CN116474081B - 鲍曼不动杆菌疫苗及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了鲍曼不动杆菌疫苗及制备方法，涉及生物技术领域。所述疫苗包括鲍曼不动杆菌核苷二磷酸激酶NDK重组蛋白，且所述鲍曼不动杆菌核苷二磷酸激酶NDK重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。利用本发明NDK重组蛋白制备的疫苗可通过肌肉注射途径进行免疫接种，激发机体产生高效价抗体。并经动物实验证实，所述基因工程重组单价疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位疫苗研究打下基础，同时对疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。

Description

鲍曼不动杆菌疫苗及制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及鲍曼不动杆菌疫苗及制备方法。
背景技术
鲍曼不动杆菌是一种广泛存在的非发酵革兰氏阴性杆菌，作为机会性病原体，可导致医院或社区获得性疾病，如脑膜炎、肺炎（医院或社区获得）、菌血症、心内膜炎、***（UTI）以及皮肤和软组织感染等。据报道，在美国、韩国及挪威，由鲍曼不动杆菌引起的医院获得性感染分别占到21%、24.4%、46.9%。亚洲36%的ICU获得性肺炎都与鲍曼不动杆菌感染有关。重症监护病区的耐药鲍曼不动杆菌检出率为78.3%，远高于其他病区。除医院获得性感染外，鲍曼不动杆菌导致的社区获得性感染病例也日渐上升。鲍曼不动杆菌耐药严重，2021年中国细菌耐药监测报告显示，2021年碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的检出率为54.3%，较2020年的53.7%上升0.6个百分点，仍然维持较高的水平。由于多药耐药菌株的增加以及高发病率和死亡率，鲍曼不动杆菌已被列入世界卫生组织（WHO）的耐药细菌和抗菌药物耐药性重点研究名单。
由于多药耐药鲍曼不动杆菌的流行和爆发，现有的抗菌药物不能有效治疗这些菌株引起的感染，而新的抗菌药物研发周期长，且易产生耐药性，为了治疗耐药鲍曼不动杆菌感染相关疾病，迫切需要新的治疗药物及策略，开发预防鲍曼不动杆菌感染的疫苗，诱导机体产生免疫反应，是治疗耐药鲍曼不动杆菌的有效方法。
发明内容
本发明的目的在于提供鲍曼不动杆菌疫苗及制备方法，利用本发明的NDK重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过肌肉注射途径进行免疫接种，激发机体产生IgG抗体和细胞免疫应答，具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。
核苷二磷酸激酶（Nucleoside Diphosphate Kinase，NDK）是鲍曼不动杆菌中一种参与核苷酸代谢的酶。本发明利用反向疫苗学筛选鲍曼不动杆菌的潜在保护性抗原库，其中包含NDK蛋白，该蛋白由143个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码DNA序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用NDK蛋白的第1-143位氨基酸序列，设计一种鲍曼不动杆菌疫苗。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的鲍曼不动杆菌疫苗，所述疫苗包括鲍曼不动杆菌核苷二磷酸激酶NDK重组蛋白，且所述鲍曼不动杆菌核苷二磷酸激酶NDK重组蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
根据一种优选实施方式，所述鲍曼不动杆菌NDK重组蛋白至少包含NDK蛋白的第1-143位氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种所述的鲍曼不动杆菌疫苗的制备方法，包括如下步骤：
（1）根据鲍曼不动杆菌的核苷二磷酸激酶NDK蛋白基因序列设计PCR引物，以鲍曼不动杆菌的全基因组DNA为模板，根据所设计的PCR引物对编码鲍曼不动杆菌的NDK蛋白氨基酸序列的目的基因进行PCR扩增；
其中，所设计的PCR引物的正向引物：5'-CGCGGATCCATGGCAATTGAACGTACTTTGTCT-3'，反向引物：5'-TTATGCGGCCGCTTAACGAGTGCGTGGGCAG-3'；
（2）将步骤（1）所得的PCR扩增产物克隆至含有GST标签的表达载体，并转化至原核表达***进行诱导表达含有GST标签的NDK融合蛋白；
