CN103384828A - 使用基于抗体的阵列进行恶性癌症疗法的药物选择 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于选择合适抗癌药物疗法的方法、以及用于鉴定和预测应答的方法、用于治疗涉及异常c-Met信号传导的恶性癌症的方法。本发明也提供了用于监测涉及异常cMet信号传导的恶性癌症的状态以及监测患有所述恶性癌症的患者如何应答于抗癌药物疗法的方法。

Description

使用基于抗体的阵列进行恶性癌症疗法的药物选择
相关申请的交互引用
本申请要求2011年2月2日提交的美国临时申请号61/438,904和2010年12月23日提交的美国临时申请号61/426,948的优先权，其公开内容出于全部目的通过引用的方式完整并入本文作为参考。
背景技术
多种人类恶性肿瘤由持久的cMet刺激、过量表达或突变引起，包括乳腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、肾癌和甲状腺癌。cMet的活化可以诱导细胞生长、侵入、血管生成和转移的增加。例如，已经在具有***状肾癌特定遗传性形式的患者中鉴定到cMet基因(MET)中的激活性突变，这直接暗示cMet参与人类肿瘤形成。因cMet受体借助基因组变更或蛋白质表达增加而活化所致的cMET信号传导失调已经与一系列原发肿瘤相关。例如，来自原发肿瘤患者的41-72%的肺肿瘤显示增加的cMet表达，并且8-13%的肿瘤携带MET突变。
cMet是一种在许多癌症、尤其非小细胞肺癌中突变并过量表达的酪氨酸激酶受体。一旦与其配体HGF结合，则cMet二聚化和使其激酶结构域中的酪氨酸残基自身磷酸化。这引起衔接子蛋白的招募并通过众多下游级联如MAPK和AKT途径引起信号转导。
异常cMet信号传导涉及癌症进展以及患者对抗癌药物的应答。导致蛋白表达增加的cMET基因扩增以及HGF刺激均可以通过激活PI3K-AKT途径在肺癌细胞中引起耐药(见，例如，McDermott等人,71:1625-1634(2010)；Engelman等人,Science,316:1039-1043,(2007)；和Yano等人,Cancer Res.,68:9479-9487(2008))。Engelman等人也显示，在酪氨酸激酶抑制剂(吉非替尼)存在下，PI3K-AKT途径借助HER3的磷酸化由cMet激活。Zucali等人(Ann.Oncol.,19:1605-12(2008))描述了激活的cMet的升高表达与非小细胞肺癌(NSCLC)患者中较短的直至进展的时间(TTP)显著相关。
cMet信号传导在肿瘤生长和进展中的意义已经导致开发旨在阻断cMet信号传导的多种抗癌药物。Holmes等人(J.Mol.Biol.,367:395-408,(2007))描述了HGF的N末端可以结合但是不激活cMet信号传导，表明这可能是拮抗cMet途径的有效方法。处于开发的当前c-Met药物的例子包括中和抗体如MAG102(Amgen)和MetMab(Roche)以及酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，如ARQ197、XL184、PF-02341066、GSK1363089/XL880、INC280、MP470、MGCD265、SGX523、PF04217903和JNJ38877605。这些药剂中有几种的初步临床结果是令人鼓舞的。
针对表皮生长因子受体(EGFR)的酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼和厄洛替尼已经用来治疗癌症，包括NSCLC。这些药物已经显示在10-20%的NSCLC患者中激发部分应答(Fukuoko等人,J.Clin.Oncol,21:2237-2246(2003)和Kris等人,JAMA,290:2149-2158(2003))。在携带EGFR突变和处于EGFR-TKI疗法的那些NSCLC患者当中，70-75%显示阳性应答率(见，例如Yano等人,Cancer Res.,68:9479-9487(2008))。然而，25-30%患者天生耐受EGFR-TKI。另外，甚至作为最初治疗应答者的那些患者随时间推移获得耐药性。Cappuzzo等人(J.Clin.Oncol.,27:1667-1674(2009))描述了来自经历手术切除的NSCLC患者的肿瘤样品显示增加的MET拷贝数，如荧光原位杂交(FISH)所测定。来自经历手术切除的NSCLC患者的肿瘤样品的亚类(20%)显示出增加的EGFR和MET拷贝数，这提示EGFR-和cMet-TKI耐药性之间的相关性(Cappuzzo等人,J.Clin.Oncol.,27:1667-1674(2009))。令人震惊地，McDermott等人显示针对EGFR TKI的敏感性与获得的cMet TKI耐药性相关。
因此，本领域需要检测患者样品中异常cMet信号传导存在以便监测cMet抑制剂疗法并指导治疗决策的测定法。本发明满足这种需要并且还提供相关优点。
因此，本领域需要检测患者样品中异常cMet信号传导存在以便监测cMet抑制剂疗法并指导治疗决策的测定法。本发明满足这种需要并且还提供相关优点。
发明简述
本发明提供用于检测肿瘤细胞(例如，非小细胞肺癌细胞)中信号转导途径组分的状态(例如，表达水平和/或活化水平)的组合物和方法。源自实施本发明的关于信号转导途径组分(例如，HER3和/或c-Met信号转导途径组分)的表达和/或活化状态的信息可以用于恶性癌症诊断、预后并用于设计针对恶性肿瘤的癌症疗法，所述恶性肿瘤涉及异常c-Met信号传导。
在一个方面，本发明提供一种用于选择受试者的方法疗法，所述受试者具有涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤，所述方法包括：
(a)检测和/或定量cMet蛋白在取自所述受试者的样品中的表达水平和/或活化水平；
(b)检测和/或定量HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平；
(c)将cMet蛋白和/或HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平与(i)对照蛋白的表达水平和/或活化水平和/或(ii)cMet蛋白和/或HER3蛋白在对照样品中的表达水平和/或活化水平比较；和
(d)基于cMet蛋白和/或HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平相比于所述对照蛋白和/或对照样品之间的差异，确定是否仅施用cMet抑制剂或施用与途径定向疗法组合的cMet抑制剂。
在某些实施方案中，步骤(d)包括基于cMet蛋白和/或HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平相比于所述对照蛋白和/或对照样品之间的差异，确定仅施用cMet抑制剂或施用与途径定向疗法组合的cMet抑制剂。在某些情况下，对照蛋白表达或活化的水平对应于某个截断值或阈值。在其他情况下，cMet蛋白或HER3蛋白在对照样品中表达或活化的水平对应于某个截断值或阈值。
在一些实施方案中，本发明的方法可以用来帮助或辅助选择用于治疗涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤的合适抗癌药物(例如，cMet抑制剂)。在其他实施方案中，本发明的方法可以用于改善对用于治疗涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤的合适抗癌药物(例如，cMet抑制剂)的选择。在其他实施方案中，本发明的方法可以用来预测或鉴定涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤的应答(或应答的可能性)或患有这种恶性肿瘤的受试者对抗癌药物(例如，cMet抑制剂)治疗的应答(或应答的可能性)。
在另一个方面，本发明提供一种用于监测受试者中涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤的状态或监测具有这种恶性肿瘤的患者如何对疗法做出反应的方法，该方法包括：
(a)检测和/或定量cMet蛋白在取自所述受试者的样品中的表达水平和/或活化水平的系列变化；
(b)检测和/或定量HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平的系列变化；并且
(c)将cMet蛋白和/或HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平与(i)对照蛋白随时间推移的表达水平和/或活化水平和/或(ii)cMet蛋白和/或HER3蛋白在对照样品中随时间推移的表达水平和/或活化水平比较，
其中cMet蛋白和/或HER3蛋白随时间推移的增加表达水平和/或活化水平指示病情进展或对所述疗法消极应答，和
其中cMet蛋白和/或HER3蛋白随时间推移的减少表达水平和/或活化水平指示疾病缓解或对所述疗法积极应答。
在一些实施方案中，本发明的方法可以用来帮助或辅助监测受试者中涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤的状态或监测具有这种恶性肿瘤的患者如何应答于抗癌药物(例如，cMet抑制剂)疗法。在一些实施方案中，本发明的方法可以用于改善对受试者中涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤的状态的监测或对具有这种恶性肿瘤的患者如何应答于抗癌药物(例如，cMet抑制剂)疗法的监测。
以下专利文献的公开内容出于全部目的通过引用的方式完整并入本文作为参考：PCT公开号WO 2008/036802；PCT公开号WO 2009/012140；PCT公开号WO 2009/108637；PCT公开号WO 2010/132723；PCT公开号WO 2011/008990；和PCT公开号WO 2011/050069。
本领域技术人员将从以下详述和附图中显而易见本发明的其他目的、特征和优点。
附图简述
图1显示使用本文所述的协同酶增强反应性免疫测定法(CollaborativeEnzyme Enhanced Reactive ImmunoAssay)(CEER)时，HER1、HER2、HER3、cMet、IGF1R、cKit、PI3K和Shc在来自高加索人患者的NSCLC肿瘤组织样品中的表达谱。使用IgG和细胞角蛋白(CK)作为对照。
图2显示如通过CEER所测定的HER1和HER2总蛋白在来自亚洲人患者和高加索人患者的NSCLC肿瘤组织样品中的表达水平。
图3显示如通过CEER所测定的HER3和cMET总蛋白在来自亚洲人患者和高加索人患者的NSCLC肿瘤组织样品中的表达水平。
图4A显示HER1、HER2、HER3、cMET和CK在来自亚洲人患者的NSCLC肿瘤组织样品中的表达水平的汇总表。图4B显示HER1、HER2、HER3、cMET和CK在来自高加索人患者的NSCLC肿瘤组织样品中的表达水平的汇总表。
图5显示来自亚洲人和高加索人患者的NSCLC肿瘤组织样品的差异性HER3和cMET表达谱的比较。
图6显示本发明的另一个实施方案，其特别用于确定生物样品中的活化(例如，磷酸化)分析物水平和总分析物水平。作为非限制性例子，可以使用CEER阵列检测总HER3、cMET和PI3K以及磷酸化HER3、cMET和PI3K的表达谱。
图7显示使用CEER时，HER1、HER2、HER3、c-Met、IGF1R、cKit、PI3K和Shc在来自亚洲人患者的NSCLC肿瘤组织样品中的表达谱。使用IgG和细胞角蛋白(CK)作为对照。
图8显示使用CEER时，VEGFR2在来自亚洲人患者的NSCLC肿瘤组织样品中的表达谱。使用IgG作为对照。
图9显示如通过CEER所测定，活化的cMET、HER2、HER3和PI3K在用各种剂量的cMET抑制剂处理的N87细胞中的表达。
图10显示使用CEER时，HER1、HER2、HER3、c-Met、IGF1R、cKit、PI3K和Shc蛋白在用不同量的HGF处理的HCC827细胞中的表达谱。使用IgG和CK作为对照。在一个非限制性例子中，一系列的HGF用来处理所述细胞。
本发明的具体描述
I．介绍
cMet是一种由二硫键连接的50kDa细胞外α链和140-kDa跨膜β链组成的酪氨酸激酶受体。一旦与其配体肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)结合，则cMet二聚化和使其激酶结构域中的酪氨酸残基自身磷酸化。这引起衔接子蛋白的招募并通过众多下游信号传导级联如MAPK和AKT途径引起信号转导。HGF/SF和cMet一起构成一种充分表征的配体/受体复合物，其参与多条细胞信号传导途径和众多细胞功能，包括增殖、细胞存活、运动和形态发生。
cMet信号传导失调已经涉及许多不同类型的癌，包括结肠癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、肺癌、头颈癌、甲状腺癌和胰腺癌(见例如Peruzzi,B和Bottaro,DP,Clin.Cancer Res.,12:3657-3660(2006)。在肿瘤细胞中、cMet信号传导的激活触发一系列多样化信号传导级联(例如，MAPK、PI3K、VEGFR、EGFR、HER2和HER3途径)，导致细胞生长、增殖、侵入、移行、保护免于凋亡、和转移(见，例如，Eder等人,Clin.Cancer Res.,15:2207-2214(2009))。例如，cMet信号传导通过诱导内皮细胞增殖和移行以及诱导VEGF表达而诱导肿瘤血管生成(见，例如，Rosen等人,Adv.Cancer Res.,67:257-279(1995))。已经展示cMet与激酶如RON、EGFR、HER2、HER3、PI3K和SHC相互作用并使其磷酸化。cMet可以也与其他激酶(例如，p95HER2、IGF-1R、c-KIT和其他)相互作用。因cMet受体失调或其配体(肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF))过量表达所致的cMet信号传导途径的异常信号传导已经与浸润性***状肾癌相关。
异常cMet信号传导可以归因于基因组变更如基因扩增或突变，以及cMet蛋白和HGF/SF过量表达。已经在受体的酪氨酸激酶结构域、近膜结构域和脑信号蛋白(semaphorin)结构域内部鉴定出cMet基因中的基因扩增和/或激活性突变。分析原发性肿瘤患者揭示，41-72%的原发性肺肿瘤患者具有过量表达cMet蛋白的肿瘤细胞，而8-13%的患者具有携带cMet突变的肺肿瘤细胞(见，实施例4中的表3)。已经显示，突变和过量表达的cMet一般与不良癌症预后相关。更重要地，在过去数年内，异常cMet信号传导已经与抗癌疗法(例如，EGFR抑制剂、尤其EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKI)的耐药性相关。
众多治疗策略已经用来抑制cMet，如单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂。处于开发中的cMet抑制剂的例子包括中和抗体如MAG102(Amgen)和MetMab(Roche)和酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，如ARQ197、XL184、PF-02341066、GSK1363089/XL880、MP470、MGCD265、SGX523、PF04217903和JNJ38877605。已经证实cMET和HGF/SF是MET抑制剂阳性反应的标志物(见，ARQ127 Study in MetMab，欧洲医学肿瘤学大会，2010年10月17日)。然而有趣地，存在恶性肿瘤(例如，胃癌)和cMet基因扩增的患者对酪氨酸激酶抑制剂无反应。Engelman等人(Science,316:1039-1043,(2007))显示针对EGFR TKI吉非替尼的耐药性与激活HER3和PI3K-AKT信号传导途径的活化cMet相关。针对MET和/或EGFR抑制剂的耐药性可以归因于多条信号传导途径之间的功能性冗余。因此，在许多情况下，需要采用多靶向疗法以克服针对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性并且有效治疗涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤。
已经显示用cMet抑制剂处理过量表达HER2的胃癌细胞(例如，N87细胞)造成活化的cMet、EGFR、HER2和HER3蛋白的增加水平。用cMet抑制剂处理NSCLC细胞(例如，HCC827细胞)通过激活HER2-HER3和PI3K-AKT信号传导途径诱导cMet和PI3K的活化(见实施例10)。
一项在患有NSCLC的高加索人患者中的II期临床研显示对cMet抑制剂的阳性反应(见，ARQ127Study in MetMab，欧洲医学肿瘤学大会，2010年10月17日)可以导致无疾病进展的存活的增加和存活的增加。在本发明的一个示例性展示中，大部分患有NSCLC的高加索人患者显示HER1和HER2的低表达，并且多于50%的所述患者也具有cMet和HER3的高表达(见实施例8)。进一步的分析揭示，对cMet抑制剂疗法阳性反应的高加索人患者也表达活化形式的cMet和HER3(分别是磷酸cMet和磷酸HER3)，表明cMet和HER3信号传导途径可以在来自这些患者的肿瘤细胞中共激活。共激活的可能机制包括cMet与截短的HER3蛋白相互作用或HER3与截短的cMet蛋白相互作用。因此，cMet和HER3是患有NSCLC的高加索人患者中对cMET抑制剂疗法阳性反应的标志物。在本发明的另一个展示中，显示患有存在KRAS突变的NSCLC的高加索人患者显示高水平的cMet和HER3表达(见实施例8)。此外，使用本发明预测到，仅用cMet抑制剂如单药疗法治疗这些高加索人患者将因同时抑制cMet途径和HER3-PI3K途径而产生阳性反应。
