CN112898387A - 一种重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，解决了现有技术中纯化工艺在放大过程中出现纯化收率低，蛋白收获量少的技术问题。它顺次包括下述步骤：（1）菌体破碎，（2）澄清过滤，（3）SPFF柱层析，（4）SPHP柱层析，（5）酶切，（6）Phenyl HP柱层析，（7）G25柱层析，（8）Q HP柱层析，（9）原液制备。本发明提供的重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，解决了纯化工艺在放大过程中纯化收率低的问题，蛋白收获量高。

Description

一种重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法。
背景技术
SpA5抗原蛋白，金葡菌临床分离株均表达SpA，表明SpA为一种高度保守的抗原成分。其分子量为55kDa，分布在细胞壁表面。成熟肽的N端包含5个56-61氨基酸残基的Ig结合结构域，卷曲成三个alpha螺旋束。该结构域能结合于哺乳动物IgG，从而抑制宿主调理吞噬作用。亦能与VH3型的B细胞受体结合，使B细胞凋亡而破坏获得性及天然免疫应答。
在金葡菌感染的脓毒性关节炎、败血症和皮肤脓肿的小鼠模型中，SpA缺陷突变的金葡菌毒力降低，其原因认为是与IgG-Fc结合的SpA减少，降低了金葡菌的抗吞噬作用。SpA抗吞噬作用的机制可能为：①SpA与IgG结合消耗了免疫球蛋白，致使其与吞噬细胞Fc受体的结合减少，降低IgG的调理作用；②葡萄球菌外包被了IgG，在空间上阻止了吞噬细胞与葡萄球菌的接触及吞噬作用。
SpA是一个能和多种宿主成分起作用的多能毒力因子。SpA的Fc结合区域也能与TNFR1结合，发挥肿瘤坏死因子(TNF)样作用，启动TNF信号级联放大反应，发挥促炎效应，这是葡萄球菌性肺炎致病的关键。
SpA可以在IgG存在情况下与血管性假血友病因子(vonWillebrand factor，vWF)结合。vWF是止血过程中一个关键因子，遗传性vWF缺陷可导致严重出血的血友病症状。vWF的主要功能是捕捉血循环中的血小板，并将其固定在血管损伤处，同时刺激血凝块的形成。SpA也可通过Spa-gC1qR/p33直接与血小板结合。SpA是一种黏附因子，其与血小板结合有助于金葡菌在血管内损伤处定植，在血管内感染和感染性心内膜炎的发生过程中起重要作用。
MntC抗原蛋白，金葡菌的生存需要多种金属离子，它们参与多种生化过程，如新陈代谢，DNA合成和毒力因子的监管等。这些离子的代谢需要特定功能蛋白的支撑，若通过疫苗产生针对特定蛋白的抗体阻断其功能，就可抑制金葡菌的代谢与生长。
锰离子代谢相关蛋白主要包括一个ATP合成蛋白MntA、一个完整的细胞膜转运蛋白MntB和一个锰离子转运蛋白MntC。其中锰离子转运蛋白C(MntC)是一个高度保守的细胞表面蛋白，最新的MntC结构研究结果显示，MntC蛋白具有经典的双结构域结构，每个结构域由α螺旋之间“夹心”四股β链组成，其两个结构域通过一个长链8倍螺旋和紧附在两个结构域表面的金属结合位点相连，MntC同源的两个结构域由一个长的α-螺旋作为骨架蛋白支撑，使得其结构更稳定，不易突变，进而形成高度保守的序列。
研究表明，MntC可作为疫苗免疫抗原，快速介导有效的免疫应答阻止金葡菌的感染。此外发现，抗MntC的单克隆抗体在金葡菌感染的小鼠中诱导出较强的中性粒细胞吞噬活性，在小鼠的被动免疫保护模型中产生了免疫保护作用。
但是，现有技术中的SpA5蛋白和MntC蛋白纯化工艺是将破菌液直接经过亲和层析(Glutathione 4FF)进行融合蛋白的捕获和酶切，以达到初步纯化目的蛋白的目的，该工艺放大过程中出现纯化收率低，蛋白收获量少(SpA5抗原蛋白的收率为0.1mg蛋白/g菌左右，MntC抗原蛋白的收率为0.4mg蛋白/g菌左右)的情况。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，以解决现有技术中SpA5蛋白和MntC蛋白纯化工艺在放大过程中均出现纯化收率低，蛋白收获量少的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，顺次包括下述步骤：
(1)菌体破碎
将SpA5菌体或MntC菌体用缓冲液溶解，然后破菌、离心，收集上清液；
(2)澄清过滤
将步骤(1)收集的上清液使用Cobetter 0.6～0.8μm或Pall PDH4深层滤板进行澄清过滤，收集过滤液；
(3)SPFF柱层析
采用GE SPFF填料装填层析柱，对步骤(2)收集的过滤液进行初纯，得到SPFF洗脱液；
(4)酶切
应用PP酶溶液对步骤(3)中得到SPFF洗脱液进行酶切；
(5)SPHP柱层析
采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤(4)酶切后的酶切液进行中度纯化，得到SPHP层析洗脱液；
(6)Phenyl HP柱层析
采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对步骤(5)得到的SPHP层析洗脱液进行精细纯化，得到SpA5蛋白phenyl HP洗脱液或MntC蛋白phenyl HP流穿液；
(7)G25柱层析
采用G25层析柱对步骤(6)得到的SpA5蛋白phenyl HP洗脱液或MntC蛋白phenylHP流穿液进行脱盐换液，得到G25层析液；
(8)Q HP柱层析
采用Q HP层析柱对步骤(7)得到的G25层析液进行层析，得到Q HP流穿液；
(9)原液制备
将步骤(8)得到的Q HP流穿液进行除菌过滤，得到SpA5蛋白原液或MntC蛋白原液。
进一步的，所述步骤(1)中，所述缓冲液为18-22mM的PB缓冲液，所述缓冲液的pH为5.8-6.2；所述菌体与缓冲液的比例为1:4.5-5.5，所述菌体以kg计，所述缓冲液以L计。
进一步的，所述步骤(4)中，使用20mM PB(pH 7.5)将SPFF洗脱液稀释2-5倍，控制电导率≤6.0-8.0ms/cm，使用1M NaOH调节pH＝7.50±0.10稀释后的SPFF洗脱液与PP酶溶液的体积比为55-65:1；将稀释后的SPFF洗脱液与PP酶溶液混合均匀后在2～8℃保温、静置酶切4～20h。