（3）使用酶切方法将目的蛋白和GST标签分开，获得鲍曼不动杆菌的NDK重组蛋白；
（4）对步骤（3）所得的NDK重组蛋白进行纯化；
（5）将纯化后的NDK重组蛋白与佐剂进行吸附，以形成鲍曼不动杆菌疫苗。
根据一种优选实施方式，在步骤（5）中，所述佐剂包括Al（OH）3佐剂、AlPO4佐剂、MF59、AS03、AS04、不完全弗氏佐剂或完全弗氏佐剂。
基于上述技术方案，本发明的鲍曼不动杆菌疫苗及制备方法至少具有如下有益效果：
（1）将NDK蛋白用于鲍曼不动杆菌疫苗领域，所制备的鲍曼不动杆菌疫苗能够有效激发机体引起保护性免疫应答，从而抵御鲍曼不动杆菌致死性感染。
（2）在本发明的制备方法中，NDK蛋白的表达质粒在原核表达***（大肠杆菌）中诱导表达，表达量高，质量安全可控。选择pGEX-6p-2表达载体，使得NDK重组蛋白以融合蛋白形式表达，最大限度保持了其原有的空间构象。
（3）本发明的制备方法所表达的融合蛋白中含有一个GST标签，此标签可成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；且NDK融合蛋白表达率约为25%（如图4经Image Lab软件分析目的蛋白灰度值，计算泳道“+”中目的蛋白灰度（箭头所示）占整个“+”泳道总蛋白灰度值得到的比例），纯化后的NDK蛋白纯度为95%（图6经Image Lab软件分析计算NDK泳道中NDK目的蛋白灰度值占总蛋白灰度值的比例得到的结果）。
（4）本发明所制备的NDK重组蛋白能够诱导动物产生特异性的高效价的抗体。
利用本发明NDK重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过肌肉注射途径进行免疫接种，激发机体产生高效价的特异性的IgG抗体。并经动物实验证实，所述基因工程重组单价亚单位疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位重组疫苗研究打下基础，同时对疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为NDK基因的PCR扩增结果图。
图2为重组表达质粒pGEX-6p-2/NDK的酶切鉴定结果图。
图3为重组表达质粒pGEX-6p-2/NDK测序与目的蛋白的DNA序列比对结果图。
图4为在16℃下诱导NDK-GST融合蛋白表达结果图。
图5为重组工程菌在16℃下诱导表达后，上清中获得的融合蛋白及其纯化结果图。
图6为重组工程菌在16℃下诱导表达后，对NDK-GST融合蛋白酶切后获得NDK重组蛋白，使用离子交换柱精纯后的结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下面对本发明的技术方案进行说明。
本发明所使用的菌株与各种试剂如下：
1.菌株
鲍曼不动杆菌菌株ATCC17978购自美国ACTT。
2.试剂
质粒pGEX-6p-2（购于GE公司）、大肠杆菌菌株BL21（DE3）（购于擎科公司）；
2×High Fidelity PCR Master Mix、DNA Marker、DNA Ligation Mix购买于北京擎科生物公司；限制性内切酶BamH I和Not I购于美国NEB公司；蛋白Marker为伯乐公司产品。
质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为上海生物公司产品。
实施例1：鲍曼不动杆菌NDK蛋白的克隆。
1.首先在NCBI网站蛋白库中检索鲍曼不动杆菌菌株的NDK获得蛋白序列（GenBank: EZF14775.1），其蛋白序列如SEQ ID NO .1所示。并根据其编码基因得到 NDK基因序列如SEQ ID NO.2所示。
2.通过生物信息学软件分析该蛋白的性质，表达蛋白全长，采用PCR方法以鲍曼不动杆菌全基因组为模板扩增NDK蛋白的基因，扩增步骤如下：
1）设计PCR引物如下，分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
（下划线示酶切位点碱基序列）
正向引物：SEQ ID NO.4
5'-CGCGGATCCATGGCAATTGAACGTACTTTGTCT-3'，
BamH I
反向引物：SEQ ID NO.5
5'-TTATGCGGCCGCTTAACGAGTGCGTGGGCAG-3'，
Not I