在本发明的另一个示例性展示中，从患有NSCLC的亚洲人患者获得的样品显示高水平的HER1，同时伴随活化(即，磷酸化)HER1的表达(见实施例9)。不同于高加索人患者，这些亚洲人患者不表达高水平的cMet和HER3(见实施例9)。基于本发明的预测方法，预期cMet抑制剂在患有NSCLC的亚洲人患者中不是有效的。患有NSCLC的亚洲人患者的表达/活化图谱与支持EGFR抑制剂在亚洲人患者中高度有效的观点的数据相关。
本发明提供了基于检测、定量和比较特定信号转导途径及其组分的活性，为患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤的患者选择疗法的疗法，其中所述特定信号转导途径及其组分充当特定患者群体中给定类型癌症的表达/活化谱或标签。因此，在治疗之前、期间和之后知晓癌细胞内部特定信号转导***的活性水平，为医师提供可以用来选择待采用的适宜治疗过程的高度相关信息。另外，随着治疗进展持续监测在癌细胞中活跃的信号转导途径可以为提供医师关于治疗功效的额外信息，敦促医师继续特定的治疗过程或当例如癌细胞已经因激活相同或另一条信号转导途径的畸变而变得耐受治疗时敦促其转向另一线治疗。
因而，本发明提供了通过在特异性、多通道、高通量测定法(如协同酶增强反应性免疫测定法(CEER))检测、定量和比较多种失调信号转导分子在实体瘤的肿瘤组织中的表达和活化状态，选择疗法的方法。本发明也提供用于选择适宜疗法(单一药物或药物组合)以下调或关闭失调的信号传导途径的方法。因此，本发明可以用来促进癌症患者个性化疗法的设计。
本发明的一个重要优点是以下能力：检测和定量多条信号转导途径在以失调的cMet信号传导为特征的肿瘤细胞中的活性并且随后基于靶蛋白与对照蛋白和样品相比的表达和/或活化水平差异确定是否仅施用(例如，单药疗法)或施用与途径定向疗法组合(例如，联合疗法)的cMet抑制剂。选择有效治疗策略用于癌症患者的现有问题归因于针对抗癌药物治疗(例如，酪氨酸激酶抑制剂)的内在和获得性耐药性的高发生率。例如，一个非小细胞肺癌患者亚类内在地抵抗EGFR TKI。并且甚至最初对疗法有反应的那些患者随时间推移倾向于变得耐药。本发明通过以下方式克服或缓和这个问题和其他问题：提供基于如特异性、多通道、高通量测定法(如协同酶增强反应性免疫测定法(CEER))所确定的多种失调信号转导分子在实体瘤的肿瘤组织中的预示性表达/活化谱，选择适宜疗法(单一药物或药物组合)的方法。就这一点而论，检测肿瘤中稀有细胞内多个信号传导者的活化状态促进了癌症预后和诊断以及个性化靶向疗法的设计。
有益地调整本发明的方法以便解决癌症防治中的关键问题并且为恶性癌症患者提供更高护理标准，因为它们(1)提供了检测和定量与癌症相关的多条信号传导途径的组分的蛋白表达和/或活化蛋白水平的方法，(2)提供将所述蛋白表达和/或活化蛋白水平与对照蛋白或对照样品比较的方法，(3)能够进行途径概况描述(例如，可以在来自患者的肿瘤样品中检测特定信号转导分子的表达和/或活化状态)，和(4)可以用作患者对抗癌疗法反应的预示指示物。就这一点而论，本发明的方法使恶性肿瘤组织的系列采样成为可能，产生关于肿瘤细胞中随时间和疗法变化而出现的变化的有价值信息并且为临床医生提供监测快速演化的癌途径标签的手段。
总之，通过使用例如多通道、基于抗体测定法(如CEER)进行途径概况描述并且将途径谱与预示患者对特定抗癌疗法反应的预后性分子谱比较，本发明的方法有利地提供对存在异常cMet信号传导的癌症患者的精确预测、选择和监测，其中所述癌症患者最可能从靶向疗法得益。
II．定义
如本文所用，除非另外指明，否则以下术语具有归属于它们的含义。
术语“癌症”意在包括一类以异常细胞失控生长为特征的疾病的任何成员。该术语包括全部已知的癌症和肿瘤性疾病，无论是否表征为恶性、良性、软组织性或实体性，和全部阶段及等级的癌，包括转移前或转移后癌症。不同类型癌症的例子包括但不限于消化道癌和胃肠道癌、如胃部癌(例如，胃癌)、结直肠癌、胃肠道间质肿瘤(GIST)、胃肠道类癌瘤、结肠癌、直肠癌、***癌、胆管癌、小肠癌和食管癌；乳腺癌；肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；盲肠癌；***癌、卵巢癌；肾癌(例如，肾细胞癌)；中枢神经***癌；皮肤癌；淋巴瘤；胶质瘤；绒毛膜癌；头颈癌；成骨肉瘤；和血癌。如本文所用，“肿瘤”包含一个或多个癌细胞。
术语“非小细胞肺癌”或“NSCLC”包括其中恶性癌细胞在肺组织中形成的疾病。非小细胞肺癌的例子包括但不限于鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌。
术语“分析物”包括确定其存在、量(表达水平)、活化状态和/或身份的任何目的分子，一般是大分子如多肽。在某些情况下，分析物是信号转导分子例如HER3(ErbB3)或cMet信号传导途径的组分。
术语“信号转导分子”或“信号传导者”包括实施以下过程的蛋白和其他分子，其中通过所述过程，细胞将胞外信号或刺激转换成反应，这一般涉及细胞内部高度有序的一系列生物化学反应。转导分子的例子信号分别包括但不限于受体酪氨酸激酶如EGFR(例如，EGFR/HER1/ErbB1、HER2/Neu/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4)、VEGFR1/FLT1、VEGFR2/FLK1/KDR、VEGFR3/FLT4、FLT3/FLK2、PDGFR(例如，PDGFRA、PDGFRB)、c-KIT/SCFR、INSR(胰岛素受体)、IGF-IR、IGF-IIR、IRR(胰岛素受体相关受体)、CSF-1R、FGFR1-4、HGFR1-2、CCK4、TRKA-C、c-MET、RON、EPHA1-8、EPHB1-6、AXL、MER、TYRO3、TIE1-2、TEK、RYK、DDR1-2、RET、c-ROS、V-钙黏着蛋白、LTK(白细胞酪氨酸激酶)、ALK(间变性淋巴瘤激酶)、ROR1-2、MUSK、AATYK1-3和RTK106；截短形式的受体酪氨酸激酶如丢失氨基端胞外结构域的截短HER2受体(例如，p95ErbB2(p95m)、p110、p95c、p95n等)、丢失氨基端胞外结构域的截短cMET受体和丢失氨基端胞外结构域的截短HER3受体；受体酪氨酸激酶二聚体(例如，p95HER2/HER3；p95HER2/HER2；与HER1、HER2、HER3或HER4在一起的截短HER3受体；HER2/HER2；HER3/HER3；HER2/HER3；HER1/HER2；HER1/HER3；HER2/HER4；HER3/HER4等)；非受体酪氨酸激酶如BCR-ABL、Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes/Fps、Fak、Jak、Ack和LIMK；酪氨酸激酶信号传导级联组分如AKT(例如，AKT1、AKT2、AKT3)、MEK(MAP2K1)、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、PI3K(例如，PIK3CA(p110)、PIK3R1(p85))、PDK1、PDK2、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、SGK3、4E-BP1、P70S6K(例如，p70S6激酶剪接变体αI)、蛋白酪氨酸磷酸酶(例如，PTP1B、PTPN13、BDP1等)、RAF、PLA2、MEKK、JNKK、JNK、p38、Shc(p66)、Ras(例如，K-Ras、N-Ras、H-Ras)、Rho、Rac1、Cdc42、PLC、PKC、p53、细胞周期蛋白D1、STAT1、STAT3、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)、磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)、mTOR、BAD、p21、p27、ROCK、IP3、TSP-1、NOS、GSK-3β、RSK1-3、JNK、c-Jun、Rb、CREB、Ki67和桩蛋白；核激素受体如***受体(ER)、孕酮受体(PR)、雄激素受体、糖皮质激素受体、盐皮质激素受体、维生素A受体、维生素D受体、类视黄醇受体、甲状腺激素受体和孤儿受体；核受体共激活因子和阻遏蛋白如乳腺癌扩增-1(amplified in breast cancer-1)(AIB1)和核受体共阻遏蛋白1(NCOR)；及其组合。
术语“HER3信号传导途径的组分”包括HER3的上游配体、HER3的结合配偶物和/或借助HER3受调节的下游效应分子中的任一种或多种。HER3信号传导途径组分的例子包括但不限于调蛋白(heregulin)、HER1/ErbB1、HER2/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4、AKT(例如，AKT1、AKT2、AKT3)、MEK(MAP2K1)、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、PI3K(例如，PIK3CA(p110)、PIK3R1(p85))、PDK1、PDK2、PTEN、SGK3、4E-BP1、P70S6K(例如，剪接变体αI)、蛋白酪氨酸磷酸酶(例如，PTP1B、PTPN13、BDP1等)、HER3二聚体(例如，p95HER2/HER3、HER2/HER3、HER3/HER3、HER3/HER4等)、GSK-3β、PIP2、PIP3、p27及其组合。
术语“c-Met信号传导途径的组分”包括c-Met的上游配体、c-Met的结合配偶物和/或借助c-Met受调节的下游效应分子中的任一种或多种。c-Met信号传导途径组分的例子包括但不限于肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)、丛蛋白B1、CD44v6、AKT(例如，AKT1、AKT2、AKT3)、MEK(MAP2K1)、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、STAT(例如，STAT1、STAT3)、PI3K(例如，PIK3CA(p110)、PIK3R1(p85))、GRB2、Shc(p66)、Ras(例如，K-Ras、N-Ras、H-Ras)、GAB1、SHP2、SRC、GRB2、CRKL、PLCγ、PKC(例如PKCα、PKCβ、PKCδ)、桩蛋白、FAK、内收蛋白、RB、RB1、PYK2及其组合。
术语“异常c-Met信号传导”指一种或多种c-Met信号传导途径组分归因于以下情况但不限于此而失调：c-Met受体因基因组变更而活化、蛋白表达水平变化、活化的蛋白水平变化和增加的配体刺激。c-Met信号传导途径组分的例子包括但不限于本文所述的那些。
术语“截短的c-Met蛋白”包括截短形式的c-Met受体，其包括但不限于，含有c-Met胞质结构域和近膜结构域的蛋白质(见，例如，Amicone等人,Gene,162:323-328(1995)和Amicone等人,Oncogene,21:1335-1345)；含有c-Met胞外结构域的蛋白质；包含c-Met的α链和85kD C端截短β链的蛋白质(见，例如，Prat等人,Mol.Cell.Biol.11:5954-5962(1991))；和包含c-Met的α链和75-kDa C端截短β链的蛋白质(见，例如，Prat等人,Mol.Cell.Biol.,11:5954-5962(1991))。在某些情况下，截短的受体一般地是全长受体的片段并且与全长受体共有胞内结构域(ICD)结合区。在某些实施方案中，全长受体包含胞外结构域(ECD)结合区、跨膜结构域和胞内结构域(ICD)结合区。不受任何具体理论约束，截短的受体可以因蛋白酶解加工全长受体的ECD或翻译从位于跨膜结构域之前、内部或之后的甲硫氨酸残基的备选起始而产生，例如，以产生具有缩短ECD的截短c-Met受体或包含膜结合或胞质ICD片段的截短c-Met受体。
术语“截短的HER3蛋白”包括截短形式的HER3受体，其包括但不限于含有HER3胞质结构域和近膜结构域的蛋白质；后接43个独特残基的140个氨基酸的HER3截短胞外片段(见，例如，Srinivasan等人,CellSignal,13:321-30(2001))；和45-kDa糖基化HER3蛋白(见，例如，Lin等人,Oncogene,.27:5195-5203(2008))。在某些情况下，截短的受体一般地是全长受体的片段并且与全长受体共有胞内结构域(ICD)结合区。在某些实施方案中，全长受体包含胞外结构域(ECD)结合区、跨膜结构域和胞内结构域(ICD)结合区。不受任何具体理论约束，截短的受体可以因蛋白酶解加工全长受体的ECD或翻译从位于跨膜结构域之前、内部或之后的甲硫氨酸残基的备选起始而产生，例如，以产生具有缩短ECD的截短HER3受体或包含膜结合或胞质ICD片段的截短HER3受体。
术语“活化状态”指特定信号转导分子如HER3或c-Met信号传导途径组分是否活化。类似地，术语“活化水平”指特定信号转导分子如HER3或c-Met信号传导途径组分活化为何种程度。活化状态一般对应于一种或多种信号转导分子的磷酸化、遍在蛋白化和/或复合状态。活化状态(在括号中列出)的非限制性例子包括：HER1/EGFR(EGFRvIII、磷酸化(p-)EGFR、EGFR:Shc、遍在蛋白(u-)EGFR、p-EGFRvIII)；ErbB2(p-ErbB2、p95HER2(截短的ErbB2)、p-p95HER2、ErbB2:Shc、ErbB2:PI3K、ErbB2:EGFR、ErbB2:ErbB3、ErbB2:ErbB4)；ErbB3(p-ErbB3、截短的ErbB3、ErbB3:PI3K、p-ErbB3:PI3K、ErbB3:Shc)；ErbB4(p-ErbB4、ErbB4:Shc)；c-MET(p-c-MET、截短的c-MET、c-Met:HGF复合物)；AKT1(p-AKT1)；AKT2(p-AKT2)；AKT3(p-AKT3)；PTEN(p-PTEN)；P70S6K(p-P70S6K)；MEK(p-MEK)；ERK1(p-ERK1)；ERK2(p-ERK2)；PDK1(p-PDK1)；PDK2(p-PDK2)；SGK3(p-SGK3)；4E-BP1(p-4E-BP1)；PIK3R1(p-PIK3R1)；c-KIT(p-c-KIT)；ER(p-ER)；IGF-1R(p-IGF-1R、IGF-1R:IRS、IRS:PI3K、p-IRS、IGF-1R:PI3K)；INSR(p-INSR)；FLT3(p-FLT3)；HGFR1(p-HGFR1)；HGFR2(p-HGFR2)；RET(p-RET)；PDGFRA(p-PDGFRA)；PDGFRB(p-PDGFRB)；VEGFR1(p-VEGFR1、VEGFR1:PLCγ、VEGFR1:Src)；VEGFR2(p-VEGFR2、VEGFR2:PLCγ、VEGFR2:Src、VEGFR2:硫酸肝素、VEGFR2:VE-钙黏着蛋白)；VEGFR3(p-VEGFR3)；FGFR1(p-FGFR1)；FGFR2(p-FGFR2)；FGFR3(p-FGFR3)；FGFR4(p-FGFR4)；TIEl(p-TIEl)；TIE2(p-TIE2)；EPHA(p-EPHA)；EPHB(p-EPHB)；GSK-3β(p-GSK-3β)；NFKB(p-NFKB)、IKB(p-IKB、p-P65:IKB)；BAD(p-BAD、BAD:14-3-3)；mTOR(p-mTOR)；Rsk-1(p-Rsk-1)；Jnk(p-Jnk)；P38(p-P38)；STAT1(p-STAT1)；STAT3(p-STAT3)；FAK(p-FAK)；RB(p-RB)；Ki67；p53(p-p53)；CREB(p-CREB)；c-Jun(p-c-Jun)；c-Src(p-c-Src)；桩蛋白(p-桩蛋白)；GRB2(p-GRB2)、Shc(p-Shc)、Ras(p-Ras)、GAB1(p-GAB1)、SHP2(p-SHP2)、GRB2(p-GRB2)、CRKL(p-CRKL)、PLCγ(p-PLCγ)、PKC(例如，p-PKCα、p-PKCβ、p-PKCδ)、内收蛋白(p-内收蛋白)、RB1(p-RB1)和PYK2(p-PYK2)。
术语“KRAS突变”包括KRAS(其也可以称作KRAS2或RASK2)基因中的任一种或多种突变。KRAS突变的例子包括但不限于G12C、G12D、G13D、G12R和G12V。
术语“EGFR突变”包括EGFR(其也可以称作ErbB1)基因中的任一种或多种突变。EGFR突变的例子包括但不限于外显子19中的缺失如L858R、G719S、G719S，G719C、L861Q和S768I，以及外显子20中的***，如T790M。
术语“途径定向疗法”包括使用可以改变蛋白质的表达水平和/或活化水平的治疗剂。
术语“cMet抑制剂”包括干扰cMet途径组分的功能的治疗剂。cMet抑制剂的例子包括但不限于中和抗体如MAG102(Amgen)和MetMab(Roche)以及酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)如ARQ197、XL184、PF-02341066，GSK1363089/XL880、MP470、MGCD265、SGX523、PF04217903和JNJ38877605。
术语“EGFR抑制剂”包括干扰EGFR途径组分的功能的治疗剂。非限制性例子包括西妥昔单抗(Cetaximab)、帕尼单抗(Panitumumab)、马妥珠单抗(Matuzumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、ErbB1疫苗、厄洛替尼、吉非替尼、EKB569和CL-387-785。
