CN111650144A - 重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法 - Google Patents

重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法，本发明用不同浓度的GST标准品和SpA5蛋白原液包被酶标板，检测SpA5蛋白原液中GST的含量，是以GST标准品溶液吸光度值对其相应的浓度拟合出标准曲线，将HI蛋白原液吸光度值代入标准曲线计算出SpA5蛋白原液中的GST含量，再计算出SpA5蛋白原液中的GST残留量。所述检测方法灵敏度高，能特异性的测出重组金黄色葡萄球菌疫苗HI蛋白原液中的GST含量。

Description

重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测 方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种革兰阳性菌，广泛分布于自然界，存在人和动物的体表、鼻咽、***部及肠道，通常引发皮肤软组织感染、菌血症以及转移并发症，如肺炎、心内膜炎、脓毒性关节炎和骨髓炎。1961年英国首次报道分离出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)以来，目前MRSA已成为全球医院内感染率最高的病原菌之一，与乙型肝炎、AIDS并称为当今世界3大感染性疾病。MRSA对绝大多数抗生素产生多重耐药，目前万古霉素是治疗MRSA的最后一道防线。随着抗生素的滥用，金黄色葡萄球菌的耐药性也在不断发生变化，美国分别于2002和2004年报道分离出耐万古霉素金葡菌(VRSA)，使得MRSA可能将面临无抗生素可治的严峻挑战。因此，研发能有效预防MRSA感染和耐药性发展的新型MRSA疫苗具有重要意义。而首先研发出具有自主知识产权的、高效、安全、经济的MRSA疫苗对控制MRSA感染、耐药性发展、生物恐怖防御和提高国际竞争力具有重要意义。
目前，我国自主研发的重组金黄色葡萄球菌疫苗为多组分重组蛋白疫苗，于2019年进入了II期临床试验阶段。由于在产业化放大生产重组金黄色葡萄球菌疫苗需要严格把控疫苗质量，保证疫苗的安全性，合格性和有效性，而SpA5蛋白是该疫苗的成分之一，然而在生产SpA5蛋白原液过程中，首先需要通过初级纯化获得的是GST-SPA5融合蛋白，再经过PreScission protease酶切和精细纯化后才能获得SpA5蛋白原液，因此最后获得的SpA5蛋白原液中可能残留GST蛋白。为了保证获得的SpA5蛋白原液所有质检项目合格，我们需要对纯化后SpA5蛋白原液进行GST残留量检测。而目前市场上现有的试剂盒中没有针对重组金黄色葡萄球菌疫苗SPA5蛋白原液的GST残留量检测的试剂盒，因此发明和研究重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法迫在眉睫。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法，分别以梯度稀释的GST蛋白溶液和重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液为包被酶标板，洗涤后用牛血清白蛋白溶液封闭，加入GST鼠抗体与封闭好的酶标板反应，再用HRP标记的山羊抗鼠抗体与酶标板反应，加入TMB显色液显色并终止反应，接着在波长450nm处测定吸光度，根据梯度稀释的GST蛋白溶液的吸光度绘制标准曲线，最后以重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液的吸光度数值在标准曲线上得到重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量。
优选的，所述梯度稀释的GST蛋白溶液浓度分别为1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8125ng/ml。
优选的，所述重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液浓度为250μg/ml。
优选的，所述封闭为将质量分数为1％牛血清白蛋白溶液以200μl/孔加至酶标板内封闭酶标板，37℃放置2小时。
优选的，所述GST鼠抗体浓度为400ng/ml；所述HRP标记的山羊抗鼠抗体浓度为80ng/ml。
优选的，所述TMB显色液为可溶性单组份TMB底物溶液。
优选的，所述标准曲线为y＝0.002x-0.0461，相关系数为R2＝0.9893。
优选的，所述GST蛋白溶液由以下方法制备，将含有pGEX-6P-2的XL-1blue菌液活化后，加入IPTG在30℃下诱导表达，然后收集菌体超声破碎，离心收集上清用GlutathioneSepharose 4B填料柱子进行亲和层析，再用谷胱甘肽溶液进行洗脱，接着进行G25脱盐柱脱盐，获得的GST蛋白保存于磷酸盐缓冲液中，获得GST蛋白溶液。
本发明的有益效果在于：本发明公开了重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法，通过选择pGEX-6P-2/XL-1blue制备出高纯度GST蛋白，能够特异性检测出重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留；同时还能准确的计算出重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量。可以用于检测产业化放大生产重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5白原液中GST残留量是否合格，保证疫苗的安全性，合格性和有效性的重要手段。该GST残留量检测方法检测SpA5蛋白原液中GST残留量是否合格为制备出合格的重组金黄色葡萄球菌疫苗打下夯实的基础，同时为检测试剂盒的研制及应用具有重要的作用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为GST纯化电泳图；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明的菌株pGEX-6P-2/XL-1blue由pGEX-6P-2转化大肠杆菌获得，为本实验室保存。