本实施例将编码SEQ ID NO.1所示NDK蛋白氨基酸序列的DNA序列作为目的基因进行PCR扩增，该核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2）-80℃冷冻库中取出保存的鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株三线法复苏于TSA固体培养基上，于37℃培养过夜，再挑取单菌落接种于TSB液体培养基中置于恒温摇床中37℃，220rpm培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提全基因组。
3）以鲍曼不动杆菌全基因组DNA为模板PCR扩增NDK蛋白基因。
其中，PCR体系：
模板 （200 ng/μl） 2μl
正向引物 （1μM） 1μl
反向引物 （1μM） 1μl
2×High Fidelity PCR Master Mix 20μl
灭菌双蒸水 16μl
总体积 40μl
PCR扩增反应条件：95℃预变性30s，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃完全延伸5min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果如图1所示，其中，泳道M：核酸（DNA）分子量标准（Marker）；泳道1：NDK基因（432bp）的PCR扩增产物。
4）使用凝胶回收试剂盒回收NDK PCR产物。
3. PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下：
1）BamH I和Not I分别酶切pGEX-6P-2质粒和NDK PCR产物；
其中，酶切反应体系：
BamH I 2μl
Not I 2μl
10× CutSmart Buffer 4μl
质粒或PCR产物 1μg
总体积（用无菌去离子水补齐） 40μl
37℃酶切1h。
2）使用凝胶回收试剂盒回收酶切的pGEX-6P-2质粒和经BamH I和Not I酶切的PCR产物。
3）连接和转化。
通过紫外分光光度计测定目的基因酶切回收产物核酸浓度，根据载体与外源DNA摩尔数一般比为1：2-10，设计以下连接反应体系。
连接反应体系：
T4 DNA Ligase 0.5μl
目的基因酶切回收产物 4.3μl
PGEX-6P-2酶切回收产物 0.7μl
10×ligation buffer 1μl
无菌去离子水 3.5μl
总体积 10μl
混匀，16℃连接1h。
4）从-80℃冰箱取3管大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，第一管加入pGEX-6P-2质粒，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴30min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600μl LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中200rpm振摇1h。
各管以5000rpm室温离心5min，弃去400μl上清，再重悬菌体，取100μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。
5）pGEX-6p-2/NDK重组表达质粒的筛选、鉴定；
①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上生长良好的单菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；
②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；
③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切；
双酶切反应体系：
BamH I 1μl
Not I 1μl
10×CutSmart Buffer 2μl
质粒 1μg
总体积（用无菌去离子水补齐） 20μl
37℃酶切1h；
④1%的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图2所示，其中，泳道M：核酸（DNA）分子量标准（Marker）；泳道1：表示重组表达质粒pGEX-6p-2/NDK经酶切后的鉴定结果，其中酶切后的片段大小为4954bp和432bp；可见泳道1样品为构建成功的pGEX-6p-2/NDK重组表达质粒；
⑤pGEX-6p-2/NDK重组表达质粒送往上海生工生物公司进行核酸测序，经比对，测序结果与目的蛋白核酸序列完全相符，即pGEX-6p-2/NDK重组表达质粒的目的基因片段的序列是正确的，如图3所示。
实施例2：鲍曼不动杆菌NDK蛋白在原核表达***－大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定。