术语“VEGFR抑制剂”包括干扰VEGF受体途径组分的功能的治疗剂，包括但不限于VEGF1/FLT1、VEGFR2/FLK1/KDR、VEGFR3/FLT4、AKT(例如，AKT1、AKT2、AKT3)、MEK(MAP2K1)、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、STAT(例如，STAT1、STAT3)、PI3K(例如，PIK3CA(p110)、PIK3R1(p85))、GRB2、Shc(p66)、Ras(例如，K-Ras、N-Ras、H-Ras)、GAB1、SHP2、SRC、GRB2、CRKL、PLCγ、PKC(例如，PKCα、PKCβ、PKCδ)、桩蛋白、FAK、内收蛋白、RB、RB1、PYK2、eNOS、HSP27及其组合。VEGFR抑制剂的非限制性例子包括贝伐珠单抗(阿瓦斯汀)、HuMV833、VEGF-Trap、AZD2171、AMG-706、舒尼替尼(SU11248)、索拉替尼(BAY43-9006)、AE-941(Neovastat)和瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584)。
术语“系列变化”包括测定法检测在不同时间点取自受试者的样品中某蛋白质表达水平和/或活化水平的变化的能力。例如，可以在疗法过程期间(包括在疗法开始之前的时间)在患者中监测cMet蛋白的表达水平和/或活化水平。
术语“阴性反应”包括疾病状况在接受疗法的患者中加重，从而该患者体验到该疾病加重或额外的体征或症状。
术语“阳性反应”包括存在疾病状况的患者中的改善，从而该疗法减轻这种疾病的体征或症状。
术语“疾病缓解”包括癌症的分级，其中存在疾病体征和症状的消失。
术语“病情进展”包括继续生长或扩展的癌症分级，其可以导致癌症的额外体征或症状。例如，肿瘤在患有NSCLC的患者中的肺组织内复发在本文中称作病情进展。
术语“应答率”或“RR”包括对于治疗疾病的规定疗法存在阳性反应如肿瘤收缩或消失的患者的百分比。
术语“完全应答”或“完全缓解(complete remission)”或“CR”包括由对应于治疗一段时间后癌症的全部体征消失所描述的临床终点。例如，如果在时间或疗程结束时，不存在可以通过测量症状控制和生活质量(如通过检验、X射线和扫描进行)或分析该疾病的生物标志物来鉴定的残存疾病，则患者在本文中描述为显示对疗法完全应答。在某些情况下，完全应答是全部肿瘤损害消失(见，国家癌症研究所实体瘤应答评价标准(RECIST)，2009年1月更新)。
术语“部分应答”或“PR”包括被描述为治疗一段时间后癌症的一些但并非全部体征消失的临床终点。例如，如果在时间或疗程结束时，存在可以通过测量症状控制和生活质量(如通过检验、X射线和扫描进行)或分析该疾病的生物标志物来鉴定的某些可检测残存疾病，则患者在本文中描述为显示对疗法部分应答。在某些情况下，部分应答是肿瘤损害区的最长直径的总和下降30%(见，国家癌症研究所实体瘤应答评价标准(RECIST)，2009年1月更新)。
术语“病情稳定”或“SD”包括癌症中以不出现新肿瘤和现存已知肿瘤的尺寸无明显变化为特征的临床终点。根据RECIST，将病情稳定定义为不符合完全应答、部分应答和进展性病情(其定义为肿瘤损害区的最长直径的总和增加20%)之规定的小变化。
术语“直至进展的时间”或“TTP”包括在诊断或治疗疾病后直至病情开始恶化(例如，出现新肿瘤、肿瘤尺寸增加；生活质量变化，或症状控制变化)的时间量度。
术语“无进展生存”或“PFS”包括在治疗疾病期间和之后患者在患病情况下存活而没有该疾病额外症状的时间长度。
术语“总生存”或“OS”包括描述患者的临床终点，其中所述患者在经诊断患有疾病如癌症或因其而治疗后存活限定的时间段。
如本文所用，术语“稀释系列”意在包括一系列降低浓度的特定样品(例如，细胞裂解物)或试剂(例如，抗体)。稀释系列一般通过以下方法产生：将起始浓度的测定量样品或试剂与稀释剂(例如，稀释缓冲液)混合以产生较低浓度的样品或试剂，并且重复该过程足够次数以获得所需数目的系列稀释物。可以将样品或试剂系列稀释至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、500或1000倍以产生包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50份降低浓度的样品或试剂的稀释系列。例如，可以通过以下方式产生以1mg/ml起始浓度构成捕获抗体试剂2倍系列稀释的稀释系列：将某个量的起始浓度的捕获抗体与等量稀释缓冲液混合以产生0.5mg/ml浓度的捕获抗体，并且重复该过程以获得0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.0325mg/ml等的捕获抗体浓度。
如本文所用的术语“优越动态范围”指测定法在少至1个细胞中或在多达上千个细胞中检出特定分析物的能力。例如，本文所述的免疫测定法拥有优越动态范围，因为使用捕获抗体浓度的稀释系列，它们有利地在约1-10000个细胞(例如，约1、5、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500或10000个细胞)中检出特定目的信号转导分子。
如本文所用，术语“循环型细胞”包括已经从实体瘤转移或微转移的肿瘤外细胞。循环型细胞的例子包括但不限于循环型肿瘤细胞、癌干细胞和/或移行至肿瘤的细胞(例如循环型内皮祖先细胞、循环型内皮细胞、循环型促血管生成髓样细胞、循环型树突细胞等)。含有循环型细胞的患者样品可以从任何可获得的生物流体(例如，全血、血清、血浆、痰、支气管灌洗液、尿、***抽吸物、淋巴液、唾液、细针头抽吸物等)获得。在某些情况下，将全血样品分离成血浆或血清部分和细胞部分(即，细胞沉淀)。细胞部分一般含有红细胞、白细胞和/或实体瘤的循环型细胞如循环型肿瘤细胞(CTC)、循环型内皮细胞(CEC)、循环型内皮祖先细胞(CEPC)、癌干细胞(CSC)、***的弥散肿瘤细胞及其组合。血浆或血清部分通常尤其含有由实体瘤循环型细胞释放的核酸(例如，DNA、RNA)和蛋白质。
循环型细胞一般使用一种或多种分离方法从患者样品分离，所述分离方法包括例如免疫磁性分离法(见，例如，Racila等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:4589-4594(1998)；Bilkenroth等人,Int.J.Cancer,92:577-582(2001))、Immunicon的***(Huntingdon Valley,PA)、微流体分离法(见，例如，Mohamed等人,IEEE Trans.Nanobiosci.,3:251-256(2004)；Lin等人,摘要编号5147，97th AACR Annual Meeting,Washington,D.C.(2006))、FACS法(见，例如，Mancuso等人,Blood,97:3658-3661(2001))、密度梯度离心法(见，例如，Baker等人,Clin.Cancer Res.,13:4865-4871(2003))和耗尽法(见，例如，Meye等人,Int.J.Oncol.,21:521-530(2002))。
如本文所用的术语“样品”包括从患者获得的任何生物标本。样品包括但不限于全血、血浆、血清、红细胞、白细胞(例如，外周血单个核细胞)、导管灌洗液、***抽吸物、淋巴液(例如，***的弥散肿瘤细胞)、骨髓抽吸物、唾液、尿、粪(即，粪便)、痰、支气管灌洗液、泪、细针头抽吸物(例如，通过随机乳晕细针头抽吸法收获)、任何其他体液、组织样品(例如，肿瘤组织)如肿瘤(例如，针头活组织检查)或***(例如，岗哨***活组织检查)的活组织检查样品、组织样品(例如，肿瘤组织)如肿瘤的手术切除物及其细胞提取物。在一些实施方案中，样品是全血或其分离组分如血浆、血清、或细胞沉淀物。在优选的实施方案中，通过使用本领域已知的任何技术从全血或其细胞部分中分离实体瘤循环型细胞，获得样品。在其他实施方案中，样品是***固定的石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织样品，例如，来自胃或胃肠道其他部分的实体瘤。
“活组织检查”指取出组织样品用于诊断性或预后性评价的方法，并且指组织标本本身。本领域已知的任何活组织检查技术可以适用于本发明的方法和组合物。使用的活组织检查技术通常将取决于待评价的组织类型和肿瘤的大小和类型(即，实体或悬浮(即，血液或腹水))，以及其他因素。代表性活组织检查技术包括切除活组织检查、切***组织检查、针头活组织检查(例如，芯针活组织检查、细针头抽吸活组织检查等)、手术活组织检查和骨髓活组织检查。活组织检查技术例如在Harrison′s Principles ofInternal Medicine,Kasper等人编著，第16版，2005年，第70章和直至第V部分中讨论。本领域技术人员将理解可以开展活组织检查技术以鉴定给定组织样品中的癌性和/或前癌细胞。
术语“受试者”或“患者”或“个体”一般包括人，但是也可以包括其他动物，例如，其他灵长类、啮齿类、犬、猫、马、羊、猪等。
术语“高加索人”包括非拉美的欧洲后裔人类的人种分类。例如，一个具有在欧洲、近东或北非的任一种原始人类起源的人。
术语“亚洲人”包括这些人类的人种分级，所述人类源自在亚洲的人种群。例如，一个具有在远东、东南亚或印度次大陆(包括例如，柬埔寨、中国、印度、日本、韩国、马来西亚、巴基斯坦、菲律宾群岛、泰国和越南)的任一种原始人类起源的人。
“阵列”或“微阵列”包括的固定或约束于固相支持物，例如玻璃(例如，载玻片)、塑料、芯片、针、滤器、珠(例如，磁珠、聚苯乙烯珠等)、纸、膜(例如，尼龙、硝酸纤维素、聚偏氟乙烯(PVDF)等)、纤维束或任何其他合适基底的捕获抗体的独特集群和/或稀释系列。这些捕获抗体通常借助共价或非共价相互作用(例如，离子键、疏水相互作用、氢键、范德瓦尔斯力、偶极-偶极键)固定或约束于固相支持物上。在某些情况下，捕获抗体包含与结合至固相支持物的捕获剂相互作用的捕获标签。在本文所述的测定法中使用的阵列一般包含在不同的已知/可寻址位置与固相支持物表面偶联的多种不同捕获抗体和/或捕获抗体浓缩物。
术语“捕获抗体”意在包括对样品如细胞提取物中的一种或多种目的分析物特异(即，结合、由其结合或与之形成复合物)的固定抗体。在具体的实施方案中，将捕获抗体约束在阵列中的固相支持物上。在固相支持物上固定多种信号转导分子中任一种的合适捕获抗体从Upstate(Temecula,CA)、Biosource(Camarillo,CA)、Cell Signaling Technologies(Danvers,MA)、R&D Systems(Minneapolis,MN)、Lab Vision(Fremont,CA)、SantaCruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)、Sigma(St.Louis,MO)、和BDBiosciences(San Jose,CA)可获得。
如本文所用的术语“检测抗体”包括含有可检测标记物的抗体，所述抗体对样品中的一种或多种目的分析物特异(即，结合、由其结合或与之形成复合物)。该术语也包括对一种或多种目的分析物特异的抗体，其中所述抗体可以被包含可检测标记物的另一个种类结合。可检测标记物的例子包括但不限于生物素/链亲和素标记物、核酸(例如，寡核苷酸)标记物、化学活性标记物、荧光标记物、酶标记物、放射性标记物及其组合。用于检测多种信号转导分子中任一种的活化状态和/或总量的合适检测抗体从Upstate(Temecula,CA)、Biosource(Camarillo,CA)、Cell SignalingTechnologies(Danvers,MA)、R&D Systems(Minneapolis,MN)、LabVision(Fremont,CA)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)、Sigma(St.Louis,MO)、和BD Biosciences(San Jose,CA)可获得。作为非限制性例子、针对各种磷酸化形式的信号转导分子如EGFR、c-KIT、c-Src、FLK-1、PDGFRA、PDGFRB、AKT、MAPK、PTEN、Raf和MEK的磷酸特异性抗体从Santa Cruz Biotechnology可获得。
术语“活化状态依赖性抗体”包括对样品中的一种或多种目的分析物的特定活化状态特异(即，结合、由其结合或与之形成复合物)的检测抗体。在优选的实施方案中，活化状态依赖性抗体检测一种或多种分析物(如一种或多种信号转导分子)的磷酸化、遍在蛋白化和/或复合状态。在一些实施方案中，使用活化状态依赖性抗体检测受体酪氨酸激酶的EGFR家族成员的磷酸化和/或EGFR家族成员之间异二聚体复合物的形成。在具体的实施方案中，活化状态依赖性抗体可用于检测一种或多种以下信号转导分子中的一个或多个磷酸化位点(磷酸化位点对应于人蛋白序列中的氨基酸位置)：EGFR/HER1/ErbB1(例如，酪氨酸(Y)1068)；ErbB2/HER2(例如，Y1248)；ErbB3/HER3(例如，Y1289)；ErbB4/HER4(例如，Y1284)；c-Met(例如，Y1003、Y1230、Y1234、Y1235和/或Y1349)；SGK3(例如，苏氨酸(T)256和/或丝氨酸(S)422)；4E-BP1(例如，T70)；ERK1(例如，T185、Y187、T202和/或Y204)；ERK2(例如，T185、Y187、T202和/或Y204)；MEK(例如，S217和/或S221)；PIK3R1(例如，Y688)；PDK1(例如，S241)；P70S6K(例如，T229、T389和/或S421)；PTEN(例如，S380)；AKT1(例如，S473和/或T308)；AKT2(例如，S474和/或T309)；AKT3(例如，S472和/或T305)；GSK-3β(例如，S9)；NFKB(例如，S536)；IKB(例如，S32)；BAD(例如，S112和/或S136)；mTOR(例如，S2448)；Rsk-1(例如，T357和/或S363)；Jnk(例如，T183和/或Y185)；P38(例如，T180和/或Y182)；STAT3(例如，Y705和/或S727)；FAK(例如，Y397、Y576、S722、Y861和/或S910)；RB(例如，S249、T252、S612和/或S780)；RB1(例如，S780)；内收蛋白(例如，S662和/或S724)；PYK2(例如，Y402和/或Y881)；PKCα(例如，S657)；PKCα/β(例如，T368和/或T641)；PKCδ(例如，T505)；p53(例如，S392和/或S20)；CREB(例如，S133)；c-Jun(例如，S63)；c-Src(例如，Y416)；和桩蛋白(例如，Y31和/或Y118)。
术语“活化状态非依赖性抗体”包括对样品中的一种或多种目的分析物(无论其活化状态如何)特异(即，结合、由其结合或与之形成复合物)的检测抗体。例如，活化状态非依赖性抗体可以检测一种或多种分析物(如一种或多种信号转导分子)的磷酸化形式和非磷酸化形式。
活化状态非依赖性c-Met抗体的非限制性例子包括按以下目录号可获得的那些抗体：AF276、MAB3581、MAB3582、MAB3583和MAB5694(R&D Systems)；ab51067、ab39075、ab47431、ab14571、ab10728、ab59884、ab47431、ab49210、ab71758、ab74217、ab47465、ab27492(Abcam)；SC161HRP(Santa Cruz)；PA1-14257、PA1-37483和PA1-37484(Thermo Scientific)；05-1049、MAB3729(Millipore)；sc-162、sc-34405、sc-161、sc-10、sc-8307、sc-46394、sc-46395、sc-81478(SantaCruz Biotechnology)；8198、3127、3148和4560(Cell SignalingTechnology)；和700261、370100、718000(Life Technologies)。
活化状态依赖性cMET抗体的非限制性例子包括按以下目录号可获得的那些抗体：AF2480、AF3950、AF4059(R&D Systems)；PA1-14254、PA1-14256(Thermo Scientific)；sc-16315、sc-34086、sc34085、sc-34087、sc-101736、sc-101737(Santa Cruz Biotechnology)；ab61024、ab5662、ab73992和ab5656(Abcam)；3135、3077、3129、3126、3133、3121(CellSignaling Technology)；和44892G、44896G、700139、44887G、44888G、44882G(Life Technologies)。
识别cMET的捕获抗体的非限制性例子包括按以下目录号可获得的那些抗体：AF276、MAB3581、MAB3582、MAB3583和MAB5694(R&DSystems)；ab51067、ab39075、ab47431、ab14571、ab10728、ab59884、ab47431、ab49210、ab71758、ab74217、ab47465、ab27492(Abcam)；SC161HRP(Santa Cruz)；PA1-14257、PA1-37483和PA1-37484(Thermo Scientific)；05-1049、MAB3729(Millipore)；sc-162、sc-34405、sc-161、sc-10、sc-8307、sc-46394、sc-46395、sc-81478(SantaCruz Biotechnology)；8198、3127、3148和4560(Cell SignalingTechnology)；和700261、370100、718000(Life Technologies)。
活化状态非依赖性HER3抗体的非限制性例子包括按以下目录号可获得的那些抗体：PA1-86644和MS-201-PABX(Thermo Scientific)；MAB348、MAB3481、MAB3482、MAB3483(R&D Systems)；sc-415、sc-53279、sc-23865、sc-7390、sc-71067、sc-71066、sc-56385、sc-285、sc-71068、sc-81454、sc81455(Santa Cruz Technologies)；和44897M(LifeTechnologies)。
