories,Detroit,MI)中。让培养物在37℃生长6小时,同时以200rpm搅拌,然后通过以10,000x g离心收集。将细菌沉淀重新悬浮到含有20%甘油的100ml TSB肉汤中,并无菌分发到2ml深低温小瓶(每小瓶1ml)中,储存在-90℃直到使用。将工作种子用于生产富含铁调节的膜蛋白(包括铁调节的膜蛋白)的组合物。
让所有菌株适应于生长在高度贫铁的培养基(即含有极低水平的游离铁的培养基)中。这通过在含有渐增浓度的2,2-联吡啶(从300-1600μM)的TSB中传代培养细菌来实现。
如下从细菌制备蛋白质。通过传代培养到25ml的贫铁培养基(含有1000μM 2,2’-联吡啶)和富铁培养基中,然后在37℃孵育同时以400rpm振荡,自冷冻的工作种子储液生长细菌。孵育12小时后,将5ml每种培养物转移到在37℃预孵育的500ml贫铁或富铁培养基中。让培养物在37℃孵育8小时,同时以100rpm振荡,然后通过以10,000x g离心20分钟来沉淀细胞。将细菌沉淀重新悬浮在100ml无菌生理盐水中,并以10,000x g离心10分钟。然后将沉淀重新悬浮在45ml的Tris-缓冲的盐水,pH 7.2(TBS;25mM Tris、150mM NaCl)中,将得到的细菌悬浮液以9-ml等份样分发到5个单独的管中。将1毫升含有50单位溶葡萄球菌素(Sigma,St.Louis,MO)的TBS加入到每管中,得到5单位/ml的终体积。在以200rpm振荡的同时于37℃孵育30分钟后,将1ml含有0.1mg溶菌酶(Sigma)的TBS加入到各管中。然后让细菌悬浮液再孵育45分钟,同时以200rpm振荡。接着在4℃以3050x g让悬浮液离心12分钟,沉淀大的细胞碎片。通过在不扰动沉淀的情况下抽吸收集上清液。然后以39,000x g让上清液离心2.5小时。将得到的含有蛋白质的沉淀重新悬浮在200μL没有盐水的Tris缓冲液,pH 7.2中。将每种分离株的蛋白质溶液合并为1ml总体积,储存在-90℃。
在使用4%浓缩胶和10%分离胶SDS-PAGE凝胶上,让源自金黄色葡萄球菌的富含蛋白的提取物按大小分级分离。通过让10μl样品与30μl的SDS还原样品缓冲液(62.5mM Tris-HCL pH 6.8,20%甘油,2%SDS,5%β-分巯基乙醇)合并并煮沸4分钟,来制备用于电泳的样品。用Protein II xi cell电源(BioRad Laboratories,Richmond,CA,1000/500型)在4℃让样品以18mA恒流电泳5小时。利用GS-800密度计(BioRad)用大范围的分子量标记作为参考标准(BioRad),来估测在SDS-PAGE凝胶上肉眼可见的每一单独蛋白质的分子量。
来自在1600μM联吡啶存在下生长时的每一种分离株的蛋白质的SDS-PAGE图案,显示与在300μM联吡啶存在下生长时的同一菌株相比极为不同的蛋白质表达模式。例如,当在300μM联吡啶中生长时,分离株SAAV1产生90kDa、84kDa、72kDa、66kDa、36kDa、32kDa和22kDa的金属调节的蛋白质,而在1600μM联吡啶中生长时,产生87.73kDa、54.53kDa、38.42kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa和33.0kDa的金属调节的蛋白质。同样,当在300μM联吡啶中生长时,分离株19636产生42kDa和36kDa的蛋白质,而在1600μM联吡啶中生长时,产生87.73kDa、54.53kDa、38.42kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa和33.0kDa的金属调节的蛋白质。所有的条件(包括在富铁培养基中生长)都导致以下大概非金属调节的蛋白质的表达:150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa和40kDa。
此外,不同金黄色葡萄球菌菌株在1600μM联吡啶中的生长产生相似的蛋白质表达模式。来自禽分离株(SAAV1)的富含铁调节的膜蛋白质的组合物包含分子量为87.73kDa、54.53kDa、38.42kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa和33.0kDa的蛋白质。来自ATCC分离株19636的蛋白质的分子量基本上与来自禽分离株的相同。当两种牛分离株在1600μM 2,2-联吡啶下生长时,对于大部分蛋白质(87.73kDa、54.53kDa、37.7kDa、35.70kDa、34.91kDa和33.0kDa)都表达与禽和ATCC分离株相似的带型分布。然而,两种牛分离株都不产生在禽和ATCC分离株中观察到的38.42kDa的蛋白质,而牛分离株都表达在禽和ATCC菌株中未观察到的三种蛋白质(80.46kDa、65.08kDa和31.83kDa)(参见图1和表7)。所有条件都导致表达以下非金属调节的蛋白质:150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa和40kDa。
表7.自金黄色葡萄球菌分离株获得的金属调节的多肽的分子量
令人感兴趣的是,通过SDS-PAGE检查,在用溶葡萄球菌素/溶菌酶处理细菌后的澄清上清液和细菌沉淀之间,没有蛋白质概况的差别。提取的细菌沉淀和上清液二者通过SDS-PAGE检查都具有准确相同的蛋白质概况。当用AVESTIN匀浆仪以30,000psi破碎细菌细胞时亦看到这种相同的观察结果。在慢速离心后得到的细菌沉淀,与以30,000x g在4℃高速离心2.0小时后的澄清上清液相比,在其蛋白质概况方面相同。
实施例2
源自金黄色葡萄球菌的免疫组合物的制备
将如实施例1所述制备的来自生长在贫铁条件中的人分离株ATCC 19636和牛分离株1477的蛋白质,用于配制两种疫苗组合物。来自ATCC分离株的蛋白质具有87.73kDa、54.53kDa、38.42kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa和33.0kDa的分子量,而牛分离株表达的蛋白质具有87.73kDa、80.46kDa、65.08kDa、54.53kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa、33.0kDa和31.83的分子量。每一种组合物亦含有以下非金属调节的蛋白质:150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa,41kDa和40kDa。通过以下方法来从两种菌株制备储备疫苗:用IKA Ultra Turrax T-50匀浆容器(IKA,Cincinnati,OH)让每一种水性蛋白质悬浮液(500μg总蛋白质/ml)乳化到市购佐剂(EMULSIGEN,MVP Laboratories,Ralston,Nebraska)中,得到在0.1ml注射体积中50μg总蛋白质的最终剂量,其含22.5%体积/体积的佐剂浓度。作为对照疫苗接种,如实施例1所述从生长在富铁条件(补充300μM氯化铁的TSB)中的牛分离株1477制备蛋白质组合物。通过在以上方案中用生理盐水取代水性蛋白质悬浮液来制备安慰剂疫苗。
实施例3
小鼠疫苗接种
将重16-22克的自Harlan繁殖实验室(Indianapolis,IN)获得的70只(N=70)雌性CF-1小鼠,平均分为7个组别(10只小鼠/组)。将小鼠安置在聚碳酸酯小鼠笼(Ancore Corporation,Bellmore,NY)中。一个笼用于一个治疗组,给所有小鼠随意供应食物和水。如下用0.1ml的合适组合物以14天间隔对所有小鼠腹膜内疫苗接种2次:
组别-1:安慰剂疫苗接种的
组别-2:用在铁受限下表达的ATCC 19636蛋白质疫苗接种的
组别-3:安慰剂疫苗接种的
组别-4:用在铁受限下表达的牛1477蛋白质疫苗接种的
组别-5:用在铁受限下表达的牛1477蛋白质疫苗接种的
组别-6:用在铁受限下表达的ATCC 19636蛋白质疫苗接种的
组别-7:牛1477 FeCl3疫苗接种的,其中“牛1477 FeCl3”是指从在补充300μM氯化铁的TSB中生长的牛1477获得的蛋白质。
实施例4
攻击生物体的制备
将先前所述的金黄色葡萄球菌菌株ATCC 19636和菌株1477用作攻击生物体。简言之,将来自冷冻储液(先前所述的)的分离株划线到血液琼脂板上,在37℃培养18小时。将每一分离株的单个菌落传代培养到含有1600μM的2,2′联吡啶的50ml胰蛋白酶大豆肉汤(Difco)中。让培养物在37℃培养6小时,同时以200rpm旋转振荡,然后在4℃以10,000x g离心10分钟以沉淀细菌。通过在4℃于TBS中离心洗涤细菌沉淀两次。将最后的沉淀重新悬浮于TBS中,达在体积大约25ml的TBS中在562nm处的光密度为42%透光率(T),用于攻击。在临攻击前,将1ml这些细菌悬浮液系列稀释,并平板接种到琼脂上,以计数每小鼠剂量的菌落形成单位(CFU)数。
实施例5
攻击
在第二次疫苗接种14天后,用0.1ml合适生物体在颈背部皮下攻击所有组别(1-7)的小鼠。如下攻击7个组别的小鼠:
组别-1(安慰剂疫苗接种的):用ATCC 19636攻击
组别-2(用在铁受限下表达的ATCC 19636蛋白质疫苗接种的):用ATCC 19636攻击
组别-3(安慰剂疫苗接种的):用牛1477攻击
组别-4(疫苗接种在铁受限下表达的牛1477蛋白质):用牛1477攻击
组别-5(疫苗接种在铁受限下表达的牛1477蛋白质):用ATCC19636攻击
组别-6(疫苗接种在铁受限下表达的ATCC 19636蛋白质):用牛1477攻击
组别-7(牛1477FeCl3疫苗接种的):用牛1477攻击
如通过实施例4所述计数方案所测定,用于攻击的金黄色葡萄球菌19636的浓度为每小鼠剂量1.35x108个菌落CFU,用于攻击的金黄色葡萄球菌1477的浓度为每小鼠剂量1.65x108CFU。攻击后7天内每日记录发病率、死亡率及大体病理学。
当比较用ATCC 19636分离株攻击的小鼠时,70%的安慰剂疫苗接种的组别1的小鼠在攻击的7天内死亡(表8和图2)。这证明在给予的剂量水平时菌株19636引起小鼠高死亡率。与组别1的小鼠形成对照,组别2中只有10%的小鼠在攻击后7天内死亡。这些结果表明用菌株19636攻击的小鼠明显受到用19636组合物疫苗接种的保护(p=0.020,费希尔精确检验)。而且,死亡时间数据的Kaplan-Meier分析表明,疫苗提供针对同源攻击的显著(p=0.0042,时序检验(logranktest))保护(图3)。另外,组别5中只有20%小鼠在攻击的7天内死亡,这表明牛1477组合物提供针对用ATCC 19636菌株攻击的明显保护(p=0.015,死亡率的时序检验)。当通过Kaplan-Meier存活曲线及时序检验来分析数据(图4)时,确定针对死亡率的保护是显著的(p=0.015,死亡率的时序检验),这表明源自菌株1477的疫苗组合物提供针对用菌株19636攻击的异源保护。
表8.在用金黄色葡萄球菌(人ATCC分离株19636和牛分离株1477)攻击后疫苗接种和不疫苗接种小鼠的死亡率
*组别-1,(安慰剂疫苗接种/用ATCC 19636攻击)
*组别-2(用在铁受限下表达的ATCC 19636蛋白质疫苗接种/用ATCC 19636攻击)
*组别-3(安慰剂疫苗接种/用牛1477攻击)
*组别-4(用在铁受限下表达的牛1477蛋白质疫苗接种/用牛1477攻击)
*组别-5(用在铁受限下表达的牛1477蛋白质疫苗接种/用ATCC 19636攻击)
*组别-6(用在铁受限下表达的ATCC 19636蛋白质疫苗接种/用牛1477攻击)
*组别-7(牛1477FeCl3疫苗接种/用牛1477攻击)
当比较用牛1477分离株攻击的小鼠时,只有20%安慰剂疫苗接种组(组别3)中的小鼠在攻击的7天内死亡。然而,用牛1477分离株的攻击对组别3的存活小鼠中的6只(75%)引发出现坏死性皮肤损伤。测量了这些损伤,在存活小鼠中损伤的平均大小为18.5mm(表9)。与此相反,20%的组别4小鼠在攻击的7天内死亡,但只有3只(38%)存活小鼠形成损伤(平均直径2.7mm)。这些结果表明,牛1477组合物在用牛菌株1477攻击的小鼠中,针对形成损伤提供显著同源保护(p=0.009,斯氏t检验)。另外,用ATCC 19636组合物疫苗接种保护免受用菌株1477的攻击,因为组别6中没有小鼠死亡,并且只有3只(30%)小鼠形成了皮肤损伤(平均直径3.7mm)。综合起来看,在组别5和组别6小鼠中降低死亡率和/或损伤形成,证明源自19636和1477菌株的组合物的显著交叉保护特性(p=0.012,基于损伤大小的斯氏t检验)。在证明与非铁调节的蛋白质相比的组合物的功效中,组别7中的20%的小鼠死亡,4只存活者形成了皮肤损伤(平均直径15.8mm)。组别7的小鼠表明通过用1477分离株蛋白质疫苗接种有某种程度的保护,因为与安慰剂疫苗接种的组别3相比,形成损伤的小鼠更少。然而,在组别7的小鼠中观察到的皮肤损伤比在组别4的小鼠中的损伤更频繁且直径更大,这表明相对于分离自在富铁条件下生长的细胞的蛋白质,分离自在铁限定下生长的细菌的蛋白质针对同一攻击提供更优保护。
在小鼠攻击研究中观察到的蛋白质的交叉保护特性,受到来自实施例1所述的金黄色葡萄球菌菌株的相似分子量的蛋白质(图1)的支持。尽管来自牛来源分离株的蛋白质的SDS-PAGE概况有显著差别,尤其是缺乏38.4kDa蛋白质及存在3种另外的蛋白质,但来自1477和ATCC 19636两种菌株的蛋白质都引发异源保护。这些结果表明,19636和1477菌株之间的相似蛋白质很可能是造成在组别5及组别6中所观察到的交叉保护的原因。相比之下,来自在贫铁和富铁条件下生长的菌株1477的蛋白质概况明显不同。与在富铁条件下分离的蛋白质相比,在贫铁条件下分离的那些蛋白质更具有保护性,这通过与组别7的小鼠相比组别4的小鼠中损伤形成减少得到证明。
表9.用金黄色葡萄球菌(ATCC分离株19636和/或牛分离株1477)攻击后7天,小鼠中坏死性损伤的诱导
*组别-1(安慰剂疫苗接种/ATCC 19636攻击)
*组别-2(用在铁受限下表达的ATCC 19636蛋白质疫苗接种/ATCC 19636攻击)
*组别-3(安慰剂疫苗接种/牛1477攻击)
*组别-4(用在铁受限下表达的牛1477蛋白质疫苗接种/牛1477攻击)
*组别-5(用在铁受限下表达的牛1477蛋白质疫苗接种/ATCC 19636攻击)