1.目的蛋白诱导表达。
1）取双酶切鉴定正确的两个重组工程菌种pGEX-6P-2-NDK/BL21（DE3）菌液100μL加入10ml Amp抗性的TB培养基中，220rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液2ml加入18ml Amp抗性的TB培养基中（余下的菌液保存在4℃冰箱中备用），37℃培养2-3h，转速250rpm，二次活化至OD600为0.8-1.2时，加入IPTG 10μL，使其终浓度为500μM，再置于摇床诱导表达， 16℃过夜诱导表达。
2）将诱导表达后的菌液取出，以10000rpm离心2min，弃去上清，加入1ml PBS缓冲液混匀，超声裂解3min，再4℃ 14000rpm离心15min，收集上清。
2.SDS-PAGE电泳，将5%浓缩胶灌入制胶版中，再加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入10%分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。
3.将处理好的上清样品分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80V电泳30min，再调至200V，电泳45min后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在成像***下观察结果，结果如图4所示，泳道M：蛋白分子量标准（Marker），泳道“-”：表示重组工程菌在诱导表达前，在全菌中的蛋白条带；泳道“+”：重组工程菌在16℃下诱导表达后，在全菌中获得的NDK-GST融合蛋白，箭头所示为目的融合蛋白条带位置，分子量大小约为42.29 kD。泳道“S”：重组工程菌在16℃下诱导表达后，在细菌破菌上清中获得的NDK-GST融合蛋白。结果显示PGEX-6P-2-NDK/ BL21（DE3）有在16℃条件下能表达出正确的含GST标签的NDK蛋白（NDK-GST融合蛋白），且重组蛋白均在超声裂解的上清中，为可溶形式表达。（其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示）。
实施例3：NDK重组蛋白的制备。
1．放大培养获取蛋白。
取保存在-80℃冰箱中的pGEX-6P-2-NDK/ BL21（DE3）菌种分别接种于LB氨苄抗性平板，37℃培养过夜；挑取单菌落接种于50ml LB培养基，37℃，220rpm培养过夜；将活化的10ml菌液加入到1L LB培养基中进行二次活化，37℃培养3-4h至OD600为0.8时，加入500μlIPTG（终浓度为500μM）置于16℃摇床中诱导12h后，6000rpm离心20min收集菌体，再加100mlPBS重悬菌体后，将菌液进行超声裂解30min，12000rpm，离心30min，收集上清与10mlGST填料4℃结合过夜；获得大量的含有GST标签的NDK融合蛋白。
本步骤的LB固体和液体培养基均含100mg/ml氨苄青霉素；
本步骤的GST填料全称GST 4FF琼脂糖纯化树脂。
2．使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取NDK重组蛋白；
向余下约4ml已结合NDK-GST融合蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B中加入4ml PBS和120μL PreScission protease（PP酶），4℃垂直旋转酶切过夜，离心吸取上清后，分别用2ml PBS洗涤2次，取10μL样品变性处理后，上样10μL进行SDS-PAGE蛋白电泳，在成像***下观察结果，酶切后获得NDK蛋白分子量在15kDa左右，与预期蛋白分子量大小相符合，电泳结果示于图5，泳道M为蛋白分子量标准（Marker），泳道1为重组工程菌在16℃诱导表达后的全菌；泳道2为过夜结合后酶切前与GST填料结合的蛋白（主要是GST-NDK融合蛋白和部分杂蛋白）；泳道3为酶切后收集的蛋白（主要是目的NDK重组蛋白），泳道4为洗脱后残留在GST填料上的蛋白（主要是酶以及酶切后残留的GST标签）。
3.使用离子交换柱对NDK重组蛋白进行进一步纯化，获取高纯度的NDK重组蛋白。