进一步的，所述PP酶溶液的浓度＞0.5mg/ml。
进一步的，所述步骤(3)中，采用GE SPFF填料装填层析柱，对步骤(2)收集的过滤液进行初纯，得到SPFF洗脱液；采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高18-20cm、柱直径200mm、柱体积5.5-6.5L；
缓冲液：SPFF平衡液：20mM PB(pH 6.0)，SPFF洗脱液：20mM PB+1M NaCl(pH 6.0)；
上样流速：36-72L/h，RT＝5-10min；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：36-72L/h，平衡体积：5～8CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速36-72L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
收集标准：收集SPFF洗脱液，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU时停止收集，记录收集的SPFF洗脱液体积。
进一步的，所述步骤(5)中，采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤(4)酶切后的酶切液进行中度纯化，得到SPHP层析洗脱液；具体包括下述步骤：
①酶切液采用0.22μm滤膜进行减菌过滤，收集过滤液，待上柱纯化；
②采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤①收集的过滤液进行中度纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高18-20cm、柱直径200mm、柱体积5.5-6.5L；
缓冲液：SPHP平衡液：20mM PB(pH7.5)；SPHP洗脱液：20mM PB+1M NaCl(pH7.5)；
上样流速：12-24L/h，RT＝15-30min；
复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速12-24L/h；平衡体积：2～5CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速12-24L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
收集标准：收集SpA5蛋白SPHP层析洗脱液时，当UV280nm≥300mAU时开始收集峰，当UV280nm≤200mAU停止收集，记录收集的SpA5蛋白SPHP层析洗脱液体积；
收集MntC蛋白SPHP层析洗脱液时，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU停止收集，记录收集的MntC蛋白SPHP层析洗脱液体积。
进一步的，所述步骤(6)中，采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对步骤(5)得到的SPHP层析洗脱液进行精细纯化，得到phenyl HP洗脱液；具体包括下述步骤：
①按照体积比SPHP层析洗脱液：硫酸铵溶液＝1-3：1-3，加入20mM PB+3M(NH4)2SO4(pH7.5)进行稀释，待进行下一步纯化；
②采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对SPHP层析洗脱液进行精细纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高为9-11cm，柱直径140-200mm、柱体积1.5-3L；
缓冲液：Phenyl HP平衡液：20mM PB+1.2-1.5M(NH4)2SO4(pH7.5)；Phenyl HP洗脱液：20mM PB(pH7.5)；
上样流速：12-36L/h，RT＝3.75-10min；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：12-36L/h，平衡体积：3-5CV，至UV值、pH、电导稳定；
洗脱：洗脱流速：12-24L/h，洗脱梯度：0-100％B，10CV；
收集标准：收集SpA5蛋白phenyl HP洗脱液时，当UV280nm值到达峰顶端且开始下降时开始收集，当UV280nm≤100mAU停止收集，记录收集的SpA5蛋白phenyl HP洗脱液体积；
收集MntC蛋白phenyl HP流穿液时，当UV280nm≥50mAU时开始收集峰，当UV280nm≤50mAU停止收集；记录收集的MntC蛋白phenyl HP流穿液体积。
进一步的，所述步骤(7)中，采用G25层析柱对步骤(6)得到的SpA5蛋白phenyl HP洗脱液或MntC蛋白phenyl HP流穿液进行脱盐换液，得到G25层析液；采用的层析柱、平衡液、上样流速、上样量以及收集标准分别为：
层析柱：柱高28-30cm、柱直径300mm、柱体积为19.5-20.5L；
平衡液：10mM L-His+0.9％NaCl(pH6.0)；
上样流速：80L/h，RT＝15min；
上样量≤柱床体积的25％；
收集标准：收集MntC蛋白G25层析液时，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集；记录收集的MntC蛋白G25层析液体积；
收集SpA5蛋白G25层析液时，当UV280nm≥20mAU时开始收集，当UV280nm≤20mAU停止收集；记录收集的收集SpA5蛋白G25层析液。
进一步的，所述步骤(8)中，采用Q HP层析柱对步骤(7)得到的G25层析液进行层析，得到Q HP流穿液；采用的层析柱、平衡液、上样流速、上样量以及收集标准分别为：
层析柱：柱高8-11cm、柱直径140mm、柱体积1.2-1.8L；
平衡液：10mM L-His+0.9％NaCl(pH6.0)；
上样流速：12-24L/h，RT＝3.75-7.5min；