活化状态依赖性HER3抗体的非限制性例子包括按以下目录号可获得的那些抗体：AF5817(R&D Systems)；sc-135654(Santa CruzBiotechnology)；8017、4561、4784、4791和4754(Cell SignalingTechnology)；和44901M(Life Technologies)。
识别HER3的捕获抗体的非限制性例子包括按以下目录号可获得的那些抗体：PA1-86644和MS-201-PABX(Thermo Scientific)；MAB348、MAB3481、MAB3482、MAB3483(R&D Systems)；sc-415、sc-53279、sc-23865、sc-7390、sc-71067、sc-71066、sc-56385、sc-285、sc-71068、sc-81454、sc81455(Santa Cruz Technologies)；和44897M(LifeTechnologies)。
识别磷酸酪氨酸残基的活化状态依赖性抗体的例子包括但不限于来自Millipore的4G10抗磷酸酪氨酸抗体；来自Abcam plc的抗磷酸酪氨酸抗体[PY20](ab10321)；来自PerkinElmer Inc.的DELFIA Eu-N1抗磷酸酪氨酸P-Tyr-100、PT66和PY20抗体；和来自Sigma-Aldrich Co.的抗磷酸酪氨酸PY20、PT-66和PT-154单克隆抗体。识别磷酸化丝氨酸残基的活化状态依赖性抗体的例子包括但不限于，来自Sigma-Aldrich Co.的PSR-45单克隆抗体；来自Abcam plc的抗磷酸化丝氨酸抗体[PSR-45](ab6639)；来自Millipore的抗磷酸化丝氨酸克隆4A4；来自Novus Biologicals的磷酸化丝氨酸抗体(NB600-558)；来自PerkinElmer Inc.的DELFIA Eu-N1标记的抗磷酸化丝氨酸抗体；和来自Qiagen的磷酸化丝氨酸抗体Q5。识别磷酸化苏氨酸残基的活化状态依赖性抗体的例子包括但不限于，来自Sigma-Aldrich Co.的PTR-8单克隆抗体P3555；来自Cell SignalingTechnology的磷酸苏氨酸抗体(P-Thr-多克隆)#9381；来自Abcam plc的抗磷酸化苏氨酸抗体(ab9337)；和来自Qiagen的磷酸化苏氨酸抗体Q7。
术语“核酸”或“多核苷酸”包括处于单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物，例如，DNA和RNA。核酸包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，并且具有与参考核酸相似的结合特性。这类类似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2′-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。除非特别地限制，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性。除非另外说明，否则特定核酸序列也隐含包括其保守方式修饰的变体和互补序列，以及明确指出的序列。
术语“寡核苷酸”包括RNA、DNA、RNA/DNA杂交分子的单链低聚物或聚合物，和/或其模拟物。在某些情况下，寡核苷酸由天然存在的(即，未修饰的)核碱基、糖和核苷间(主链)键组成。在某些其他情况下，寡核苷酸包含修饰的核碱基、糖和/或核苷间键。
如本文所用，术语“错配基序”或“错配区域”指寡核苷酸的与其互补序列不具有100%互补性的部分。寡核苷酸可以具有至少1、2、3、4、5、6个或更多个错配区域。错配区域可以是连续的或可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个核苷酸分隔。错配基序或区域可以包含单个核苷酸或可以包含2、3、4、5个或更多个核苷酸。
短语“严格杂交条件”指这样的条件，在所述条件下寡核苷酸与其互补序列杂交，而不与其他序列杂交。严格条件具有序列依赖性并且会在不同的环境中不同。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的深入指导存在于Tijssen,Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Probes,“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays(杂交原理和核酸分析策略概述)”(1993)中。通常，将严格条件选择成在定义的离子强度pH下低于特定序列的热解链温度(Tm)约5-10℃。Tm是(在定义的离子强度、pH和核酸浓度下)与靶互补的50%探针与所述靶序列平衡杂交的温度(当靶序列过量存在时，在Tm，平衡占据了50%探针)。也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少两倍于背景，优选地10倍于背景杂交。
在两个或更多个核酸的情况下，术语“基本上相同”或“实质同一性”指这样的两个或更多个序列或子序列，其中在比较窗或指定的区域内为最大对应性(如使用序列比较算法或通过手工比对和视检所测量)进行比较和比对时，所述序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同核苷酸(即，在指定区域内至少约60%、优选地至少约65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性)。当上下文指明时，这个定义也类似地指序列的互补物。优选地，实质同一性在至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100个核苷酸长度的区域内存在。
术语“孵育”同义地与“接触”和“暴露”使用并且除非另外说明，否则不暗示任何特定的时间或温度要求。
“受体酪氨酸激酶”或“RTKs”包括五十六种(56)以跨膜结构域和酪氨酸激酶基序为特征的蛋白家族。RTKs在细胞信号传导方面发挥作用并且传递调节生长、分化、黏附、移行和凋亡的信号。受体酪氨酸激酶的突变性激活和/或过量表达使细胞转化并且经常在癌症形成中发挥关键作用。RTKs已经变成多种分子靶向剂如曲妥珠单抗、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、舒尼替尼、伊马替尼、尼洛替尼等的靶。一条充分表征的信号转导途径是MAP激酶途径，其负责转导来自表皮生长因子(EGF)的信号以促进细胞中的细胞增殖。
III．实施方案的描述
本发明提供了用测定法(例如，如本文所述的特异性、多通道、高通量邻近测定法)检测源自肿瘤组织的肿瘤细胞或实体瘤的循环型细胞中信号转导途径组分的状态(例如，表达水平和/或活化水平)的方法。本发明也提供用于选择适宜疗法以下调一个或多个失调的信号转导途径的方法。因此，本发明的某些实施方案可以用来基于特定的分子标签促进个性化疗法的设计，其中通过收集给定患者的肿瘤(例如，涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤)中总信号转导蛋白和活化的信号转导蛋白提供所述特定的分子标签。
在特定的方面，本发明提供分子标志物(生物标志物)，所述分子标志物可以确定或预测特定癌是否可以对抗癌药物(例如，EGFR调节化合物(例如，EGFR抑制剂)、VEGFR调节化合物(例如，VEGFR抑制剂)和/或cMet调节化合物(例如，cMet抑制剂))反应或可能对该抗癌药物具有有利反应。在特定的实施方案中、测量HER3和/或cMet信号传导途径的一种或多种组分(例如，cMet、截短的cMet受体、HER1、HER2、p95HER2、HER3、截短的HER3受体、HER4、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR1-3和/或PDGFR)的表达和/或活化水平特别可用于选择合适的抗癌药物和/或鉴定或预测细胞如恶性癌细胞中对所述抗癌药物的反应。
在一个方面，本发明提供一种方法，用于受试者的疗法选择，所述受试者具有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤，所述方法包括：
(a)检测和/或定量cMet蛋白在取自所述受试者的样品中的表达水平和/或活化水平；
(b)检测和/或定量HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平；
(c)将cMet蛋白和/或HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平与(i)对照蛋白的表达水平和/或活化水平和/或(ii)cMet蛋白和/或HER3蛋白在对照样品中的表达水平和/或活化水平比较；和
(d)基于cMet蛋白和/或HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平相比于所述对照蛋白和/或对照样品之间的差异，确定是否仅施用cMet抑制剂或施用与途径定向疗法组合的cMet抑制剂。
在一些实施方案中，将一种或多种分析物的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平表示为与特定目的分析物的信号强度对应的相对荧光单元(RFU)值，其中使用例如邻近测定法(如本文所述的协同酶增强反应性免疫测定法(CEER))测定所述信号强度。在其他实施方案中，通过针对标准曲线校正或归一化例如使用邻近测定法(如CEER所测定)的RFU值，将一种或多种分析物的表达水平和/或活化水平定量，其中针对特定的目的分析物产生所述标准曲线。在某些情况下，可以基于标准曲线计算RFU值。
在其他实施方案中，将一种或多种分析物的表达水平和/或活化水平表示为与特定目的分析物的增加信号强度对应的“低”、“中等”或“高”，其中使用例如邻近测定法(如CEER)测定所述信号强度。在一些情况下，例如使用邻近测定法(如CEER)所测定的特定目的分析物的不可检测到或最小可检测表达或活化水平可以表示为“不可检测到”。在其他情况下，例如使用邻近测定法(如CEER)所测定的特定目的分析物的低表达或活化水平可以表示为“低”。在另外的其他情况下，例如使用邻近测定法(如CEER)所测定的特定目的分析物的中等表达或活化水平可以表示为“中等”。在另外的其他情况下，例如使用邻近测定法(如CEER)所测定的特定目的分析物的中等至高表达或活化水平可以表述为“中等至高”。在其他情况下，例如使用邻近测定法(如CEER)所测定的特定目的分析物的极高表达或活化水平可以表述为“高”。
在某些实施方案中，当表述为“低”、“中等”或“高”时，特定目的分析物的表达(例如，总计)水平或活化(例如，磷酸化)水平可以例如与阴性对照(如IgG对照)相比时、与针对所述目的分析物所产生的标准曲线相比时、与阳性对照如泛CK对照相比时、与抗癌药物存在下所测定的表达或活化水平相比时和/或与抗癌药物不存在下所测定的表达或活化水平相比时，对应于至少是约0；5000；10000；15000；20000；25000；30000；35000；40000；45000；50000；60000；70000；80000；90000；100000RFU或更大的表达或活化水平。在一些情况下，相关性是分析物特异性的。作为一个非限制性例子，与参比表达或活化水平相比时，例如使用邻近测定法(如CEER)所测定的“低”水平表达或活化可以在表达或活化方面对一种分析物而言对应于10000RFU，并且对于另一种分析物而言，对应于50000RFU。
在某些实施方案中，特定目的分析物的表达或活化水平可以对应于称作“低”、“中等”或“高”的表达或活化水平，后者是相对于参比表达水平或活化水平而言的，例如与阴性对照(如IgG对照)相比时、与针对所述目的分析物所产生的标准曲线相比时、与阳性对照如泛CK对照相比时、与抗癌药物存在下所测定的表达或活化水平相比时和/或与抗癌药物不存在下所测定的表达或活化水平相比时。在一些情况下，相关性是分析物特异性的。作为一个非限制性例子，与参比表达或活化水平相比时，例如使用邻近测定法(如CEER)所测定的“低”水平表达或活化可以在表达或活化方面对一种分析物而言对应于2倍增加，并且对于另一种分析物而言，对应于5倍增加。
在某些实施方案中，特定目的分析物的表达或活化水平可以对应于与阴性对照(如IgG对照(即，对照蛋白))相比、与针对所述目的分析物所产生的标准曲线相比、与阳性对照如泛CK对照(即，对照蛋白)相比时、与抗癌药物(即，对照样品)存在下所测定的表达或活化水平相比和/或与抗癌药物(即，对照样品)不存在下所测定的表达或活化水平相比的表达或活化水平。在具体的实施方案中，对照样品可以源自不含涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤的细胞系或组织样品。
在优选的实施方案中，途径定向疗法是可以改变信号传导途径组分的表达和/或活化的治疗剂，如但不限于泛HER抑制剂、EGFR抑制剂、cMet抑制剂和VEGFR抑制剂。泛HER抑制剂的非限制性例子包括PF-00299804、奈拉替尼(HKI-272)、AC480(BMS-599626)、BMS-690154、PF-02341066、HM781-36B、CI-1033、BIBW-2992及其组合。HER2抑制剂的例子包括但不限于单克隆抗体如曲妥珠单抗
Figure BDA00003704294600281
和培妥珠单抗(2C4)；小分子酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼(易瑞沙
Figure BDA00003704294600282
)、厄洛替尼(特罗凯
Figure BDA00003704294600283
)、培利替尼、CP-654577、CP-724714、卡纽替尼(CI1033)、HKI-272、拉帕替尼(GW-572016；
Figure BDA00003704294600284
)、PKI-166、AEE788、BMS-599626、HKI-357、BIBW2992、ARRY-380、ARRY-334543、CUDC-101、JNJ-26483327和JNJ-26483327；及其组合。EGFR抑制剂的非限制性例子包括西妥昔单抗、帕尼单抗、马妥珠单抗、尼妥珠单抗、ErbB1疫苗、厄洛替尼、吉非替尼、ARRY-334543、AEE788、BIBW2992、EKB569、CL-387-785、CUDC-101、AV-412及其组合。VEGFR抑制剂的非限制性例子包括贝伐珠单抗(阿瓦斯汀)、HuMV833、VEGF-Trap、AV-952、AZD2171、AMG-706、舒尼替尼(SU11248)、索拉替尼(BAY43-9006)、AE-941(Neovastat)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584)、GSK-1363089、PTK-787、XL-800、ZD6474、AG13925、AG013736、CEP-7055、CP-547,632、GW786024、GW654652、GSK-VEG1003、GW786034B及其组合。
在一些实施方案中，cMet抑制剂选自多重激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和单克隆抗体。在特定方面，多重激酶抑制剂(例如，泛HER抑制剂)是阻断多种激酶(如但不限于cMet、RON、EGFR、HER2、HER3、VEGFR1、VEGR2、VEGFR3、PI3K、SHC、p95HER2、IGF-1R和/或c-Kit)的药剂。在其他方面，酪氨酸激酶抑制剂是特异性阻断选自但不限于cMet、RON，EGFR、HER2、HER3、VEGFR1、VEGR2和/或VEGFR3的酪氨酸激酶的药剂。可以在本发明中使用的小分子酪氨酸激酶抑制剂的非限制性例子包括吉非替尼(易瑞沙
Figure BDA00003704294600291
)、厄洛替尼(特罗凯
Figure BDA00003704294600292
)、培利替尼、CP-654577、CP-724714、卡纽替尼(CI1033)、HKI-272、拉帕替尼(GW-572016；
Figure BDA00003704294600293
)、PKI-166、AEE788、BMS-599626、HKI-357、BIBW2992、ARRY-334543、JNJ-26483327和JNJ-26483327；及其组合。用于本发明中的单克隆抗体的非限制性例子包括曲妥珠单抗
Figure BDA00003704294600294
培妥珠单抗(2C4)、阿伦珠单抗
Figure BDA00003704294600295
贝伐珠单抗
Figure BDA00003704294600296
西妥昔单抗(爱必妥
Figure BDA00003704294600297
)、吉妥珠单抗
Figure BDA00003704294600298
帕尼单抗(VectibixTM)、利妥昔单抗
Figure BDA00003704294600299
和托西莫单抗
Figure BDA000037042946002910
及其组合。上文描述了泛HER抑制剂，HER2抑制剂，EGFR抑制剂和VEGFR抑制剂的非限制性例子。
调节cMet活性的化合物的非限制性例子在本文中描述并且包括单克隆抗体、小分子抑制剂及其组合。在优选的实施方案中，调节cMet的化合物抑制cMet活性和/或阻断cMet信号传导，例如，是一种cMet抑制剂。cMet抑制剂的例子包括但不限于单克隆抗体，如AV299、L2G7、AMG102、DN30、OA-5D5和MetMAb；和cMet的小分子抑制剂，如ARQ197、AMG458、BMS-777607、XL184、XL880、INCB28060、E7050、GSK1363089/XL880、K252a、LY2801653、MP470、MGCD265、MK-2461、NK2、NK4、SGX523、SU11274、SU5416、PF-04217903、PF-02341066、PHA-665752、JNJ-38877605；及其组合。
