CN101855238A

CN101855238A - 融合蛋白疫苗

Info

Publication number: CN101855238A
Application number: CN200880020390A
Authority: CN
Inventors: G·林达尔
Original assignee: LUNDS UNIVERSITETS UTVECKLINGSAKTIEBOLAG
Current assignee: Rice nanowatt Ke Si limited liability company
Priority date: 2007-04-16
Filing date: 2008-04-14
Publication date: 2010-10-06
Anticipated expiration: 2028-04-14
Also published as: PL2144924T3; PT2144924T; LT2144924T; ES2586418T3; RU2487890C2; WO2008127179A8; EP2144924A4; US20100062015A1; RU2009142976A; CA2684494A1; HRP20160995T1; CA2684494C; SI2144924T1; DK2144924T3; EP2144924A1; US8313748B2; EP2144924B1; CY1117896T1; HUE028253T2; WO2008127179A1

Abstract

本发明涉及微生物学和疫苗技术领域，并且涉及能够赋予对B组链球菌感染的免疫性的疫苗的研发。更具体地说，本发明涉及包含B组链球菌表面蛋白的N-末端区片段的新融合蛋白，它赋予对B组链球菌的侵入菌株的免疫性。本发明进一步涉及编码所述融合蛋白的分离的核苷酸序列；载体；宿主细胞；疫苗；和预防或治疗B组链球菌感染的方法。

Description

融合蛋白疫苗

发明领域

本发明涉及微生物学和疫苗技术领域，并且涉及能够赋予对B组链球菌感染的免疫性的疫苗的研发。更具体地说，本发明涉及赋予对B组链球菌的侵入菌株的免疫性的新融合蛋白。本发明进一步涉及编码所述融合蛋白的分离的核苷酸序列；载体；宿主细胞；疫苗；和预防或治疗B组链球菌感染的方法。

发明背景

B组链球菌(无乳链球菌(Streptococcus agalactiae))(GBS)为新生儿期侵入性细菌感染，包括脑脊膜炎的主要原因。仅在美国，目前每年就有约5000个因这种细菌导致的侵入性疾病的病例。这些感染总计具有约10％的死亡率，并且存活婴儿中的许多存在持久性的神经后遗症。就此而言，已经作出了巨大尝试来找到预防和治疗的方法和分析GBS导致感染的机理。

GBS还可以导致牛的乳腺炎，即具有相当的经济重要性的牛疾病。研发针对GBS感染的疫苗由此在兽药中也受到关注。

所有女性中约20％为GBS的***携带者，并且从母亲产道垂直传播可能是因这种细菌导致的新生儿疾病中的感染的最常见来源。然而，仅约1％的分娩时居留GBS的婴儿患有严重的感染。并非在分娩过程中接触该细菌的其它因素由此必定促成新生儿疾病的发生。

基于多糖囊的结构将B组链球菌菌株分成9种血清型(Ia，Ib和II-VIII)(Baker，J Inf Dis 1990.161：917)。4种“典型的”血清型Ia，Ib，II和III几乎以等比例出现在正常菌群种的菌株中，但III型在临床上为最重要的血清型，特别是因为它导致大部分脑脊膜炎病例。因为所述囊为公知的毒力因素，所以特别是对III型菌株的研究相当详细。已经尝试研发疫苗，其中III型多糖囊可以为主要成分。

EP 0 866 133中披露了能够研发接受者发生因B组链球菌导致的感染的疫苗。本发明涉及ε蛋白的多糖和片段的组合的应用。它进一步披露了流行病学数据提示类型特异性囊在对B组链球菌感染的免疫性中起重要作用(参见第7页，第2-3行)。另外，在本申请中，不同蛋白质与提及的多糖之间存在大量不同的组合，但所有的权利要求均包括表现出该特定成分的重要性的多糖。然而，多糖囊作为疫苗的应用因与人体组织的交叉反应而可能产生问题(Pritchard等，InfectImmun 1992.60：1598)。因此，如果基于非多糖类的蛋白质研发疫苗，那么可能极为有价值。

对比文件Gravekamp等，Infection and Immunity，1997年12月，p 5216-5221中披露了免疫原性的评价和alpha(α)C蛋白和单独的N-末端部分的重复单位数量的保护。发现免疫原性随重复单位的数量增加而下降(参见图2B)。然而，还发现在保护试验中，与针对N-末端区的抗体相比，针对重复区的抗体主要负责保护(参见5219页，左栏，从倒数1行数第6行，和5220页，右栏，第26-29行)。

WO 9410317中描述了α蛋白，即GBS表面蛋白在研发缀合疫苗中的应用。使用这种蛋白质的缺点在于它通常不被III型菌株表达，而这些菌株为许多严重GBS感染的主要原因。因此，针对这些菌株的保护性免疫不会由α蛋白疫苗引起。

WO 9421685中描述了Rib蛋白，即GBS表面蛋白在研发疫苗中的应用。这种蛋白质在与明矾一起给予时引起免疫性。然而，Rib蛋白具有它不引起针对所有GBS菌株的保护性免疫的缺点。

目前，如上所述，适合于预防GBS疾病的疫苗尚未得到，不过，更多的工作致力于解决这一问题。显然，目前对研发预防和治疗GBS感染的方法存在长期需求，但尚未得到满足。因此，仍然需要探索能够引起针对广泛GBS菌株的保护性免疫的疫苗策略。

因此，本发明的主要目的在于提供能够引起针对GBS感染的保护性免疫的疫苗。

本发明的另一个目的在于提供引起针对许多临床重要的GBS菌株的保护性免疫的疫苗。

本发明的另一个目的在于提供由引起针对GBS感染的保护性免疫的单一融合蛋白组成的疫苗。所述单一蛋白具有优于由多种蛋白质组成的疫苗的几个优点，例如生产成本和安全性。

实现上述目的和其它目的中的每一个的手段从下文对本发明的描述中显而易见。

发明概述

令人意外地发现包含两种不同的非免疫显性区，诸如来自与来自GBSα蛋白的N-末端区片段融合的GBS Rib蛋白的N-末端区片段的融合蛋白，即由两种不同GBS菌株表达的两种不同蛋白质中的非免疫显性区之间的融合体可以产生一种融合蛋白，在将该融合蛋白作为疫苗对哺乳动物给予时，它可以产生针对因两种不同细菌菌株导致的感染的极为有效的保护作用。这种保护作用由抗体赋予。

本发明在第一个方面中涉及融合蛋白，包含B组链球菌表面蛋白或其类似物，同源物，衍生物或免疫相关的氨基酸序列或片段中的至少一种第一N-末端区片段，其与B组链球菌表面蛋白或其类似物，同源物，衍生物或免疫相关的氨基酸序列或片段中的至少一种第二N-末端区片段融合，其中所述B组链球菌表面蛋白中的第一和第二的至少一种N-末端区片段来源于不同B组链球菌菌株，并且其中所述融合蛋白能够引起针对B组链球菌的保护性免疫。

本发明的融合蛋白的主要优点在于它包括来自相关表面蛋白Rib和α的区，它们各自被B组链球菌的许多临床重要的菌株表达，且最重要的是，已经表明其引起针对这些临床重要的菌株的保护性免疫。

该融合蛋白具有甚至在不使用佐剂的情况下它也具有免疫原性，从而引起针对表达Rib-和α的菌株的保护性免疫的优点。此外，本发明的融合蛋白疫苗可以与明矾(一种适用于人体的佐剂)一起给予。相反，据报道近期描述的“通用疫苗”仅与弗氏佐剂，即一种不能用于人体药物的强刺激性成分共同起作用(Maione，D.等，Science 2005.309：148-150)。

本发明的另一个优点在于本发明的疫苗组合物可以由单一融合蛋白组成，并且仍然引起针对不同GBS感染的保护性免疫。这具有优于由多种蛋白质组成的疫苗的几个优点，例如单一蛋白质比包含多种蛋白质的混合物简单，安全和制备低廉。

更具体地说，本发明涉及所述融合蛋白；分离的核苷酸序列；载体，宿主细胞；疫苗；和预防或治疗B组链球菌感染的方法。

下面将特别参照附图更详细地描述本发明。

附图简述

图1表示实施例中所用的蛋白质。(A)表示Rib和α蛋白，包括期唯一的N-末端区(N-区)精确长重复区(R-区)。显示了不同区中氨基酸残基的数量和残基的同一性。(B)来源于Rib和α的重组蛋白。(C)通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质。(D)使用小鼠抗-Rib抗体的抑制试验。(E)斑点印迹分析。

图2表示来自使用被动免疫法的研究的数据。(A)针对RibN或Rib2R的兔抗血清与表达Rib的菌株BM110(开放式符号)或其Rib-阴性突变体(封闭式符号)的反应性。(B)具有兔抗-RibN或抗-Rib2R的小鼠的被动疫苗接种。