收集标准：收集MntC蛋白Q HP流穿液时，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集，记录收集的MntC蛋白Q HP流穿液的体积；
收集SpA5蛋白Q HP流穿液时，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集，记录收集的SpA5蛋白Q HP流穿液的体积。
进一步的，所述步骤(9)中，所述除菌过滤为将步骤(8)得到的Q HP流穿液在生物安全柜或无菌隔离器中，使用0.22μm滤器除菌过滤。
基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
(1)本发明提供的重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，增加澄清过滤步骤，提高了破碎后菌液的澄清度，去除破菌离心液中细小颗粒物以及大量核酸等杂质，降低层析填料的高柱压，增加了填料的寿命；
(2)本发明提供的重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，使用SP FF阳离子层析作为初纯步骤，可以快速捕获目的蛋白，使目的蛋白从成分复杂的破菌上清液中浓缩和稳定，避免了使用GST亲和层析捕获蛋白的效率低、蛋白收获量少且不稳定、后续步骤无法开展、放大困难的问题，同时降低了由于亲和填料昂贵、填料寿命短带来的高额成本；将初纯得到的GST融合蛋白使用液体模式中低温下的柱下酶切方式，提高酶切效率，减少酶用量，降低成本，且低温下酶切利于蛋白质的稳定；将SP HP阳离子层析定义为中纯步骤，并改进上样pH值进行该层析步骤，去除大肠杆菌细胞破碎液中含有的SPFF步骤中仍未去除的大量杂质，例如HCP、核酸、酶以及PP酶酶切产生的GST标签蛋白和添加的PP酶，同时优化梯度洗脱参数通过SPHP高分辨率填料达到提高蛋白纯度的目的；使用疏水层析作为精纯步骤，同时优化了操作参数，有效去除疏水性杂质提高蛋白纯度，使目的蛋白各项指标符合质量标准要求；后续采用G25层析进行缓冲液置换、Q HP层析进行内毒素的有效去除，与前述步骤进行有效的衔接，最终样品采用0.22μm滤膜除菌过滤后进行分装得到原液。
(3)本发明提供的重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，解决了纯化工艺在放大过程中纯化收率低的问题，蛋白收获量高，本发明提供的重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，SpA5抗原蛋白的收率大于0.4mg蛋白/g菌，MntC抗原蛋白的收率大于2mg蛋白/g菌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中制备的SpA5蛋白原液电泳纯度测定结果图；
图2是本发明实施例2中制备的SpA5蛋白原液电泳纯度测定结果图；
图3是本发明实施例3中制备的SpA5蛋白原液电泳纯度测定结果图；
图4是本发明实施例4中制备的MntC蛋白原液电泳纯度测定结果图；
图5是本发明实施例5中制备的MntC蛋白原液电泳纯度测定结果图；
图6是本发明实施例6中制备的MntC蛋白原液电泳纯度测定结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
一、实施例：
实施例1：
一种重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，包括下述步骤：
(1)菌体破碎
将SpA5菌体用缓冲液溶解，缓冲液为20mM的PB(pH 6)缓冲液；菌体与缓冲液的比例为1:5，所述菌体以kg计，所述缓冲液以L计；溶解后采用高压匀质机破菌，调节压力为750bar，冷凝***温度为6℃，破碎3次；然后采用高速冷冻离心机将破碎后的菌液进行离心，离心参数：12000g，6℃离心20min；收集上清液；
(2)澄清过滤
将步骤(1)收集的上清液使用Cobetter 0.6～0.8μm或Pall PDH4深层滤板进行澄清过滤，收集过滤液；
(3)SPFF柱层析
采用GE SPFF填料装填层析柱，对步骤(2)收集的过滤液进行初纯，得到SPFF洗脱液；采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高20cm、柱直径200mm、柱体积约6L；
缓冲液：SPFF平衡液：20mM PB(pH 6.0)，SPFF洗脱液：20mM PB+1M NaCl(pH 6.0)；
上样流速：54L/h，RT8min；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：50L/h，平衡体积：6.5CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速54L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
收集标准：收集SPFF洗脱液，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU时停止收集，记录收集的SPFF洗脱液体积；
再生：使用20mM PB+1M NaCl(pH 6.0)冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(4)酶切
使用20mM PB(pH 7.5)将SPFF洗脱液稀释3.5倍，控制电导率≤8.0ms/cm，使用1MNaOH调节pH＝7.50±0.10，按稀释后的SPFF洗脱液与PP酶溶液(浓度为1mg/ml)的体积比为60:1加入PP酶溶液，以转速50RPM搅拌5min将上清液与PP酶溶液混合均匀，然后关闭搅拌，在6℃保温、静置酶切12h。
(5)SPHP柱层析
采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤(4)酶切后的酶切液进行中度纯化，得到SPHP层析洗脱液；具体的包括下述步骤：
①将酶切液采用0.22μm滤膜进行减菌过滤，收集过滤液，待上柱纯化；