在特定的实施方案中，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤的患者将拥有存在一个或多个KRAS突变的肿瘤组织。KRAS突变可以是选自由G12C、G12D、G13D、G12R、G12V及其组合组成的突变集合的成员。
在某些情况下，涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤包括乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌或其组合。在某些其他情况下，涉及异常cMet信号传导的恶性癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在某些实施方案中，NSCLC是除小细胞肺癌之外的任何类型上皮肺癌。如本领域技术人员已知，最常见类型的NSCLC是鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌。
在一些实施方案中，步骤(d)包括当确定cMet蛋白在样品中的表达水平和/或活化水平与对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。在具体的实施方案中，存在中等至高水平cMet蛋白表达和/或活化的受试者是高加索人受试者。在某些实施方案中，cMet蛋白的活化水平对应于磷酸化cMet蛋白的水平。
在其他实施方案中，步骤(d)包括当确定HER3蛋白在样品中的表达水平和/或活化水平与对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。在具体的实施方案中，存在中等至高水平HER3表达和/或活化的受试者是高加索人受试者。在某些实施方案中，HER3蛋白的活化水平对应于磷酸化HER3蛋白的水平。
在其他实施方案中，步骤(d)包括当各自独立地确定cMet蛋白和HER3蛋白在样品中的表达水平和/或活化水平与对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。在某些其他实施方案中，存在中等至高水平cMet蛋白和HER3蛋白表达和/或活化的受试者是高加索人受试者。就这一点而论，在这些实施方案中，在步骤(d)中确定是否应当仅施用cMet抑制剂包括确定cMet蛋白和HER3蛋白的表达水平和/或活化水平与对照蛋白和/或对照样品相比均是否位于中等至高的范围内。如上文所述，在某些优选的实施方案中，分析物的表达水平和/或活化水平可以使用邻近测定法如CEER进行确定并以RFU值为单位表述，其中可以将所述RFU值描述为“低”、“中等”或“高”。
在本发明的另外其他实施方案中，在步骤(d)中确定是否应当仅施用cMet抑制剂包括：确定样品中cMet和HER3蛋白的表达水平和/或活化水平与对照蛋白和/或对照样品相比均是否处于中等至高的范围内，并且样品中HER1和HER2蛋白的表达水平与对照蛋白和/或对照样品相比均是否低。在具体的情况下，被描述成具有中等至高水平cMet和HER3和低水平HER1和HER2的受试者肿瘤样品的表达/活化谱可以指示医师向该受试者施用cMet抑制剂。在某些实施方案中，该受试者是高加索人受试者。
在又一个实施方案中，本发明的方法还包括检测并定量HGF/SF蛋白(cMet的配体)的表达水平和/或活化水平。在具体的实施方案中，在步骤(d)中确定是否应当仅施用cMet抑制剂包括确定样品中cMet、HER3和HGF/SF蛋白的表达水平和/或活化水平与对照蛋白和/或对照样品相比是否处于中等至高的范围内。在一些情况下，被描述成具有中等至高水平cMet、HER3和HGF/SF的受试者肿瘤样品的表达/活化谱可以预示对用于该受试者的cMet抑制剂疗法的阳性反应。在某些实施方案中，该受试者是高加索人受试者。
在其他实施方案中，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤的受试者拥有存在一个或多个KRAS突变的肿瘤组织。KRAS突变的非限制性例子包括G12C、G12D、G13D、G12R、G12V及其组合。在具体的情况下，步骤(d)包括当所述KRAS突变存在于样品中并且各自独立地确定cMet蛋白、HER3蛋白和HGF/SF蛋白在样品中的表达水平和/或活化水平与对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。在这类情况下，被描述成具有KRAS突变和中等至高水平cMet、HER3和HGF/SF的受试者肿瘤样品的表达/活化谱可以预示对用于该受试者的cMet抑制剂疗法的阳性反应。在某些实施方案中，该受试者是高加索人受试者。
在某些实施方案中，在步骤(d)中确定是否向受试者仅施用cMet抑制剂包括：确定cMet蛋白的表达水平是否处于低至中等的范围内并且cMet蛋白的活化(例如，磷酸化)水平是否高，二者均与对照蛋白和/或对照样品相比。在某些其他实施方案中，在步骤(d)中确定是否向受试者仅施用cMet抑制剂还包括：与对照蛋白和/或对照样品相比，确定HER3蛋白的表达水平是否处于低至中等的范围内并且HER3蛋白的活化(例如，磷酸化)水平是否高。在这类情况下，这种受试者肿瘤样品的表达/活化谱可以预示对用于该受试者的cMet抑制剂疗法的阳性反应，其中所述表达/活化谱描述成具有单独的或与低至中等HER3蛋白表达水平组合的低至中等cMet蛋白表达水平，以及单独或与高HER3蛋白活化水平组合的高cMet蛋白活化水平。在某些实施方案中，该受试者是高加索人受试者。如上文所述，在优选的实施方案中，分析物的表达水平和/或活化水平可以使用邻近测定法如CEER进行确定并以RFU值为单位表述，其中可以将所述RFU值描述为“低”、“中等”或“高”。
在其他实施方案中，本发明的方法还包括检测和/或定量从受试者获得的样品中截短的cMet蛋白的表达水平和/或活化水平。在具体的情况下，步骤(d)包括当截短的cMet蛋白在样品中的表达水平是可检测的并且确定HER3蛋白在样品中的表达水平与对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。在某些实施方案中，该受试者是高加索人受试者。
在另外的其他实施方案中，本发明的方法还包括检测和/或定量从受试者获得的样品中截短的HER3蛋白的表达水平和/或活化水平。在具体的情况下，步骤(d)包括当截短的HER3蛋白在样品中的表达水平是可检测的并且确定cMet蛋白在样品中的表达水平与对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。在某些实施方案中，该受试者是高加索人受试者。
在额外的实施方案中，本发明的方法还包括检测和/或定量从受试者获得的样品中PI3K蛋白的表达水平和/或活化水平。在具体的情况下，步骤(d)包括当样品中PI3K蛋白活化并且各自独立地确定cMet蛋白和HGF/SF蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平与对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定应当仅施用所述cMet抑制剂。在某些实施方案中，该受试者是高加索人受试者。
在其他实施方案中，本发明的方法还包括对受试者就EGFR突变进行基因分型。EGFR突变的非限制性例子包括外显子19中的缺失、外显子20中的***、L858R、G719S、G719A、G719C、L861Q、S768I、T790M及其组合。在具体的实施方案中，步骤(d)包括当EGFR突变存在时并且当确定cMet蛋白在样品中的表达水平与对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定cMet抑制剂应当与途径定向疗法组合施用。在优选的实施方案中，这种途径定向疗法是EGFR抑制剂。EGFR抑制剂的例子包括但不限于西妥昔单抗、帕尼单抗、马妥珠单抗、尼妥珠单抗、ErbB1疫苗、厄洛替尼、吉非替尼、ARRY-334543、AEE788、BIBW2992、EKB569、CL-387-785、CUDC-101、AV-412及其组合。在某些实施方案中，该受试者是高加索人受试者。
在另外的其他实施方案中，本发明的方法还包括检测和/或定量从受试者获得的样品中EGFR蛋白、HER2蛋白、PI3K蛋白、VEGFR1蛋白、VEGFR2蛋白和/或VEGFR3蛋白的表达水平和/或活化水平。在某些具体实施方案中，步骤(d)包括当各自独立地确定EGFR蛋白、HER2蛋白和HER3蛋白在样品中的活化水平与对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高并且确定cMet蛋白在样品中的表达水平与对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定cMet抑制剂应当与途径定向疗法组合施用。在其他具体的实施方案中，步骤(d)包括当确定PI3K蛋白在样品中的活化水平与对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高并且各自独立地确定HER2蛋白、HER3蛋白和cMet蛋白在样品中的表达水平与对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定cMet抑制剂应当与途径定向疗法组合施用。在另外其他的具体实施方案中，步骤(d)包括当各自独立地确定cMet蛋白、EGFR蛋白和HER2蛋白在样品中的表达水平和/或活化水平与对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定cMet抑制剂应当与途径定向疗法组合施用。在某些实施方案中，该受试者是高加索人受试者。
在优选的实施方案中，途径定向疗法是EGFR抑制剂、泛HER抑制剂或其组合。EGFR抑制剂的非限制性例子包括西妥昔单抗、帕尼单抗、马妥珠单抗、尼妥珠单抗、ErbB1疫苗、厄洛替尼、吉非替尼、ARRY-334543、AEE788、BIBW2992、EKB569、CL-387-785、CUDC-101、AV-412及其组合。泛HER抑制剂的非限制性例子包括PF-00299804、奈拉替尼(HKI-272)、AC480(BMS-599626)、BMS-690154、PF-02341066、HM781-36B、CI-1033、BIBW-2992及其组合。
在另外其他的具体实施方案中，步骤(d)包括当各自独立地确定cMet蛋白、HER3蛋白和VEGFR1-3蛋白之任意一种、两种或全部三种在样品中的表达水平和/或活化水平与对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定cMet抑制剂应当与途径定向疗法组合施用。在优选的实施方案中，途径定向疗法是可以改变信号传导途径组分的药物，如，但不限于VEGFR抑制剂。VEGFR抑制剂的例子包括但不限于贝伐珠单抗(阿瓦斯汀)、HuMV833、VEGF-Trap、AZD2171、AMG-706、舒尼替尼(SU11248)、索拉替尼(BAY43-9006)、AE-941(Neovastat)、瓦他拉尼(PTK787/ZK222584)及其组合。在某些实施方案中，该受试者是高加索人受试者。
在其他实施方案中，步骤(d)包括当与所述对照蛋白和/或对照样品相比，cMet蛋白和/或HER3蛋白的表达水平和/或活化水平各自独立地低或不可检测并且EGFR(HER1)蛋白的表达(例如，总计)水平及活化(例如，磷酸化)水平高时，确定不应当向受试者施用cMet抑制剂。在这些具体实施方案中，该方法可以还包括当受试者的肿瘤样品显示出这种表达/活化谱时，确定应当施用EGFR抑制剂。EGFR抑制剂的非限制性例子包括西妥昔单抗、帕尼单抗、马妥珠单抗、尼妥珠单抗、ErbB1疫苗、厄洛替尼、吉非替尼、ARRY-334543、AEE788、BIBW2992、EKB569、CL-387-785、CUDC-101、AV-412及其组合。在某些实施方案中，该受试者是亚洲人受试者。
如本文所述，可以用邻近双重检测测定法(proximity dual detectionassay)如协同酶增强反应性免疫测定法(CEER)检测和定量分析物的表达水平和/或活化水平。在具体的实施方案中，检测和定量的分析物表达水平和/或活化水平可以以RFU值表述，其中可以将所述RFU值描述例如为“低”、“中等”或“高”。
在另一个方面，本发明提供一种用于监测受试者中涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤的状态或监测具有这种恶性肿瘤的患者如何对疗法做出反应的方法，该方法包括：
(a)检测和/或定量cMet蛋白在取自所述受试者的样品中的表达水平和/或活化水平的系列变化；
(b)检测和/或定量HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平的系列变化；并且
(c)将cMet蛋白和/或HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平与(i)对照蛋白随时间推移的表达水平和/或活化水平和/或(ii)cMet蛋白和/或HER3蛋白在对照样品中随时间推移的表达水平和/或活化水平比较，
其中cMet蛋白和/或HER3蛋白随时间推移的增加表达水平和/或活化水平指示病情进展或对所述疗法消极应答，和
其中cMet蛋白和/或HER3蛋白随时间推移的减少表达水平和/或活化水平指示疾病缓解或对所述疗法积极应答。
在某些实施方案中，本发明包括一种监测恶性癌症在患者中状态的方法，其中所述患者可以接受或可以不接受抗癌疗法。在具体方面，该方法包括检测和定量在取自患者的肿瘤组织样品中cMet和HER3蛋白随时间推移的表达和/或活化水平，其中所述患者患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤。在某些情况下，来自用本发明方法验定的患者的一系列肿瘤组织样品由临床医生评价，以监测患者肿瘤的变化。在某些情况下，当cMet蛋白和/或HER3蛋白的表达和/或活化水平随时间推移增加时，表达/活化谱可以指示病情进展或对抗癌疗法的阴性反应。病情进展一般对应出现疾病(例如，癌症)的额外体征或症状。对疗法的阴性反应描述这样一种情况，其中接受治疗的患者遭遇病情进展或疾病症状恶化。其他情况下，当cMet蛋白和/或HER3蛋白的表达和/或活化水平随时间推移减低时，表达/活化谱可以指示疾病消退或对抗癌疗法的阳性反应。疾病缓解或对疗法的阳性反应一般与患者的疾病状态改善相关。它可以表明具体的抗癌疗法成功减轻疾病的体征或症状。
在某些实施方案中，特定目的分析物的表达或活化水平可以对应于与阴性对照(如IgG对照(即，对照蛋白))相比、与针对所述目的分析物所产生的标准曲线相比、与阳性对照如泛CK对照(即，对照蛋白)相比、与抗癌药物(即，对照样品)存在下所测定的表达或活化水平相比和/或与抗癌药物(即，对照样品)不存在下所测定的表达或活化水平相比的表达或活化水平。在某些方面，对照样品可以是不含涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤的细胞系或组织样品。
在一些实施方案中，当与一种疗法(如抗癌药物)不存在的情况下相比，一种或多种分析物至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%更多或更少地活化时，认为所述分析物的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平在这种疗法(例如，抗癌药物)存在的情况下“改变”。在其它实施方案中，当与一种疗法(如抗癌药物)不存在的情况下相比，一种或多种分析物至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%更少地活化时，认为所述分析物的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平在这种疗法存在的情况下“实质地下降”。在另外的其他实施方案中，(1)当出现分析物在一种疗法不存在下从“高”或“中等至高”表达和/或活化至所述分析物在这种疗法存在下“低”、“弱”或“可检测”表达和/或活化的变化时，或(2)当出现所述分析物在一种疗法不存在下从“中等”表达和/或活化至所述分析物在这种疗法存在下“低”、“弱”或“非常弱”表达和/或活化的变化时，认为所述分析物的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平在所述疗法(如抗癌药物)存在的情况下“实质地下降”。
在其他实施方案中，将一种或多种分析物的表达水平和/或活化水平表述为与特定目的分析物的信号强度对应的相对荧光单元(RFU)值，其中使用例如邻近测定法(如本文所述的协同酶增强反应性免疫测定法(CEER))测定所述信号强度。在另外的其他实施方案中，通过针对标准曲线校正或归一化例如使用邻近测定法(如CEER所测定)的RFU值，将一种或多种分析物的表达水平和/或活化水平定量，其中针对特定的目的分析物产生所述标准曲线。在某些情况下，可以基于标准曲线计算RFU值。
在另外的其他实施方案中，将一种或多种分析物的表达水平和/或活化水平表述为与特定目的分析物的信号强度对应的相对荧光单元(RFU)值，其中使用例如邻近测定法(如CEER))测定所述信号强度。在其他实施方案中，将一种或多种分析物的表达水平和/或活化水平表述为与特定目的分析物的增加信号强度对应的“低”、“中等”或“高”，其中使用例如邻近测定法(如CEER)测定所述信号强度。在一些情况下，例如使用邻近测定法(如CEER)所测定的特定目的分析物的不可检测或最小可检测表达或活化水平可以表述为“不可检测”。在其他情况下，例如使用邻近测定法(如CEER)所测定的特定目的分析物的低表达或活化水平可以表述为“低”。在另外的其他情况下，例如使用邻近测定法(如CEER)所测定的特定目的分析物的中等表达或活化水平可以表述为“中等”。在另外的其他情况下，例如使用邻近测定法(如CEER)所测定的特定目的分析物的中等至高表达或活化水平可以表述为“中等至高”。在其他情况下，例如使用邻近测定法(如CEER)所测定的特定目的分析物的极高表达或活化水平可以表述为“高”。