图3表示：(A)Rib和α的N-末端区之间的交叉反应性分析：(B)针对RibN-αN和Rib2R-α2R的兔抗体的表征。(C)具有针对两种融合蛋白的抗体的小鼠的被动疫苗接种，随后使用表达Rib的III型菌株BM110或表达α的Ia型A909攻击。(D)使用抗-(RibN-αN)的被动疫苗接种，随后使用表达Rib的II型菌株或表达α的Ib型菌株攻击。(E)使用抗-(RibN-αN)的被动疫苗接种，随后使用Rib-阴性BM110突变体攻击。

图4表示来自使用RibN-αN融合蛋白主动免疫接种的结果。(A)在使用或不使用佐剂情况下给药时RibN-αN的免疫原性。(B)使用RibN-αN的主动疫苗接种。

图5表示：(A)能够侵入人宫颈细胞系ME180的细胞的能力的细菌比较；(B)抗-(RibN-αN)对上皮细胞的抑制。

发明详述

术语“免疫原性”意指具有引起免疫应答的能力。本发明的新融合蛋白为免疫原性的并且特征在于其引起针对至少包含Rib-和α-蛋白的GBS的保护性免疫应答的能力。

术语“类似物”意指与Rib-和α-蛋白相关的那些蛋白质，其中Rib-或α-蛋白(SEQ ID NO：2和4)的一种或多种氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代，只要该类似物蛋白质或融合蛋白的总体功能性和免疫原性受到保护。这类类似物可以为天然存在的或可以通过合成方式或重组DNA技术，例如通过SEQ ID NO：1和3之一或其两者的诱变产生。本发明融合蛋白的类似物具有能够产生与Rib-蛋白反应的至少一个表位和与α蛋白反应的至少一个表位。这类类似物可以与SEQ IDNO：6中所示的融合蛋白具有至少80％的总体同源性或同一性，诸如80-99％的同源性或同一性或其中的任意范围。

例如，可以使用购自University of Wisconsin GeneticsComputer Group(UWGCG)的GAP计算机程序6.0版比较序列信息确定同源性百分比。GAP程序应用Needleman和Wunsch的序列对比法(J MolBiol 1970 48：443)，如Smith和Waterman修订(Adv Appl Math 19812：482)。简言之，GAP程序将相似性定义为除以两种序列中较短的中的符号总数的彼此类似的序列对比符号(即核苷酸或氨基酸)数量。GAP程序的优选默认参数包括：(1)Gribskov和Burgess的单元比较矩阵(包含同一性的1值和非同一性的0值)和加权比较矩阵(Nucl AcidsRes 1986 14：6745)，如Schwartz和Dayhoff，eds.所述(Atlas ofProtein Sequence and Structure，National Biomedical ResearchFoundation，Washington，D.C.1979，pp.353-358)；(2)对各空位而言3.0的罚分和对每个空位中的每个符号而言额外的0.10罚分；和(3)对末端空位而言无罚分。

本文所用的“同源物”与来自链球菌的种类无乳链球菌的所述融合蛋白或Rib-和α-蛋白相关，其中氨基酸序列(SEQ ID NO：2或4)中的一种或多种氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代，只要该同源物蛋白质的总体功能性和免疫原性得以保留。这类同源物可以为天然存在的或可以通过合成方式或通过重组DNA技术产生。SEQ ID NO：2或4的同源物具有能够产生与Rib-或α-蛋白反应的至少一个表位。这种同源物与Rib-和α-蛋白可以具有至少80％的总体同源性(即，相似性)或同一性，诸如80-99％的同源性(即，相似性)或同一性或其中的任意范围。

本文所用的“衍生物”为多肽，其中一种或多种物理，化学或生物特性已被改变。这类改变包括，但不限于：氨基酸取代，修饰，添加或缺失；脂化，糖基化或磷酸化模式的改变；存在于多肽中的氨基酸残基的游离氨基，羧基或羟基侧基与其它有机和无机分子的反应；和其它改变，其中的任一种可以导致一级，二级或三级结构的改变。

本发明的“片段”具有至少一个免疫原性表位。本发明的优选片段会引起足以预防或改善感染严重性的免疫应答。

术语“药学上可接受的媒介物”意指任何合适的常用于药物制剂的可接受的赋形剂、佐剂、载体、稀释剂。

本发明涉及抵抗B组链球菌(GBS)感染的疫苗，这种感染是新生儿中危及生命的细菌感染的最重要的原因。本发明基于本发明人的知识和如下实现：来源于B组链球菌的两种大表面蛋白中的亚区的融合蛋白Rib和α蛋白引起保护性免疫。

鉴于研发基于单一成分的B组链球菌(GBS)疫苗的长期目的，本发明人分析了来源于Rib和α的融合蛋白是否可以引起保护性免疫。Rib和α的大的尺寸和重复区的遗传不稳定性意味着融合蛋白应来源于亚区。然而，亚区的选择并不是显而易见的，因为保护性表位存在于α和Rib的重复区中。令人意外的是，本发明人已经证实来源于N-末端区的融合蛋白具有优于来源于这些蛋白质的其它区，即重复区的特性并且引起良好的保护性免疫。

在本说明书中，除非另有规定，否则“一种(a)”或“一种(an)”意指“一种或多种”。

在本说明书的上下文中，特别将任何和所有的参考文献引入本专利申请中作为参考。

融合蛋白

本发明在第一个方面中涉及融合蛋白，包含B组链球菌的至少第一N-末端区片段，其与B组链球菌表面蛋白的至少第二N-末端区片段融合，其中所述B组链球菌表面蛋白中的第一和第二N-末端区片段来源于不同B组链球菌表面蛋白，并且其中三十融合蛋白能够引起针对B组链球菌的保护性免疫。

可以包含在本发明的融合蛋白中的不同链球菌表面蛋白包括，但不限于B组链球菌Rib蛋白；B组链球菌α蛋白；B组链球菌β蛋白；B组链球菌ε蛋白；和/或B组链球菌R28蛋白。

本发明的一个实施方案涉及融合蛋白，包含与B组链球菌α蛋白的N-末端区片段融合的B组链球菌的Rib蛋白的N-末端区片段，其中所述融合蛋白能够引起针对B组链球菌的保护性免疫。

本发明的另一个实施方案涉及融合体，其中该融合蛋白包含至少第一氨基酸序列SEQ ID NO：2或其类似物，同源物，衍生物或免疫相关的氨基酸序列或片段，其与至少第二氨基酸序列SEQ ID NO：4或其类似物，同源物，衍生物或免疫相关的氨基酸序列或片段融合。所述至少第一氨基酸序列包含与如SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列具有至少80，85，90，95，96，97，98或99％序列同一性的氨基酸序列。所述至少第二氨基酸序列包含与如SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列具有至少80，85，90，95，96，97，98或99％序列同一性的氨基酸序列。融合蛋白的一个实例如SEQ ID NO：6中所示，另一个实例为包含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的三种或三种以上氨基酸序列或其部分的融合蛋白。

B组链球菌Rib蛋白，在本说明书中也称作Rib和Rib蛋白，其为本领域已知的表面蛋白，并且例如描述在WO 9421685中。符号“Rib”意指：蛋白酶抗性，免疫性和B组。Rib蛋白首先分离自血清型III的B组链球菌菌株，为不同的95kDa蛋白质。蛋白质Rib由几乎所有临床重要的血清型III的B组链球菌菌株表达，这些菌株导致脑脊膜炎的大部分病例，并且由前体血清型，诸如II型的某些菌株表达。此外，Rib由III型超毒力克隆的所有菌株表达。已经设计了纯化蛋白质Rib的方法，并且已经证实针对该蛋白质的抗体预防因表达蛋白质Rib的菌株导致的致命感染(进一步的详细描述，诸如DNA和蛋白质序列参见WO 9421685)。

B组链球菌α蛋白，在本说明书中也称作α，α蛋白和α抗原，其为本领域已知的B组链球菌表面蛋白。WO 9410317中描述了包含α蛋白的缀合疫苗组合物。如WO 9410317中所述的天然B组链球菌α前体蛋白具有108kDa的分子量。切割41个氨基酸的推断的信号序列产生104kDa的成熟蛋白(然而，注意随后显示该信号序列具有56个氨基酸残基的长度：

-Carlemalm等，J Exp Med 177，1593；1993)。α蛋白的20kDa N-末端区未显示出与上述蛋白质序列的同一性并且其后面跟随一系列9个串联重复单位，它们构成所述成熟蛋白的74％。每个重复单位(本文称作“R”)相同并且由82个氨基酸组成，分子量约为8500道尔顿，被246个核苷酸编码。α抗原的C-末端包含存在于许多革兰氏阳性表面蛋白中的细胞壁锚定结构域基元。