②采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤①收集的过滤液进行中度纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高20cm、柱直径200mm、柱体积约6L；
缓冲液：SPHP平衡液：20mM PB(pH7.5)；SPHP洗脱液：20mM PB+1M NaCl(pH7.5)；
上样流速：18L/h，RT＝22min；
复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速18L/h；平衡体积：3CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速18L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
收集标准：收集SpA5蛋白SPHP层析洗脱液，当UV280nm≥300mAU时开始收集峰，当UV280nm≤200mAU停止收集，记录收集的SpA5蛋白SPHP层析洗脱液体积；
再生：使用20mM PB+1M NaCl(pH 7.5)冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(6)Phenyl HP柱层析
采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对步骤(5)得到的SpA5蛋白SPHP层析洗脱液进行精细纯化，得到SpA5蛋白phenyl HP洗脱液；具体包括下述步骤：
①按照体积比SpA5蛋白SPHP层析洗脱液：硫酸铵溶液＝3：2，加入20mM PB+3M(NH4)2SO4(pH7.5)进行稀释，稀释液待进行下一步纯化；
②采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对步骤①得到稀释液进行精细纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高为10cm，柱直径140mm、柱体积约1.5L；
缓冲液：Phenyl HP平衡液：20mM PB+1.2M(NH4)2SO4(pH7.5)；Phenyl HP洗脱液：20mM PB(pH7.5)；
上样流速：18L/h，RT＝5min；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：18L/h，平衡体积：3CV，至UV值、pH、电导稳定；
洗脱：洗脱流速：18L/h，洗脱梯度：0-100％B，5CV；
收集标准：收集SpA5蛋白phenyl HP洗脱液，当UV280nm值到达峰顶端且开始下降时开始收集，当UV280nm≤100mAU停止收集，记录收集的SpA5蛋白phenyl HP洗脱液体积；
再生：使用20mM PB(pH 7.5)冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(7)G25柱层析
采用G25层析柱对步骤(6)得到的SpA5蛋白phenyl HP洗脱液进行脱盐换液，得到SpA5蛋白G25层析液；采用的层析柱、平衡液、上样流速、上样量以及收集标准分别为：
层析柱：柱高30cm、柱直径300mm、柱体积约为20L；
平衡液：10mM L-His+0.9％NaCl(pH6.0)；
上样流速：80L/h，RT＝15min；
上样量≤柱床体积的25％。
收集标准：收集SpA5蛋白G25层析液，当UV280nm≥20mAU时开始收集，当UV280nm≤20mAU停止收集；如分次层析，合并每次洗脱液并混合均匀；记录收集的SpA5蛋白G25层析液体积；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(8)Q HP柱层析
采用Q HP层析柱对步骤(7)得到的SpA5蛋白G25层析液进行层析，得到SpA5蛋白QHP流穿液；采用的层析柱、平衡液、上样流速、上样量以及收集标准分别为：
层析柱：柱高10cm、柱直径140mm、柱体积约1.5L；
平衡液：10mM L-His+0.9％NaCl(pH6.0)；
上样流速：18L/h，RT＝5min；
收集标准：收集Q HP流穿液，当UV280nm≥20mAU时开始收集，当UV280nm≤20mAU停止收集，记录收集的Q HP流穿液的体积；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(9)原液制备
将步骤(8)得到的SpA5蛋白Q HP流穿液在生物安全柜或无菌隔离器中，使用0.22μm滤器进行除菌过滤，得到SpA5蛋白原液。
实施例2
与实施例1不同的是：
步骤(1)菌体破碎中，缓冲液为18mM的PB(pH 6.2)缓冲液；菌体与缓冲液的比例为1:4.5；高压匀质机破菌，调节压力为700bar，冷凝***温度为2℃；离心：2℃离心；
步骤(3)SPFF柱层析中，上样流速：36L/h，RT10min；复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：36L/h，平衡体积：5CV，至UV值、电导平稳；洗脱：洗脱流速36L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
步骤(4)酶切中，将SPFF洗脱液稀释2倍；按稀释后的SPFF洗脱液与PP酶溶液(浓度为0.8mg/ml)的体积比为55:1加入PP酶溶液；在2℃保温、静置酶切20h。
步骤(5)SPHP柱层析中，上样流速：12L/h，RT＝30min；复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速12L/h；平衡体积：2CV，至UV值、电导平稳；洗脱：洗脱流速12L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
步骤(6)Phenyl HP柱层析中，上样流速：12L/h，RT＝7.5min；复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：12L/h，平衡体积：2CV，至UV值、pH、电导稳定；洗脱：洗脱流速：12L/h，洗脱梯度：0-100％B，5CV；