*组别-6(用在铁受限下表达的ATCC 19636蛋白质疫苗接种/牛1477攻击)
*组别-7(牛1477FeCl3疫苗接种/牛1477攻击)
实施例6
在哺乳动物中,业已显示对组织损伤或细菌感染的响应导致急性炎性反应。该反应增加毛细管渗透性和吞噬细胞浸润,这产生公认为炎症的临床体征;肿胀、发热、疼痛及发红;若不加以控制,这可导致死亡。体液因子的激活及细胞因子的释放介导统称为急性期蛋白应答的全身性事件,从而导致生理学及生物化学事件级联。该应答的持续时间直接与损伤的严重程度及全身感染的量级相关。业已充分证明在细菌性脓毒症、大外科手术、烧伤及其它身体创伤期间,血清中多种金属离子例如铁、铜和锌的浓度有改变。例如,在感染的急性期,铁和锌的血浆水平降低,铜的增加。血清中这些痕量金属离子的改变可直接影响任何细菌感染的严重性或进展。
在本研究中,我们检查了在各种金属离子限制条件下金黄色葡萄球菌蛋白质的表达,以便模拟可在全身入侵期间表达的新型蛋白质的表达。在本研究中评估的金黄色葡萄球菌菌株,源自三种不同动物物种的临床样品:禽(菌株SAAV1)、人(菌株19636)和牛(菌株1477和2176)。简言之,从200ml胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)的主种子储液中制备每一分离株的培养物。每种培养物在37℃生长6小时,同时以200rpm搅拌。将10ml每种培养物转移到含有以下4种金属离子螯合剂之一的500ml贫乏TSB中:2,2-联吡啶(Dp)、2-吡啶基甲基-乙二胺(TPEN)、儿茶素和柚皮素(所有的都自Sigma,St.Louis,MO获得)。另外,每种培养物亦在含有以300μM浓度制备的氯化铁、氯化锌和/或氯化铜的富阳离子培养基中生长。使用以下浓度的金属离子螯合剂:2,2-联吡啶(800μM)、300μM儿茶素和柚皮素和100μM浓度的2-吡啶基甲基-乙二胺。培养物与每种螯合剂生长8小时,在该时间点将培养物第二次传代培养,达另外的12小时。将每一种培养物以12小时间隔连续传代三次。在第三次传代结束时,通过以10,000x g离心20分钟来收获每种培养物。通过在4℃以10,000x g离心并重新悬浮在20ml Tris-缓冲的盐水(pH 7.2)中来将每种培养物洗涤2次。
将每种细菌沉淀重新悬浮在45ml的Tris-缓冲的盐水,pH 7.2(25mM Tris和150mM NaCl)中,将得到的细菌悬浮液以9-ml等份样分发到5个单独管中,一共20支管。将含有50单位溶葡萄球菌素(Sigma,St.Louis,MO)的1毫升TBS加入到各管中,得到5单位/ml的最终浓度。在37℃培养30分钟(同时以200rpm振荡)后,将含有0.1mg溶菌酶(Sigma)的1ml TBS加入各管中。然后让细菌悬浮液再培养45分钟,同时以200rpm振荡。接着以3050x g在4℃将悬浮液离心12分钟,以沉淀大细胞碎片。通过在不扰乱沉淀的情况下抽吸来收集上清液。然后以39,000x g将上清液离心2.5小时。将得到的富含金属调节的膜蛋白的沉淀重新悬浮在200μL Tris缓冲液,pH 7.2中。将每种分离株的蛋白质溶液合并为1ml的总体积,储存在-90℃。
自生长在贫铁、贫锌和贫铜条件下的SAAV1、19636、1477和2176金黄色葡萄球菌分离株获得的蛋白质包括金属调节的多肽。
在利用4%浓缩胶和10%分离胶的SDS-PAGE凝胶上让源自每种分离株的细胞提取物按大小分级分离。通过让10μl样品与30μl的SDS还原样品缓冲液(62.5mM Tris-HCL pH 6.8,20%甘油,2%SDS,5%β-巯基乙醇)合并并煮沸4分钟,来制备用于电泳的样品。用ProteinII xi cell电源(BioRad Laboratories,Richmond,CA,1000/500型)在4℃让样品以18mA恒流电泳5小时。
所有分离株在锌和/或铜螯合下产生的蛋白质的SDS-PAGE图案显示独特的带型,其当在与存在2,2’-联吡啶的在铁受限下生长的同一分离株比较时不同。例如,当19636分离株在铁受限下或在螯合剂2,2’-联吡啶存在下生长时,在87.73kDa、54.53kDa、38.42kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa和33.0kDa区域处表达独特的铁调节的蛋白。当分离株在存在氯化铁下生长时,这些蛋白质下调。然而,当同样的分离株在锌和或铜螯合剂存在下生长时,相对于在铁受限下表达的蛋白质表达了新型蛋白质子集;所述新型的蛋白质具有大约115kDa、88kDa、80kDa、71kDa、69kDa、35kDa、30kDa、29kDa和27kDa的分子量。另外,在铁受限或铜受限条件下表达87.73kDa蛋白质,但当培养物为锌受限的时候不表达。当在锌受限和/或铜受限下生长时,似乎下调了在铁受限下表达的蛋白质,但不完全停止表达,如当分离株在氯化铁中生长时所观察的。
似乎当生物体在铜受限和/或锌受限下生长时有新型蛋白质表达,该蛋白质在同一分离株在铁受限条件下生长时不表达。因为生物体使用过渡金属来构建催化各种生物化学反应的酶,在全身感染期间金属离子可在微生物存活中起关键作用。或许因为这一原因,在脓毒症期间这些过渡金属的可利用性瞬时降低,这使得不能获得它们来用于生物体生长。这些新型蛋白质可极好地提高在铁受限下产生的现有组合物的保护性功效,因为它们亦可由细菌在全身入侵期间经历的金属离子受限下表达。
实施例7
亦可在大规模商业条件下生产本发明组合物
发酵
将实施例1所述的工作种子深低温小瓶(2ml,109CFU/ml)用于接种500ml胰蛋白酶大豆肉汤(TSB),所述TSB没有右旋糖(Difco),被预热到37℃并且含有0.125g/l 2,2-联吡啶(Sigma)、2.7克BiTek酵母提取物(Difco)和甘油(3%体积/体积)。让培养物在37℃培养12小时,同时以200rpm搅拌,在12小时时将其用于接种2升上述培养基,并使其在37℃再生长4小时。将该培养物用于接种20-升VIRTIS台式发酵罐(Virtis,Gardiner,NY),其装有13升上述培养基。通过用50%NaOH和10%HCL自动滴定将pH始终保持在6.9-7.1。调节搅拌速度为400rev/分钟,在37℃以11升空气/分钟为培养物通气。通过加入11ml去泡剂(Mazu DF 204 Chem/Serv,Minneapolis,MN)来自动控制发泡。让培养物在这些条件连续生长4小时,此时将其无菌操作泵入到150-升发酵罐(W.B.Moore,Easton,PA)中。该发酵罐装有不含右旋糖的120升胰蛋白酶大豆肉汤(3,600.0克)、BiTek酵母提取物(600克)、甘油(3,600ml)、2,2-联吡啶(3.0克)和Mazu DF 204去泡剂(60ml)。发酵参数如下:通过逐渐增加搅动到220rev/分钟、喷入60升空气/分钟和每平方英寸10磅(psi)的反压,保持溶解氧(DO)在30%+/-10%。通过用50%NaOH和10%HCL自动滴定将pH始终保持在6.9-7.1,温度保持在37℃。在发酵4.5小时(OD540 8-9)时,将培养物转到1,500升New Brunswick Scientific发酵罐IF-15000中,其装有不含右旋糖的1200升胰蛋白酶大豆肉汤(36,000克)、BiTek酵母提取物(6,000克)、甘油(36,000ml)、2,2-联吡啶(30.0克)和Mazu DF 204去泡剂(600ml)。发酵参数如下:通过逐渐增加搅动到300rev/分钟、喷入300-1100升空气/分钟和每平方英寸5磅(psi)反压,保持溶解氧(DO)在60%+/-10%。随着发酵进展,加入0-90升/分钟补充氧气,以帮助控制溶解氧。通过用50%NaOH和10%HCL自动滴定将pH始终保持在6.9-7.4,温度保持在37℃。
在接种大发酵罐大约5小时后,通过加入70升含有不含右旋糖的18,000克TSB、3,000克酵母提取物、30.0克2,2-联吡啶和18,000ml甘油的培养基,向培养物补充另外的营养物。调整加料速率到大约28升/小时,同时加快搅动。在结束加料时,让发酵再继续4小时,此时通过将发酵罐温度降低到18℃来终止发酵(以1∶100稀释的OD54035-40)。
收获
用Pall Filtron切向流Maxiset-25(Pall Filtron Corporation,Northboro,MA)浓缩并洗涤细菌发酵物,所述Pall Filtron切向流Maxiset-25配有3个连接到Waukesha U-60型加料泵(WaukeshaCherry-Burrell,Delevan,WI)的30ft2 Alpha 300-K明渠滤器,货号AS300C5,(Pall Filtron)。用30psi的过滤器进口压力和5-6psi的渗余物压力将1250升原始培养物体积减少到50升(2.5升/分钟)。用Tris-缓冲的盐水(pH 8.5)将细菌渗余物回调到150升,然后再次浓缩到50升,以帮助除去任何污染的外来蛋白质(例如胞外蛋白质),包括分泌性毒素和蛋白酶。tris-缓冲的盐水的升高的pH,帮助防止可在全细胞悬浮液储存期间发生的很多蛋白水解降解。可用蛋白酶抑制剂来取代升高pH,或除了升高pH外,还可使用蛋白酶抑制剂。在200-升罐中用底部安置的磁力驱动的混合器彻底混合渗余物。然后将渗余物无菌分发(3.5升)到无菌的4升2122号Nalgene容器中,置于-20℃冷藏室储存,用作制备中的转换点,或可进一步处理。通过将发酵培养物和最终收获物的30ml样品离心来计算沉淀质量。简言之,以39,000x g让预称重的50ml Nalgene锥形管在用JA-21转头的Beckman J2-21离心机(Beckman Instruments,Palo Alto CA)中离心90分钟。离心结束时将上清液倒掉,再次称重管。计算每一阶段沉淀的质量。发酵过程产生大约60千克的湿沉淀质量。
破碎
将80千克的Tris-缓冲的盐水pH 8.5中的细菌细胞浆液无菌转移到1000升原地带蒸汽夹套的处理罐(Lee,259LU型)中,所述处理罐具有顶部安装的混合器(Eastern,TME-1/2型,EMI Incorporated,Clinton,CT),含有900升TBS pH 8.5。将大量细菌悬浮液冷却到4℃,且以200rpm连续混合18小时,此时通过匀浆来破碎。简言之,让含有细菌悬浮液的1000升罐与C-500-B型AVESTIN匀浆仪(Avestin Inc,Ottawa Canda)连接。将第二个1000升夹套处理罐(空的)与匀浆仪连接,以使处理罐中的流体可经由匀浆仪流到空罐中并再次流回来,这使得可进行多次匀浆通过同时仍然保持封闭***。匀浆期间的温度保持在4℃。在开始第一次通过时,经由Waukesha 10DO型泵(Waukesha)通到匀浆仪(500加仑/小时),以70psi使流体循环,同时将匀浆仪压力调整到30,000psi。在首次通过之前,从匀浆仪取出两个匀浆前的样品,以建立用于确定破碎程度和监测pH的基线。通过与非匀浆样品相比的透光率(以1∶100稀释的在540nm处的%T)来监测破碎程度。将通过匀浆仪的通过次数标准化,以得到在1∶100稀释时78-91%T优选86-91%的最终透光率百分比。匀浆后,将罐从匀浆仪移走,放到4℃的冷却器回路中并以240rpm混合。
蛋白质收获
通过用T-1Sharples(Alfa Laval Seperations,Warminster,PA)离心收集含有图1中阐明的铁调节的蛋白质的破碎的细菌悬浮液。简言之,以250ml/分钟的加料速率在17psi以60,000x g离心力,将含有破碎的细菌匀浆的1000升夹套处理罐加到12个Sharples。通过封闭无菌回路让流出液收集到第二个1000升夹套处理罐,这使得可多次通过离心机同时保持封闭***。离心期间的温度保持在4℃。匀浆液通过离心机8次。在第二次通过后收集大约50%的蛋白质,此时匀浆流体浓缩为其初始体积的1/3,这缩短了后面6次通过的处理时间。从离心机无菌拆开匀浆罐,连接到Millipore Pellicon切向流过滤器组件(Millipore Corporation,Bedford,MA)用于浓缩,所述组件配有连接到Waukesha U30型加料泵的25ft2筛通道系列Alpha 30K Centrasette过滤器(Pall Filtron)。浓缩后,继续离心直到完成处理。在每次通过后收集蛋白质。将蛋白质收集、重新悬浮并分发到50升含有作为防腐剂的0.15%formulin(Sigma)的Tris-缓冲的盐水pH 8.5中。
渗滤
通过在4℃渗滤以除去任何外源蛋白质(蛋白酶、毒素、细胞质酶和代谢酶等)来洗涤蛋白质悬浮液。简言之,将50升蛋白质无菌转移到含有150升无菌Tris-缓冲的盐水(pH 8.5)的200升处理罐中,所述处理罐配有底部安置的以125rev/分钟旋转的Dayton 2Z846型混合器(Dayton Electric,Chicago,IL)中。将处理罐无菌连接到MilliporePellicon切向流过滤器组件(Millipore Corporation),所述组件配有连接到Waukesha U30型加料泵的25ft2筛通道系列Alpha 30K Centrasette过滤器(Pall Filtron)。通过过滤到50升目标体积来浓缩200升蛋白质溶液,此时加入150升无菌盐水。然后将蛋白质悬浮液浓缩到大约50升。将蛋白质浓缩液储存到配有顶部安装的混合器的50升夹套处理罐中,并储存在4℃。
引人关注地注意到,源自用匀浆作为破碎手段的大规模处理的组合物,产生与实施例1所述的小规模处理相比,通过SDS-PAGE检查的相同的带型谱。这些结果显示溶葡萄球菌素可用AVESTIN匀浆仪C500-B取代为细菌裂解剂。该发现使得可以以低花费从葡萄球菌生产大体积的铁调节的蛋白质。
实施例8
小鼠的高度免疫及多克隆抗体的制备