GBS的Rib和α蛋白各自包括唯一的N-末端区(N)和长重复(R)区。GBS菌株BM110和A909表达的蛋白质分别具有12和9个重复单位，如图1A中所示。壁锚定区位于C-末端上。

Rib和α中的串联重复单位在每种蛋白质内相同，但在蛋白质之间不同，并且在分离物之间的数量上可变。除这种变化外，Rib和α的序列在菌株中稳定。尽管氨基酸残基同一性明显(图1A)，但是两种蛋白质几乎未表现出或无抗原交叉反应性。

R28蛋白为B组链球菌表面蛋白，它赋予保护性免疫并且促进结合人上皮细胞(

-Carlemalm等Molecular Microbiology1999.33，208-219)。

ε蛋白为B组链球菌α-蛋白-样蛋白(Creti等Clin Microbiol.2004.42：1326-9)。

本发明涉及的术语“N-末端区”意指蛋白质的N-末端区(N)。Rib和α的N-末端区的氨基酸序列的实例如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中所示。

就本发明的目的而言，术语“融合蛋白”意指两个或两个以上蛋白质区的装配集合或其片段，例如，包含B组链球菌Rib蛋白的N-末端区片段和B组链球菌α蛋白的N-末端区片段。例如，可以存在一个Rib-蛋白的N-末端区片段和一个α-蛋白的N-末端区片段或Rib-和α-蛋白的2，3，4或5个N-末端区片段，其中来自两种蛋白质的片段数量不相等。

B组链球菌Rib蛋白的N-末端区片段和B组链球菌α蛋白的N-末端区片段的实例包括编码天然α和Rib蛋白(例如SEQ ID NO：2和SEQID NO：4)的N-末端区的天然氨基酸序列的肽或可以为这些区的天然序列的功能性衍生物，其中这些功能性衍生物保持其引起针对B组链球菌的保护性免疫的能力。术语功能性衍生物用以包括N-末端区的序列和片段的部分；它还用以包括天然蛋白质的变体(诸如如天然分子表现出的具有氨基酸序列改变，但保持引起免疫原性，毒力或抗原特性的能力的蛋白质)，例如具有改变的侧翼序列。

包括可以按照本发明使用来自B组链球菌不同菌株的N-末端区片段。这意味着N-末端区片段中的序列轻微改变，但不会改变生物特性及其引起保护性免疫的功能能力。例如，分离自B组链球菌的不同菌株，而非SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中披露的那些的B组链球菌α和Rib抗原旨在本发明的范围内。

可以通过几种方式，例如：通过偶联以化学方式，缀合或交联直接或通过中间体结构；通过经俘获在大分子结构中或上以物理方式；或通过分子的生物融合，即通过包含能够编码两者中每一种的核酸片段的重组核酸分子的组合，以便最终产生单一连续表达产物可以实现多肽类的组合以提供融合蛋白。

就本发明的目的而言，术语“蛋白质”意指氨基酸的分子链。蛋白质不具有具体的长度，并且如果需要，可以在体内或体外通过例如糖基化，酰胺化，羧化或磷酸化加以修饰。特别地，肽类，寡肽类和多肽类包括在本定义中。蛋白质或肽可以是天然或合成来源的。在本文的上下文中，融合蛋白意指通过几种方式，诸如上述的那些直接或间接地彼此共价连接的两种或多种多肽类。术语“融合”意指生成如上所述的融合蛋白。

B组链球菌菌株，本文也称作GBS，为众所周知的并且可以分离自感染的人类血液。GBS在美国为最常见的新生儿脓毒症的原因并且每年造成约5000个病例。

名称“B组链球菌”来源于如下事实：基于其细胞表面上存在的特异性碳水化合物抗原将链球菌分入免疫组。目前，公认了A-O组(Davis，B.D.等：Microbiology，3rd.Edition，609页，(Harper &Row，1980)。

本发明涉及的术语“保护性免疫”意指血清抗体和/或细胞毒性T细胞应答在免疫接种过程中诱导预防(部分或完全)因病原体，诸如B组链球菌导致的疾病的能力。即本发明疫苗免疫接种的脊椎动物经历了B组链球菌生长和传播受限。为了测定融合蛋白或疫苗是否诱导保护性免疫，可以使用本领域技术人员众所周知的技术。例如，为了测定免疫接种本发明的融合蛋白或疫苗是否诱导针对B组链球菌感染的保护性免疫，可以使用B组链球菌度免疫接种试验动物进行攻击并且测定B组链球菌的生长和传播。例如，为了确定是否诱导了保护性免疫，可以使用如下实施例中所述的方法。

在本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白进一步包含B组链球菌R28蛋白的N-末端区片段(基因库登记号：AAD39085.1)和/或B组链球菌ε蛋白的N-末端区片段。

在本发明的一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含B组链球菌蛋白(即α和Rib)的N-末端区片段的重复肽序列。

按照本发明的一个实施方案，所述融合蛋白包含与如SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列具有至少80％，85％，优选90％，更优选95％序列同一性的氨基酸序列。

术语“序列同一性”表示等长度的两个氨基酸序列或等长度的两个核苷酸序列之间的同源性程度的定量测量值。如果待比较的两个序列不具有等长度，那么必须将它们进行序列比对以便达到最佳可能的拟合。例如，可以通过BLAST程序，例如BLASTP程序或BLASTN程序计算序列同一性(Pearson W.R and D.J.Lipman(1988)PNAS USA85：2444-2448)(www.ncbl.nlm.nlh.gov/BLAST)。

按照本发明的另一个实施方案，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列。

分离的DNA&表达***

在本发明的第二方面中提供了分离的核苷酸序列/DNA分子，其包含编码本发明融合蛋白的核苷酸序列/DNA序列。一个实例为包含至少第一如SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列或其片段的核苷酸序列，其与如SEQ ID NO：3中所示的至少第二核苷酸或其片段融合。

还提供了重组表达***，包括载体和宿主细胞。

各种表达宿主/载体组合可以用于表达本发明的核苷酸序列。用于真核宿主的有用表达载体包括，例如包含来自SV40，牛***瘤病毒，腺病毒，腺伴随病毒，巨细胞病毒和逆转录病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用表达载体包括细菌制粒，诸如来自大肠杆菌(E.coli)的那些，包括pBluescript，pGEX2T，pUC载体，col E1，pCR1，pBR322，pMB9及其衍生物衍生物，较宽宿主范围的制粒，诸如RP4，噬菌体DNA，例如噬菌体λ的大量衍生物，例如λGt10和λGT11，NM989，和其它DNA噬菌体，诸如M13和丝状单链DNA噬菌体。用于酵母细胞的有用表达载体包括2.mu.质粒及其衍生物。用于昆虫细胞的有用载体包括pVL 941。

此外，各种表达控制序列中的任一种可以用于这些载体以便表达本发明的核苷酸序列/DNA序列。有用的表达控制序列包括与上述表达载体基因相关的表达控制序列。有用的表达控制序列的实例包括，例如SV40或腺病毒的早期和完全启动子，lac***，trp***，TAC或TRC***，T3和T7启动子，噬菌体λ的主要操纵子和启动子区，外被蛋白的控制区，3-磷酸甘油酸酯激酶启动子或其它糖酵解酶，酸性磷酸酶启动子，例如Pho5，酵母α-交配***启动子和其它已知用于控制原核或真核细胞或其病毒基因表达的组成型和诱导型启动子序列及其各种组合。

使用上述载体转化的宿主细胞构成了本发明的另一个方面。各种单细胞宿主细胞用于表达本发明的核苷酸序列/DNA序列。这些宿主可以包括众所周知的原核和真核宿主，诸如革兰氏阴性和革兰氏阳性菌株，诸如大肠杆菌菌株，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)，链霉菌属(Streptomyces)，链球菌属(streptococcus)，葡萄球菌属(staphylococcus)，乳杆菌属(lactobacillus)，曲霉属(aspergillus)，志贺氏菌属(shigella)，沙门菌属(salmonella)利斯特氏菌属(listeria)，，真菌，酵母，昆虫细胞，诸如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(SF9)，动物细胞，诸如CHO和小鼠细胞，非洲绿猴细胞，诸如COS 1，COS 7，BSC 1，BSC 40和BMT 10，人体细胞，和组织培养物中的植物细胞。优选的宿主生物体包括细菌，诸如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，和组织培养物中的哺乳动物细胞。