步骤(8)Q HP柱层析中，上样流速：12L/h，RT＝7.5min；
步骤(9)原液制备中，在生物安全柜中，使用0.22μm滤器进行除菌过滤。
其余同实施例1。
实施例3
与实施例1不同的是：
步骤(1)菌体破碎中，缓冲液为22mM的PB(pH 5.8)缓冲液；菌体与缓冲液的比例为1:5.5；高压匀质机破菌，调节压力为800bar，冷凝***温度为8℃；离心：8℃离心；
步骤(3)SPFF柱层析中，上样流速：72L/h，RT5min；复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：72L/h，平衡体积：8CV，至UV值、电导平稳；洗脱：洗脱流速72L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
步骤(4)酶切中，将SPFF洗脱液稀释5倍；按稀释后的SPFF洗脱液与PP酶溶液(浓度为1.2mg/ml)的体积比为65:1加入PP酶溶液；在8℃保温、静置酶切4h；
步骤(5)SPHP柱层析中，上样流速：24L/h，RT＝15min；复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速24L/h；平衡体积：5CV，至UV值、电导平稳；洗脱：洗脱流速24L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
步骤(6)Phenyl HP柱层析中，上样流速：24L/h，RT＝3.75min；复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：24L/h，平衡体积：5CV，至UV值、pH、电导稳定；洗脱：洗脱流速：24L/h，洗脱梯度：0-100％B，5CV；
步骤(8)Q HP柱层析中，上样流速：24L/h，RT＝3.75min；
步骤(9)原液制备中，在无菌隔离器中，使用0.22μm滤器进行除菌过滤。
其余同实施例1。
实施例4：
一种重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，包括下述步骤：
(1)菌体破碎
将MntC菌体用缓冲液溶解，缓冲液为20mM的PB(pH 6)缓冲液；菌体与缓冲液的比例为1:5，所述菌体以kg计，所述缓冲液以L计；溶解后采用高压匀质机破菌，调节压力为750bar，冷凝***温度为6℃，破碎3次；然后采用高速冷冻离心机将破碎后的菌液进行离心，离心参数：12000g，6℃离心20min；收集上清液；
(2)澄清过滤
将步骤(1)收集的上清液使用1M NaOH/3MHCl调节pH＝6.00±0.10，然后使用Cobetter 0.6～0.8μm或Pall PDH4深层滤板进行澄清过滤，收集过滤液；
(3)SPFF柱层析
采用GE SPFF填料装填层析柱，对步骤(2)收集的过滤液进行初纯，得到SPFF洗脱液；采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高19cm、柱直径200mm、柱体积约6L；
缓冲液：SPFF平衡液：20mM PB(pH 6.0)，SPFF洗脱液：20mM PB+1M NaCl(pH 6.0)；
上样流速：54L/h，RT＝7.5min；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：54L/h，平衡体积：6CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速54L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
收集标准：收集SPFF洗脱液，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU时停止收集，记录收集的SPFF洗脱液体积；
再生：使用20mM PB+1M NaCl(pH 6.0)冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(4)酶切
使用20mM PB(pH 7.5)将SPFF洗脱液稀释3.5倍，控制电导率≤6.0ms/cm，使用1MNaOH调节pH＝7.50±0.10，按稀释后的SPFF洗脱液与PP酶溶液(浓度为1mg/ml)的体积比为50:1加入PP酶溶液，以转速50RPM搅拌5min将稀释后的SPFF洗脱液与PP酶溶液混合均匀，然后关闭搅拌，在6℃保温、静置酶切12h；
(5)SPHP柱层析
采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤(4)酶切后的酶切液进行中度纯化，得到SPHP层析洗脱液；具体的包括下述步骤：
①将酶切液采用0.22μm滤膜进行减菌过滤，收集过滤液，待上柱纯化；
②采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤①收集的过滤液进行中度纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高19cm、柱直径200mm、柱体积约6L；
缓冲液：SPHP平衡液：20mM PB(pH7.5)；SPHP洗脱液：20mM PB+1M NaCl(pH7.5)；
上样流速：18L/h，RT＝22min；
复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速18L/h；平衡体积：3.5CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速18L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
收集标准：收集MntC蛋白SPHP层析洗脱液，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU停止收集，记录收集的MntC蛋白SPHP层析洗脱液体积；