用分离自小鼠的纯化抗体进行的免疫,针对同源和异源金黄色葡萄球菌攻击提供保护,所述小鼠用源自生长在铁限制条件下的金黄色葡萄球菌菌株ATCC 19636的蛋白质疫苗接种。用如实施例1和2所述源自生长在贫铁条件下的金黄色葡萄球菌菌株ATCC 19636的蛋白质组合物,如实施例3所述疫苗接种15只成年CD1小鼠。每次疫苗接种用50μg蛋白质组合物,以7天间隔腹膜内疫苗接种小鼠3次。在第三次免疫7天后,通过心脏穿刺为小鼠完全放血。合并血清,用标准硫酸铵沉淀纯化抗体。在通过加入0.5体积的饱和硫酸铵(pH 7.2)的抗体沉淀前,首先除去外来血清蛋白质。于4℃将溶液以100rpm搅拌24小时。以3000x g将溶液再次离心30分钟。收集上清液,通过加入足够的饱和硫酸铵以使最终浓度到55%饱和来再次沉淀。于4℃将溶液以100rpm搅拌24小时。以3000x g将沉淀离心30分钟。将来自每一样品的最终沉淀重新悬浮到2ml PBS pH 7.2中。然后用50,000分子截止值的透析管(Pierce,Rockford IL),让沉淀的抗体针对3次更换溶液的1升磷酸缓冲盐水透析30小时,以除去硫酸铵。用.02%叠氮化钠保存头2升更换液。最后1升更换缓冲液不含防腐剂。收集透析液,再次以3000x g离心30分钟以除去任何残留碎片。将抗体溶液储存在4℃,48小时内使用。将每一样品铺到血液琼脂板上,以在输注前确证无菌性。
实施例9
被动免疫和攻击
为了评估针对在铁限制期间表达的金黄色葡萄球菌蛋白质产生的输注抗体的保护作用,用含纯化的抗体制剂(组别1)或生理盐水(组别2)的200μL输注液腹膜内输注给两组15只小鼠组中的每一只。用纯化的抗体制剂(组别3)或生理盐水(组别4)皮下输注给另外两组15只小鼠组中的每一只。60分钟后,用1.3x108cfu的金黄色葡萄球菌菌株19636腹膜内攻击接受腹膜内输注的两组15只小鼠组。同样,用1.3x108cfu的金黄色葡萄球菌菌株1477皮下攻击接受皮下输注的两组15只小鼠组,以检测针对不同金黄色葡萄球菌菌株攻击的交叉保护。记录5天死亡率和/或损伤大小,死后取走所有小鼠肝脏,匀浆并铺板,以测定存在的金黄色葡萄球菌数目,作为全身感染的衡量。Kaplan-Meier存活曲线(图5和6)显示,输注来自用在铁限制期间表达的金黄色葡萄球菌蛋白质疫苗接种的小鼠的抗体提供保护作用。尽管输注组和对照组对ATCC 19636-攻击组之间的差异不显著(p=0.076,时序检验),但让抗体输注组内第1天死亡的单只小鼠的肝脏在血液琼脂中培养,以测定是否存在攻击生物体(金黄色葡萄球菌)。源自该小鼠的培养物为金黄色葡萄球菌阴性的,显示在血液琼脂板或培养基上没有生长。相比之下,在安慰剂组内死亡的小鼠肝脏对于葡萄球菌的存在情况都为阳性的,实际上,从源自这些小鼠肝脏的每一血液琼脂板上都获得纯培养物。尽管肝脏数据不能排除抗体输注组内死亡的小鼠死于金黄色葡萄球菌感染的可能性,但所述感染不是全身性的,因为在安慰剂组内是全身性的,并且小鼠可死于其它原因。对该抗体输注的小鼠死亡的检查(censoring)导致抗体输注和安慰剂治疗之间的显著差异(p=0.015,时序检验)。交叉攻击数据亦显示保护性倾向,其中小鼠用源自ATCC 19636的蛋白质疫苗接种后产生的抗体输注,并用金黄色葡萄球菌菌株1477攻击。在攻击后7-14天之间,输注组和非输注组的所有小鼠都开始形成坏死性皮肤损伤。然而,肉眼检查小鼠清楚地显示组之间可见损伤形成以及损伤严重程度的可见延缓。输注的小鼠与非输注对照小鼠相比形成损伤更慢,非输注对照小鼠比输注的小鼠形成损伤更快及严重程度更大。输注的小鼠愈合得比非输注小鼠快。这在攻击后21-35天之间显而易见。在攻击后35天肉眼检查小鼠,显示非输注小鼠严重变丑,显示更大程度的瘢痕形成。事实上,这些小鼠中很多失去了正常体态,即它们外观表现出扭曲,这与输注小鼠形成对照,所述输注小鼠几乎不形成如非输注小鼠形成的扭曲外观所显示的大量疤痕组织和/或损形。总之,这些数据提示,腹膜内输注针对金黄色葡萄球菌的铁诱导的蛋白质产生的抗体,既可对金黄色葡萄球菌感染提供保护又可限制金黄色葡萄球菌感染的严重程度。
实施例10
在慢性感染的乳畜群中评估源自金黄色葡萄球菌的疫苗组合物
选择具有归因于金黄色葡萄球菌的慢性高体细胞计数历史的商用乳畜群,用于评估如实施例1所述的疫苗组合物。用于确定本实验研究的疫苗功效的标准为:1)在与不接种对照相比的接种疫苗中由金黄色葡萄球菌引起的临床乳腺炎的发生率降低;2)与对照相比的接种疫苗中体细胞计数的改善(即降低);和3)在接种和不接种对照间,金黄色葡萄球菌培养物阳性分离率降低。在首次疫苗接种时间(第0天)采血和首次免疫后3及6周再次采血。在整个研究期间监测疫苗接种后的注射部位反应或全身性反应。另外,培养大罐牛奶样品,并定量计数以测定疫苗接种后培养的金黄色葡萄球菌CFU数是否降低。
如实施例1所述让源自慢性感染牛群内的泌乳牛的三株葡萄球菌分离株在铁受限条件和非铁受限条件下生长。将三株分离株命名为TTX101、TTX102和TTX103。由SDS-PAGE检查提取的样品以比较分离株之间的带型谱。在所检查的分离株之间观察到相同的带型谱;自每一分离株制备的组合物包含具有以下分子量的蛋白质:87.73kDa、80.46kDa、65.08kDa、54.53kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa、33.0kDa和31.83kDa。这些蛋白质具有与先前表7所述相同的分子量。另外,当比较分离株时,观察到在所有条件下表达的不由铁调节的以下蛋白质的相同带型谱:150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa和40kDa。这些结果与先前的观察一致。选择一种命名为TTX101的分离株作为制备用于本研究的组合物的分离株。
实施例11
金黄色葡萄球菌(TTX101)的疫苗制备
用分离株TTX101如实施例1所述制备组合物。组合物包含在贫铁条件表达的具有以下分子量的蛋白质:87.73kDa、80.46kDa、65.08kDa、54.53kDa、37.37kDa、35.70kDa、34.91kDa、33.0kDa和31.83kDa;以及非金属调节的具有以下分子量的蛋白质:150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa 43kDa 41kDa和40kDa。通过以下方法将源自菌株TTX101的免疫组合物用于制备实验疫苗:用IKA Ultra Turrax T-50匀浆容器(IKA,Cincinnati,OH)将提取的蛋白质悬浮液(每毫升400μg总蛋白质)乳化到商业佐剂(EMULSIGEN,MVP Laboratories,Ralston NE),得到2.0ml注射体积中800μg总蛋白质的最终剂量,且含22.5%体积/体积的佐剂浓度。以21天间隔皮下给予疫苗2次。
实施例12
实验设计及畜群疫苗接种
在首次疫苗接种前18天,通过标准的需氧细菌学培养方法检测所有登记入研究的泌乳母牛(N=80)的金黄色葡萄球菌,所述方法通过培养源自每一泌乳母牛的单独的牛奶样品来进行。另外,由乳畜群改良协会用标准方法计算体细胞计数(SCC)。80头母牛中有14头临床诊断患有乳腺炎,金黄色葡萄球菌培养物阳性。其余的母牛(N=66)检测为金黄色葡萄球菌阴性。将80头母牛平均分为命名为组别-1(疫苗接种的)(N=40)和组别-2(不疫苗接种的)(N=40)的两个组。将14头临床诊断葡萄球菌细菌阳性的母牛平均分到两个组中,以便每一研究组含有7头临床乳腺炎母牛。首次疫苗接种前组间的平均SCC在非疫苗接种对照中为203,219,相比疫苗接种疫苗中的240,443(无统计学差异,p=0.7)。
首次取样后18天,如实施例11所述用2ml疫苗在右上肩皮下接种组别1的所有母牛。首次疫苗接种后10天,由DHIA在该时间期间采取牛奶样品用于每一单独母牛的体细胞计数。在该时间期间牛奶样品不进行确定葡萄球菌存在情况的细菌学检测。该时期组间的SCC差异为125,241(接种疫苗)对比196,297(对照)。接种疫苗与不接种对照间的体细胞数目差异为36%。在该取样期对照和接种疫苗之间的SCC差异无统计学差异(p=0.5)。在两次取样期间组间的SCC都无统计学差异是由于母牛间个体SCC的大变化。在该同一时期亦检查每一疫苗接种的母牛的注射部位。通过身体检查,所检查的母牛在注射部位都未显示任何有害组织反应。另外,没有因疫苗接种而出现可测量的产奶损失。
在首次疫苗接种后21天,给予组别-1(接种疫苗)的所有母牛第二次疫苗接种或加强免疫。在第一和第二次疫苗接种之间的时间期间,两个组别(接种疫苗和对照)的母牛都因环境温度急剧降低而形成导致在***端形成损伤的***损害,这导致形成***感染,并可能增加取样期间葡萄球菌的分离,这在第三取样期观察到。在第二次疫苗接种后23天,由DHIA从每单头母牛采取牛奶样品用于计数体细胞。亦细菌学检测牛奶样品中金黄色葡萄球菌的存在情况。第一次取样期间检测阴性的母牛在此时期的金黄色葡萄球菌分离率急剧增加。在不接种对照中,与接种疫苗形成对照的是这些母牛中42.9%检测为金黄色葡萄球菌阳性,而接种疫苗仅显示35.5%的增加。接种疫苗对比不接种对照之间的差异为7.4%。很难说接种组中金黄色葡萄球菌分离率的改进只是由于疫苗的作用。人们不能忽略从***损伤的母牛获得干净牛奶样品的难度,所述***损伤可增加在获得样品时金黄色葡萄球菌对牛奶的潜在污染。尽管如此,接种疫苗对比对照之间的平均SCC仍有显著差异。接种组的平均SCC为222,679,相比于对照组中测量的404,278个体细胞。接种疫苗对比不接种对照之间的差异为44.9%。令人感兴趣地推测在这些组之间观察的SCC差异,亦与组间金黄色葡萄球菌分离率差异一致。然而,由于单个动物间的SCC变化大及实验性试验在动物数量方面的小样品大小,所述差异没有统计学差异(p=0.28)。
在此同一时期检查每头接种母牛注射部位的可由疫苗组合物引起的任何有害组织反应。通过身体检查,所检查的母牛中没有一头在注射部位显示任何有害反应。疫苗组合物似乎具有高度组织相容性,在每次疫苗接种后未引起可测量的产奶损失。
通过测量SCC及牛奶样品中是否存在金黄色葡萄球菌继续监测母牛。每组中的某些母牛在第二次疫苗接种后的42天接种第三次。似乎有差异,偏向利用疫苗组合物用于降低体细胞计数及控制由金黄色葡萄球菌引起的感染。进一步的监测包括基于针对疫苗组合物的抗体滴度的血清学,因健康改善所致的接种疫苗母牛在产奶方面的变化和与非接种同龄组相比接种疫苗动物的SCC降低。另外,进行了其它实验来研究基于用有毒力金黄色葡萄球菌攻击后的剂量反应的疫苗保护指数。
实施例13
因为业已证明在不同金黄色葡萄球菌菌株中的蛋白质分子量相似,并因为在小鼠攻击研究中观察到异源保护,我们试图确定共有图1中的相似分子量的蛋白质是否为相似蛋白质。选择表征蛋白质的技术为基质辅助激光解析/电离质谱(MALDI-MS)。如实施例1所述用SDS-PAGE分离组合物部分,用考马斯亮蓝染色凝胶以显现蛋白质。材料和方法
切除和洗涤:用水2次洗涤凝胶10分钟。通过尽可能靠近蛋白条带切割来切除每种目的蛋白条带,以减少样品中存在的凝胶的量。
将每一凝胶切片切割为1x1mm的立方块,置于1.5ml管中。用水洗涤凝胶片15分钟。在洗涤步骤中所用的所有溶剂体积大约等于凝胶切片体积的2倍。接着用水/乙腈(1∶1)洗涤凝胶切片15分钟。当用银染色蛋白质时,除掉水/乙腈混合物,在SPEEDVAC真空浓缩仪/干燥器(ThermoSavant,Holbrook,NY)中干燥凝胶片,然后如下所述使其还原并烷基化。当不用银染凝胶片时,除去水/乙腈混合物,加入乙腈覆盖直到凝胶片变为粘性白色,此时除掉乙腈。在100mMNH4HCO3中使凝胶片再水合,5分钟后,加入等于2倍凝胶片体积的乙腈。让其孵育15分钟,除掉液体,在SPEEDVAC中干燥凝胶片。
还原及烷基化:在10mM DTT和100mM NH4HCO3中使干燥凝胶片再水合,并在56℃孵育45分钟。使管冷却到室温后,除掉液体,立即加入同样体积的55mM碘乙酰胺和100mM NH4HCO3混合物。让其于黑暗中在室温孵育30分钟。除掉液体,加入乙腈覆盖直到凝胶片变为粘性白色,此时除掉乙腈。在100mM NH4HCO3中使凝胶片再水合,5分钟后,加入等于2倍凝胶片体积的乙腈。使其孵育15分钟,除掉液体,在Speed vac中干燥凝胶片。若用考马斯蓝染色凝胶,则仍保留残余的考马斯,重复用100mM NH4HCO3/乙腈洗涤。
凝胶内消化:在Speed Vac中彻底干燥凝胶片。在消化缓冲液(50mM NH4HCO3,5mM CaCl2,每微升12.5纳克(ng/μl)胰蛋白酶)中于4℃使凝胶片再水合。加入足量缓冲液覆盖凝胶片,并根据需要加入更多。让凝胶片在冰上孵育45分钟,移除上清液,用5-2μl不含胰蛋白酶的同样缓冲液取代。使其在有氧培养箱中于37℃孵育过夜。
肽的提取:将足量体积的25mM NH4HCO3加入覆盖凝胶片并孵育15分钟(通常在超声浴超声波仪中)。加入同样体积的乙腈并孵育15分钟(可能的话在超声浴超声波仪中),回收上清液。提取重复2次,用5%甲酸代替NH4HCO3。加入足量体积的5%甲酸覆盖凝胶片,并孵育15分钟(通常在超声浴超声波仪中)。加入同样体积的乙腈并孵育15分钟(通常在超声浴超声波仪中),回收上清液。合并提取物,加入10mM DTT到最终浓度1mM DTT。在SPEEDVAC真空浓缩仪/干燥器中干燥样品到最终体积大约5μl。
肽脱盐:用ZIPTIP移液管吸头(C18,Millipore,Billerica,MA)按厂商建议让样品脱盐。简言之,让样品在重构溶液(5∶95乙腈∶H2O,0.1%-0.5%三氟乙酸)中重构,离心,检查pH以确证其小于3。通过抽吸10μl溶液1(50∶50乙腈∶H2O,0.1%三氟乙酸)并弃掉抽吸的等份样来使ZIPTIP水合。接着抽吸10μl溶液2(去离子H2O中的0.1%三氟乙酸)并弃掉抽吸的等份样。通过缓慢抽吸10μl样品到吸头将样品上载到吸头,将其排放到样品管中,重复该步骤5-6次。将10微升溶液2抽吸到吸头中,通过排出弃掉溶液,重复该过程5-7次以洗涤。通过抽吸2.5μl冰冷的溶液3(60∶40,乙腈∶H2O,0.1%三氟乙酸)、排出、然后再抽吸同样等份样进出吸头3次来洗脱肽。从吸头排出溶液后,盖上管帽并储存在冰上。
质谱法肽作图:将肽悬浮于10.μl-30μl的5%甲酸中,并通过MALDI-TOF MS(Bruker Daltonics Inc.,Billerica,MA)分析。按厂商建议测定肽片段质谱。简言之,让含有来自胰蛋白酶消化的肽的样品与基质氰基-4-羟基肉桂酸混合,转移到目标中,使其干燥。将干燥的样品置于质谱仪中,照射,检测每种离子的飞行时间,用于测定组合物中存在的每一种蛋白质的肽质量指纹。将已知多肽用于使设备标准化。