本发明使用的试剂获得途径如下：无水碳酸钠，国药集团化学试剂有限公司；碳酸氢钠，国药集团化学试剂有限公司；GST蛋白，自制；牛血清白蛋白，新西兰；PBS缓冲液干粉，无锡傲锐东源生物；吐温-20，diamond；兔多克隆抗体，自制；山羊抗小鼠IgG辣根酶(HRP)标记，北京中杉金桥；Anti GST Tag Mouse，Abbkine；可溶型单组分TMB底物溶液，TIANGEN；ELISA终止液，自制。
实施例1、GST蛋白的制备
(1)GST蛋白诱导表达
1)取pGEX-6P-2/XL-1blue菌液100μL加入10mL Amp抗性的LB培养基中，80rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液2ml加入400mL Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养5h，转速200rpm，加入IPTG再置于30℃摇床诱导表达3h。
2)将诱导表达后的菌液取出，离心弃去上清，加入PBS混匀，超声裂解，再4℃离心分离上清和沉淀。
(2)纯化GST蛋白溶液
1)将上步获得的超声裂解上清用Glutathione Sepharose 4B填料柱子进行亲和层析，提取GST蛋白；
2)亲和层析完毕后，采用谷胱甘肽溶液进行洗脱获得GST蛋白溶液；
3)将洗脱获得的GST溶液进行脱盐，采用G25脱盐柱脱盐，GST蛋白保存于磷酸盐缓冲液中。
4)纯化SDS-PAGE电泳结果如图1。
收取洗脱液GST为目标蛋白，进行BCA浓度测定OD562nm处吸光度值如表1所示，通过线性拟合计算结果为GST蛋白溶液1.04mg/ml。
表1、OD562nm吸光度值
1 2 3 4 5 6 7 8 9
2.345 1.860 1.295 1.022 0.771 0.483 0.315 0.164 0.136
2.302 1.824 1.289 1.018 0.764 0.471 0.311 0.169 0.136
0.048 0.038 0.038 0.043 0.039 0.039 0.038 0.038 0.038
1.305 0.043 0.043 0.039 0.039 0.039 0.039 0.116 0.038
1.306 0.041 0.041 0.042 0.039 0.044 0.039 0.036 0.038
pGEX-6P-2/XL-1blue在30℃下高GST可溶性目的蛋白，经过纯化其纯度达到95％以上。
实施例2、兔多克隆抗体的制备
兔多克隆抗体的制备，具体步骤如下：
1)购买健康家兔一只，心脏采血收集血液约60ml。
2)将收集血液，置于37℃恒温培养箱静置2h。
3)4℃，2000rpm离心30min，收集兔血清。
4)经过Protein A柱结合，并用甘氨酸缓冲液洗脱收集蛋白峰。
5)加入甘油保存于-80℃备用。
实施例3、重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液GST残留量检测
(1)取实施例1制备的GST蛋白溶液，用包被液稀释成每1ml中含GST蛋白1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng的溶液；SPA5重组蛋白原液(Patent No.：US 9,890,199 B2)浓度(T)为0.92mg/ml，用包被液稀释3.68倍(n)成每1ml中约含250μg的溶液，分别以100μl/孔加至96孔酶标板内，每个稀释度做双孔，同时加入2孔空白对照(包被液)4℃放置过夜。
(2)用洗涤液洗板4次，用洗涤液制备1％牛血清白蛋白溶液，以200μl/孔加至酶标板内封闭酶标板，37℃放置2小时。
(3)将封闭好的酶标板用洗涤液洗板4次，取1mg/ml阴性兔多抗，以100μl/孔加至酶标板内，37℃恒温孵育1小时。
(4)用洗涤液洗板4次，将GST鼠抗体用稀释液稀释1000倍，以100μl/孔加至酶标板内，37℃放置1小时。
(5)用稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠抗体5000倍，以100μl/孔加至酶标板内，37℃放置40分钟。
(6)用洗涤液洗板4次，以100μl/孔加入底物液，37℃避光放置10分钟，以50μl/孔加入终止液终止反应。
(7)用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值如表2所示，以不同浓度GST溶液吸光度对其相应的浓度拟合标准曲线：y＝0.002x-0.0461，相关系数R2＝0.9893，以SpA5蛋白原液吸光度数值在标准曲线上得到SpA5蛋白原液中GST浓度(c)为32.8ng/ml。
表2、OD450nm吸光度值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1.423 1.037 0.515 0.213 0.090 0.064 0.063 0.054 0.058 0.046 0.076
1.370 1.034 0.519 0.197 0.086 0.062 0.058 0.053 0.054 0.045 0.075
按以下公式计算：
Figure BDA0002587402520000051
SpA5蛋白原液中GST含量为0.01312％。