再生：使用20mM PB+1M NaCl(pH 6.0)冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(6)Phenyl HP柱层析
采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对步骤(5)得到的MntC蛋白SPHP层析洗脱液进行精细纯化，得到MntC蛋白phenyl HP洗脱液；具体包括下述步骤：
①按照体积比MntC蛋白SPHP层析洗脱液：硫酸铵溶液＝1：1，加入20mMPB+3M(NH4)2SO4(pH7.5)进行稀释，稀释液待进行下一步纯化；
②采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对步骤①得到稀释液进行精细纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高为10cm，柱直径140mm、柱体积约1.5L；
缓冲液：Phenyl HP平衡液：20mM PB+1.5M(NH4)2SO4(pH7.5)；Phenyl HP洗脱液：20mM PB(pH7.5)；
上样流速：27L/h，RT＝7.5min；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：27L/h，平衡体积：3.5CV，至UV值、pH、电导稳定；
洗脱：洗脱流速：18L/h，洗脱梯度：0-100％B，5CV；
收集标准：收集MntC蛋白phenyl HP流穿液，当UV280nm≥50mAU时开始收集峰，当UV280nm≤50mAU停止收集，记录收集的MntC蛋白phenyl HP流穿液体积；
再生：使用20mM PB(pH 7.5)冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(7)G25柱层析
采用G25层析柱对步骤(6)得到的MntC蛋白phenyl HP流穿液进行脱盐换液，得到MntC蛋白G25层析液；采用的层析柱、平衡液、上样流速、上样量以及收集标准分别为：
层析柱：柱高29cm、柱直径300mm、柱体积约为20L；
平衡液：10mM L-His+0.9％NaCl(pH6.0)；
上样流速：80L/h，RT＝15min；
上样量≤柱床体积的25％；
收集标准：收集MntC蛋白G25层析液，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集；如分次层析，合并每次洗脱液并混合均匀；记录收集的MntC蛋白G25层析液体积；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(8)Q HP柱层析
采用Q HP层析柱对步骤(7)得到的MntC蛋白G25层析液进行层析，得到MntC蛋白QHP流穿液；采用的层析柱、平衡液、上样流速、上样量以及收集标准分别为：
层析柱：柱高10cm、柱直径140mm、柱体积约1.5L；
平衡液：10mM L-His+0.9％NaCl(pH6.0)；
上样流速：18L/h，RT＝5min；
收集标准：收集MntC蛋白Q HP流穿液，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集，记录收集的MntC蛋白Q HP流穿液的体积；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20％乙醇溶液对层析柱进行保存；
(9)原液制备
将步骤(8)得到的MntC蛋白Q HP流穿液在生物安全柜中，使用0.22μm滤器进行除菌过滤，得到MntC蛋白原液。
实施例5
与实施例4不同的是：
步骤(1)菌体破碎中，缓冲液为18mM的PB(pH 6.2)缓冲液；菌体与缓冲液的比例为1:4.5；高压匀质机破菌，调节压力为700bar，冷凝***温度为2℃；离心：2℃离心；
步骤(3)SPFF柱层析中，上样流速：36L/h，RT10min；复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：36L/h，平衡体积：5CV，至UV值、电导平稳；洗脱：洗脱流速36L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
步骤(4)酶切中，将SPFF洗脱液稀释2倍；按稀释后的SPFF洗脱液与PP酶溶液(浓度为0.8mg/ml)的体积比为55:1加入PP酶溶液；在2℃保温、静置酶切20h。
步骤(5)SPHP柱层析中，上样流速：12L/h，RT＝30min；复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速12L/h；平衡体积：2CV，至UV值、电导平稳；洗脱：洗脱流速12L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
步骤(6)Phenyl HP柱层析中，上样流速：18L/h，RT＝10min；复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：18L/h，平衡体积：2CV，至UV值、pH、电导稳定；洗脱：洗脱流速：18L/h，洗脱梯度：0-100％B，5CV；
步骤(8)Q HP柱层析中，上样流速：12L/h，RT＝7.5min；
步骤(9)原液制备中，在生物安全柜中，使用0.22μm滤器进行除菌过滤。
其余同实施例4。
实施例6
与实施例4不同的是：
步骤(1)菌体破碎中，缓冲液为22mM的PB(pH 5.8)缓冲液；菌体与缓冲液的比例为1:5.5；高压匀质机破菌，调节压力为800bar，冷凝***温度为8℃；离心：8℃离心；
步骤(3)SPFF柱层析中，上样流速：72L/h，RT5min；复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：72L/h，平衡体积：8CV，至UV值、电导平稳；洗脱：洗脱流速72L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