在某些实施方案中，当特定目的分析物的表达水平或活化水平表述为“低”、“中等”或“高”时，特定目的分析物的表达水平或活化水平可以例如与阴性对照(如IgG对照)相比时、与针对所述目的分析物所产生的标准曲线相比时、与阳性对照如泛CK对照相比时、与抗癌药物存在下所测定的表达或活化水平相比时和/或与抗癌药物不存在下所测定的表达或活化水平相比时，对应于至少是约0；5000；10000；15000；20000；25000；30000；35000；40000；45000；50000；60000；70000；80000；90000；100000RFU的表达或活化水平。在一些情况下，相关性是分析物特异性的。作为一个非限制性例子，与参比表达或活化水平相比时，例如使用邻近测定法(如CEER)所测定的“低”水平表达或活化可以在表达或活化方面对一种分析物而言对应于10000RFU，并且对于另一种分析物而言，对应于50000RFU。
在某些实施方案中，特定目的分析物的表达或活化水平可以对应于称作“低”、“中等”或“高”的表达或活化水平，后者是相对于参比表达水平或活化水平而言的，例如与阴性对照(如IgG对照)相比时、与针对所述目的分析物所产生的标准曲线相比时、与阳性对照如泛CK对照相比时、与抗癌药物存在下所测定的表达或活化水平相比时和/或与抗癌药物不存在下所测定的表达或活化水平相比时。在一些情况下，相关性是分析物特异性的。作为一个非限制性例子，与参比表达或活化水平相比时，例如使用邻近测定法(如CEER)所测定的“低”水平表达或活化可以在表达或活化方面对一种分析物而言对应于2倍增加，并且对于另一种分析物而言，对应于5倍增加。
在具体的实施方案中，所述疗法包括用cMet抑制剂治疗。在一些实施方案中，这种cMet抑制剂选自多重激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和单克隆抗体。在特定方面，多重激酶抑制剂(例如，泛HER抑制剂)是阻断多种激酶(如但不限于cMet、RON、EGFR、HER2、HER3、VEGFR1、VEGR2、VEGFR3、PI3K、SHC、p95HER2、IGF-1R和c-Kit)的药物。在其他方面，酪氨酸激酶抑制剂是阻断一种或多种酪氨酸激酶(如但不限于cMet、RON、EGFR、HER2、HER3、VEGFR1、VEGR2和/或VEGFR3)的药物。可以在本发明中使用的小分子酪氨酸激酶抑制剂的非限制性例子包括吉非替尼(易瑞沙
Figure BDA00003704294600381
)、厄洛替尼(特罗凯)、培利替尼、CP-654577、CP-724714、卡纽替尼(CI1033)、HKI-272、拉帕替尼(GW-572016；
Figure BDA00003704294600383
)、PKI-166、AEE788、BMS-599626、HKI-357、BIBW2992、ARRY-334543、JNJ-26483327和JNJ-26483327；及其组合。用于本发明中的单克隆抗体的非限制性例子包括曲妥珠单抗
Figure BDA00003704294600391
培妥珠单抗(2C4)、阿伦珠单抗
Figure BDA00003704294600392
贝伐珠单抗
Figure BDA00003704294600393
西妥昔单抗(爱必妥
Figure BDA00003704294600394
)、吉妥珠单抗
Figure BDA00003704294600395
帕尼单抗(VectibixTM)、利妥昔单抗
Figure BDA00003704294600396
和托西莫单抗
Figure BDA00003704294600397
及其组合。上文描述了泛HER抑制剂、HER2抑制剂、EGFR抑制剂和VEGFR抑制剂的非限制性例子。
调节cMet活性的非限制性例子化合物在本文中描述并且包括单克隆抗体、小分子抑制剂及其组合。在优选的实施方案中，调节cMet的化合物抑制cMet活性和/或阻断cMet信号传导，例如，是一种cMet抑制剂。cMet抑制剂的例子包括但不限于单克隆抗体，如AV299、L2G7、AMG102、DN30、OA-5D5和MetMAb；和cMet的小分子抑制剂，如ARQ197、AMG458、BMS-777607、XL184、XL880、INCB28060、E7050、GSK1363089/XL880、K252a、LY2801653、MP470、MGCD265、MK-2461、NK2、NK4、SGX523、SU11274、SU5416、PF-04217903、PF-02341066、PHA-665752、JNJ-38877605；及其组合。
在优选的实施方案中，受试者患有涉及异常cMet信号传导的恶性癌症。在某些情况下，涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤是乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌或其组合。在某些其他情况下，涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)。
在另一个方面，本发明提供一种用于监测患者中恶性肿瘤状态或监测具有这种恶性肿瘤的患者如何对疗法做出反应的方法。在具体的情况下，该疾病在患者中的状态可以对应于疾病缓解或对疗法的阳性反应，其中将所述疾病(例如，癌症)的症状评价并且使其与临床定义的患者结局(例如，临床结果)相关。临床结果的非限制性例子包括应答率(RR)、完全应答(CR)、部分应答(PR)、稳定疾病(SD)、直至进展的时间(TTP)、无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。应答率包括对于治疗疾病的规定疗法存在阳性反应如肿瘤收缩或消失的患者的百分比。完全应答包括由对应于治疗一段时间后癌症的全部体征消失所描述的临床终点。例如，如果在时间或疗程结束时，不存在可以通过测量症状控制和生活质量(如通过检验、X射线和扫描进行)或分析该疾病的生物标志物来鉴定的残存疾病，则患者在本文中描述为显示对疗法完全应答。在某些情况下，完全应答是全部肿瘤损害消失(见，国家癌症研究RECIST，2009年1月更新)。在另一方面，部分应答包括描述在治疗一段时间后癌症的一些但并非全部体征消失的临床终点。例如，如果在时间或疗程结束时，存在可以通过测量症状控制和生活质量(如通过检验、X射线和扫描进行)或分析该疾病的生物标志物来鉴定的某些可检测残存疾病，则患者在本文中描述为显示对疗法部分反应。在某些情况下，部分应答包括肿瘤损害的最长直径的总和下降30%(见，国家癌症研究RECIST，2009年1月更新)。病情稳定包括癌症中以不出现新肿瘤和现存已知肿瘤的尺寸无明显变化为特征的临床终点。根据RECIST，将病情稳定定义为不符合完全应答、部分应答和进展性病情(其定义为肿瘤损害的最长直径的总和增加20%)之规定的小变化。直至进展的时间(TTP)包括在诊断或治疗疾病后直至病情开始恶化(例如，出现新肿瘤、肿瘤尺寸增加；生活质量变化，或症状控制变化)的时间量度。无进展生存期(PFS)包括在治疗疾病期间和之后患者在患病情况下存活而没有该疾病额外症状的时间长度。总生存期(OS)包括一种描述患者的临床终点，其中所述患者在经诊断患有疾病如癌症或因其而治疗后存活定义的时间段。
在一些实施方案中，途径定向疗法包括在癌细胞中干扰活化的信号转导途径组分的功能的药剂。这类药剂的非限制性例子包括下表1中列出的那些。
表1
Figure BDA00003704294600411
Figure BDA00003704294600421
Figure BDA00003704294600431
Figure BDA00003704294600441
Figure BDA00003704294600451
在某些实施方案中，途径定向疗法包括抗信号传导剂(即，细胞生长抑制药)如单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂；抗增殖剂；化疗药(即，细胞毒药物)；激素治疗药；放疗药；疫苗；和/或具有减少或消除异常细胞(如癌细胞)失控生长的能力的任何其他化合物。在一些实施方案中，受试者用与至少一种化疗药组合的一种或多种抗信号传导药、抗增殖剂和/或激素治疗药治疗。
适用于本发明中的抗信号传导药的例子包括但不限于单克隆抗体，如曲妥珠单抗培妥珠单抗(2C4)、阿伦珠单抗
Figure BDA00003704294600453
贝伐珠单抗
Figure BDA00003704294600454
西妥昔单抗(爱必妥
Figure BDA00003704294600455
)、吉妥珠单抗帕尼单抗(VectibixTM)、利妥昔单抗
Figure BDA00003704294600457
托西莫单抗AV299、L2G7、AMG102、DN30、OA-5D5和MetMAb；酪氨酸激酶抑制剂，如吉非替尼(易瑞沙
Figure BDA00003704294600459
)、舒尼替尼(索坦
Figure BDA00003704294600461
)、厄洛替尼(特罗凯
Figure BDA00003704294600462
)、拉帕替尼(GW-572016；
Figure BDA00003704294600463
)、卡纽替尼(CI1033)、semaxinib(SU5416)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584)、索拉替尼(BAY43-9006；多吉美
Figure BDA00003704294600464
)、甲磺酸伊马替尼
Figure BDA00003704294600465
来福米特(leflunomide)(SU101)、凡德他尼(ZACTIMATM；ZD6474)、培利替尼、CI-1033、CL-387-785、CP-654577、CP-724714、CUDC-101、HKI-272、HKI-357、PKI-166、ARQ197、AMG458、AEE788、BMS-599626、BMS-690154、HKI-357、BIBW2992、EKB569、HM781-36B、ARRY-380、ARRY-334543、AV-412、BMS-777607、XL184、XL880、INCB28060、E7050、GSK1363089/XL880、K252a、LY2801653、MP470、MGCD265、MK-2461、NK2、NK4、SGX523、SU11274、SU5416、PF-04217903、JNJ-38877605PHA-665752、PF-00299804、PF-02341066、JNJ-26483327和JNJ-26483327；及其组合。
示例性抗增殖剂包括mTOR抑制剂如西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素)、坦罗莫司(CCI-779)、依维莫司(RAD001)、BEZ235和XL765；AKT抑制剂如1L6-羟甲基-螺-肌醇-2-(R)-2-O-甲基-3-O-十八基-sn-甘油基碳酸酯、9-甲氧基-2-甲基椭圆玫瑰树碱
Figure BDA00003704294600466
乙酸酯、1,3-二氢-1-(1-((4-(6-苯基-1H-咪唑并[4,5-g]喹
Figure BDA00003704294600467
啉-7-基)苯基)甲基)-4-哌啶基)-2H-苯并咪唑-2-酮、10-(4′-(N-二乙基氨基)丁基)-2-氯吩
Figure BDA00003704294600468
嗪、3-甲酰基色酮硫代半卡巴腙(Cu(II)Cl2络合物)、API-2(源自原癌基因TCL1氨基酸10-24的15-mer肽)(Hiromura等人,J.Biol.Chem.,279:53407-53418(2004)、KP372-1以及在Kozikowski等人,J.Am.Chem.Soc.,125:1144-1145(2003)和Kau等人,Cancer Cell,4:463-476(2003)中描述的化合物；PI3K抑制剂如PX-866、渥曼青霉素、LY294002、槲皮素、柠檬酸河豚毒素盐、硫丙咪胺马来酸、GDC-0941(957054-30-7)、IC87114、PI-103、PIK93、BEZ235(NVP-BEZ235)、TGX-115、ZSTK474、(-)-鱼藤素、NU7026、杨梅黄酮、坦度替尼、GDC-0941双甲磺酸盐、GSK690693、KU-55933、MK-2206、OSU-03012、哌立福新、曲西立滨、XL-147、PIK75、TGX-221、NU7441、PI828、XL-765和WHI-P154；MEK抑制剂如PD98059、ARRY-162、RDEA119、U0126、GDC-0973、PD184161、AZD6244、AZD8330、PD0325901和ARRY-142886；及其组合。
泛HER抑制剂的非限制性例子包括PF-00299804、奈拉替尼(HKI-272)、AC480(BMS-599626)、BMS-690154、PF-02341066、HM781-36B、CI-1033、BIBW-2992及其组合。
化疗药的非限制性例子包括铂基药物(例如，奥沙利铂、顺铂、卡铂、螺铂、异丙铂、沙铂等)、烷基化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仓、氮芥、乌拉莫司汀、塞替派、亚硝基脲等)、抗代谢药(例如，5-氟尿嘧啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨
Figure BDA00003704294600471
培美曲塞
Figure BDA00003704294600472
雷替曲塞等)、植物生物碱(例如，长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、鬼臼毒素、紫杉醇
Figure BDA00003704294600473
多西紫杉醇
Figure BDA00003704294600474
等)、拓扑异构酶抑制剂(例如，依立替康、拓扑替康、安吖啶、依托泊苷(VP16)、依托泊苷磷酸、替尼泊苷等)、抗肿瘤抗生素(例如，多柔比星、阿霉素、佐柔比星、表柔比星、放线菌素D、博来霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普利霉素等)、其可药用盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物及其组合。
激素治疗药的例子包括但不限于芳香酶抑制剂(例如，氨鲁米特、阿那曲唑
Figure BDA00003704294600475
来曲唑
Figure BDA00003704294600476
伏氯唑、依西美坦(
Figure BDA00003704294600477
4-雄甾烯-3,6,17-三酮(6-OXO)、1,4,6-雄甾三烯-3,17-二酮(ATD)、福美坦
Figure BDA00003704294600478
等)、选择性***受体调节物(例如，巴多昔芬、氯米芬、氟维司群、拉索昔芬、雷洛昔芬、他莫昔芬、托瑞米芬等)、类固醇(例如，***)、非那雄胺和促性腺素释放激素激动剂(GnRH)如戈舍瑞林、其可药用盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物及其组合。
可用于本发明中的癌疫苗的非限制性例子包括来自Active Biotech的ANYARA、来自Northwest Biotherapeutics的DCVax-LB、来自IDMPharma的EP-2101、来自Pharmexa的GV1001、来自IderaPharmaceuticals的IO-2055、来自Introgen Therapeutics的INGN 225和来自Biomira/Merck的Stimuvax的任一种。
放疗药的例子包括但不限于放射性核素如47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At和212Bi，任选地与针对肿瘤抗原的抗体缀合。
调节HER2活性的非限制性例子化合物在本文中描述并且包括单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂及其组合。在优选的实施方案中，调节HER2的化合物抑制HER2活性和/或阻断HER2信号传导，例如，是一种HER2抑制剂。HER2抑制剂的例子包括但不限于单克隆抗体如曲妥珠单抗
Figure BDA00003704294600481
Figure BDA00003704294600482
和培妥珠单抗(2C4)；小分子酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼(易瑞沙
Figure BDA00003704294600483
)、厄洛替尼(特罗凯
Figure BDA00003704294600484
)、培利替尼、CP-654577、CP-724714、卡纽替尼(CI1033)、HKI-272、拉帕替尼(GW-572016；
Figure BDA00003704294600485
)、PKI-166、AEE788、BMS-599626、HKI-357、BIBW2992、ARRY-380、ARRY-334543、CUDC-101、JNJ-26483327和JNJ-26483327；及其组合。在其他实施方案中，调节HER2的化合物激活HER2途径，例如，是一种HER2激活物。
调节cMet活性的非限制性例子化合物在本文中描述并且包括单克隆抗体、小分子抑制剂及其组合。在优选的实施方案中，调节cMet的化合物抑制cMet活性和/或阻断cMet信号传导，例如，是一种cMet抑制剂。cMet抑制剂的例子包括但不限于单克隆抗体，如AV299、L2G7、AMG102、DN30、OA-5D5和MetMAb；cMet的小分子抑制剂，如ARQ197、AMG458、BMS-777607、XL184、XL880、INCB28060、E7050、GSK1363089/XL880、K252a、LY2801653、MP470、MGCD265、MK-2461、NK2、NK4、SGX523、SU11274、SU5416、PF-04217903、PF-02341066、PHA-665752和JNJ-38877605；及其组合。