数据分析:用Mascot搜寻引擎的肽质量指纹搜寻方法(MatrixScience Ltd.,London,UK和www.matrixscience.com,参见Perkins等,Electrophoresis 20,3551-3567(1999)),将在每一次质谱中实验性观察到的肽质量与预期的蛋白质质量比较。搜寻参数包括:数据库:MSDB或NCBInr;分类学:细菌(真细菌)或厚壁菌门(Firmicutes)(革兰氏阳性菌);搜寻类型:肽质量指纹;酶:胰蛋白酶;固定修饰:脲甲基(C)或没有;可变修饰:氧化(M)、脲甲基(C)、组合或没有;质量值:单同位素;蛋白质质量:不受限制;肽质量公差:±150ppm和±430ppm之间或±1Da;肽电荷状态:Mr;最大遗漏切割(max missed cleavages):0或1;查询数:20。
结果
对存在于组合物中的每一种蛋白质的质量指纹的本搜寻结果示于表2、3、4和5中。
实施例14
用基于微阵列的基因表达分析在低铁条件下生长的金黄色葡萄球菌来鉴定铁调节的蛋白质家族
对于微阵列分析,在由单一储备溶液制备的化学成分确定的培养基(CDM)(表10)中培养细菌。
表10:用于金黄色葡萄球菌的化学成分确定的培养基(CDM)
制备方法:为了制备贫铁培养基,将除阳离子和微量营养素外的所有储液合并,用MilliQ纯化水使在容量瓶中达到合适体积,留下足够空体积以容纳阳离子添加物。每1L培养基加15g CHELEX树脂,室温搅拌至少2小时。用2μm瓶顶过滤器将溶液过滤到硫酸(10%)处理的玻璃瓶中。加入过滤的阳离子储液,在4℃黑暗中储存至多2周。
使用金黄色葡萄球菌菌株RF122(分离自牛乳腺炎)和MSA553(分离自人中毒性休克综合征)。在用于实验之前将两种分离株都直接从第二代冷藏储液划线到胰蛋白酶大豆肉汤琼脂。CDM含有的最终柠檬酸盐浓度大约与牛乳(5mM)中相似。对于无铁CDM而言,合并以下组分(0.998L总体积)并加入到15g CHELEX树脂(BioRadLaboratories,Hercules,CA)然后室温搅拌1.5小时:盐、葡萄糖、氨基酸、维生素和核苷酸。然后用2μm瓶顶过滤器(Nalgene NuncInternational,Rochester NY)将去铁(deferrated)的基础培养基过滤到硫酸处理的瓶中,此后加入微量营养素和100μM MgCl2(用MilliQ水在酸处理的玻璃器皿中制备这两种溶液)。将CDM储存在4℃黑暗中直到使用。
将细菌单菌落接种到25ml酸处理的玻璃培养管中的3ml贫铁CDM中,以250rpm在37℃培养箱中振摇过夜。然后在第二天用1毫升传代培养物接种2500ml Erlenmeyer烧瓶中的500ml的CDM中。在37℃以250rpm振荡孵育培养物。贫铁CDM培养物需时大约为CDM+50μM FeSO4的2倍以达到OD为1.0(18小时对比36小时)。在对数中期(OD=0.600),将4x100ml培养物等份样分发到500mlErlenmeyer烧瓶中,并在加入实验铁溶液之前使其在培养箱中振荡10分钟。向一个烧瓶中加入300μl牛乳铁蛋白(50mg/ml,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)到最终浓度150μg/ml。向另一烧瓶中加入50μl柠檬酸铁(100mM)。其余的两个对照烧瓶不加补充品。在5、30、60和120分钟,收集7.5ml培养物并加入到5ml含有β-巯基乙醇和0.5%十二烷基肌氨酸钠的硫氰酸胍溶液中。彻底混合溶液以停止转录,在8℃以4,000x g离心8分钟;倒掉上清液,用乙醇/干冰浴将细胞冷冻在250μl Trizol(Invitrogen)中,然后储存在-80℃直到提取RNA。
为了提取RNA,在冰上解冻细胞沉淀,加入750μl Trizol(Invitrogen,Carlsbad CA)。通过旋涡重新悬浮细胞,将浆液转移到含有0.1mm二氧化硅-锆珠粒的2ml螺帽管中,然后在BeadBeater(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,OK)中拍打3x2分钟,且在重复之间用冰孵育。让浆液在室温再孵育20分钟,接着离心以沉淀珠粒和细胞组分。加入400μl氯仿,倒置混合,在室温孵育10分钟,让管在8℃以12,000X g离心8分钟。除掉水层,用400μl异丙醇沉淀RNA,接着用1ml 70%乙醇洗涤。短暂风干纯RNA沉淀,重新悬浮于100μl无RNA酶的H2O中。用标准DNA酶试剂盒(Qiagen,Valencia CA)消化DNA,接着按照厂商推荐在RNeasy柱(Qiagen)上净化。最后,用Turbo无DNA试剂盒(Ambion,Austin TX)来确保从制剂中根除DNA。在分光光度计中测量RNA,在Agilent生物分析仪(Agilent,Palo AltoCA)上运行以在产生用于微阵列杂交的cDNA之前确证质量和数量。
按已建立的方案进行微阵列分析。利用BioRobotics Microgrid IIArray Spotter(BioRobotics,Cambridge UK),将阵列一式三份点到GapsII氨基盐水(aminosaline)包被的玻片(Corning,Acton MA)上,所述阵列特征为3841个70聚物寡核苷酸(Illumina,San Diego CA),其代表来自9个测定序列的金黄色葡萄球菌基因组(包括RF122和MSA553)的开放读框(ORF)。重新水合玻片,UV交联并在干燥下储存。在临杂交前,让玻片在42℃于预杂交缓冲液中孵育1小时,所述预杂交缓冲液由25ml甲酰胺、12.5ml 20X SSC、12ml dH20、500μL 10%SDS和0.5g BSA组成。用2L MilliQ水漂洗玻片,通过离心干燥。为了制备样品,让8-10μg总细菌RNA与20μg随机六聚物于70℃孵育10分钟,接着用Superscript II(Invitrogen)和氨基-烯丙基偶联的dUTP(Sigma)进行具有氨基-烯丙基掺入的逆转录。将标记的cDNA中和、纯化、干燥并用Cy3或Cy5荧光染料(Amersham Biosciences Corp.,Piscataway NJ)重新悬浮;继续偶联2小时。用Qiagen PCR纯化试剂盒洗涤荧光标记的cDNA样品(每种12μl),合并并加入到9.8μl甲酰胺、6.8μL 20X SSC、3.4μl鲑鱼***DNA(10mg/ml,Invitrogen)和1μl 10%SDS。让样品在热循环仪中于99.9℃孵育2分钟,在阵列施用之前使其冷却。然后将探针施用到阵列上,用玻璃盖玻片覆盖,在42℃水浴中孵育过夜。在孵育12-16小时后用稀释的SSC缓冲液彻底洗涤玻片,用Axon 4100B Scanner和Axon GenePix软件(AxonInstruments,Union City CA)扫描。将原始强度数据输出到GeneSpring(Agilent Technologies,[Silicon Genetics],Palo Alto CA)用于标准化及过滤。基于最小(>1500)原始强度值让点全部标准化、过滤,并一式三份取平均。每一实验进行2次,在匹配时间点之间用染料交换对每一次运行单一玻片。因而,在每一时间点对于每一基因产生至少6个染料交换数据点,这代表至少2个生物学重复。通过分级群聚(欧几里得距离,平均连锁,UPGMA)和K-均值聚类(基于所测量距离的偏心相关性)用EPCLUST(Jaak Vilo,EBI)和SpotFire(SpotFire,Somerville,MA)进一步分析数据。在所有时间点对用一级模型的中位数居中的log比率使用微阵列的显著性分析(SAM,(157)),以测定基因表达是否显著不同于0。用严格的δ值以使假阳性的百分比估测为0。通过SAM分析显示类似上调或下调的操纵子的概述显示在表11中,这支持了阵列检测生物学反应的能力。
表11.具有用微阵列分析金黄色葡萄球菌基因表达鉴定的协同转录响应的操纵子聚簇
对于蛋白质标准克隆,通过标准聚合酶链式反应从由金黄色葡萄球菌(菌株ATCC19636)提取的DNA扩增合适的基因。设计引物以引入StuI和KpnI限制性核酸内切酶位点并如下所示。
表12.克隆引物
将从金黄色葡萄球菌ATCC19636提取的DNA用作模板。通过凝胶电泳确证DNA扩增子,切下扩增的DNA条带,纯化、消化并连接到切割的pQE30-Xa载体,转化到感受态XL-1大肠杆菌中,并筛选氨苄西林抗性。用菌落PCR针对质粒***片段筛选抗性克隆。
实施例15
保护性蛋白质候选者的免疫反应性的筛选
为了评估从MALDI-TOF分析(实施例13)和/或微阵列和基因组分析(实施例14)鉴定的蛋白质的抗体反应性,用分体式筛选(two-partscreen)来评估个别表达的葡萄球菌蛋白质。首次快速筛选用转录活性PCR片段来调查抗体与小量用无细胞大肠杆菌(E.coli)裂解物表达的候选蛋白质的结合。为了确证首次筛选的阳性候选者,第二次筛选在利用商业载体(pQE30Xa,Qiagen,Valencia CA)的大肠杆菌中使用基于标准PCR的克隆、蛋白质的表达和纯化。第二次筛选亦产生含有对应于每一免疫反应性蛋白质候选者的表达载体的大肠杆菌宿主细胞的主种子储液,用于产生和纯化用于疫苗接种和实验的足量蛋白质。
使用用于产生单独SIRP抗原的高通量方法,来检测几种编码参与金属代谢的金黄色葡萄球菌蛋白质的候选基因。该方法用2-步PCR反应产生转录活性PCR(TAP)扩增子,所述PCR反应使用增加启动子、终止子和C-末端His6标签的引物。将产生的转录活性扩增子用作在由大肠杆菌细胞裂解物、氨基酸和缓冲液组成的无细胞体外转录/翻译反应中产生蛋白质的模板。2-步PCR反应需要针对目的基因的第一套引物,所述引物亦包括与第二套引物匹配的接头序列。设计第一步PCR的每套引物以排除膜加工的信号序列,从而防止整合到细胞膜上,其如下所示。
表13.TAP引物
用(1单位高保真度Taq DNA聚合酶(Invitrogen)、0.2μM引物、2mM dNTP(每一种)、2mM最终Mg++和大约5ng起始DNA模板、缓冲到60mM的TrisSO4(pH 8.9)和18mM硫酸铵)来实施标准50μlPCR反应。PCR循环方案包括在94℃的1分钟的初始变性,接着以下30个循环:变性/94℃/30秒;退火/55℃/30秒;延伸/68℃,90秒。用具有合适重叠的同一引物进行第二步PCR反应,该引物由厂商(Genlantis)提供。纯化得到的DNA PCR产物以消除残留引物、盐和DNA片段,并将其用作第二反应的模板,所述第二反应具有标准引物套以利用相似条件加入启动子和终止子序列。然后纯化DNA模板,加入大肠杆菌无细胞快速翻译***RTS 100反应混合物(Roche)中,所述混合物含有12μl大肠杆菌裂解物、12μl氨基酸、10μl反应混合物、1μl添加的甲硫氨酸、5μl重构缓冲液和10μl来自2步PCR反应的纯化的DNA模板。在30℃孵育5小时后,将1微升各种蛋白质样品(大约0.5μg/μl总蛋白质)施用到甲醇饱和后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将印迹用5%NFDM/TTBS过夜封闭,与铁限制蛋白质孵育,增加(IRPE)高度免疫小鼠血清(以1∶500稀释)或抗-His6抗体(1∶500),洗涤,与第二山羊-抗小鼠碱性磷酸酶(AP)缀合物(1∶3000)孵育,洗涤并显色(Bio-Rad AP显色试剂盒)20分钟。鉴别含有血清反应性多肽的裂解液。
让如实施例14所述产生的克隆生长到对数中期,用1mM IPTG诱导并生长4小时。沉淀细胞,洗涤,在煮沸的SDS-PAGE上样缓冲液中裂解。通过SDS-PAGE分离粗裂解液,考马斯染色。将第二套分离的蛋白质转移到PVDF膜,用在1%NFDM/TTBS中1∶500稀释的IRPE疫苗高度免疫小鼠血清进行免疫印迹。洗涤印迹,与碱性磷酸酶(AP)-缀合的山羊抗-小鼠第二抗体孵育,洗涤,用显色底物显色。
实施例16
从重组产生的多肽制备免疫组合物
为了分离用于调配疫苗的重组金黄色葡萄球菌多肽,让实施例14所述的大肠杆菌克隆于37℃(225rpm)在1L胰蛋白酶大豆肉汤中生长到对数中期(OD600=0.4-0.6),然后用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)诱导4小时。于4℃在Sorvall离心机(4000x g)中让培养物沉淀10分钟,在进行纯化程序前冷冻在-80℃。然后通过两种不同方法处理细菌沉淀,这视过表达的金黄色葡萄球菌多肽的溶解性而定。
对于可溶性多肽(例如MntC、FhuD、SYN2、SirA或SYN1),将细菌沉淀重新悬浮于25ml的BUGBUSTER试剂(Novagen)中,在冰上用安装有microtip的Branson超声仪(65%工作循环,输出5)进行15分钟超声。通过10分钟离心(4000x g)除掉不溶性物质。过滤(0.2μm)可溶性上清液,按照厂商提供的说明书进行金属亲和色谱(Ni-NTAHis-Bind,Novagen)。
对于不溶性多肽(例如PflB或Opp1A),将细菌沉淀重新悬浮于25ml的BUGBUSTER试剂(Novagen)中,在振荡平台上放置10分钟,然后进行离心(15,000x g,12分钟)。将得到的沉淀重新悬浮于10ml的BUGBUSTER加20ml稀释的BUGBUSTER(在PBS中1∶10)中,进行离心(5000x g,12分钟)。然后将沉淀重新悬浮于20ml稀释的BUGBUSTER,进行最后的离心步骤(15,000x g,12分钟)。将最终沉淀重新悬浮于10ml缓冲液A(0.1M NaH2PO4、0.01Tris-HCl、8M尿素,pH 8.0)中,并在振荡平台上于室温孵育10分钟。然后让样品离心(12,000x g,20分钟),通过金属亲和色谱(Ni-NTA His-Bind,Novagen)按照厂商提供的说明书分离得到的上清液,但进行以下改良。在装柱后,用10ml缓冲液A平衡树脂。在多肽结合后,用15ml缓冲液B(0.1M NaH2PO4、0.01 Tris-HCl、8M尿素,pH 6.0)洗涤柱,并用15ml缓冲液C(0.1M NaH2PO4、0.01 Tris-HCl、8M尿素,pH 4.5)洗脱。
在15ml体积中从柱洗脱分离的重组多肽,置于20kDa截止值的透析盒(Pierce),针对2L磷酸缓冲盐水(PBS)透析。在经30小时过程中换3次缓冲液后,移走多肽,过滤(0.2μm)并用20kDa截止值Centricon设备(Millipore)浓缩到2-3ml体积。用标准BCA方法(Pierce)测定纯化多肽的浓度。
合并10μg每种多肽,用PBS将体积调整到100μl,形成免疫组合物。
实施例17
小鼠疫苗接种
IV攻击(研究A)