步骤(4)酶切中，将SPFF洗脱液稀释5倍；按稀释后的SPFF洗脱液与PP酶溶液(浓度为1.2mg/ml)的体积比为65:1加入PP酶溶液；在8℃保温、静置酶切4h；
步骤(5)SPHP柱层析中，上样流速：24L/h，RT＝15min；复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速24L/h；平衡体积：5CV，至UV值、电导平稳；洗脱：洗脱流速24L/h，洗脱梯度0～50％B，10CV；
步骤(6)Phenyl HP柱层析中，上样流速：36L/h，RT＝5min；复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：36L/h，平衡体积：5CV，至UV值、pH、电导稳定；洗脱：洗脱流速：36L/h，洗脱梯度：0-100％B，5CV；
步骤(8)Q HP柱层析中，上样流速：24L/h，RT＝3.75min；
步骤(9)原液制备中，在无菌隔离器中，使用0.22μm滤器进行除菌过滤。
其余同实施例4。
二、对实施例1-3和实施例4-6中制备的SpA5蛋白原液和MntC蛋白原液(实施例1-实施例3中制备的SpA5原液顺次编号为SpA5原液20200805、SpA5-2原液0200807、SpA5原液20200814；实施例4-实施例6中制备的MntC原液顺次编号为MntC原液20200715、MntC原液20200717、MntC原液20200722)进行检测并进行纯度实验
1、将实施例1-3和实施例4-6中制备的SpA5蛋白原液和MntC蛋白原液，进行检测，检测结果如下表1和表2所示：
表1实施例1-3中SpA5蛋白原液检测结果
Figure BDA0002991308990000201
表2实施例4-6中MntC蛋白原液检测结果
Figure BDA0002991308990000211
由表1和表2可知，实施例1-3中制备的SpA5蛋白原液均符合质量标准要求，且收率均大于0.4mg蛋白/g菌；实施例4-6中制备的MntC蛋白原液均符合质量标准要求，且收率均大于2mg蛋白/g菌。
2、采用电泳实验测定实施例1-3中制备的SpA5蛋白原液以及实施例4-6制备的MntC蛋白原液的纯度，测定方法采用《中国药典》2020版中的SDS-PAGE法；实施例1的测定结果如图1所示，实施例2的测定结果如图2所示，实施例3的测定结果如图3所示；实施例4的测定结果如图4所示，实施例5的测定结果如图5所示，实施例6的测定结果如图6所示。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：顺次包括下述步骤：
（1）菌体破碎
将SpA5菌体或MntC菌体用缓冲液溶解，然后破菌、离心，收集上清液；
（2）澄清过滤
将步骤（1）收集的上清液使用Cobetter 0.6～0.8μm或Pall PDH4深层滤板进行澄清过滤，收集过滤液；
（3）SPFF柱层析
采用GE SPFF填料装填层析柱，对步骤（2）收集的过滤液进行初纯，得到SPFF洗脱液；
（4）酶切
应用PP酶溶液对步骤（3）中得到SPFF洗脱液进行酶切；
（5）SPHP柱层析
采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤（4）酶切后的酶切液进行中度纯化，得到SPHP层析洗脱液；
（6）Phenyl HP柱层析
采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对步骤（5）得到的SPHP层析洗脱液进行精细纯化，得到SpA5蛋白phenyl HP洗脱液或MntC蛋白phenyl HP流穿液；
（7）G25柱层析
采用G25层析柱对步骤（6）得到的SpA5蛋白phenyl HP洗脱液或MntC蛋白phenyl HP流穿液进行脱盐换液，得到G25层析液；
（8）Q HP柱层析
采用Q HP层析柱对步骤（7）得到的G25层析液进行层析，得到Q HP流穿液；
（9）原液制备
将步骤（8）得到的Q HP流穿液进行除菌过滤，得到SpA5蛋白原液或MntC蛋白原液。
2.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述缓冲液为18-22mM 的PB缓冲液，所述缓冲液的pH为 5.8-6.2；所述菌体与缓冲液的比例为1:4.5-5.5，所述菌体以kg计，所述缓冲液以L计。
3.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（3）中，采用GE SPFF填料装填层析柱，对步骤（2）收集的过滤液进行初纯，得到SPFF洗脱液；采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高18-20cm、柱直径200mm、柱体积5.5-6.5L；
缓冲液： SPFF平衡液：20mM PB，pH 为6.0；SPFF洗脱液：20mM PB+1M NaCl，pH 为6.0；
上样流速：36-72L/h，RT=5-10min；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：36-72L/h，平衡体积：5～8CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速36-72L/h，洗脱梯度0～50%B，10CV；
收集标准：收集SPFF洗脱液，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU时停止收集，记录收集的SPFF洗脱液体积。
4.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（4）中，使用pH为 7.5的20mM PB将SPFF洗脱液稀释2-5倍，控制电导率≤6.0-8.0ms/cm，使用1M NaOH调节pH=7.50±0.10稀释后的SPFF洗脱液与PP酶溶液的体积比为55-65:1；将稀释后的SPFF洗脱液与PP酶溶液混合均匀后在2～8℃保温、静置酶切4～20h。
5.根据权利要求4所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗 HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述PP酶溶液的浓度＞0.5mg/ml。