取出离子交换柱，并连接安装，用去离子水冲洗交换柱5个柱体积，用过滤后20mMPB（pH=8.0）溶液对柱进行充分平衡；对保存于20mM PB （pH=8.0）缓冲液中样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合；用含有10mM NaCl和20mM NaCl先后对交换柱的杂蛋白进行冲洗，以除去杂蛋白；使用线性的方法对目的蛋白进行洗脱，并收集流出液进行电泳检测，如图6所示，泳道M：蛋白分子量标准（Marker），泳道NDK表示使用离子交换柱后精纯的NDK重组蛋白，经Image Lab软件分析计算泳道NDK中目的蛋白灰度值占总蛋白灰度值的比例为95%，即目的蛋白纯度为95%。
4.置换缓冲液，将目的蛋白保存于PBS缓冲液中（pH6.0）。
5.BCA法测定重组蛋白浓度，浓度约为0.45 mg/ml。
实施例4：小鼠鲍曼不动杆菌感染模型的构建。
将鲍曼不动杆菌菌株用三线法接种于TSA固体培养基平板，37℃恒温孵育16小时；在平板上挑取单菌落，接种于10ml TSB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中220rpm震荡培养。5小时后收集菌体，用无菌PBS稀释15倍后测其OD600的值，并以1.5×109CFU/ml/OD600进行计算，将菌液稀释至1×108CFU/ml、2×108CFU/ml、3×108CFU/ml，4×108CFU/ml三种不同浓度，再将各组菌液经静脉注射入C57Bl/6雌性小鼠尾静脉（100μL/只）。6-8周龄、体重为18-20g的小鼠最佳。设置每组5只小鼠，连续观察7天并统计各组小鼠的死亡率。最终得到鲍曼不动杆菌感染剂量为3×107CFU/只小鼠，后续小鼠模型构建均选用此剂量。
表1：鲍曼不动杆菌致死剂量的确定
感染剂量（CFU/mouse） 小鼠（只） 七天内死亡数（只） 死亡率
1 x 107 5 0 0
2 x 107 5 2 40%
3 x 107 5 5 100%
4 x 107 5 5 100%
以上结果针对小鼠的生存率进行了动物模型的评价，为鲍曼不动杆菌疫苗的成功研制及鲍曼不动杆菌感染的发病机制的研究奠定了基础。
实施例5：NDK重组蛋白疫苗的制备。
将NDK重组蛋白与不同的佐剂进行吸附做预实验并检测吸附效果，发现Al（OH）3吸附效率最好，后续主要Al（OH）3作为佐剂成分，进行吸附制备疫苗。经摸索后的方法如下：将NDK 重组蛋白 (也即抗原)浓度调节为200μg/ml，量取氢氧化铝佐剂用pH6.0的组氨酸稀释液调整浓度到5 mg/ml，充分混匀，取等体积的NDK 重组蛋白 (也即抗原)溶液和佐剂溶液于4℃条件下旋转混悬吸附1小时后获得疫苗。 同样条件将重组蛋白(抗原)溶液用疫苗稀释液替代制备不含抗原的佐剂对照制剂。
实施例6：NDK重组蛋白免疫动物。
首次免疫，将含NDK蛋白的疫苗制剂用胰岛素针头，双侧大腿肌肉注射C57Bl/6小鼠，每只小鼠注射量为200μl，每侧后肢大腿各100μl，并设置阴性对照组（Al（OH）3佐剂组）；第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上；第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上。
实施例7：重组NDK蛋白的抗体效价检测。
1.样本：重组NDK疫苗第三次免疫后第7天，采集免疫C57Bl/6小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后IgG体液应答水平。
2.ELISA检测试剂制备。
①包被液的配制：称取NaHCO3 1.6g，Na2CO3 2.9g，溶于1L ddH2O，用pH计将pH调至9.6；
②封闭液的配制：1g牛血清白蛋白，溶于100ml抗体稀释液（1:100）；
③抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH2O，再加入500μl Tween 20，再用pH计将pH调至7.4；
④洗涤液的制备：称取2.42g Tris溶于1L ddH2O，再加入500μl Tween 20，再用pH计将pH调至7.4；
⑤显色液（TMB），为天根公司产品；
⑥终止液（2M H2SO4）的制备：将22.2ml浓硫酸倾注入177.8ml ddH2O中。
3.ELISA检测NDK重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价。
①用包被液将纯化后的NDK重组蛋白稀释为4μg/ml；
②包被：将稀释的NDK重组蛋白加入酶标板，100μl/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤4遍；
③封闭：酶标板加封闭液100μl/孔，置于37℃孵育2小时，洗涤4遍；
④将血清进行1:1000、1:5000、1:25000、1:125000倍稀释；
⑤取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μl/孔，置于37℃孵育箱2h，洗涤4遍，控干；