将重16-22克的自Harlan繁殖实验室(Indianapolis,IN)获得的50只(N=50)雌性BALB/C小鼠,分成3个组别(10-20只小鼠/组)。将小鼠安置在聚碳酸酯小鼠笼(N=5只小鼠/笼)中。给所有小鼠随意供应食物和水。用50%IFA作为佐剂调配所有疫苗。如下用0.1ml的合适组合物以14天间隔对所有小鼠皮下疫苗接种2次:
组别1:安慰剂,用卵清蛋白(70μg/100μl)疫苗接种(安慰剂,20只小鼠)。
组别2:用在铁受限下表达的ATCC 25904蛋白质(70μg/100μl)疫苗接种(SIRP提取物,20只小鼠)。
组别3:用重组的多肽MntC(10μg/100μl)疫苗接种(rMntC,10只小鼠)。
IP攻击(研究B)
将重16-22克的自Harlan繁殖实验室(Indianapolis,IN)获得的40只(N=40)雌性BALB/C小鼠,平均分为4个组别(10只小鼠/组)。将小鼠安置在聚碳酸酯小鼠笼(N=5只小鼠/笼)中。给所有小鼠随意供应食物和水。用50%IFA作为佐剂调配所有疫苗。如下利用2次疫苗接种(组别1-3)或3次疫苗接种(组别4)用0.1ml的合适组合物以14天间隔对小鼠皮下疫苗接种:
组别1:安慰剂,用卵清蛋白(70μg/100μl)疫苗接种2次(安慰剂)。
组别2:用在铁受限下表达的ATCC 25904蛋白质(70μg/100μl)疫苗接种2次(SIRP提取物)。
组别3:用重组的多肽PflB、Opp1A、SirA、SYN2、FhuD、SYN1和MntC(每一种10μg/100μl,总蛋白质70μg/100μl)疫苗接种2次(rSIRP7(2x))。
组别4:用重组的多肽PflB、Opp1A、SirA、SYN2、FhuD、SYN1和MntC(每一种10μg/100μl,总蛋白质70μg/100μl)疫苗接种3次(rSIRP7(3x))。
IC攻击(研究C)
将重16-22克的自Harlan繁殖实验室(Indianapolis,IN)获得的30只(N=30)雌性BALB/C小鼠,平均分为3个组别(10只小鼠/组)。将小鼠安置在聚碳酸酯小鼠笼(N=5只小鼠/笼)中。给所有小鼠随意供应食物和水。如下用0.1ml的合适组合物以14天间隔对小鼠皮下疫苗接种2次:
组别1:安慰剂,用卵清蛋白(70μg/100μl)疫苗接种(安慰剂)。
组别2:用在铁受限下表达的ATCC 25904蛋白质(70μg/100μl)疫苗接种(SIRP提取物)。
组别3:用重组的多肽PflB、Opp1A、SirA、SYN2、FhuD、SYN1和MntC(每一种10μg/100μl,总蛋白质70μg/100μl)疫苗接种(rSIRP7)。
实施例18
攻击生物体的制备
IV攻击(研究A)
用金黄色葡萄球菌菌株ATCC 25904作为攻击生物体。简言之,将生长在标准TSB(无铁限制)的来自冷冻甘油储液的1μl细菌接种环,用于接种20ml TSB培养物,并在37℃孵育18小时。将2.5ml该培养物传代到500ml新鲜TSB中。让培养物在37℃孵育大约2小时,同时以250rpm振荡直到达到光密度(OD600)为0.4(吸光度)(对数中期),然后在4℃以10,000x g离心细胞10分钟以沉淀细菌。通过在4℃在PBS中离心来洗涤细菌沉淀。让最终沉淀重新悬浮于20ml的PBS中。通过将该浓缩的细菌培养物等份样加到PBS中,产生对应于大约6.67x108CFU/ml的OD600为4.0(A)的溶液,来制备最终攻击剂量。在临攻击前,系列稀释1ml这些细菌悬浮液,铺在琼脂板上以计数每小鼠剂量的菌落形成单位(CFU)数。
IP攻击(研究B)
用金黄色葡萄球菌菌株ATCC 25904作为攻击生物体。简言之,将生长在标准TSB(无铁限制)的来自冷冻甘油储液的1μl细菌接种环,用于接种20ml TSB培养物,并在37℃孵育18小时。将2.5ml该培养物传代到500ml新鲜TSB中。让培养物在37℃孵育大约2小时,同时以250rpm振荡直到达到光密度(OD600)为0.4(吸光度)(对数中期),然后在4℃以10,000x g离心细胞10分钟以沉淀细菌。通过在4℃在PBS中离心来洗涤细菌沉淀。让最终沉淀重新悬浮于20ml的PBS中。通过将该浓缩的细菌培养物等份样加到PBS中,产生对应于大约3.33x109CFU/ml的OD600为6.0(A)的溶液,来制备最终攻击剂量。在临攻击前,系列稀释1ml这些细菌悬浮液,铺在琼脂板上以计数每小鼠剂量的菌落形成单位(CFU)数。
IV攻击(研究C)
用金黄色葡萄球菌菌株ATCC 25904作为攻击生物体。简言之,将生长在标准TSB(无铁限制)的来自冷冻甘油储液的1μl细菌接种环,用于接种20ml TSB培养物,并在37℃孵育18小时。将2.5ml该培养物传代到500ml新鲜TSB中。让培养物在37℃孵育大约2小时,同时以250rpm振荡直到达到光密度(OD600)为0.4(吸光度)(对数中期),然后在4℃以10,000x g离心细胞10分钟以沉淀细菌。通过在4℃在PBS中离心来洗涤细菌沉淀。让最终沉淀重新悬浮于20ml的PBS中。通过将该浓缩的细菌培养物等份样加到PBS中,产生对应于大约6.67x108CFU/ml的OD600为4.0(A)的溶液,来制备最终攻击剂量。在临攻击前,系列稀释1ml这些细菌悬浮液,铺在琼脂板上以计数每小鼠剂量的菌落形成单位(CFU)数。
实施例19
攻击
IV攻击(研究A)
在第二次疫苗接种后14天,用0.3ml合适生物体在侧尾静脉内静脉内攻击所有组别(1-3)的小鼠。用每只小鼠2x108CFU金黄色葡萄球菌菌株ATCC 25904等同地攻击三组小鼠。攻击后10天每天记录死亡率。
当比较用ATCC 25904分离株攻击的小鼠时,80%的安慰剂疫苗接种的组别1小鼠在攻击的10天内死亡(表14)。这证明菌株ATCC25904在给予的剂量水平处引起小鼠高死亡率。与组别1中的小鼠形成对照,组别2(用自在贫铁条件下生长后的菌株ATCC 25904提取的蛋白质(SIRP提取物)疫苗接种)中只有25%小鼠在攻击后10天内死亡。这些结果表明,用菌株ATCC 25904攻击的小鼠受到用源自贫铁ATCC 25904的蛋白质组合物疫苗接种的显著保护(p=0.0006,死亡率时序检验)。另外,组别3(用重组的MntC多肽(rMntC)疫苗接种)中只有50%小鼠在攻击的10天内死亡,这表明重组的蛋白质提供对用ATCC 25904菌株攻击的保护(p=0.100,死亡率时序检验)。
IP攻击(研究B)
在第二次疫苗接种后14天,用0.5ml合适生物体腹膜内攻击所有组别(1-4)的小鼠。用每只小鼠1x109CFU金黄色葡萄球菌菌株ATCC 25904等同地攻击三组小鼠。攻击后10天每天记录死亡率。
当比较用ATCC 25904分离株攻击的小鼠时,60%的安慰剂疫苗接种的组别1小鼠在攻击的10天内死亡(表14)。这证明菌株ATCC25904在给予的剂量水平处引起小鼠中等死亡率。与组别1中的小鼠形成对照,组别2(用自在贫铁条件下生长后的菌株ATCC 25904提取的蛋白质(SIRP提取物)疫苗接种)中只有30%小鼠在攻击后10天内死亡。这些结果表明,用源自贫铁ATCC 25904的蛋白质组合物疫苗接种的小鼠当用菌株ATCC 25904攻击时,死亡率为安慰剂疫苗接种小鼠的一半(p=0.143,死亡率时序检验)。用7种重组蛋白质的组合疫苗接种的小鼠,相对于安慰剂显示较高水平的保护。组别3(用重组的多肽疫苗接种2x,rSIRP72x)中只有20%小鼠在攻击的10天内死亡,组别4(用重组的多肽疫苗接种3x,rSIRP73x)中只有10%小鼠在攻击的10天内死亡,这表明用重组蛋白质的三次疫苗接种提供对用ATCC25904菌株攻击的显著保护(p=0.040,死亡率时序检验)。
IV攻击(研究C)
在第二次疫苗接种后14天,用0.3ml合适生物体在侧尾静脉内静脉内攻击所有组别(1-3)的小鼠。用2x108CFU金黄色葡萄球菌菌株ATCC 25904等同地攻击三组小鼠。攻击后10天每天记录死亡率。
当比较用ATCC 25904分离株攻击的小鼠时,90%的安慰剂疫苗接种的组别1小鼠在攻击的10天内死亡(表14)。这证明菌株ATCC25904在给予的剂量水平处引起小鼠高死亡率。与组别1中的小鼠形成对照,组别2(用自在贫铁条件下生长后的菌株ATCC 25904提取的蛋白质(SIRP提取物)疫苗接种)中只有40%小鼠在攻击后10天内死亡。这些结果表明,用菌株ATCC 25904攻击的小鼠受到用源自贫铁ATCC 25904的蛋白质组合物接种的显著保护(p=0.0164,死亡率时序检验)。另外,组别3(用重组的多肽rSIRP7疫苗接种)中只有40%小鼠在攻击的10天内死亡,这表明重组的蛋白质提供对用ATCC 25904菌株攻击的显著保护(p=0.0255,死亡率时序检验)。
结果示于表14和图161中。
表14.在用金黄色葡萄球菌ATCC分离株25904攻击后疫苗接种和未疫苗接种的小鼠的死亡率
组别 | 小鼠数 | 死亡数 | 死亡率百分比(%) |
IV攻击(研究A) | |||
组别1(安慰剂) | 20 | 16/20 | 80 |
组别2(SIRP提取物) | 10 | 5/20 | 25 |
组别3(rMntC) | 10 | 5/10 | 50 |
IP攻击(研究B) | |||
组别1(安慰剂) | 10 | 6/10 | 60 |
组别2(SIRP提取物) | 10 | 3/10 | 30 |
组别3(rSIRP(2x)) | 10 | 2/10 | 20 |
组别4(rSIRP(3x)) | 10 | 1/10 | 10 |
IV攻击(研究C) | |||
组别1(安慰剂) | 10 | 9/10 | 90 |
组别2(SIRP提取物) | 10 | 4/10 | 40 |
组别3(rMntC) | 10 | 4/10 | 40 |
实施例20
用重组制备的多肽被动免疫
如实施例8所述制备多克隆抗体组合物,不同的是用如实施例16所述制备的重组多肽组合物疫苗接种小鼠。
如实施例9所述将得到的抗体组合物用于被动免疫小鼠。如实施例9所述攻击免疫的小鼠。
与未疫苗接种和安慰剂疫苗接种的小鼠相比,免疫的小鼠应显示降低的死亡率。
实施例21
重组产生的多肽的大规模发酵和分离
可通过让生物体于37℃在2000ml无菌RM培养基(每升20g酪蛋白氨基酸、60g Na2HPO4、30g KH2PO4、5g NaCl、10g NH4Cl,以及100ug/ml氨苄西林)生长8小时,来制备实施例14的重组大肠杆菌的主种子储液。可通过以10,000x g离心30分钟来收获细菌。可通过离心(10,000x g)洗涤培养物2次,将最终的细菌沉淀重新悬浮于含有20%无菌甘油的500ml无菌RM培养基中。将1毫升培养物转移到2ml冷冻管并储存在-85℃。
可将重组的主种子储液冷冻管(1ml)用于接种含有上述培养基的100ml培养瓶,不同的是所述培养基含有2g酪蛋白氨基酸和0.5%葡萄糖(“改良RM培养基”)。可让培养物在37℃孵育7小时,此时可将其接种到2升改良RM培养基中,使其在37℃再生长4小时。可将该培养物用于接种装有20升改良RM培养基的30-升New BrunswickBIOFLOW 4台式发酵罐,不同的是所述培养基的最终酪蛋白氨基酸浓度为20g/升(“发酵RM培养基”)。可通过用30%NaOH和10%HCl自动滴定让发酵培养基的pH保持在6.9-7.2。可以以350rev/分钟搅拌发酵培养物,可在37℃以11升/分钟给培养物通气。可通过加入0.4%硅酮去泡剂(Antifoam-B,J.T.Baker,NJ)自动控制发泡。可让培养物在这些条件下连续生长4小时(OD600=4.0-6.0),此时可将培养物泵入装有110升发酵RM培养基和0.2%去泡剂的150-升发酵罐(W.B.Moore,Easton PN)中。发酵参数可如下:650rpm、60%DO、50slpm空气、10psi反压、37℃和pH用NaOH保持在7.2。在达到指数生长后期(大约6小时,OD600=15.0)后,可通过加入150ug/ml IPTG诱导重组的蛋白质。可让发酵再进行3小时,此时可通过降低发酵罐温度到18℃(OD600 20-25,以1∶100稀释)来终止发酵。
发酵后可通过常规手段收获重组产生的多肽。破碎细胞(例如通过匀浆)以释放重组产生的多肽,其中某些为可溶,某些不可溶。
可通过切向流过滤浓缩可溶的多肽,用去污剂增溶,通过金属亲和色谱收获。可如实施例16中对分离可溶性多肽所述来分离收集的可溶的多肽。
可通过高速离心来收获不溶性蛋白质。可收集不溶性多肽的沉淀,然后如实施例16中对分离不溶性的多肽所述来分离。
实施例22
小鼠疫苗接种
如实施例16所述制备并分离重组产生的SirA、SYN2、FhuD和MntC多肽。
将重16-22克的自Harlan繁殖实验室(Indianapolis,IN)获得的30只(N=30)雌性BALB/C小鼠,平均分为3个组别(10只小鼠/组)。将小鼠安置在聚碳酸酯小鼠笼(N=5只小鼠/笼)中。给所有小鼠随意供应食物和水。如下用0.1ml的合适组合物以14天间隔对小鼠皮下疫苗接种2次:
组别-1:安慰剂,用卵清蛋白(40μg/100μl)疫苗接种
组别-2:用在铁受限下表达的ATCC 25904蛋白质(40μg/100μl)疫苗接种。
组别-3:用重组多肽SirA、SYN2、FhuD和MntC(每种10μg/100μl,总蛋白质40μg/100μl)疫苗接种。
如实施例19所述攻击小鼠。与组别1的小鼠相比,组别3的小鼠应表现出降低的死亡率。
实施例23
小鼠疫苗接种
如实施例16所述制备并分离重组产生的PflB多肽。
将重16-22克的自Harlan繁殖实验室(Indianapolis,IN)获得的30只(N=30)雌性BALB/C小鼠,平均分为3个组别(10只小鼠/组)。将小鼠安置在聚碳酸酯小鼠笼(N=5只小鼠/笼)中。给所有小鼠随意供应食物和水。如下用0.1ml的合适组合物以14天间隔对小鼠皮下疫苗接种2次:
组别-1:安慰剂,用卵清蛋白(10μg/100μl)疫苗接种
组别-2:用在铁受限下表达的ATCC 25904蛋白质(10μg/100μl)疫苗接种。
组别-3:用重组的多肽PflB(各自10μg/100μl)疫苗接种。
如实施例19所述攻击小鼠。与组别1的小鼠相比,组别3的小鼠应表现出降低的死亡率。
实施例24
小鼠疫苗接种
如实施例16所述制备并分离重组产生的Opp1A多肽。
将重16-22克的自Harlan繁殖实验室(Indianapolis,IN)获得的30只(N=30)雌性BALB/C小鼠,平均分为3个组别(10只小鼠/组)。将小鼠安置在聚碳酸酯小鼠笼(N=5只小鼠/笼)中。给所有小鼠随意供应食物和水。如下用0.1ml的合适组合物以14天间隔对小鼠皮下疫苗接种2次:
组别-1:安慰剂,用卵清蛋白(10μg/100μl)疫苗接种
组别-2:用在铁受限下表达的ATCC 25904蛋白质(10μg/100μl)疫苗接种。
组别-3:用重组的多肽Opp1A(各自10μg/100μl)疫苗接种。
如实施例19所述攻击小鼠。与组别1的小鼠相比,组别3的小鼠应表现出降低的死亡率。
实施例25
小鼠疫苗接种
如实施例16所述制备并分离重组产生的SirA多肽。
将重16-22克的自Harlan繁殖实验室(Indianapolis,IN)获得的30只(N=30)雌性BALB/C小鼠,平均分为3个组别(10只小鼠/组)。将小鼠安置在聚碳酸酯小鼠笼(N=5只小鼠/笼)中。给所有小鼠随意供应食物和水。如下用0.1ml的合适组合物以14天间隔对小鼠皮下疫苗接种2次:
组别-1:安慰剂,用卵清蛋白(10μg/100μl)疫苗接种
组别-2:用在铁受限下表达的ATCC 25904蛋白质(10μg/100μl)疫苗接种。
组别-3:用重组的多肽SirA(各自10μg/100μl)疫苗接种。
如实施例19所述攻击小鼠。与组别1的小鼠相比,组别3的小鼠应表现出降低的死亡率。
实施例26
小鼠疫苗接种
如实施例16所述制备并分离重组产生的SYN2多肽。
将重16-22克的自Harlan繁殖实验室(Indianapolis,IN)获得的30只(N=30)雌性BALB/C小鼠,平均分为3个组别(10只小鼠/组)。将小鼠安置在聚碳酸酯小鼠笼(N=5只小鼠/笼)中。给所有小鼠随意供应食物和水。如下用0.1ml的合适组合物以14天间隔对小鼠皮下疫苗接种2次:
组别-1:安慰剂,用卵清蛋白(10μg/100μl)疫苗接种
组别-2:用在铁受限下表达的ATCC 25904蛋白质(10μg/100μl)疫苗接种。
组别-3:用重组的多肽SYN2(各自10μg/100μl)疫苗接种。
如实施例19所述攻击小鼠。与组别1的小鼠相比,组别3的小鼠应表现出降低的死亡率。
实施例27
小鼠疫苗接种
如实施例16所述制备并分离重组产生的FhuD多肽。
将重16-22克的自Harlan繁殖实验室(Indianapolis,IN)获得的30只(N=30)雌性BALB/C小鼠,平均分为3个组别(10只小鼠/组)。将小鼠安置在聚碳酸酯小鼠笼(N=5只小鼠/笼)中。给所有小鼠随意供应食物和水。如下用0.1ml的合适组合物以14天间隔对小鼠皮下疫苗接种2次:
组别-1:安慰剂,用卵清蛋白(10μg/100μl)疫苗接种
组别-2:用在铁受限下表达的ATCC 25904蛋白质(10μg/100μl)疫苗接种。
组别-3:用重组的多肽FhuD(各自10μg/100μl)疫苗接种。
如实施例19所述攻击小鼠。与组别1的小鼠相比,组别3的小鼠应表现出降低的死亡率。
实施例28
小鼠疫苗接种
如实施例16所述制备并分离重组产生的SYN1多肽。
将重16-22克的自Harlan繁殖实验室(Indianapolis,IN)获得的30只(N=30)雌性BALB/C小鼠,平均分为3个组别(10只小鼠/组)。将小鼠安置在聚碳酸酯小鼠笼(N=5只小鼠/笼)中。给所有小鼠随意供应食物和水。如下用0.1ml的合适组合物以14天间隔对小鼠皮下疫苗接种2次:
组别-1:安慰剂,用卵清蛋白(10μg/100μl)疫苗接种
组别-2:用在铁受限下表达的ATCC 25904蛋白质(10μg/100μl)疫苗接种。
组别-3:用重组的多肽SYN1(各自10μg/100μl)疫苗接种。
如实施例19所述攻击小鼠。与组别1的小鼠相比,组别3的小鼠应表现出降低的死亡率。
实施例29
小鼠疫苗接种
如实施例16所述制备并分离重组产生的MntC多肽。
将重16-22克的自Harlan繁殖实验室(Indianapolis,IN)获得的30只(N=30)雌性BALB/C小鼠,平均分为3个组别(10只小鼠/组)。将小鼠安置在聚碳酸酯小鼠笼(N=5只小鼠/笼)中。给所有小鼠随意供应食物和水。如下用0.1ml的合适组合物以14天间隔对小鼠皮下疫苗接种2次:
组别-1:安慰剂,用卵清蛋白(10μg/100μl)疫苗接种
组别-2:用在铁受限下表达的ATCC 25904蛋白质(10μg/100μl)疫苗接种。
组别-3:用重组的多肽MntC(各自10μg/100μl)疫苗接种。
如实施例19所述攻击小鼠。与组别1的小鼠相比,组别3的小鼠应表现出降低的死亡率。
实施例30
小鼠疫苗接种
如实施例16所述制备并分离重组产生的SstD多肽。
将重16-22克的自Harlan繁殖实验室(Indianapolis,IN)获得的30只(N=30)雌性BALB/C小鼠,平均分为3个组别(10只小鼠/组)。将小鼠安置在聚碳酸酯小鼠笼(N=5只小鼠/笼)中。给所有小鼠随意供应食物和水。如下用0.1ml的合适组合物以14天间隔对小鼠皮下疫苗接种2次:
组别-1:安慰剂,用卵清蛋白(10μg/100μl)疫苗接种
组别-2:用在铁受限下表达的ATCC 25904蛋白质(10μg/100μl)疫苗接种。
组别-3:用重组的多肽SstD(各自10μg/100μl)疫苗接种。
如实施例19所述攻击小鼠。与组别1的小鼠相比,组别3的小鼠应表现出降低的死亡率。
实施例31
小鼠疫苗接种
如实施例16所述制备并分离重组产生的FhuD2多肽。
将重16-22克的自Harlan繁殖实验室(Indianapolis,IN)获得的30只(N=30)雌性BALB/C小鼠,平均分为3个组别(10只小鼠/组)。将小鼠安置在聚碳酸酯小鼠笼(N=5只小鼠/笼)中。给所有小鼠随意供应食物和水。如下用0.1ml的合适组合物以14天间隔对小鼠皮下疫苗接种2次:
组别-1:安慰剂,用卵清蛋白(10μg/100μl)疫苗接种
组别-2:用在铁受限下表达的ATCC 25904蛋白质疫苗接种(10μg/100μl)。
组别-3:用重组的多肽FhuD2(各自10μg/100μl)疫苗接种。
如实施例19所述攻击小鼠。与组别1的小鼠相比,组别3的小鼠应表现出降低的死亡率。
实施例32
由金黄色葡萄球菌感染产生的血清特异性结合重组的多肽
将金黄色葡萄球菌如实施例4所述制备为攻击生物体,用于如实施例5或19所述攻击小鼠。在攻击前自小鼠获得血清,或自接受安慰剂疫苗的小鼠、用金黄色葡萄球菌Newman攻击并恢复(康复期)的小鼠获得血清。从受攻击及未受攻击的小鼠采取血液,并通过离心获得血清。用如实施例15所述免疫印迹方法将血清用于评估单独的重组产生的多肽的反应性。
在攻击前自小鼠收集的血清不与任何重组的多肽反应。
因金黄色葡萄球菌攻击而产生的血清中的抗体如图202所示与重组产生的多肽反应。针对在金黄色葡萄球菌感染期间表达的多肽产生的抗体,识别重组产生的多肽变体。因而,重组的多肽为例如由攻击金黄色葡萄球菌表达的免疫多肽的免疫片段的免疫取代物。
实施例33
针对重组产生的多肽的抗体和针对直接自金黄色葡萄球菌细胞提取的铁调节膜多肽的抗体交叉反应
如实施例16所述表达和纯化重组的铁调节的多肽。铁调节的膜多肽如实施例1所述直接自生长在低铁条件中的金黄色葡萄球菌细胞提取。将重组的多肽如实施例16所述调配为疫苗,用于如实施例17所述疫苗接种小鼠。如实施例2所述将金黄色葡萄球菌提取的多肽调配为疫苗,并用于如实施例3所述疫苗接种小鼠。对于重组的多肽疫苗,将单种重组的多肽调配为疫苗。收集来自疫苗接种小鼠的抗血清,用于如实施例15所述的免疫印迹。
进一步将来自用重组产生的铁调节多肽疫苗接种的动物的抗血清,用于在用SDS-PAGE分离提取的铁调节多肽后评估与提取的铁调节多肽的反应性。来自用重组的多肽疫苗接种的动物的抗血清将与合适的SDS-PAGE分离的提取的多肽结合,其中抗体表位在提取的多肽和重组产生的多肽之间保守。
进一步将来自用提取的铁调节多肽疫苗接种的动物的抗血清,用于在用SDS-PAGE分离重组的铁调节多肽后评估与单独重组生的铁调节多肽的反应性。来自用提取的多肽疫苗接种的动物的抗血清将与合适的SDS-PAGE分离的重组多肽结合,其中抗体表位在重组产生的多肽和提取的多肽之间保守。
实施例34
重组金黄色葡萄球菌蛋白质的蛋白质印迹分析
如实施例16中所述制备重组的金黄色葡萄球菌蛋白质,然后进行十二烷基硫酸钠-10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,并转移到硝酸纤维素膜(BioRad,Hercules,CA)用于蛋白质印迹分析。单个印迹与来自健康(未报道葡萄球菌感染)或康复期(耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)人供者的血清反应。
作为鉴别每种重组组氨酸标记蛋白质的对照,让每一印迹与抗组氨酸抗体(Rockland Immunochemicals,Inc.,Gilbertsville,PA和QiagenGmbH,Hilden,Germany)共孵育,以用两色分析鉴别重组蛋白质。以1∶1000稀释使用所有初始抗血清,在振荡器上孵育1小时。在用TBS+0.05%Tween洗涤几次以除掉未结合的抗体后,让膜随后与800CW染料缀合的人第二抗体(Rockland Immunochemicals,Inc.,Gilbertsville,PA)、680染料缀合的小鼠第二抗体(Li-cor Biosciences,Lincoln,NE)或800CW染料缀合的兔第二抗体(Li-Cor Biosciences)按厂商推荐的稀释度在黑暗中孵育1小时。用TBS+0.05%Tween将膜再洗涤3-5次,最后一次洗涤只用TBS。用Odyssey红外成像***(Li-Cor Biosciences)检测荧光信号(680和800)。结果示于图203(健康)和图204(康复期)中。
实施例35
金属调节的多肽的金黄色葡萄球菌DU5875表面表达
让金黄色葡萄球菌菌株DU5875(cap-,spa-)生长在富铁(TSB+0.3mM氯化铁)或贫铁(TSB+1mM联吡啶)条件中到OD600为大约0.6。
在图205的A-C图中,金黄色葡萄球菌菌株DU5875在贫铁条件下生长到OD600为大约0.75并冷冻。融化细菌,在PBS中洗涤,重悬于PBS+1%Pig IgG+1%BSA中作为封闭步骤。将针对FhuD、Opp1A或PflB产生的小鼠抗血清以1∶100稀释度用于染色大约2x106个细菌。将免疫前的小鼠血清用作阴性对照。然后在封闭缓冲液中洗涤细菌,并与AF633缀合的山羊抗小鼠第二抗体孵育,在流式细胞仪上分析。将与以1∶100稀释的免疫前小鼠血清孵育的细菌用作阴性对照。
在图205的D图中,金黄色葡萄球菌菌株DU5875生长在贫铁条件中到OD600为大约2.0并冷冻。融化细菌,在PBS中洗涤,重悬于PBS+0.2%Pig IgG+1%BSA中作为封闭步骤。将针对rSIRP7产生的小鼠抗血清以1∶50稀释度用于染色大约5x107个细菌,其中将免疫前的小鼠血清用作阴性对照。然后在封闭缓冲液中洗涤细菌,并与AF633缀合的山羊抗小鼠第二抗体孵育,在流式细胞仪上分析。
本测定结果表明,针对SIRP蛋白质产生的鼠抗体与金黄色葡萄球菌细胞结合。在贫铁条件下生长的细胞比在富铁条件下生长的细胞结合更多的抗体,这提供了对以下结论的进一步的证据:FhuD、Opp1A和PflB在低铁条件下以较高水平表达,它们为可诱导针对葡萄球菌属的免疫学活性的抗原。中值荧光强度(MFI)增加证明,当抗SIRP抗体结合金黄色葡萄球菌细胞时与免疫前的小鼠血清的MFI相比,荧光相对增加。结果示于图205中。
实施例36
将Luminex测定用于评估脾细胞的细胞因子表达,所述脾细胞来自用重组SIRP组分PflB(SEQ ID NO:353)、Opp1A(SEQ ID NO:364)、SirA(SEQ ID NO:375)、SYN2(SEQ ID NO:386)、FhuD(SEQ IDNO:397)、SYN1(SEQ ID NO:408和MntC(SEQ ID NO:419)的组合(rSIRP7)或安慰剂免疫然后用SIRP Eextract(SIRPE)或rSIRP7再刺激的小鼠。再刺激后若干细胞因子上调,由SIRPE和rSIRP7再刺激诱导的细胞因子概况相似。因响应rSIRP7或SIRPE再刺激而产生的细胞因子的总体概况与从Th1/Th17型免疫应答预期的相似,并证明用重组SIRP组分疫苗接种诱导可根据细胞因子表达测量的细胞免疫应答。
方法:用70μg用50%IFA调配的总蛋白质(OVA,SIRP提取物或rSIRP7)以14天间隔疫苗接种小鼠两次。通过用CD4+T细胞分离试剂盒和LD柱(Miltenyi Biotec,Inc.,Auburn,CA)进行阴性选择来从脾细胞悬浮液纯化CD4+T细胞。简言之,用生物素化的抗体标记除CD4+T细胞外的所有细胞,然后将链霉亲和素缀合的磁珠用于用磁性柱从混合物除掉这些细胞,留下高度纯化的CD4+T细胞。基于CD3和CD4表达发现得到的CD4+T细胞大于95%纯度。用丝裂霉素C处理幼稚脾细胞来产生有丝***不活跃的抗原呈递细胞。将4x105APC加入到5x105CD4+T细胞,加上刺激的抗原,接着孵育42小时。通过Luminex用标准测定参数分析上清液。结果如图206所示。
实施例37
用实施例1中所述方法制备来自若干菌株(Newman,Reynolds)的金黄色葡萄球菌提取物。让金黄色葡萄球菌细胞生长在含有1000μm2,2-联吡啶(Sigma-Aldrich St.Louis,MO)的铁受限的培养基中或含有300μM FeCl3(Sigma-Aldrich St.Louis,MO)的富铁培养基中。
用ITRAQ和LCQ质谱鉴别并定量测定来自富铁和贫铁培养物的金黄色葡萄球菌膜提取物中的蛋白质。用ITRAQ-8plex试剂(AppliedBiosystems,Inc.,Foster City,CA)利用40.0μg膜提取物(试剂113对比115)按照厂商的8Plex方案,进行贫铁和富铁金黄色葡萄球菌Newman菌株膜提取物的胺修饰标记。用MCX柱(Waters Corp.,Milford,MA)进行阳离子交换色谱,并用偶联到用QSTAR XL质谱仪(AppliedBiosystems,Inc.,Foster City,CA)的ESI模式的ULTIMATE 3000NANO LC***(Dionex Corp.Bannockburn,IL)分离肽。
测量了由生长在铁受限培养基中的细胞产生的金属调节的多肽与生长在富铁培养基中的所述多肽的比率。该比率是蛋白质表达的相对量度,不提供表明提取物中存在的蛋白质的绝对量的数据。结果示于表15中。
表15.