6.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（5）中，采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤（4）酶切后的酶切液进行中度纯化，得到SPHP层析洗脱液；具体包括下述步骤：
①酶切液采用0.22μm滤膜进行减菌过滤，收集过滤液，待上柱纯化；
②采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤①收集的过滤液进行中度纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高18-20cm、柱直径200mm、柱体积5.5-6.5L；
缓冲液： SPHP平衡液：20mM PB，pH为7.5；SPHP洗脱液：20mM PB+1M NaCl，pH为7.5；
上样流速：12-24L/h，RT=15-30min；
复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速12-24L/h；平衡体积：2～5CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速12-24L/h，洗脱梯度0～50%B，10CV；
收集标准：收集 SpA5蛋白SPHP层析洗脱液时，当UV280nm≥300mAU时开始收集峰，当UV280nm≤200mAU停止收集，记录收集的SpA5蛋白SPHP层析洗脱液体积；
收集MntC蛋白SPHP层析洗脱液时，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU停止收集，记录收集的MntC蛋白SPHP层析洗脱液体积。
7.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（6）中，采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对步骤（5）得到的SPHP层析洗脱液进行精细纯化，得到phenyl HP洗脱液；具体包括下述步骤：
①按照体积比SPHP层析洗脱液：硫酸铵溶液=1-3：1-3，加入pH为7.5的20mM PB+3M（NH4）2SO4进行稀释，待进行下一步纯化；
②采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对SPHP层析洗脱液进行精细纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高为9-11cm，柱直径140-200mm、柱体积1.5-3L；
缓冲液： Phenyl HP平衡液：20mM PB+1.2-1.5M（NH4）2SO4，pH为7.5；Phenyl HP洗脱液：20mM PB，pH为7.5；
上样流速：12-36L/h，RT=3.75-10min；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：12-36L/h，平衡体积：3-5CV，至UV值、pH、电导稳定；
洗脱：洗脱流速：12-24L/h，洗脱梯度：0-100%B，10CV；
收集标准：收集SpA5蛋白phenyl HP洗脱液时，当UV280nm值到达峰顶端且开始下降时开始收集，当UV280nm≤100mAU停止收集，记录收集的SpA5蛋白phenyl HP洗脱液体积；
收集MntC蛋白phenyl HP流穿液时，当UV280nm≥50mAU时开始收集峰，当UV280nm≤50mAU停止收集；记录收集的MntC蛋白phenyl HP流穿液体积。
8.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（7）中，采用G25层析柱对步骤（6）得到的SpA5蛋白phenyl HP洗脱液或MntC蛋白phenyl HP流穿液进行脱盐换液，得到G25层析液；采用的层析柱、平衡液、上样流速、上样量以及收集标准分别为：
层析柱：柱高28-30cm、柱直径300mm、柱体积为19.5-20.5L；
平衡液：10mM L-His+0.9%NaCl，pH6.0；
上样流速：80L/h，RT＝15min；
上样量≤柱床体积的25%；
收集标准：收集MntC蛋白G25层析液时，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集；记录收集的MntC蛋白G25层析液体积；
收集SpA5蛋白G25层析液时，当UV280nm≥20mAU时开始收集，当UV280nm≤20mAU停止收集；记录收集的收集SpA5蛋白G25层析液。
9.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（8）中，采用Q HP层析柱对步骤（7）得到的G25层析液进行层析，得到Q HP流穿液；采用的层析柱、平衡液、上样流速、上样量以及收集标准分别为：
层析柱：柱高8-11cm、柱直径140mm、柱体积1.2-1.8L；
平衡液：10mM L-His+0.9%NaCl，pH6.0；
上样流速：12-24L/h，RT=3.75-7.5min；
收集标准：收集MntC蛋白Q HP流穿液时，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集，记录收集的MntC蛋白Q HP流穿液的体积；
收集SpA5蛋白Q HP流穿液时，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集，记录收集的SpA5蛋白Q HP流穿液的体积。
10.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（9）中，所述除菌过滤为将步骤（8）得到的Q HP流穿液在生物安全柜或无菌隔离器中，使用0.22μm滤器除菌过滤。
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