当然，应理解并非所有的载体和表达控制序列都将同样良好地其作用以表达本发明的核苷酸序列/DNA序列。不是所有的宿主均对同样的表达***起同样良好的作用。然而，本领域技术人员可以不经过度实验并且在不脱离本发明的范围的情况下在这些载体，表达控制序列和宿主中进行选择。例如，在选择载体的过程中，必须考虑到宿主，因为载体必须在其中复制。还应考虑载体的拷贝数，控制该拷贝数的能力和该载体编码的任意其它蛋白质，诸如抗生素标记的表达。在选择表达控制序列的过程中，也应考虑各种因素。它们包括，例如序列的相对强度，其可控性及其与本发明核苷酸序列/DNA序列的相容性，特别是就可能的二级结构而言。应通过考虑其与选择的载体的相容性，本发明核苷酸序列/DNA序列编码的产物毒性，其分泌特征，其正确折叠蛋白质的能力，其发酵或培养要求和从它们中纯化部分核苷酸序列/DNA序列编码的产物的便利性选择单细胞宿主。在这些参数中，本领域技术人员可以选择各种载体/表达控制序列/宿主组合，它们在培养时或大规模动物培养中表达本发明的核苷酸序列/DNA序列。

可以使用各种常规方法中的任一种从微生物培养物或细胞培养物中分离并且稠合本发明核苷酸序列/DNA序列编码的多肽类，包括：液相色谱法，诸如正相或反相，使用HPLC，FPLC等；亲和色谱法(诸如使用无机配体或单克隆抗体)；离子交换色谱法，尺寸排阻色谱法；固定化金属螯合物色谱法；凝胶电泳等。本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围的情况下选择最适当的分离和纯化技术。

此外，可以通过几种化学技术中的任一种生成本发明的多肽类。例如，可以使用最初由R.B.Merrifield描述的固相合成技术制备它们(J Am Chem Soc 1963 83：2149-54)，或可以通过溶液中的合成制备它们。肽合成技术综述可以在E.Gross&H.J.Meinhofer，4 ThePeptides：Analysis Synthesis，Biology；Modern Techniques OfPeptide And Amino Acid Analysis，John Wiley & Sons，(1981)；和M.Bodanszky，Principles Of Peptide Synthesis，Springer-Verlag(1984)中找到。

本发明的优选组合物和方法包括具有增强的免疫原性的多肽类。这类多肽类可以在该多肽类或其片段的天然形式被修饰或进行处理以便增强其在指定接受者中的免疫原性时产生。许多技术是可以利用的并且是本领域技术人员众所周知的，可以在不进行过度实验的情况下使用它们，以便显著增加本文披露的多肽类的免疫原性。例如，可以通过与二硝基苯酚部分或氨苯胂酸偶联或通过加热和/或SDS变性修饰所述多肽类。特别地，如果所述多肽类为以化学方式合成的小多肽类，那么可能期望使它们与免疫原性载体偶联。偶联当然不一定干扰所述多肽或载体适当其作用的能力。就偶联策略中的某些一般性考虑的综述而言，参见Antibodies，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，ed.E.Harlow和D.Lane(1988)。有用的免疫原性载体是本领域众所周知的。这类载体的实例为钥孔

血蓝蛋白(KLH)；白蛋白，诸如牛血白蛋白(BSA)和卵白蛋白，PPD(结核菌素的纯化蛋白衍生物)；红血细胞；破伤风类毒素；霍乱类毒素；琼脂糖珠；活性炭；或膨润土。

还可以在所谓的不含细胞的表达***中进行表达。这类***包括来自可操作地与在该特定***中起作用的启动子连接的适当的重组核酸的所有表达用必需因子。

Rib和α的N-末端区的核苷酸序列/DNA序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3中所示，并且如下实施例中所用的融合蛋白的核苷酸序列/DNA序列如SEQ ID NO：5中所示。

本发明在一个实施方案中涉及生产所述融合蛋白的方法，包括下列步骤：提供包含如上所述核苷酸序列的如上所公开的宿主细胞，使该宿主细胞在本领域技术人员众所周知的合适的宿主培养基中繁殖，使用上述技术中的一种或多种纯化所述融合蛋白并且获得所述融合蛋白，可以将其进一步用于制备如下所述的疫苗。

疫苗组合物

本发明在第三个方面中提供了疫苗，其包含本发明的融合蛋白和药学上可接受的媒介物。

本发明的疫苗组合物除包含所述融合蛋白外还可以包含其它药学上可接受的组分，诸如盐，缓冲剂，免疫活性成分，佐剂，湿润剂，乳化剂和助悬剂或甜味剂，矫味剂，芳香剂和改善组合物功效所需的其它物质。如果接受者个体可以耐受其给药，那么认为组合物为“药学上可接受的”。

还可以通过使用本领域已知的技术合并所述融合蛋白与其它成分，包括，但不限于白喉类毒素或破伤风类毒素或多糖类制备多价疫苗。

本发明的多价疫苗的优选蛋白的其它实例包括B组链球菌的额外表面蛋白或其等效物诸如R28蛋白和ε蛋白。

在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物包含B组链球菌R28蛋白的片段和/或B组链球菌ε蛋白的片段。

制备和配制疫苗组合物的方法是本领域技术人员众所周知的。组分的选择例如根据组合物给药途径的不同而改变。例如，用于非肠道给药的组合物包括无菌水或非水溶液，混悬液和乳剂。非水溶剂的实例为丙二醇，植物油，诸如橄榄油，和可注射有机酯类，诸如油酸乙酯。载体或封闭敷料可以用于增加皮肤渗透性和促进抗原吸收。用于口服给药的液体剂型一般可以包括含该液体剂型的脂质体溶液。用于悬浮脂质体的合适的剂型包括乳剂，混悬液，溶液，糖浆剂和酏剂，它们包含本领域中常用的惰性稀释剂，诸如纯水。

本发明的疫苗组合物可以包含额外的免疫活性成分。所述额外的免疫活性成分可以为抗原，免疫增强物质和/或疫苗；它们中的任一种可以包含佐剂。

佐剂为可以用于特别强化特异性免疫应答的物质。正常情况下，在呈递给免疫***前将佐剂和组合物混合，或单独将它们呈递入免疫接种的动物或人的同一部位。可以将佐剂基于其组成大致分成几组。这些组包括油佐剂(例如弗氏完全和不完全佐剂)，无机盐(例如AlK(SO₄)₂，AlNa(SO₄)₂，AlNH₄(SO₄).二氧化硅，高岭土和碳)，聚核苷酸(例如聚IC和聚AU酸)，和某些天然物质(例如来自结核分枝杆菌的蜡D以及在小棒杆菌(Corynebacterium parvum)或百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)中发现的物质和布鲁杆菌属(Brucella)中的成员。在那些物质中特别用作佐剂的是皂苷类，诸如，例如QuilA。适用于疫苗组合物的材料的实例提供在Remington′sPharmaceutical Sciences(Osol，A，Ed，Mack Publishing Co，Easton，PA，pp.1324-1341(1980)中。

在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白可以用作缀合疫苗中的多糖的载体。在该实施方案中，所述疫苗包含与多糖(诸如荚膜多糖)缀合的蛋白质，即融合蛋白。

多肽，蛋白质或融合蛋白作为缀合疫苗中的多糖的载体的应用是本领域众所周知的，例如，参见US 6 855 321，WO 9410317和US 4 496538)。

所谓多糖意指由通常通过配糖键连接的单糖残基组成的任意直链或支链聚合物，且由此包括寡糖类。优选所述多糖包含2-50个单糖单位，更优选6-30个单糖单位。

多糖成分可以基于或衍生于来自许多革兰氏阳性和革兰氏阴性菌病原体，诸如流感嗜血菌(H.influenzae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)和肺炎链球菌(S.pneumoniae)的多糖荚膜的多糖成分。从中多糖成分可以与本发明的载体蛋白缀合的其它细菌包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)。适用于本发明该方面的多糖成分包括Hib寡糖，来自铜绿假单胞菌的脂多糖(Seid和Sadoff，1981)，来自沙门菌属的脂多糖(Konadu等，1996)和来自痢疾志贺氏菌的O-特异性多糖(Chu等，1991)。适用于本发明的其它多糖成分将是本领域技术人员众所周知的。

可以通过任何合适的方法，诸如通过酸水解或超声照射生产细菌荚膜多糖片段(Szn等，1986)。多糖成分的其它制备方法将是本领域技术人员众所周知的。

在本发明的一个实施方案中，所述多糖为来源于B组链球菌的荚膜多糖或其等效物。

应当优选地使缀合疫苗的多糖成分通过共价键与载体蛋白偶联。偶联多糖和蛋白质的特别优选的方法通过还原氨基化进行。其它方法包括：使用溴化氰活化多糖，随后与己二酸二酰肼(间隔基)反应和使用可溶性碳二亚胺与载体蛋白的羰基化物部分缀合(Shneerson等，1986)；使用己二酸二酰肼使载体蛋白官能化，随后与溴化氰活化的多糖类偶联(Dick等，1989)；对载体蛋白和多糖进行化学修饰，随后进行其偶联(Marburg等，1986；Marburg等，1987和1989)。