蛋白质 | 提取物中鉴定到 | 在低铁中的倍数增加 |
MntC | 是 | 22 |
SYN1 | 是 | 未测定 |
FhuD | 否 | 未测定 |
SYN2 | 是 | 23 |
SirA | 是 | 36 |
Opp1A | 是 | 未测定 |
PflB | 是 | 未测定 |
FhuD2 | 是 | 6 |
SstD | 是 | 14 |
实施例38
可将氧化爆发测定用于测量由嗜中性粒细胞产生的活性氧类别,这是炎症反应的指征。为了从新鲜血液获得嗜中性粒细胞,通过加入1∶10稀释的裂解缓冲液(150mM NH4Cl、10mM KHCO3、1mM EDTA二钠,pH 7.4)裂解来自新鲜人血液的红血细胞,在室温孵育10分钟,以430x g离心10分钟。通过倒置管去掉上清液,用PBS洗涤沉淀2次,然后重新悬浮于5ml的RPMI-Hepes 5%FCS+谷氨酰胺(完全RPMI)中,并在ISOTON中1/500稀释细胞悬浮液(20μl细胞在10mlISOTON中,Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA)后用MULTISIZER(Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA)计数。
为了制备细菌,将金黄色葡萄球菌菌株Lowenstein接种在TSB培养基中,于37℃在50ml培养基中生长20小时。于4℃以4000rpm达10分钟,将5ml该培养物沉淀。然后用50ml的PBS洗涤沉淀,通过在4℃以4000rpm离心10分钟重新沉淀。重复洗涤步骤,将细菌沉淀重新悬浮于5ml的PBS中。将细菌调整为1.109CFU/ml的理论密度,将细胞稀释液铺在琼脂板上并孵育,用于第二天准确计数。
为了去掉血清中的补体,让所有血清在56℃孵育30分钟。在聚丙烯无菌DW板上以每孔500μl的最终体积进行血清和细胞混合。向每孔中按次序加入以下试剂(如表16所示):培养基(RPMI-Hepes、谷氨酰胺、5%FCS)、合适浓度的活细菌、合适稀释度的血清、补体、合适浓度的hPMN和最后作为氧化爆发标记的DHR分子(LifeTechnologies,Inc.,Carlsbad,CA)。让板在37℃振荡孵育25分钟。通过让板在冰上孵育5分钟来终止反应。
表16.
对于流式细胞术分析,将人PMN首先按照其大小及粒度来鉴定,然后通过表面表达特异性标记(CD35、CD16、GR1等)及氧化爆发标记来确证。根据能够诱导氧化爆发的活化hPMN与阴性对照组相对比的百分比来给出数据(Didier,2003;Ploppa,2008)。
实施例39
调理吞噬测定
业已开发了调理吞噬测定(OPA)以通过测量血清的补体依赖性调理活性,来评估金黄色葡萄球菌血清的功能性吞噬活性。OPA概述于表17中。将两株金黄色葡萄球菌菌株用于测定。将不产生荚膜或A蛋白的菌株DU5875用于最佳对照测定。将表达荚膜和A蛋白的菌株LST4 Lowenstein在测定中用作野生型菌株。用于测定的细菌数量视效应白血细胞的来源而定,介于1x105cfu/ml-5x107cfu/ml浓度之间。将来自健康人志愿者或来自人早幼粒细胞性白血病细胞系HL-60的白血细胞用作吞噬效应细胞。如表17所指示,用于测定的效应细胞数量视细胞来源而定。用幼兔血清作为补体来源,视血清批号而定进行1%-10%的稀释,以便使兔血清的功能性补体活性最大化同时使毒性最小化。让进行调理活性测定的免疫前或免疫后血清在56℃30分钟去掉补体,并以1∶20-1∶2,000,000稀释度在测定中进行检测。通过金黄色葡萄球菌活菌计数(cfu)来测定吞噬作用。认为与免疫前的血清相比显示显著损失cfu和活性补体的试验血清有调理作用。通过斯氏t检验用含不等方差的单尾分布来分析测定数据。(Kim 2010;Stranger-Jones 2006;Dryla 2005)。
表17.
实施例40
免疫机理研究(体内)
在另一实施例中评估疫苗蛋白质为小鼠提供保护的免疫机理。这些实验可包括两种类型:(1)在疫苗-攻击实验中用基因敲除小鼠测定保护是否需要特定的免疫组分;和(2)过继转移实验,其中在细菌攻击前将来自免疫供体小鼠的免疫细胞转移到幼稚受者,以便检测转移的组分是否足以提供保护。
例如,涉及在基因敲除小鼠中的疫苗攻击实验,小鼠可购自商业供应者,可包括几种表征完全的品系,例如B细胞敲除(μMT)、T细胞敲除(TCRα)和诸如IFN-γ、IL-1α、TNFα、IL-17等多种细胞因子敲除)。小鼠可如实施例3所述免疫,并如实施例5所述用金黄色葡萄球菌攻击。用含同样遗传背景的野生型小鼠(Balb/c)可提供合适的对照,以测量敲除对疫苗介导的针对金黄色葡萄球菌的保护的影响。例如,若疫苗接种的B细胞敲除小鼠相对于疫苗接种的对照小鼠因响应细菌攻击而死得更快,或死亡数量更多,则可推断B细胞(或其产物)对疫苗介导的针对金黄色葡萄球菌的保护重要。这些策略在关于测量各种免疫组分对疫苗保护的贡献的领域为标准实践(Spellberg,2008;Lin,2009)。
例如,涉及免疫组分的过继转移,可如实施例3所述免疫野生型Balb/c供体小鼠,以便产生用于过继转移的组织。然后可在第二次免疫后的2-4周让这些小鼠安乐死,经由心脏穿刺采集血液,收集第二淋巴组织(***和脾脏)。收集的***可包括:腋窝***、臂***、肠系膜***、腹股沟***、浅表颈***、深部颈***和腰***。可用标准方法自血液分离血清,例如基于离心的血清分离器,然后经由静脉内或腹膜内注射转移回到不同受者小鼠群。每个受者使用1-3个供者小鼠对血清转移是合理的比率,可发生在至多0.5ml体积内。另外,可用抗体和在本领域为标准实践的磁珠富集技术(Miltenyi Biotec)纯化来自供体淋巴组织的T细胞。用这些方法通常达到95-99%的细胞纯度,其通过用针对特定谱系标记的抗体染色细胞表面蛋白质及通过流式细胞术检查细胞来评估。可经由静脉内注射将目的细胞群(例如CD4+T细胞、CD8+T细胞等)转移回受者动物(每个受者2,000,000-5,000,000个T细胞)。受者小鼠可接受T细胞(或T细胞亚群)、免疫血清或二者。
作为阴性对照,亦可将安慰剂免疫的动物用于血清和T细胞分离,接着转移回幼稚受者。作为阳性对照,可包括获得用标准保护性疫苗免疫的受者组,以便提供对细菌攻击的保护功效的基线评估。
当受者小鼠接受各种转移的细胞或血清后,可如实施例5所述用金黄色葡萄球菌攻击它们。可基于死亡百分比和死亡速率来评估各种免疫组分对疫苗保护的相对贡献。例如,若给予来自免疫接种供体的T细胞的受者,以与阳性对照相同比率针对攻击提供保护,则可推断对于疫苗介导的保护T细胞就足够了。本实验策略为关于评估疫苗免疫机理的领域的标准实践(Spellberg,2008;Lin,2009)。
实施例41
铁摄取测定的抑制
为了评估针对SIRP组分的抗体是否通过阻断铁摄取来抑制细胞生长,可用与抗SIRP抗血清预孵育的细菌细胞进行铁摄取/转运测定。让来自任何菌株的金黄色葡萄球菌细胞在螯合或富铁培养基中生长过夜。让细胞在同一培养基中传代培养,并生长到对数中期至晚期,沉淀并与抗SIRP抗血清或对照抗血清在PBS中孵育至多1小时。然后通过用0.45μM过滤器过滤来收获细胞,然后重新悬浮于Chelex-100处理的基本培养基中以排除环境铁。短暂振荡细胞。同时,让铁源(例如铁色素)与放射标记的55FeCl2(或另一种放射标记的铁分子)和氮川三乙酸混合,并使其孵育几分钟。
为了开始铁摄取,将小等份样(例如10μl)的放射标记的铁混合物加入到10ml无Fe培养管中的细胞(以1ml体积)中。让管周期性旋涡孵育,取等份样过滤到膜滤器上,用LiCl洗涤。干燥后,在闪烁液中计数膜以定量测定铁摄取。与抗SIRP抗血清预孵育的细胞应该比与对照抗血清预孵育的细胞更慢摄取铁(Sebulsky,2000;Goel,2001)。
实施例42
高收率蛋白质纯化方案
在某些情况中,用高收率方法纯化重组的rSIRP。针对多肽的更高收率和更高纯度优化该方法。通过让含有重组产生的多肽的细菌沉淀重新悬浮在补充有溶菌酶(100μg/ml最终浓度)和MgCl2(1mM最终浓度)的20mM Tris pH 9、300mM NaCl中来实施该方法。然后让样品在4℃轻微振荡孵育15分钟。15分钟后,加入1U/ml benzonase,让样品在室温孵育1小时。应该用0.45μm过滤器让离心(20,000x g,4℃20分钟)后获得的可溶性裂解液过滤,并将其加入到装有镍-His结合树脂(Novagen 69670-4,EMD Chemicals,Inc.,Gibbstown,NJ)的平衡的5ml引力柱中。按厂商说明书进行N-His6-蛋白的纯化。用HiLoad26/60 Superdex 75制备级的大小排阻柱(GE Healthcare Bioscienes,Piscataway,NJ)最后纯化N-His6-蛋白质。用20mM Tris pH 9、300mMNaCl利用BioCAD FPLC(Applied Biosystems Inc.,Foster City,CA)平衡该柱,将15ml蛋白质样品以1.5ml/分钟流速上样到HiLoad柱上。用20mM Tris pH 9、300mM NaCl作为流动相以1.8ml/分钟流速运行3.5小时后洗脱样品。
用改良版的BCA(Thermo Fisher Scientific,Inc.,Rockford,IL)程序定量测定多肽,其中使用15%十二烷基硫酸钠(SDS)、8M尿素和2.5%3-([3-胆酰胺丙基]二甲基铵基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPS)来确保完全溶解样品内的所有蛋白质。测定亦包括加入到BCA工作试剂中的5%SDS,以在BCA反应阶段期间维持蛋白质的溶解性。按照产品文献来进行BCA的读数和分析。
对于密度计分析,如下定量测定3.0μg最终产物抗原的纯度:用10%SDS PAGE、考马斯染色和用ODYSSEY扫描仪(LiCorBiosciences,Lincoln,NE)成像。扫描染色的凝胶,测定主要组分相对于总面积的面积。用Endotrap blue one/endosafe试剂盒(Hyglos GmbH,Regendburg,Germany)除去残留内毒素。在PBS储存缓冲液中以介于1.0mg/ml-4.0mg/ml的浓度在低于-70℃下以合适等份样储存最后批次。
本文引用的所有专利、专利申请及出版物和可获得的电子材料(包括例如在例如GenBank和RefSeq中提呈的核苷酸序列和在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中提呈的氨基酸序列及自GenBank和RefSeq中的注释编码区翻译的氨基酸序列)的完整公开内容,都通过引用结合。若本申请公开内容与通过引用结合于此的任何文件的一种或多种公开内容之间存在任何矛盾,则应以本申请公开内容为准。给出前述详述及实施例仅用于明确理解。从其中不应该理解有不必要的限制。本发明不限于所显示和阐述的精确细节,因为对本领域技术人员显而易见的变化应包括在权利要求所限定的本发明内。
除非另外指出,否则本说明书和权利要求中所用的表达组分的量、分子量等的所有数值,应该理解为在所有情况下由术语“约”来修饰。因此,除非另外指出与此相反,否则本说明书和权利要求中所提出的数值参数为近似值,其可根据寻求通过本发明获得的期需特性而变化。丝毫不试图限制等同于权利要求范围的教义,每一数值参数至少应该根据报道的有效数字的数值并通过应用一般四舍五入技术来理解。
尽管本发明的宽广范围提出的数字范围和参数为近似值,但在具体实施例中提出的数值应尽可能精确地报告。然而,所有数值固有地包括因在其各自试验测量中存在的标准偏差而必然产生的范围。
所有标题都是为了方便读者,除非如此规定,否则不应该用于限制标题后正文的含义。
Claims (57)
1.一种组合物,其包含:
与SEQ ID NO:397的氨基酸序列具有至少92%序列相似性的分离多肽,条件是若所述分离多肽在氨基末端包括一个或多个另外的氨基酸,则与SEQ ID NO:399的1-26位氨基酸相比,所述一个或多个另外的氨基酸包括至少一种氨基酸缺失或至少一种氨基酸取代。
2.一种组合物,其包含:
与SEQ ID NO:408的氨基酸序列具有至少98%序列相似性的分离多肽,条件是若所述分离多肽在氨基末端包括一个或多个另外的氨基酸,则与SEQ ID NO:415的1-5位氨基酸相比,所述一个或多个另外的氨基酸包括至少一种氨基酸缺失或至少一种氨基酸取代。
3.权利要求1或权利要求2的组合物,其中所述组合物保护动物免受选自ATCC 19636或ATCC 25904的金黄色葡萄球菌的攻击。
4.权利要求1或权利要求2的组合物,其还包含药学上可接受的载体。
5.权利要求1的组合物,其中所述多肽包含与SEQ ID NO:397的氨基酸序列具有至少95%序列相似性的氨基酸序列。
6.权利要求1的组合物,其中所述多肽包含与SEQ ID NO:397的氨基酸序列具有至少92%序列同一性的氨基酸序列。
7.权利要求6的组合物,其中所述多肽包含与SEQ ID NO:397的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列。
8.权利要求2的组合物,其中所述多肽包含与SEQ ID NO:397的氨基酸序列具有至少98%序列同一性的氨基酸序列。
9.权利要求2的组合物,其中所述多肽包含与SEQ ID NO:408的氨基酸序列具有至少98%序列同一性的氨基酸序列。
10.权利要求1或权利要求2的组合物,其还包含至少一种第二多肽,其中所述第二多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,并且当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离。
11.权利要求10的组合物,其中所述第二多肽包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%相似性的氨基酸序列:SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:355、SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:357、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:362、SEQ ID NO:363、SEQ ID NO:364、SEQ ID NO:365、SEQ ID NO:366、SEQ ID NO:367、SEQ ID NO:368、SEQ ID NO:369、SEQ ID NO:370、SEQ ID NO:371、SEQ ID NO:372、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:395、SEQ ID NO:396、SEQ ID NO:419、SEQ ID NO:420、SEQ ID NO:421、SEQ ID NO:422、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:424、SEQ ID NO:425、SEQ ID NO:426、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:428或SEQ ID NO:429。
12.权利要求1的组合物,其还包含至少一种第二多肽,其中所述第二多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离,并且包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%相似性的氨基酸序列:SEQID NO:408、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:410、SEQ ID NO:411、SEQID NO:412、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:415、SEQID NO:416、SEQ ID NO:417或SEQ ID NO:418。
13.权利要求12的组合物,其中所述第二多肽包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:408、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:410、SEQ ID NO:411、SEQ ID NO:412、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:415、SEQ ID NO:416、SEQ ID NO:417或SEQ ID NO:418。
14.权利要求2的组合物,其还包含至少一种第二多肽,其中所述第二多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离,并且包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%相似性的氨基酸序列:SEQID NO:397、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:400、SEQID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:404、SEQID NO:405、SEQ ID NO:406或SEQ ID NO:407。
15.权利要求14的组合物,其中所述第二多肽包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406或SEQ ID NO:407。
16.权利要求1或权利要求2的组合物,所述组合物还包含:
以下分离多肽,其可分离自当在没有铁螯合剂的培养基中生长时的金黄色葡萄球菌,并且具有150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa、40kDa的分子量;或
所述分离多肽的组合。
17.一种用于治疗受试者的感染的方法,所述方法包括:
将有效量的组合物给予具有由葡萄球菌属引起的感染或处于具有所述感染的风险中的受试者,其中所述组合物包含:
与SEQ ID NO:397的氨基酸序列具有至少80%序列相似性的分离多肽。
18.一种用于治疗受试者的症状的方法,所述方法包括:
将有效量的组合物给予具有由葡萄球菌属引起的感染的受试者,其中所述组合物包含:
与SEQ ID NO:397的氨基酸序列具有至少80%序列相似性的分离多肽。
19.一种用于治疗受试者的感染的方法,所述方法包括:
将有效量的组合物给予具有由葡萄球菌属引起的感染或处于具有所述感染的风险中的受试者,其中所述组合物包含:
与SEQ ID NO:397的氨基酸序列具有至少80%序列相似性的分离多肽。
20.一种用于治疗受试者的感染的方法,所述方法包括:
将有效量的组合物给予具有由葡萄球菌属引起的感染或处于具有所述感染的风险中的受试者,其中所述组合物包含:
与SEQ ID NO:408的氨基酸序列具有至少80%序列相似性的分离多肽。
21.一种用于治疗受试者的症状的方法,所述方法包括:
将有效量的组合物给予具有由葡萄球菌属引起的感染的受试者,其中所述组合物包含:
与SEQ ID NO:408的氨基酸序列具有至少80%序列相似性的分离多肽。
22.一种用于治疗受试者的感染的方法,所述方法包括:
将有效量的组合物给予具有由葡萄球菌属引起的感染或处于具有所述感染的风险中的受试者,其中所述组合物包含:
与SEQ ID NO:408的氨基酸序列具有至少80%序列相似性的分离多肽。
23.权利要求17-22中任一项的方法,其中所述组合物还包含至少一种第二多肽,其中所述第二多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,并且当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离。
24.权利要求23的方法,其中所述第二多肽具有通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳测定的以下分子量:88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa。
25.权利要求17-22中任一项的方法,其中所述组合物还包含至少一种第二多肽,所述第二多肽包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%相似性的氨基酸序列:SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:355、SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:357、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:362、SEQ ID NO:363、SEQ ID NO:364、SEQ ID NO:365、SEQ ID NO:366、SEQ ID NO:367、SEQ ID NO:368、SEQ ID NO:369、SEQ ID NO:370、SEQ ID NO:371、SEQ ID NO:372、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:395、SEQ ID NO:396、SEQ ID NO:419、SEQ ID NO:420、SEQ ID NO:421、SEQ ID NO:422、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:424、SEQ ID NO:425、SEQ ID NO:426、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:428或SEQ ID NO:429。
26.权利要求17-19中任一项的方法,其中所述组合物还包含至少一种第二多肽,其中所述第二多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离,并且包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%相似性的氨基酸序列:SEQ ID NO:408、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:410、SEQ ID NO:411、SEQ ID NO:412、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:415、SEQ ID NO:416、SEQ ID NO:417或SEQ ID NO:418。
27.权利要求26的方法,其中所述第二多肽包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:408、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:410、SEQ ID NO:411、SEQ ID NO:412、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:415、SEQ ID NO:416、SEQ ID NO:417或SEQ ID NO:418。
28.权利要求20-22中任一项的方法,其中所述组合物还包含至少一种第二多肽,其中所述第二多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离,并且包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%相似性的氨基酸序列:SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406或SEQ ID NO:407。
29.权利要求29的方法,其中所述第二多肽包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406或SEQ ID NO:407。
30.权利要求17-22中任一项的方法,其中所述组合物还包含:
以下分离多肽,其可分离自当在不含铁螯合剂的培养基中生长时的金黄色葡萄球菌,并且具有通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳测定的以下分子量:150kDa、132kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa、40kDa;或
所述分离多肽的组合。
31.权利要求17-22中任一项的方法,其中所述受试者为哺乳动物。
32.权利要求31的方法,其中所述哺乳动物为人。
33.权利要求17-22中任一项的方法,其中所述葡萄球菌属为金黄色葡萄球菌。
34.一种用于治疗受试者的感染的方法,所述方法包括:
将有效量的组合物给予具有由葡萄球菌属引起的感染或处于具有所述感染的风险中的受试者,其中所述组合物包含:
特异性结合分离的多肽的抗体,所述分离的多肽与SEQ IDNO:397的氨基酸序列具有至少80%的序列相似性。
35.一种用于治疗受试者的症状的方法,所述方法包括:
将有效量的组合物给予具有由葡萄球菌属引起的感染的受试者,其中所述组合物包含:
特异性结合分离的多肽的抗体,所述分离的多肽与选自SEQ IDNO:397的氨基酸序列具有至少80%的序列相似性。
36.一种用于降低受试者中的定植的方法,所述方法包括:
将有效量组合物给予葡萄球菌属定植的受试者,其中所述组合物包含:
与SEQ ID NO:397的氨基酸序列具有至少80%序列相似性的分离多肽。
37.一种用于治疗受试者的感染的方法,所述方法包括:
将有效量的组合物给予具有由葡萄球菌属引起的感染或处于具有所述感染的风险中的受试者,其中所述组合物包含:
特异性结合分离的多肽的抗体,所述分离的多肽与SEQ IDNO:408的氨基酸序列具有至少80%的序列相似性。
38.一种用于治疗受试者的症状的方法,所述方法包括:
将有效量的组合物给予具有由葡萄球菌属引起的感染的受试者,其中所述组合物包含:
特异性结合分离的多肽的抗体,所述分离的多肽与SEQ IDNO:408的氨基酸序列具有至少80%的序列相似性。
39.一种用于降低受试者中的定植的方法,所述方法包括:
将有效量的组合物给予葡萄球菌属定植的受试者,其中所述组合物包含:
与SEQ ID NO:408的氨基酸序列具有至少80%序列相似性的分离多肽。
40.权利要求34-39中任一项的方法,其中所述组合物还包含特异性结合至少一种第二多肽的抗体,其中所述第二多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,并且当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离。
41.权利要求40的方法,其中所述第二多肽具有通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳测定的以下分子量:88kDa、55kDa、38kDa、37kDa、36kDa、35kDa或33kDa。
42.权利要求40的方法,其中所述第二多肽包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%相似性的氨基酸序列:SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:355、SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:357、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:362、SEQ ID NO:363、SEQ ID NO:364、SEQ ID NO:365、SEQ ID NO:366、SEQ ID NO:367、SEQ ID NO:368、SEQ ID NO:369、SEQ ID NO:370、SEQ ID NO:371、SEQ ID NO:372、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:395、SEQ ID NO:396、SEQ ID NO:419、SEQ ID NO:420、SEQ ID NO:421、SEQ ID NO:422、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:424、SEQ ID NO:425、SEQ ID NO:426、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:428或SEQ ID NO:429。
43.权利要求34-36中任一项的方法,其中所述组合物还包含特异性结合至少一种第二多肽的抗体,其中所述第二多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离,并且包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%相似性的氨基酸序列:SEQ ID NO:408、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:410、SEQ ID NO:411、SEQ ID NO:412、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:415、SEQ ID NO:416、SEQ ID NO:417或SEQ ID NO:418。
44.权利要求43的方法,其中所述第二多肽包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:408、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:410、SEQ ID NO:411、SEQ ID NO:412、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:415、SEQ ID NO:416、SEQ ID NO:417或SEQ ID NO:418。
45.权利要求37-39中任一项的方法,其中所述组合物还包含特异性结合至少一种第二多肽的抗体,其中所述第二多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离,并且包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%相似性的氨基酸序列:SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406或SEQ ID NO:407。
46.权利要求45的方法,其中所述第二多肽包含与以下任一个的氨基酸序列具有至少85%相似性的氨基酸序列:SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406或SEQ ID NO:407。
47.权利要求34-39中任一项的方法,其中所述组合物还包含:
特异性结合多肽的抗体,所述多肽可分离自当在不含铁螯合剂的培养基中生长时的金黄色葡萄球菌,并且具有通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳测定的以下分子量:150kDa、292kDa、120kDa、75kDa、58kDa、50kDa、44kDa、43kDa、41kDa、40kDa;或
这类分离的多肽的组合。
48.权利要求34-39中任一项的方法,其中所述受试者为哺乳动物。
49.权利要求48的方法,其中所述哺乳动物为人。
50.权利要求34-39中任一项的方法,其中所述葡萄球菌属为金黄色葡萄球菌。
51.权利要求34-39中任一项的方法,其中所述抗体为多克隆抗体。
52.权利要求34-39中任一项的方法,其中所述抗体为多克隆抗体。
53.权利要求34-39中任一项的方法,其中所述抗体为单克隆抗体。
54.一种用于检测特异性结合多肽的抗体的试剂盒,所述试剂盒在分开的容器中包括:
与SEQ ID NO:408或SEQ ID NO:397的氨基酸序列具有至少80%序列相似性的分离多肽;和
检测特异性结合所述多肽的抗体的试剂。
55.权利要求24或权利要求41的方法,
其中具有88kDa分子量的分离多肽具有以下质量指纹,其与由金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636表达的88kDa多肽的质量指纹有至少80%相似性,其中所述多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,并且当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离;
其中具有55kDa分子量的分离多肽具有以下质量指纹,其与由金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636表达的55kDa多肽的质量指纹有至少80%相似性,其中所述多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,并且当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离;
其中具有38kDa分子量的分离多肽具有以下质量指纹,其与由金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636表达的38kDa多肽的质量指纹有至少80%相似性,其中所述多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,并且当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离;
其中具有37kDa分子量的分离多肽具有以下质量指纹,其与由金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636表达的37kDa多肽的质量指纹有至少80%相似性,其中所述多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,并且当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离;
其中具有36kDa分子量的分离多肽具有以下质量指纹,其与由金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636表达的36kDa多肽的质量指纹有至少80%相似性,其中所述多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,并且当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离;
其中具有35kDa分子量的分离多肽具有以下质量指纹,其与由金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636表达的35kDa多肽的质量指纹有至少80%相似性,其中所述多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,并且当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离;和
其中具有33kDa分子量的分离多肽具有以下质量指纹,其与由金黄色葡萄球菌ATCC菌株19636表达的33kDa多肽的质量指纹有至少80%相似性,其中所述多肽可分离自当在包含铁螯合剂的培养基中培养时的金黄色葡萄球菌,并且当在没有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离。
56.一种组合物,其包含:
特异性结合分离的多肽的抗体,所述分离的多肽与SEQ IDNO:397的氨基酸序列具有至少92%的序列相似性,条件是若所述分离的多肽在氨基末端包括一个或多个另外的氨基酸,则与SEQ IDNO:399的1-26位氨基酸相比,所述一个或多个另外的氨基酸包括至少一种氨基酸缺失或至少一种氨基酸取代。
57.一种组合物,其包含:
特异性结合分离的多肽的抗体,所述分离的多肽与SEQ IDNO:408的氨基酸序列具有至少98%的序列相似性,条件是若所述分离的多肽在氨基末端包括一个或多个另外的氨基酸,则与SEQ IDNO:415的1-5位氨基酸相比,所述一个或多个另外的氨基酸包括至少一种氨基酸缺失或至少一种氨基酸取代。
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