⑥将HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，按 1：10000稀释，制成抗体工作液；
⑦加入稀释抗体工作液，100μl/孔，置于37℃孵育箱45min，洗涤4遍，控干；
⑧加入底物显色液（TMB）100μl/孔，室温避光反应5min；
⑨加入终止液（2M H2SO4），立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD450值；
⑩结果判断：A样品∕A阴性值≧2.1为阳性，A为吸光度OD600（阴性对照为佐剂免疫组）。
表2 ELISA检测NDK重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价（OD450）
稀释倍数 佐剂组免疫血清 NDK免疫血清
125000 0.034 0.111
25000 0.034 0.346
5000 0.036 0.965
1000 0.047 1.925
结果如表2显示，NDK重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价大于1：125000；本发明构建的NDK重组蛋白能够刺激小鼠产生高效价NDK特异性的抗体，说明NDK具有很好的免疫原性，是较好的疫苗候选抗原。
实施例8：通过免疫攻毒实验确定NDK重组蛋白的免疫保护效果。
同实施例6的免疫方案，第三次免疫小鼠后，在第7天经尾静脉注射致死剂量的鲍曼不动杆菌活菌进行攻毒实验，每只C57Bl/6小鼠注射菌液量为3×107 CFU，观察7天，统计各组小鼠的存活率。结果示于表3。
表3重组蛋白免疫保护效果
组别 免疫疫苗组分 小鼠（只） 死亡小鼠数量（只） 死亡率（%） 保护率（%）
NDK重组蛋白免疫 重组蛋白+Al(OH)3佐剂 10 5 50 44.44
佐剂免疫对照组 Al(OH)3佐剂 10 9 90 0
表3为动物免疫试验结果，显示佐剂对照组的死亡率为90%，NDK疫苗免疫组死亡率50%，根据公式计算免疫保护率：[免疫保护率=（对照组发病率-接种组发病率）/对照组发病率×100%]，NDK蛋白免疫组的免疫保护率为44.44%。
因此，本发明的NDK重组蛋白具有良好的免疫原性，并且能够对鲍曼不动杆菌感染起到免疫保护性作用，能够诱导机体产生免疫应答，可以辅以佐剂，例如氢氧化铝佐剂，制备亚单位疫苗用于预防鲍曼不动杆菌的感染。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (4)

1.鲍曼不动杆菌疫苗，其特征在于，所述疫苗包括鲍曼不动杆菌核苷二磷酸激酶NDK重组蛋白，且所述鲍曼不动杆菌核苷二磷酸激酶NDK重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的鲍曼不动杆菌疫苗，其特征在于，所述鲍曼不动杆菌核苷二磷酸激酶NDK重组蛋白至少包含NDK蛋白的第1-143位氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.权利要求1所述的鲍曼不动杆菌疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）根据鲍曼不动杆菌的核苷二磷酸激酶NDK蛋白基因序列设计PCR引物，以鲍曼不动杆菌的全基因组DNA为模板，根据所设计的PCR引物对编码鲍曼不动杆菌的核苷二磷酸激酶NDK蛋白氨基酸序列的目的基因进行PCR扩增；
其中，所设计的PCR引物的正向引物：5'-CGCGGATCCATGGCAATTGAACGTACTTTGTCT-3'，反向引物：5'-TTATGCGGCCGCTTAACGAGTGCGTGGGCAG-3'；
（2）将步骤（1）所得的PCR扩增产物克隆至含有GST标签的表达载体pGEK-6p-2，并转化至原核表达***进行诱导表达含有GST标签的NDK融合蛋白；
（3）使用酶切方法利用PreScission protease酶将目的蛋白和GST标签分开，获得鲍曼不动杆菌的核苷二磷酸激酶NDK重组蛋白；
（4）对步骤（3）所得的NDK重组蛋白进行纯化；
（5）将纯化后的NDK重组蛋白与佐剂进行吸附，以形成鲍曼不动杆菌疫苗。
4.根据权利要求3所述的鲍曼不动杆菌疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤（5）中，所述佐剂包括Al（OH）3佐剂、AlPO4佐剂、MF59、AS03、AS04、不完全弗氏佐剂或完全弗氏佐剂。
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