可以使多糖分子通过间隔分子，诸如己二酸与载体蛋白偶联。这种间隔分子可以用于促进蛋白质与多糖的偶联。在进行偶联反应后，可以通过渗滤或其它已知方法纯化该缀合物以便除去未反应的蛋白质或多糖成分。

如果多糖来源于不同于GBS的细菌病原体，那么该缀合物可以引起针对两种或两种以上病原体，例如多种类型的细菌的免疫性。这就是所述融合蛋白的潜在重要的应用。为了制备缀合疫苗，蛋白质部分由单一融合蛋白组成具有相当的优势。

对本领域技术人员而言显而易见，本发明的疫苗组合物可以包含非上述的其它物质或化合物，诸如其它稀释剂，乳化剂或稳定剂，或其它蛋白质或多糖类。这类物质或化合物应赋予所述组合物期望的特性。

预防和治疗B组链球菌感染的方法

本发明在另外的方面中提供了预防或治疗由B组链球菌导致的感染的方法。这些方法包括对个体给予药学有效量的本发明的疫苗。本发明还提供了本发明的免疫原性组合物在制备用于预防或治疗由B组链球菌导致的感染的疫苗中的应用。

使用抵抗母亲和婴幼儿中B组链球菌感染的疫苗的母源免疫预防长期以来作为可能的途径被推荐。

本发明涉及的术语“预防或治疗”在其各种语法形式中是指预防、治愈、逆转、减弱、缓解、改善、抑制、最大限度地降低、压制或阻止1)与B组链球菌感染相关的病症的有害作用，(2)病症发展，或(3)病症病原体(B组链球菌)。此外，关注术语“预防或治疗”包括使B组链球菌感染的个体产生完全或部分免疫性。

按照一个实施方案，该预防或治疗方法包括对女性给予有效量的本发明的疫苗，该疫苗能够赋予所述女性的未出生后代对B组链球菌感染的免疫性。按照该实施方案，将所述疫苗给予非妊娠女性或妊娠女性，其时间和用量条件足以导致用于保护该女性和胎儿或新生儿的抗体产生(通过经胎盘被动传递抗体)。

在另一个实施方案中，该预防或治疗由B组链球菌导致的感染的方法包括对个体给予有效量的因第二个个体接触本发明的疫苗而产生的抗血清。按照该实施方案，对B组链球菌的抗性通过被动免疫接种被赋予该个体，即，将疫苗提供给宿主(即人或哺乳动物)志愿者，并且回收产生的抗血清并且直接提供给怀疑具有由B组链球菌导致的感染的接受者。预期可以将这类抗血清给予妊娠女性(在分娩时或分娩前)，其时间和用量条件足以使得该抗血清可以用于保护胎儿或新生儿(通过经胎盘被动掺入该抗体)。

由此可以在感染发作前(以便预防或减弱预期的感染)或在真正的感染开始后提供本发明的疫苗或抗血清。

可以将本发明的疫苗组合物或抗血清给予人或动物，包括哺乳动物和禽类，诸如啮齿动物(小鼠，大鼠，豚鼠或兔)；禽类(火鸡，雌禽或小鸡)；其它农场动物(母牛，马，猪或小猪)；宠物(狗，猫和其它宠物)；和人。尽管可以使用本发明的制品治疗许多动物，但是优选的治疗个体为人或商业上有价值的动物和家畜。

可以按照本领域已知的方法对个体给予本发明的疫苗组合物或抗血清。这类方法包括例如非肠道施用，诸如通过所有注射途径注入或通过皮肤：例如肌内、静脉内、腹膜内、粘膜、粘膜下或皮下。此外，可以通过作为滴剂、喷雾剂、凝胶或软膏局部施用于眼、鼻、口、***或***的粘膜上皮或于身体的任何部位的外部皮肤的表皮上来施用它们。其它可能的施用途径通过经呼吸道吸入的喷雾剂、气溶胶或粉末施用进行。在这最后一种情况中，可以使用的粒度将确定该颗粒穿透入呼吸道有多深。可选择地，施用可以通过与食物，饲料或饮用水混合，例如作为粉末、液体或片剂或通过经消化道进行或作为液体，凝胶，片剂或胶囊通过直接给药入口腔或作为栓剂给药至***进行。还可以以DNA疫苗的形式给予该疫苗。

存在许多用于定时免疫接种的不同技术。能够使用本发明的组合物一次以上来增加由免疫接种动物表达的免疫球蛋白谱的表达水平和多样性。一般而言，如果给予多次免疫接种，那么应将它们间隔1-2个月给予。

本发明涉及的术语“有效量”是指对指定条件和给药方案提供治疗作用的用量。这是为产生期望治疗作用计算的与所需添加剂和稀释剂，即载体或给药媒介物混合的活性物质的预定量。此外，它用于意指足以减轻并且组优选预防宿主活动和应答中的临床显著缺陷的用量。可选择地，治疗有效量足以导致宿主临床显著的病情改善。正如本领域技术人员所理解的，化合物的用量可以根据其比活性的不同而改变。合适的剂量可以包含经计算可产生期望的治疗作用的与所需的稀释剂，即载体或添加剂结合的活性组合物的预定量。此外，给药剂量将根据所用的一种或多种活性成分，所治疗个体的年龄、体重等的不同而改变。

一般而言，该剂量由最可能使用佐剂初始注射约0.01-10mg，且优选0.1-1.0mg融合蛋白抗原/个体，随后最可能的是一次或可能多次加强注射组成。优选在初始注射后约1和6个月时给予加强剂量。

实施例

为了能够更好地理解本发明，给出了下列实施例。然而，应理解给出下列实施例是为了例证本发明，而本发明并不限于这些实施例中所述的具体条件和细节。

在下面的实施例中，使用下列B组链球菌(GBS)菌株：A909(Ia型)SB35sedl(Ib型)；1954/92(II型)；和BM110(III型)(Larsson等Infect.Immun.1996.64：3518-3523；

-Carlemalm等J.Exp.Med.1993.177：1593-1603)。菌株BM110为超毒力ST-17克隆的成员。在37℃和不进行振摇下使所有GBS菌株生长在Todd-Hewitt肉汤中。

本文涉及的所有菌株均可获自本发明人所在的University ofLund and the Lund University Hospital(Doctor Gunnar Lindahl，Department of Medical Microbiology，Solvegatan 23，SE-22362Lund，瑞典)。

实施例1：Rib-和α-阴性细菌突变体的构建

Rib-阴性突变体来源于含有rib基因和侧翼序列的BM110.A～7kb片段，将其亚克隆入pJRS233(Perez-Casal等，Mol.Microbiol.1993.8：809-819.)。通过反向PCR缺失rib基因并且用卡那霉素抗性***替代。在转入BM110后，通过同源重组分离Rib-阴性突变体(Perez-Casal，J.等，1993)。不同于上述的完整的rib基因在该突变体中不存在(Waldemarsson等J.Bacteriol.2006.188：378-388)。通过PCR证实该突变体的结构。该突变体缺乏与抗-Rib血清的反应性，但不受荚膜表达的影响。通过类似技术构建A909的α-阴性突变体。该突变体缺乏与抗-α血清的反应性，但不受荚膜或β蛋白表达的影响。

实施例2：Rib和α的融合蛋白和其它衍生物的构建

在本文所述的实施例中，使用完整的蛋白质和一系列重组蛋白(参见图1B)。将BM110中的Rib基因(SEQ ID NO：1)和编码A909中α蛋白(SEQ ID NO：3)的bca基因的片段克隆入pGEX-6P-2(Amersham)并且用于制备GST-融合体。在除去GST部分后，纯化的衍生物具有N-末端序列GPLGS。RibN和Rib2R分别相当于Rib的氨基酸残基1-174和175-332，并且αN相当于α的残基1-170(等的编号：J.Biol.Chem.1996.271：18892-18897)。RibN-αN包含Rib的氨基酸1-174和α的氨基酸1-170，而Rib2R-α2R 12包含Rib的氨基酸175-332和α的氨基酸171-334。由于使用的操作，所以每种融合蛋白包括两种区之间的序列EF。Rib和α分别纯化自BM110和A909。

实施例3：纯化蛋白的分析

图1C表示通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质。该图从两种凝胶合并而来。左侧的数字表示以kDa计的分子量。因为Rib和α在凝胶中异常移动，所以蛋白质的表观大小确实与从氨基酸序列推断的大小不相当。

实施例4：Rib和α的重复区的免疫显性试验

通过s.c.免疫接种在CFA中～35μg蛋白，随后两次加强接种在IFA中的～18μg蛋白产生兔抗血清。给小鼠s.c.免疫接种25μg蛋白与或不与佐剂，如所示的在4周后使用12μg蛋白加强接种，并且在2周后取血。就CFA小鼠而言，使用IFA给予加强剂量。