在某些实施方案中，步骤(c)中所确定的一种或多种分析物(例如，一种或多种HER3和/或cMet信号传导途径组分)的参比表达或活化水平从来自不患有癌症(如非小细胞肺癌)的健康个体的正常细胞(如非癌细胞)获得。在某些其他实施方案中，步骤(c)中所确定的一种或多种分析物(例如，一种或多种HER3和/或cMet信号传导途径组分)的参比表达或活化水平从来自样品的肿瘤细胞(如非小细胞肺癌细胞)获得，所述样品来自患有癌症(如非小细胞肺癌)的患者。
在一些实施方案中，步骤(c)中所确定的一种或多种分析物(例如，一种或多种HER3和/或cMet信号传导途径组分)的参比表达或活化水平从未经所述抗癌药物处理过的细胞(例如，肿瘤细胞，如从患者样品获得的恶性癌细胞)获得。在具体的实施方案中，未经所述抗癌药物处理过的细胞从用来产生细胞提取物的分离细胞(例如，待探查的测试细胞)的相同样品中获得。在某些情况下，与参比表达或活化水平相比存在一种或多种分析物(例如，一种或多种HER3和/或cMet信号传导途径组分)的较低表达或活化水平指示抗癌药物适于治疗涉及异常cMet信号传导的恶性癌症(例如，恶性肿瘤具有增加的对所述抗癌药物反应的可能性)。在某些其他情况下，与参比表达或活化水平相比存在一种或多种分析物(例如，一种或多种HER3和/或cMet信号传导途径组分)的相同、相似或更高表达或活化水平指示抗癌药物不适于治疗涉及异常cMet信号传导的恶性癌症(例如，恶性肿瘤具有降低的对所述抗癌药物反应的可能性)。
在备选实施方案中，步骤(c)中所确定的一种或多种分析物(例如，一种或多种HER3和/或cMet信号传导途径组分)的参比表达或活化水平从对抗癌药物敏感的经所述抗癌药物处理的细胞获得。在这类实施方案中，与参比表达或活化水平相比存在一种或多种分析物(例如，一种或多种HER3和/或cMet信号传导途径组分)的相同、相似或更低表达或活化水平指示抗癌药物适于治疗涉及异常cMet信号传导的恶性癌症(例如，恶性肿瘤具有增加的对所述抗癌药物反应的可能性)。在某些其他实施方案中，步骤(c)中所确定的一种或多种分析物(例如，一种或多种HER3和/或cMet信号传导途径组分)的参比表达或活化水平从对抗癌药物耐受的经所述抗癌药物处理的细胞获得。在这类实施方案中，与参比表达或活化水平相比存在一种或多种分析物(例如，一种或多种HER3和/或cMet信号传导途径组分)的相同、相似或更高表达或活化水平指示抗癌药物不适于治疗涉及异常cMet信号传导的恶性癌症(例如，恶性肿瘤具有降低的对所述抗癌药物反应的可能性)。
在某些实施方案中，认为在步骤(a)和(b)中所检测到并定量的一种或多种分析物(例如，一种或多种HER3和/或cMet信号传导途径组分)的较高表达或活化水平在样品(例如，细胞提取物)中存在，此时所述表达或活化水平至少约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或100倍高于(例如，约1.5-3、2-3、2-4、2-5、2-10、2-20、2-50、3-5、3-10、3-20、3-50、4-5、4-10、4-20、4-50、5-10、5-15、5-20或5-50倍高于相应分析物在未经抗癌药物处理的细胞(例如，从患者样品获得的恶性癌细胞)、在经抗癌药物处理的抗癌药物敏感的细胞中或在经抗癌药物处理的抗癌耐药性细胞中的参比表达或活化水平。
在其他实施方案中，认为在步骤(a)和(b)中所检测到并定量的一种或多种分析物(例如，一种或多种HER3和/或cMet信号传导途径组分)的较低表达或活化水平在样品(例如，细胞提取物)中存在，此时所述表达或活化水平至少约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或100倍低于(例如，约1.5-3、2-3、2-4、2-5、2-10、2-20、2-50、3-5、3-10、3-20、3-50、4-5、4-10、4-20、4-50、5-10、5-15、5-20或5-50倍低于相应分析物在未经抗癌药物处理的细胞(例如，从患者样品获得的恶性癌细胞)、在经抗癌药物处理的抗癌药物敏感的细胞中或在经抗癌药物处理的抗癌耐药性细胞中的参比表达或活化水平。
可以利用本发明探查的信号转导分子和途径的非限制性例子包括表2中显示的那些。
表2
Figure BDA00003704294600511
Figure BDA00003704294600531
Figure BDA00003704294600541
可以在样品(如细胞提取物)中探查表达(例如，总量)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平的分析物(如信号转导分子)的非限制性例子包括受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶信号传导级联组分、核激素受体、核受体共激活因子、核受体阻遏蛋白及其组合。
在一个实施方案中，本发明的方法包括确定以下分析物之一在细胞提取物中的表达(例如，总量)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平：(1)HER1/EGFR/ErbB1；(2)HER2/ErbB2；(3)p95HER2；(4)HER3/ErbB3；(5)cMet；(6)截短的cMet；(7)HGF/SF；(8)PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)；(9)Shc；(10)Akt；(11)p70S6K；(12)VEGFR(例如，VEGFR1，VEGFR2，和/或VEGFR3)；和(13)截短的HER3。
在另一个实施方案中，本发明包括确定以下成对的两种分析物之一对在细胞提取物中的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平，其中“1”=HER1，“2”=HER2，“3”=p95HER2，“4”=HER3，“5”=cMet，“6”=截短的cMet，“7”=HGF/SF，“8”=PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)，“9”=Shc，“10”=Akt，“11”=p70S6K，“12”=VEGFR(例如，VEGFR1、2和/或3)，和“13”=截短的HER3：1,2；1,3；1,4；1,5；1,6；1,7；1,8；1,9；1,10；1,11；1,12；1,13；2,3；2,4；2,5；2,6；2,7；2,8；2,9；2,10；2,11；2,12；2,13；3,4；3,5；3,6；3,7；3,8；3,9；3,10；3,11；3,12；3,13；4,5；4,6；4,7；4,8；4,9；4,10；4,11；4,12；4,13；5,6；5,7；5,8；5,9；5,10；5,11；5,12；5,13；6,7；6,8；6,9；6,10；6,11；6,12；6,13；7,8；7,9；7,10；7,11；7,12；7,13；8,9；8,10；8,11；8,12；8,13；9,10；9,11；9,12；9,13；10,11；10,12；10,13；11,12；11,13和12,13。
在又一个实施方案中，本发明包括确定以下成组的三种分析物之一组在细胞提取物中的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平，其中“1”=HER1，“2”=HER2，“3”=p95HER2，“4”=HER3，“5”=cMet，“6”=截短的cMet，“7”=HGF/SF，“8”=PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)，“9”=Shc，“10”=Akt，“11”=p70S6K，“12”=VEGFR(例如，VEGFR1、2和/或3)，和“13”=截短的HER3：1,2,3；1,2,4；1,2,5；1,2,6；1,2,7；1,2,8；1,2,9；1,2,10；1,2,11；1,2,12；1,2,13；1,3,4；1,3,5；1,3,6；1,3,7；1,3,8；1,3,9；1,3,10；1,3,11；1,3,12；1,3,13；1,4,5；1,4,6；1,4,7；1,4,8；1,4,9；1,4,10；1,4,11；1,4,12；1,4,13；1,5,6；1,5,7；1,5,8；1,5,9；1,5,10；1,5,11；1,5,12；1,5,13；1,6,7；1,6,8；1,6,9；1,6,10；1,6,11；1,6,12；1,6,13；1,7,8；1,7,9；1,7,10；1,7,11；1,7,12；1,7,13；1,8,9；1,8,10；1,8,11；1,8,12；1,8,13；1,9,10；1,9,11；1,9,12；1,9,13；1,10,11；1,10,12；1,10,13；1,11,12；1,11,13；1,12,13,2,3,4；2,3,5；2,3,6；2,3,7；2,3,8；2,3,9；2,3,10；2,3,11；2,3,12；2,3,13；2,4,5；2,4,6；2,4,7；2,4,8；2,4,9；2,4,10；2,4,11；2,4,12；2,4,13；2,5,6；2,5,7；2,5,8；2,5,9；2,5,10；2,5,11；2,5,12；2,5,13；2,6,7；2,6,8；2,6,9；2,6,10；2,6,11；2,6,12；2,6,13；2,7,8；2,7,9；2,7,10；2,7,11；2,7,12；2,7,13；2,8,9；2,8,10；2,8,11；2,8,12；2,8,13；2,9,10；2,9,11；2,9,12；2,9,13；2,10,11；2,10,12；2,10,13；2,11,12；2,11,13；2,12,13；3,4,5；3,4,6；3,4,7；3,4,8；3,4,9；3,4,10；3,4,11；3,4,12；3,4,13；3,5,6；3,5,7；3,5,8；3,5,9；3,5,10；3,5,11；3,5,12；3,5,13；3,6,7；3,6,8；3,6,9；3,6,10；3,6,11；3,6,12；3,6,13；3,7,8；3,7,9；3,7,10；3,7,11；3,7,12；3,7,13；3,8,9；3,8,10；3,8,11；3,8,12；3,8,13；3,9,10；3,9,11；3,9,12；3,9,13；3,10,11；3,10,12；3,10,13；3,11,12；3,11,13；3,12,13；4,5,6；4,5,7；4,5,8；4,5,9；4,5,10；4,5,11；4,5,12；4,5,13；4,6,7；4,6,8；4,6,9；4,6,10；4,6,11；4,6,12；4,6,13；4,7,8；4,7,9；4,7,10；4,7,11；4,7,12；4,7,13；4,8,9；4,8,10；4,8,11；4,8,12；4,8,13；4,9,10；4,9,11；4,9,12；4,9,13；4,10,11；4,10,12；4,10,13；4,11,12；4,11,13；4,12,13；5,6,7；5,6,8；5,6,9；5,6,10；5,6,11；5,6,12；5,6,13；5,7,8；5,7,9；5,7,10；5,7,11；5,7,12；5,7,13；5,8,9；5,8,10；5,8,11；5,8,12；5,8,13；5,9,10；5,9,11；5,9,12；5,9,13；5,10,11；5,10,12；5,10,13；5,11,12；5,11,13；5,12,13,6,7,8；6,7,9；6,7,10；6,7,11；6,7,12；6,7,13；6,8,9；6,8,10；6,8,11；6,8,12；6,8,13；6,9,10；6,9,11；6,9,12；6,9,13；6,10,11；6,10,12；6,10,13；6,11,12；6,11,13；6,12,13；7,8,9；7,8,10；7,8,11；7,8,12；7,8,13；7,9,10；7,9,11；7,9,12；7,9,13；7,10,11；7,10,12；7,10,13；7,11,12；7,11,13；7,12,13；8,9,10；8,9,11；8,9,12；8,9,13；8,10,11；8,10,12；8,10,13；8,11,12；8,11,13；8,12,13；9,10,11；9,10,12；9,10,13；9,11,12；9,11,13；9,12,13；10,11,12；10,11,13；10,12,13和11,12,13.
在再一个实施方案中，本发明包括确定以下成组的四种分析物之一组在细胞提取物中的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平，其中“1”=HER1，“2”=HER2，“3”=p95HER2，“4”=HER3，“5”=cMet，“6”=截短的cMet，“7”=HGF/SF，“8”=PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)，“9”=Shc，“10”=Akt，“11”=p70S6K，“12”=VEGFR(例如，VEGFR1、2和/或3)，和“13”=截短的HER3：1,2,3,4；1,2,3,5；1,2,3,6；1,2,3,7；1,2,3,8；1,2,3,9；1,2,3,10；1,2,3,11；1,2,3,12；1,2,3,13；1,3,4,5；1,3,4,6；1,3,4,7；1,3,4,8；1,3,4,9；1,3,4,10；1,3,4,11；1,3,4,12；1,3,4,13；1,4,5,6；1,4,5,7；1,4,5,8；1,4,5,9；1,4,5,10；1,4,5,11；1,4,5,12；1,4,5,13；1,5,6,7；1,5,6,8；1,5,6,9；1,5,6,10；1,5,6,11；1,5,6,12；1,5,6,13；1,6,7,8；1,6,7,9；1,6,7,10；1,6,7,11；1,6,7,12；1,6,7,13；1,7,8,9；1,7,8,10；1,7,8,11；1,7,8,12；1,7,8,13；1,8,9,10；1,8,9,11；1,8,9,12；1,8,9,13；1,9,10,11；1,9,10,12；1,9,10,13；1,10,11,12；1,10,11,13；1,11,12,13；2,3,4,5；2,3,4,6；2,3,4,7；2,3,4,8；2,3,4,9；2,3,4,10；2,3,4,11；2,3,4,12；2,3,4,13；2,4,5,6；2,4,5,7；2,4,5,8；2,4,5,9；2,4,5,10；2,4,5,11；2,4,5,12；2,4,5,13；2,5,6,7；2,5,6,8；2,5,6,9；2,5,6,10；2,5,6,11；2,5,6,12；2,5,6,13；2,6,7,8；2,6,7,9；2,6,7,10；2,6,7,11；2,6,7,12；2,6,7,13；2,7,8,9；2,7,8,10；2,7,8,11；2,7,8,12；2,7,8,13；2,8,9,10；2,8,9,11；2,8,9,12；2,8,9,13；2,9,10,11；2,9,10,12；2,9,10,13；2,10,11,12；2,10,11,13；2,11,12,13；3,4,5,6；3,4,5,7；3,4,5,8；3,4,5,9；3,4,5,10；3,4,5,11；3,4,5,12；3,4,5,13；3,5,6,7；3,5,6,8；3,5,6,9；3,5,6,10；3,5,6,11；3,5,6,12；3,5,6,13；3,6,7,8；3,6,7,9；3,6,7,10；3,6,7,11；3,6,7,12；3,6,7,13；3,7,8,9；3,7,8,10；3,7,8,11；3,7,8,12；3,7,8,13；3,8,9,10；3,8,9,11；3,8,9,12；3,8,9,13；3,9,10,11；3,9,10,12；3,9,10,13；3,10,11,12；3,10,11,13；3,11,12,13；4,5,6,7；4,5,6,8；4,5,6,9；4,5,6,10；4,5,6,11；4,5,6,12；4,5,6,13；4,6,7,8；4,6,7,9；4,6,7,10；4,6,7,11；4,6,7,12；4,6,7,13；4,7,8,9；4,7,8,10；4,7,8,11；4,7,8,12；4,7,8,13；4,8,9,10；4,8,9,11；4,8,9,12；4,8,9,13；4,9,10,11；4,9,10,12；4,9,10,13；4,10,11,12；4,10,11,13；4,11,12,13；5,6,7,8；5,6,7,9；5,6,7,10；5,6,7,11；5,6,7,12；5,6,7,13；5,7,8,9；5,7,8,10；5,7,8,11；5,7,8,12；5,7,8,13；5,8,9,10；5,8,9,11；5,8,9,12；5,8,9,13；5,9,10,11；5,9,10,12；5,9,10,13；5,10,11,12；5,10,11,13；5,11,12,13；6,7,8,9；6,7,8,10；6,7,8,11；6,7,8,12；6,7,8,13；6,8,9,10；6,8,9,11；6,8,9,12；6,8,9,13；6,9,10,11；6,9,10,12；6,9,10,13；6,10,11,12；6,10,11,13；6,11,12,13；7,8,9,10；7,8,9,11；7,8,9,12；7,8,9,13；7,9,10,11；7,9,10,12；7,9,10,13；7,10,11,12；7,10,11,13；7,11,12,13；8,9,10,11；8,9,10,12,8,9,10,13；8,10,11,12；8,10,11,13；8,11,12,13；9,10,11,12；9,10,11,13；9,11,12,13和10,11,12,13.