实施例4、重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液GST残留量检测方法验证
(1)准确度：验证采用该方法测定的结果与真实值或参考值的接近程度
配制500ng/ml,250ng/ml,31.25ng/ml 3个浓度工作对照品，按照实施例3中步骤测定该3个工作对照品浓度。根据标准曲线y＝0.0016x-0.0289，R2＝0.9938，计算出浓度，回收率依次为99.7％，104.7％，79.8％；均在可接受标准范围内，可接受标准：回收率应为75％～125％，结果如表3所示。
表3、准确度计算表
Figure BDA0002587402520000052
(2)精密度
1)重复性：在相同的条件下，同一个分析人员测定所得结果的精密度。
取同样一份SpA5蛋白原液样品，按照实施例3中步骤重复检测6次，根据标准曲线y＝0.0018x-0.0312，R2＝0.9922，计算出浓度样品并计算SpA5原液样品6份数据的RSD为1.7％，在可接受范围内，可接受标准：RSD值应＜20％；结果如表4所示。
表4、重复性计算表
Figure BDA0002587402520000061
2)中间精密度：不同分析人员、不同日期对精密度的影响。
取同样一份SpA5原液样品，按照实施例3中步骤,由两个人员在不同日期分别重复检测6次，计算HI原液样品12份数据的RSD。中间精密度检测结果，SpA5原液的RSD％为5.99％，在可接受范围内，可接受标准：RSD值应＜30％，结果如表5所示。
表5、中间精密度计算表
Figure BDA0002587402520000062
(3)检测限：确认样品中的被分析物能够被检测到的最低量。
精密移取31.25ng/ml的标准品溶液300ul，300ul，150ul，100ul，50ul，加包被液0ul，300ul，450ul，700ul，750ul，制成含GST蛋白分别为31.25ng/ml，15.625ng/ml，7.8125ng/ml，3.90625ng/ml。根据标准曲线y＝0.002x-0.0337，R2＝0.9850，检测限计算结果，符合可接受标准，但是同时可以根据数据看出浓度在＜31.25ng/ml，＞0ng/ml时，数据差异不大，因此可判断出最低的检测限为31.25ng/ml，结果如表6所示。
表6、检测限计算表
Figure BDA0002587402520000071
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (8)

1.重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法，其特征在于：分别以梯度稀释的GST蛋白溶液和重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液为包被酶标板，洗涤后用牛血清白蛋白溶液封闭，加入GST鼠抗体与封闭好的酶标板反应，再用HRP标记的山羊抗鼠抗体与酶标板反应，加入TMB显色液显色并终止反应，接着在波长450nm处测定吸光度，根据梯度稀释的GST蛋白溶液的吸光度绘制标准曲线，最后以重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液的吸光度数值在标准曲线上得到重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量。
2.根据权利要求1所述重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法，其特征在于：所述梯度稀释的GST蛋白溶液浓度分别为1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8125ng/ml。
3.根据权利要求1所述重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法，其特征在于：所述重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液浓度为250μg/ml。
4.根据权利要求1所述重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法，其特征在于：所述封闭为将质量分数为1％牛血清白蛋白溶液以200μl/孔加至酶标板内封闭酶标板，37℃放置2小时。
5.根据权利要求1所述重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法，其特征在于：所述GST鼠抗体浓度为400ng/ml；所述HRP标记的山羊抗鼠抗体浓度为80ng/ml。
6.根据权利要求1所述重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法，其特征在于：所述TMB显色液为可溶性单组份TMB底物溶液。
7.根据权利要求1所述重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法，其特征在于：所述标准曲线为y＝0.002x-0.0461，相关系数为R2＝0.9893。
8.根据权利要求1所述重组金黄色葡萄球菌疫苗SpA5蛋白原液中GST残留量检测方法，其特征在于：所述GST蛋白溶液由以下方法制备，将含有pGEX-6P-2的XL-1blue菌液活化后，加入IPTG在30℃下诱导表达，然后收集菌体超声破碎，离心收集上清用GlutathioneSepharose 4B填料柱子进行亲和层析，再用谷胱甘肽溶液进行洗脱，接着进行G25脱盐柱脱盐，获得的GST蛋白保存于磷酸盐缓冲液中，获得GST蛋白溶液。
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