基本上如所述的进行抗体结合和抑制试验(图1D)(

-Carlemalm等，J.Exp.Med.1993.177：1593-1603；

等J.Biol.Chem.1996.271：18892-18897)，以便分析使用明矾作为佐剂产生的小鼠抗-Rib抗体是否定向于N-末端区和/或重复。使用白作为佐剂产生的抗体用于检测在微量滴定孔中免疫接种的纯的Rib，并且通过添加所示的纯的蛋白质(2μg)抑制结合。使用放射性标记的蛋白G检测结合的兔抗体并且通过与兔抗-小鼠Ig，随后与放射性标记的蛋白G一起孵育检测结合的小鼠抗体。计算在最低抗血清稀释下结合的蛋白G的结合％。通过使用0.05μg/ml的包被溶液和稀释1000-倍的小鼠血清优化抑制试验的灵敏度(图1D)。所有试验均至少进行三次，并且表示SDs。为了进行斑点印迹分析，将膜与所示的小鼠血清一起孵育并且通过与兔抗-小鼠Ig，随后与放射性标记的蛋白G一起孵育，并且实施放射自显影术检测结合抗体。

如预计的，与Rib的结合被Rib完全抑制，并且使用Rib2R也观察到大量几乎完全的抑制，而RibN具有极小的作用。因此，几乎所有抗体均定向于重复单位。Rib2R的抑制为非特异性的，因为它不抑制抗体与无关GBS抗原结合(数据未显示)。

在α***中，斑点印迹分析显示抗-α与完整α反应，而不与αN反应(图1E，左侧)。αN缺乏反应性并非该构建体的内在特性，因为抗-αN与α和αN均反应(图1E，右侧)。

Rib和α中的重复区的免疫显性原因尚不了解。B细胞上重复单位与Ig受体之间的多价相互作用可以促成，但Rib和α并非不依赖于T-细胞的抗原，因为它们引起IgG反应。显然对NH₂-末端区的免应答差并非因掩蔽所致，因为这些区可接近抗体(参见下文)。

实施例5：被动疫苗接种

因为针对Rib和α的抗体几乎仅定向于重复单位并且具有保护性，所以显然融合蛋白疫苗应来源于该重复单位。然而，得到的数据不包括分离的N-末端区的保护性可能超过了所述重复单位并且适合于构建融合蛋白。为了分析这种推断，我们使用了Rib***直接比较抗体定向于N-末端区或重复单位的保护能力。该分析使用了由RibN或Rib2R产生的兔抗体和被动疫苗接种小鼠模型。

如所述的使用C3H/HeN小鼠，兔抗血清和LD₉₀剂量的log-期细菌(10⁵-10⁶CFU，取决于所用的菌株)进行被动疫苗接种(

-Carlemalm等，J.Exp.Med.1993.177：1593-1603)在96小时期限过程中记录存活率。为了进行主动疫苗接种，给小鼠s.c.免疫接种混合了明矾的10μg蛋白。4周后使用明矾给予5μg加强剂量。对照组小鼠接受PBS和明矾。加强剂量后2周，剂量的细菌攻击小鼠并且记录存活率。所有实验均得到有关动物研究的管理部门广泛的综合批准。

抗体与表达Rib的细菌反应，但不与Rib-阴性突变体反应，表明它们识别Rib天然形式上暴露的表位(图2A)。因为抗-RibN具有高于抗-Rib2R～7-倍的滴度，所以将其稀释至能够在小鼠模型中直接比较。在该模型中，每种抗血清均预防致命性感染(图2B)，并且稀释的抗-RibN至少保护未稀释的抗-Rib2R。p值是指与96小时时的预先免疫的对照组的比较。在Rib***中的结果提示应将来源于Rib和α的N-末端区的融合蛋白与来源于重复单位的融合蛋白比较。然而，需要来源于N-末端区的融合蛋白并不明显，因为这些区表现出61％的残基同一性(图1A)，提示它们可能交叉反应。交叉反应性在预先的研究中未得到注意，这些研究使用针对完整蛋白的抗体，即主要针对重复单位的抗体。

用抗-RibN和抗-αN分析这种推定(图3A)。每种抗血清与表达Rib的菌株BM110的完整细菌反应(左侧，开放式符号)，而不与Rib-阴性突变体反应(左侧，封闭式符号)。类似地，每种抗血清与表达α的菌株A909的细菌反应(右侧，开放式符号)，而不与α-阴性突变体反应(右侧，封闭式符号)。使用每种类型的两种兔血清获得类似的数据。这表明N-末端区缺乏交叉反应性。由此构建了融合蛋白RibN-αN并且与来源于重复单位的类似大小的融合蛋白Rib2R-α2R比较。在兔中，融合蛋白RibN-αN引起的抗体应答优于Rib2R-α2R，正如通过与表达Rib-或α-的细菌的交叉反应性判断的(图3B)。为了在被动保护的小鼠模型中进行比较，由此将抗-(RibN-αN)稀释至与抗-(Rib2R-α2R)相同的滴度。每种抗血清预防表达Rib的III型菌株和表达α的Ia型菌株(图3C)。因此，两种融合蛋白各自产生针对Rib和α的保护性抗体。

实施例6：GBS的多血清型的被动疫苗接种

被动疫苗接种模型用于分析抗-(RibN-αN)提供的保护是否不依赖于荚膜血清型。在使用表达Rib的II型菌株和表达α的Ib型菌株进行的实验中观察到了良好的保护(图3D)。因此，抗-(RibN-αN)预防了4种类型的血清型Ia，Ib，II和III的表达Rib和α的菌株。这种预防作用为非特异性的，因为抗-(RibN-αN)不预防Rib-阴性突变体(图3E)。显然，Rib阴性突变体可以用于这种分析，因为它未在小鼠模型中表现出毒力降低。针对RibN-αN的抗体也识别表达Rib和α与相关的两种蛋白质R28和ε蛋白的菌株，这两种蛋白分别由血清型V和Ia的许多菌株表达(Lindahl等Clin.Microbiol.Rev 2005.18：102-127；Brimil等Int J Med.Microbiol.2006.296：39-44)。然而，预防表达R28或ε的菌株可能需要构建包括这些蛋白质的N-末端区的融合蛋白。

实施例7：主动疫苗接种

图4表示来自使用RibN-αN融合蛋白进行主动免疫接种的结果。(A)在使用或不使用佐剂给药时RibN-αN的免疫原性。给4组小鼠免疫接种混合了CFA，明矾或PBS的RibN-αN，4周后加强剂量并且2周后取血。分析小鼠血清与在微量滴定孔中免疫接种的纯抗原的反应性。通过与兔抗-小鼠Ig，随后与放射性标记的蛋白G一起孵育检测结合的小鼠抗体。(B)主动疫苗接种RibN-αN。给小鼠(y-轴上所示的数)免疫接种混合了明矾的纯RibN-αN，4周后加强剂量并且2周后使用Rib的III型菌株BM110(左)或表达α的Ia型菌株A909(右)攻击。对照组小鼠接受PBS和明矾。从两次实验中采集α-菌株的数据。p值是指在96小时时的比较。

在使用纯RibN-αN进行的主动免疫接种中，这种蛋白质对小鼠而言在免疫原性方面与给予CFA，明矾或PBS(图4A)时等同。此外，主动免疫接种RibN-αN和明矾预防了小鼠的表达Rib和α的菌株(图4B)。因此，RibN-αN使用人体应用可接受的佐剂引起了保护性免疫。

RibN-αN产生的抗体几乎不包括IgG类(数据未显示)。推断至人体，这些数据提示胎儿可以受到母源抗-(RibN-αN)抗体保护。这一结论得到了针对完整Rib和α的抗体经过人体胎盘转移这一发现的支持。

与使用RibN-αN获得的结果相反，Rib2R-α2R蛋白仅在接受抗原与明矾或PBS的4种CFA小鼠之一中产生抗体(数据未显示)。因此，Rib2R-α2R对小鼠而言免疫原性差，不过，完整Rib和α对重复单位引起良好的免疫应答。这些数据确证了RibN-αN作为疫苗成分特别有意义的结论。

实施例8：针对RibN-αN的抗体预防侵入上皮细胞

图5表示针对RibN-αN的抗体预防对人上皮细胞的侵入。(A)Rib和α在上皮细胞侵入中的作用。将菌株BM110的Rib-阴性突变体(左)和菌株A909的α-阴性突变体(右)与相应的野生型(WT)细菌比较它们侵入人宫颈细胞系ME180的细胞的能力。(B)抗-(RibN-αN)对上皮细胞侵入的抑制。将菌株BM110(左)或A909(右)的细菌与兔抗-(RibN-αN)或预先免疫血清一起孵育，此后用于侵入测定。(A)和B组中所有的数据均基于三次不同的实验。显示了SD和p值。

用PBS洗涤细菌培养物过夜，重新悬浮于DME中(补充了10mMHepes和4mM L-谷氨酰胺)至1x10⁷CFU ml-1，并且将样品(500μl)加入到人宫颈细胞系ME180单层中(ATCC HTB33)，在24孔平板的孔中生长至100％汇合。加入的细菌在6.7x10⁶CFU-2.7x10⁷CFU的范围。以800xg将平板离心10分钟并且在37℃下孵育1小时。使用PBS洗涤5次后，向每个孔中加入包含庆大霉素(500μg ml-1)和青霉素G(5μg ml-1)的DME(1ml)并且连续孵育2小时。用PBS洗涤3次后，使用胰蛋白酶-EDTA分离细胞并且用0.025％TritonX-100溶解细胞，且通过铺板测定胞内细菌。为了分析抗血清对侵入的抑制，将洗涤的细菌(500μl)与抗血清(50μl)混合并且在室温下孵育30分钟。将该混合物加入到ME180单层中。测定与抗血清一起孵育前和之后的CFU数量。然后如上所述进行分析。预先免疫兔血清用作对照组。在没有抗血清存在下侵入ME180的细菌部分占接种物的0.13-0.37％。

在灵长类模型中的研究表明GBS在感染过程中侵入了上皮细胞。因为α促进了体外GBS的侵入，所以我们使用GBS突变体比较了Rib和α在侵入方面的作用(图5A)。人ME180细胞的侵入就Rib突变体而言比亲代菌株降低了20-倍，而就α突变体而言比亲代菌株降低了4-倍。因此，Rib和α共有促进侵入的能力。这种潜在的重要功能被抗-(RibN-αN)有效阻断(图5B)。在侵入针对减少并非因抗体介导的细菌聚集所致，它在所用条件下并不出现(数据未显示)。这一结果提示抗-(RibN-αN)阻断了生物学的重要功能。

统计学分析.使用Fisher′s 2-尾确切检验分析来自小鼠保护试验的数据。对来自上皮细胞侵入试验的数据的分析基于对两种独立二项式分布变量的最大似然估计值的标准正态近似。将差异在统计学上视为具有显著性，其中p＜0.05。

总之，我们的工作表明Rib和α的N-末端区可以用于衍生优于来源于所述重复单位的融合蛋白疫苗。此外，就人GBS疫苗而言，我们的数据显示RibN-αN融合蛋白可以引起针对许多临床重要菌株，包括大部分导致脑脊膜炎的菌株的保护性免疫。

尽管通过实施例描述了本发明的优选实施方案，但是显然本领域技术人员可以对本发明进行变型和改变。不过，显然可以理解这类变型和改变属于如权利要求中所述的本发明范围。

序列表

<110>Gunnar Lindahl

Lindahl，Gunnar

<120>融合蛋白疫苗

<130>202292

<160>6

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>537

<212>DNA

<213>链球菌

<400>1

gggcccctgg gatccgctga agtaatttca ggaagtgctg ttacgttaaa cacaaatatg 60

actaaaaatg ttcagaatgg tagagcatat atagatttat atgatgtgaa aaatgggaaa 120

atagatccat tacaattaat tacgttaaat tcacctgatt taaaagctca gtatgtcatt 180

aggcaaggcg gcaattattt cacacaacct tctgaattga ctactgttgg tgcagctagt 240

attaattata cagtattgaa gacagatgga agtcctcata cgaagcctga tggacaagtg 300

gatattataa acgtttcatt gactatttac aattcttcag ctttgagaga taaaatagat 360

gaagttaaaa agaaagcgga agaccctaaa tgggacgagg gaagtcgcga taaagttttg 420

ataagtttag atgatatcaa aacagatatt gataataatc ctaagacgca atcagacatt 480

gccaataaaa taactgaagt tactaattta gaaaaaatac tagtacctcg aatccca 537

<210>2

<211>179

<212>PRT

<213>链球菌

<400>2

Gly Pro Leu Gly Ser Ala Glu Val Ile Ser Gly Ser Ala Val Thr Leu

1 5 10 15

Asn Thr Asn Met Thr Lys Asn Val Gln Asn Gly Arg Ala Tyr Ile Asp

20 25 30

Leu Tyr Asp Val Lys Asn Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Thr

35 40 45

Leu Asn Ser Pro Asp Leu Lys Ala Gln Tyr Val Ile Arg Gln Gly Gly

50 55 60

Asn Tyr Phe Thr Gln Pro Ser Glu Leu Thr Thr Val Gly Ala Ala Ser

65 70 75 80

Ile Asn Tyr Thr Val Leu Lys Thr Asp Gly Ser Pro His Thr Lys Pro

85 90 95

Asp Gly Gln Val Asp Ile Ile Asn Val Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Ser

100 105 110

Ser Ala Leu Arg Asp Lys Ile Asp Glu Val Lys Lys Lys Ala Glu Asp

115 120 125

Pro Lys Trp Asp Glu Gly Ser Arg Asp Lys Val Leu Ile Ser Leu Asp

130 135 140

Asp Ile Lys Thr Asp Ile Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ser Asp Ile

145 150 155 160

Ala Asn Lys Ile Thr Glu Val Thr Asn Leu Glu Lys Ile Leu Val Pro

165 170 175

Arg Ile Pro

<210>3

<211>525

<212>DNA

<213>链球菌

<400>3

gggcccctgg gatcctctac aattccaggg agtgcagcga ccttaaatac aagcatcact 60

aaaaatatac aaaacggaaa tgcttacata gatttatatg atgtaaaatt aggtaaaata 120

gatccattac aattaattgt tttagaacaa ggttttacag caaagtatgt ttttagacaa 180

ggtactaaat actatgggga tgtttctcag ttgcagagta caggaagggc tagtcttacc 240

tataatatat ttggtgaaga tggactacca catgtaaaga ctgatggaca aattgatata 300

gttagtgttg ctttaactat ttatgattca acaaccttga gggataagat tgaagaagtt 360

agaacgaatg caaacgatcc taagtggacg gaagaaagtc gtactgaggt tttaacagga 420

ttagatacaa ttaagacaga tattgataat aatcctaaga cgcaaacaga tattgatagt 480

aaaattgttg aggttaatga attagagaaa ttgttagtat tgtca 525

<210>4

<211>175

<212>PRT

<213>链球菌

<400>4

Gly Pro Leu Gly Ser Ser Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn

1 5 10 15

Thr Ser Ile Thr Lys Asn Ile Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Leu

20 25 30

Tyr Asp Val Lys Leu Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Val Leu

35 40 45

Glu Gln Gly Phe Thr Ala Lys Tyr Val Phe Arg Gln Gly Thr Lys Tyr

50 55 60

Tyr Gly Asp Val Ser Gln Leu Gln Ser Thr Gly Arg Ala Ser Leu Thr

65 70 75 80

Tyr Asn Ile Phe Gly Glu Asp Gly Leu Pro His Val Lys Thr Asp Gly

85 90 95

Gln Ile Asp Ile Val Ser Val Ala Leu Thr Ile Tyr Asp Ser Thr Thr

100 105 110

Leu Arg Asp Lys Ile Glu Glu Val Arg Thr Asn Ala Asn Asp Pro Lys

115 120 125

Trp Thr Glu Glu Ser Arg Thr Glu Val Leu Thr Gly Leu Asp Thr Ile

130 135 140

Lys Thr Asp Ile Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Thr Asp Ile Asp Ser

145 150 155 160

Lys Ile Val Glu Val Asn Glu Leu Glu Lys Leu Leu Val Leu Ser

165 170 175

<210>5

<211>1053

<212>DNA

<213>链球菌

<400>5

gggcccctgg gatccgctga agtaatttca ggaagtgctg ttacgttaaa cacaaatatg 60

actaaaaatg ttcagaatgg tagagcatat atagatttat atgatgtgaa aaatgggaaa 120

atagatccat tacaattaat tacgttaaat tcacctgatt taaaagctca gtatgtcatt 180

aggcaaggcg gcaattattt cacacaacct tctgaattga ctactgttgg tgcagctagt 240

attaattata cagtattgaa gacagatgga agtcctcata cgaagcctga tggacaagtg 300

gatattataa acgtttcatt gactatttac aattcttcag ctttgagaga taaaatagat 360

gaagttaaaa agaaagcgga agaccctaaa tgggacgagg gaagtcgcga taaagttttg 420

ataagtttag atgatatcaa aacagatatt gataataatc ctaagacgca atcagacatt 480

gccaataaaa taactgaagt tactaattta gaaaaaatac tagtacctcg aatcccagaa 540

ttctctacaa ttccagggag tgcagcgacc ttaaatacaa gcatcactaa aaatatacaa 600

aacggaaatg cttacataga tttatatgat gtaaaattag gtaaaataga tccattacaa 660

ttaattgttt tagaacaagg ttttacagca aagtatgttt ttagacaagg tactaaatac 720

tatggggatg tttctcagtt gcagagtaca ggaagggcta gtcttaccta taatatattt 780

ggtgaagatg gactaccaca tgtaaagact gatggacaaa ttgatatagt tagtgttgct 840

ttaactattt atgattcaac aaccttgagg gataagattg aagaagttag aacgaatgca 900

aacgatccta agtggacgga agaaagtcgt actgaggttt taacaggatt agatacaatt 960

aagacagata ttgataataa tcctaagacg caaacagata ttgatagtaa aattgttgag 1020

gttaatgaat tagagaaatt gttagtattg tca 1053

<210>6

<211>378

<212>PRT

<213>链球菌

<400>6

Gly Pro Leu Gly Ser Ala Ser Val Leu Ile Gly Ile Ser Phe Leu Gly

1 5 10 15

Gly Phe Thr Gln Gly Gln Phe Asn Ile Ser Thr Asp Thr Val Phe Ala

20 25 30

Ala Glu Val Ile Ser Gly Ser Ala Val Thr Leu Asn Thr Asn Met Thr

35 40 45

Lys Asn Val Gln Asn Gly Arg Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val Lys

50 55 60

Asn Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Thr Leu Asn Ser Pro Asp

65 70 75 80

Leu Lys Ala Gln Tyr Val Ile Arg Gln Gly Gly Asn Tyr Phe Thr Gln

85 90 95

Pro Ser Glu Leu Thr Thr Val Gly Ala Ala Ser Ile Asn Tyr Thr Val

100 105 110

Leu Lys Thr Asp Gly Ser Pro His Thr Lys Pro Asp Gly Gln Val Asp

115 120 125

Ile Ile Asn Val Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Ser Ser Ala Leu Arg Asp

130 135 140

Lys Ile Asp Glu Val Lys Lys Lys Ala Glu Asp Pro Lys Trp Asp Glu

145 150 155 160

Gly Ser Arg Asp Lys Val Leu Ile Ser Leu Asp Asp Ile Lys Thr Asp

165 170 175

Ile Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ser Asp Ile Ala Asn Lys Ile Thr

180 185 190

Glu Val Thr Asn Leu Glu Lys Ile Leu Val Pro Arg Ile Pro Glu Phe

195 200 205

Ser Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Thr Ser Ile Thr Lys

210 215 220

Asn Ile Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val Lys Leu

225 230 235 240

Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Val Leu Glu Gln Gly Phe Thr

245 250 255

Ala Lys Tyr Val Phe Arg Gln Gly Thr Lys Tyr Tyr Gly Asp Val Ser

260 265 270

Gln Leu Gln Ser Thr Gly Arg Ala Ser Leu Thr Tyr Asn Ile Phe Gly

275 280 285

Glu Asp Gly Leu Pro His Val Lys Thr Asp Gly Gln Ile Asp Ile Val

290 295 300

Ser Val Ala Leu Thr Ile Tyr Asp Ser Thr Thr Leu Arg Asp Lys Ile

305 310 315 320

Glu Glu Val Arg Thr Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Thr Glu Glu Ser

325 330 335

Arg Thr Glu Val Leu Thr Gly Leu Asp ThrIle Lys Thr Asp Ile Asp

340 345 350

Asn Asn Pro Lys Thr Gln Thr Asp Ile Asp Ser Lys Ile Val Glu Val

355 360 365

Asn Glu Leu Glu Lys Leu Leu Val Leu Ser

370 375

Claims

1.融合蛋白，包含B组链球菌表面蛋白或其类似物，同源物，衍生物或免疫相关的氨基酸序列或片段中的至少一种第一N-末端区片段，其与B组链球菌表面蛋白或其类似物，同源物，衍生物或免疫相关的氨基酸序列或片段中的至少一种第二N-末端区片段融合，其中所述B组链球菌表面蛋白中的第一和第二的至少一种N-末端区片段来源于不同B组链球菌菌株，并且其中所述融合蛋白能够引起针对B组链球菌的保护性免疫。

2.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述至少一种第一N-末端区片段为Rib蛋白，其与为α蛋白的至少一种第二N-末端区片段融合，其中所述融合蛋白能够引起针对B组链球菌的保护性免疫。

3.权利要求1-2中任意一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含：

a.至少一种第一氨基酸序列SEQ ID NO：2或其类似物，同源物，衍生物或免疫相关的氨基酸序列或片段，其与

b.至少一种第二氨基酸序列SEQ ID NO：4或其类似物，同源物，衍生物或免疫相关的氨基酸序列或片段融合。

4.权利要求3所述的融合蛋白，其中所述至少一种第一氨基酸序列包含与如SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列具有至少80，85，90，95，96，97，98或99％序列同一性的氨基酸序列。

5.权利要求3所述的融合蛋白，其中所述至少一种第二氨基酸序列包含与如SEQ I D NO：4中所示的氨基酸序列具有至少80，85，90，95，96，97，98或99％序列同一性的氨基酸序列。

6.权利要求1-5中任意一项所述的融合蛋白，其中该融合蛋白包含如SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列。

7.权利要求1-5中任意一项所述的融合蛋白，其中该融合蛋白包含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的三种或三种以上氨基酸序列或其部分的混合物。

8.上述权利要求中任意一项所述的融合蛋白，其中该融合蛋白进一步包含B组链球菌R28蛋白的N-末端区片段和/或B组链球菌ε蛋白的N-末端区片段。

9.分离的核苷酸序列，包含编码权利要求1-8中任意一项的融合蛋白的核苷酸序列。

10.核苷酸序列，包含：

a.如SEQ ID NO：1中所示的至少一种第一核苷酸序列或其片段，其与

b.如SEQ ID NO：3中所示的至少一种第二核苷酸序列或其片段，或

c.如SEQ ID NO：5中所示的至少一种核苷酸序列融合。

11.包含权利要求9-10中任意一项的核苷酸序列的载体。

12.包含权利要求11的载体的宿主细胞。

13.权利要求12所述的宿主，其中所述宿主为革兰氏阴性菌细胞、革兰氏阳性菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞、非洲绿猴细胞、人细胞或植物细胞。

14.权利要求13所述的宿主，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)，链霉菌属(Streptomyces)，曲霉属(aspergillus)，乳杆菌属(lactobacillus)，志贺氏菌属(shigella)，沙门氏菌属(salmonella)，利斯特氏菌属(listeria)，链球菌属(streptococcu s)，葡萄球菌属(staphylococcus)和真菌。

15.生产所述融合蛋白的方法，包括下列步骤：

a.提供权利要求12-14中任意一项的宿主细胞，

b.使所述宿主细胞繁殖，

c.纯化所述融合蛋白，和

d.获得所述融合蛋白。

16.生产权利要求1-8中任意一项所述融合蛋白的方法，其中所述方法包括不含细胞的表达***。

17.疫苗，包含药学有效量的权利要求1-8中任意一项的融合蛋白或权利要求9-10的核苷酸序列或权利要求11的载体或权利要求12-14的宿主，并且包含药学上可接受的媒介物，其中所述疫苗组合物能够引起针对B组链球菌的保护性免疫。

18.权利要求17所述的疫苗，其进一步包含佐剂。

19.权利要求17-18中任意一项的疫苗，其中所述融合蛋白与多糖缀合形成缀合疫苗。

20.权利要求17-19中任意一项的疫苗，其中所述融合蛋白与细菌多糖缀合。

21.权利要求20所述的疫苗，其中所述细菌多糖为B组链球菌多糖。

22.权利要求1-8中任意一项的融合蛋白或权利要求9-10的核苷酸序列或权利要求11的载体或权利要求12-14的宿主在制备用于预防或治疗B组链球菌导致的感染的疫苗中的应用。

23.预防或治疗B组链球菌导致的感染的方法，该方法包括对个体给予有效量的权利要求17-21中任意一项的疫苗。

24.权利要求23所述的方法，该方法包括对女性给予有效量的权利要求17-21中任意一项的疫苗，它能够赋予所述女性未出生的后代对所述感染的免疫性。

25.权利要求23-24中任意一项所述的方法，其中所述疫苗通过非肠道、肌内、静脉内、腹膜内、真皮内、粘膜、粘膜下、局部或皮下给予。

26.预防或治疗B组链球菌导致的感染的方法，该方法包括对个体给予有效量的因使第二个个体接触权利要求17-21中任意一项的疫苗而产生的抗体。