在另一个实施方案中，本发明包括确定五种以下分析物的任何可能组合的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平：“1”=HER1，“2”=HER2，“3”=p95HER2，“4”=HER3，“5”=cMet，“6”=截短的cMet，“7”=HGF/SF，“8”=PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)，“9”=Shc，“10”=Akt，“11”=p70S6K，“12”=VEGFR(例如，VEGFR1、2和/或3)，和“13”=截短的HER3。作为非限制性例子，5种分析物的组合可以包含以下之一组：1,2,3,4,5；2,3,4,5,6；3,4,5,6,7；4,5,6,7,8；5,6,7,8,9；6,7,8,9,10；7,8,9,10,11；8,9,10,11,12或者9,10,11,12,13。
在又一个实施方案中，本发明包括确定六种以下分析物的任何可能组合的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平：“1”=HER1，“2”=HER2，“3”=p95HER2，“4”=HER3，“5”=cMet，“6”=截短的cMet，“7”=HGF/SF，“8”=PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)，“9”=Shc，“10”=Akt，“11”=p70S6K，“12”=VEGFR(例如，VEGFR1、2和/或3)，和“13”=截短的HER3。作为非限制性例子，6种分析物的组合可以包含以下之一组：1,2,3,4,5,6；2,3,4,5,6,7；3,4,5,6,7,8；4,5,6,7,8,9；5,6,7,8,9,10；6,7,8,9,10,11；7,8,9,10,11,12或者8,9,10,11,12,13。
仍在又一个实施方案中，本发明包括确定七种以下分析物的任何可能组合的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平：“1”=HER1，“2”=HER2，“3”=p95HER2，“4”=HER3，“5”=cMet，“6”=截短的cMet，“7”=HGF/SF，“8”=PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)，“9”=Shc，“10”=Akt，“11”=p70S6K，“12”=VEGFR(例如，VEGFR1、2和/或3)，和“13”=截短的HER3。作为非限制性例子，7种分析物的组合可以包含以下之一组：1,2,3,4,5,6,7；2,3,4,5,6,7,8；3,4,5,6,7,8,9；4,5,6,7,8,9,10；5,6,7,8,9,10,11；6,7,8,9,10,11,12或7,8,9,10,11,12,13。
在另一个实施方案中，本发明包括确定八种以下分析物的任何可能组合的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平：“1”=HER1，“2”=HER2，“3”=p95HER2，“4”=HER3，“5”=cMet，“6”=截短的cMet，“7”=HGF/SF，“8”=PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)，“9”=Shc，“10”=Akt，“11”=p70S6K，“12”=VEGFR(例如，VEGFR1、2和/或3)，和“13”=截短的HER3。作为非限制性例子，8种分析物的组合可以包含以下之一组：1,2,3,4,5,6,7,8；2,3,4,5,6,7,8,9；3,4,5,6,7,8,9,10；4,5,6,7,8,9,10,11；5,6,7,8,9,10,11,12或6,7,8,9,10,11,12,13。
在又一个实施方案中，本发明包括确定九种以下分析物的任何可能组合的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平：“1”=HER1，“2”=HER2，“3”=p95HER2，“4”=HER3，“5”=cMet，“6”=截短的cMet，“7”=HGF/SF，“8”=PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)，“9”=Shc，“10”=Akt，“11”=p70S6K，“12”=VEGFR(例如，VEGFR1、2和/或3)，和“13”=截短的HER3。作为非限制性例子，9种分析物的组合可以包含以下之一组：1,2,3,4,5,6,7,8,9；2,3,4,5,6,7,8,9,10；3,4,5,6,7,8,9,10,11；4,5,6,7,8,9,10,11,12或5,6,7,8,9,10,11,12,13。
仍在又一个实施方案中，本发明包括确定十种以下分析物的任何可能组合的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平：“1”=HER1，“2”=HER2，“3”=p95HER2，“4”=HER3，“5”=cMet，“6”=截短的cMet，“7”=HGF/SF，“8”=PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)，“9”=Shc，“10”=Akt，“11”=p70S6K，“12”=VEGFR(例如，VEGFR1、2和/或3)，和“13”=截短的HER3。作为非限制性例子，10种分析物的组合可以包含以下之一组：1,2,3,4,5,6,7,8,9,10；2,3,4,5,6,7,8,9,10,11；3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。
在另一个实施方案中，本发明包括确定十一种以下分析物的任何可能组合的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平：“1”=HER1，“2”=HER2，“3”=p95HER2，“4”=HER3，“5”=cMet，“6”=截短的cMet，“7”=cKit，“8”=PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)，“9”=Shc，“10”=Akt，“11”=p70S6K，“12”=VEGFR(例如，VEGFR1、2和/或3)，和“13”=截短的HER3。作为非限制性例子，11种分析物的组合可以包含以下之一组：1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11；2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。
在又一个实施方案中，本发明包括确定十二种以下分析物的任何可能组合的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平：“1”=HER1，“2”=HER2，“3”=p95HER2，“4”=HER3，“5”=cMet，“6”=截短的cMet，“7”=HGF/SF，“8”=PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)，“9”=Shc，“10”=Akt，“11”=p70S6K，“12”=VEGFR(例如，VEGFR1、2和/或3)，和“13”=截短的HER3。作为非限制性例子，12种分析物的组合可以包含以下之一组：1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。
仍在又一个实施方案中，本发明包括确定全部十三种以下分析物的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平：“1”=HER1，“2”=HER2，“3”=p95HER2，“4”=HER3，“5”=cMet，“6”=截短的cMet，“7”=HGF/SF，“8”=PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)，“9”=Shc，“10”=Akt，“11”=p70S6K，“12”=VEGFR(例如，VEGFR1、2和/或3)，和“13”=截短的HER3。
在一个具体实施方案中，本发明包括确定HER1、HER2、p95HER2、HER3、cMet、截短的cMet和/或截短的HER3的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平。在另一个具体实施方案中，本发明包括确定HER1、HER2、HER3、cMet、IGF1R、HGF/SF、PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)、Shc、截短的cMet和/或截短的HER3的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平。在又一个具体实施方案中，本发明包括确定HER1、HER2、p95HER2、HER3、cMet、IGF1R、HGF/SF、PI3K(例如，PIK3CA和/或PIK3R1)、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR(例如，VEGFR1、2和/或3)、截短的cMet和/或截短的HER3的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平。
在某些实施方案中，本发明还包含确定一种或多种(例如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50种或更多种)额外分析物在细胞提取物中的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平。在一些实施方案中，一种或多种(例如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50种或更多种)额外的分析物包括选自受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶信号传导级联组分、核激素受体、核受体共激活因子、核受体阻遏蛋白及其组合的一种或多种信号转导分子。
在具体的实施方案中，本发明还包含确定一种或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50种或更多种以下额外分析物的任一组合在细胞提取物中的表达(例如，总计)水平和/或活化(例如，磷酸化)水平：HER4、MEK、PTEN、SGK3、4E-BP1、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、PDK1、PDK2、GSK-3β、Raf、SRC、NFkB-IkB、mTOR、EPH-A、EPH-B、EPH-C、EPH-D、FLT-3、TIE-1、TIE-2、c-FMS、Abl、FTL3、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、ER、PR、NCOR、AIB1、RON、PIP2、PIP3、p27、蛋白酪氨酸磷酸酶(例如，PTP1B、PTPN13、BDP1等)、受体二聚体、其他HER3信号传导途径组分、其他cMet信号传导途径组分及其组合。
IV.c-Met介导的癌症
c-Met能在许多恶性肿瘤中过量表达。在c-Met介导的癌症中，已经在酪氨酸激酶结构域、近膜结构域或脑信号蛋白结构域内部鉴定到扩增和/或激活突变。通过评估在治疗剂存在时c-Met的表达水平和/或活化状态，可能选择合适抗癌药物用于治疗c-Met介导的癌症。c-Met的活化导致增加的细胞生长、侵入、血管生成和转移。在某些实施方案中，本发明提供选择适宜治疗策略以抑制c-Met活化和/或过量表达的方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于选择合适抗癌药物用于治疗c-Met介导的癌症(例如，涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤)的方法，所述方法包括：
(a)确定从分离的癌细胞产生的细胞提取物中c-Met和任选地一种或多种额外分析物的表达水平和/或活化水平；和
(b)基于步骤(a)中确定的一种或多种分析物的表达水平和/或活化水平，选择用于治疗c-Met介导的癌症的合适抗癌药物。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于选择合适抗癌药物用于治疗c-Met介导的癌症(例如，涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤)的方法，所述方法包括：
(a)在施用抗癌药物后或在与抗癌药物孵育之前分离癌细胞；
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物；
(c)确定所述细胞提取物中c-Met和任选地一种或多种额外分析物的表达水平和/或活化水平；和
(d)将步骤(c)中所确定的c-Met和任选地一种或多种额外分析物的表达水平和/或活化水平与所述抗癌药物不存在下所生成的c-Met和任选地一种或多种额外分析物的参比表达和/或活化谱比较，以确定所述抗癌药物是否适于或不适于治疗c-Met介导的癌症。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于鉴定c-Met介导的癌症(例如，涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤)对用抗癌药物治疗的反应的方法，所述方法包括：
(a)确定从分离的癌细胞产生的细胞提取物中c-Met和任选地一种或多种额外分析物的表达水平和/或活化水平；和
(b)基于步骤(a)中确定的一种或多种分析物的表达水平和/或活化水平，鉴定c-Met介导的癌症对用抗癌药物治疗的反应。
在一些情况下，本发明提供一种用于鉴定c-Met介导的癌症(例如，涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤)对用抗癌药物治疗的反应的方法，所述方法包括：
(a)在施用抗癌药物后或在与抗癌药物孵育之前分离癌细胞；
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物；
(c)确定所述细胞提取物中c-Met和任选地一种或多种额外分析物的表达水平和/或活化水平；和
(d)将步骤(c)中所确定的c-Met和任选地一种或多种额外分析物的表达水平和/或活化水平与所述抗癌药物不存在下所生成的c-Met和任选地一种或多种额外分析物的参比表达和/或活化谱比较，以鉴定c-Met介导的癌症是否对用所述抗癌药物治疗反应或不反应。
在又一个实施方案中，本发明提供一种用于预测受试者对用抗癌药物治疗的反应的方法，所述受试者患有c-Met介导的癌症(例如，涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤)，所述方法包括：
(a)确定从分离的癌细胞产生的细胞提取物中c-Met和任选地一种或多种额外分析物的表达水平和/或活化水平；和
(b)基于步骤(a)中确定的一种或多种分析物的表达水平和/或活化水平，预测患有c-Met介导的癌症的受试者对用抗癌药物治疗的反应。
在一些情况下，本发明提供一种用于预测受试者对用抗癌药物治疗的反应的方法，所述受试者患有c-Met介导的癌症(例如，涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤)，所述方法包括：
(a)在施用抗癌药物后或在与抗癌药物孵育之前分离癌细胞；
(b)裂解分离的细胞以产生细胞提取物；
(c)确定所述细胞提取物中c-Met和任选地一种或多种额外分析物的表达水平和/或活化水平；和
(d)将步骤(c)中所确定的c-Met和任选地一种或多种额外分析物的表达水平和/或活化水平与所述抗癌药物不存在下所生成的c-Met和任选地一种或多种额外分析物的参比表达和/或活化谱比较，以预测患有c-Met介导的癌症的受试者将对用所述抗癌药物治疗做出反应的可能性。
在又一个实施方案中，本发明提供一种用于监测受试者中c-Met介导的癌症(例如，涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤)的状态或监测患有c-Met介导的癌症的患者如何对疗法做出反应的方法，该方法包括：
(a)确定从分离的癌细胞产生的细胞提取物物中c-Met和任选地一种或多种额外分析物随时间推移的表达水平和/或活化水平，以便检测并且定量cMet蛋白的表达水平和/或活化水平的系列变化；和
(b)基于步骤(a)中确定的一种或多种分析物随时间推移的表达水平和/或活化水平，监测c-Met介导的癌症的状态或患有这种c-Met介导的癌症的患者如何对疗法做出反应。
在一些实施方案中，步骤(b)包括：将步骤(a)中确定的c-Met和任选地一种或多种额外分析物随时间推移的表达水平和/或活化水平与c-Met和任选地一种或多种额外分析物随时间推移的参比表达和/或活化谱比较，以便监测c-Met介导的癌症的状态或患有这种c-Met介导的癌症的患者如何对疗法做出反应，其中步骤(a)中确定的c-Met蛋白和任选地一种或多种额外分析物随时间推移的增加表达水平和/或活化水平表示病情进展或对该疗法阴性反应，并且其中步骤(a)中确定的c-Met蛋白和任选地一种或多种额外分析物随时间推移而降低的表达水平和/或活化水平表示疾病缓解或对该疗法阳性反应。
在某些方面，本发明提供了评价患者样品(如肿瘤组织、循环型肿瘤细胞(CTC)或细针头抽吸物(FNA))中c-Met介导的癌症途径的方法。本文中的方法为患者提供最佳治疗策略。在一个方面，可以筛查或探查以下额外分析物的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种，以确定对c-Met介导的癌症疗法(例如，c-Met抑制剂)的反应：HER1、HER2、p95HER2、HER3、截短的HER3、IGF1R、cKit、PI3K(例如，PIK3CA、PIK3R1)、Shc、Akt(例如，Akt1、Akt2、Akt3)、p70S6K、VEGFR(例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3)、PDGFR(例如，PDGFRA、PDGFRB)、RON及其组合。例如，对XL-880的应答个体具有活化的c-MET和VEGFR2，而非应答个体可以具有活化的RTKs的组合。
在某些其他情况下，本文中提供的方法用于选择联合疗法以便治疗涉及异常c-Met信号传导的恶性癌症。例如，存在活化的c-MET、VEGFR2和EGFR的癌症患者可以成功地用和XL-880的组合治疗，而存在活化的c-MET、VEGFR2、HER1、HER2、p95HER2和HER3的癌症患者可以用
Figure BDA00003704294600652
治疗。
在肿瘤细胞中，认为c-Met活化造成触发多样性信号传导级联系列，导致细胞生长、增殖、侵入和保护免于凋亡。来自细胞模型和动物肿瘤模型的数据表明c-Met介导的癌症的肿瘤发生性的基础性生物学机制一般以三种不同方式实现：(1)建立HGF/c-Met自分泌环；(2)通过c-Met或HGF过量表达；和(3)在c-Met受体编码序列中存在激酶激活的突变。HGF和c-Met的过量表达表明癌症患者中增加的肿瘤侵入性和不良预后征兆。HGF/c-Met信号传导通过在内皮细胞中诱导增殖和移行、通过诱导血管内皮生长因子(VEGF)(一种关键促血管生成因子)表达以及通过大幅度下调血小板应答蛋白1(TSP-1)(一种血管生成负向调节物)而诱导肿瘤血管生成。已经在大多数实体瘤的肿瘤活组织检查样品中观察到HGF和c-Met表达，并且已经在广泛类型的人类恶性肿瘤(包括胃癌、膀胱癌、乳腺癌、颈癌、结直肠癌、胃癌、头颈癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、肾癌和甲状腺癌)中以及在各种肉瘤、造血***恶性肿瘤和黑素瘤中记录到c-Met信号传导。最值得注意地，已经在患有遗传性形式的***状肾癌的患者中阳性鉴定到c-Met的酪氨酸激酶结构域中的激活性突变，这直接暗示c-Met参与人类肿瘤形成。
在某些实施方案中，本发明提供以特异性、多通道、高通量测定法检测源自肿瘤组织的肿瘤细胞或实体瘤的循环型细胞中c-Met和任选地多种失调信号传导分子的表达状态和活化状态的方法。本发明也提供用于选择适宜疗法以下调或关闭一条或多条失调信号传导途径的方法和组合物。因此，本发明的实施方案可以用来基于特定的分子标签促进个性化疗法的设计，其中通过收集给定患者的肿瘤如肺肿瘤(例如，NSCLC)中活化的信号转导蛋白提供所述分子标签。
在一些实施方案中，抗癌药物(例如，适于治疗c-Met介导的癌症如非小细胞肺癌的一种或多种抗癌药物)包括抗信号传导剂(即，细胞生长抑制药)如单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂；抗增殖剂；化疗药(即，细胞毒药物)；激素治疗药；放疗药；疫苗；和/或具有减少或消除异常细胞(如癌细胞)失控生长的能力的任何其他化合物。在一些实施方案中，分离的细胞用与至少一种化疗药组合的一种或多种抗信号传导药、抗增殖剂和/或激素治疗药处理。
在某些实施方案中，抗体如HGF特异性或c-Met特异性抗体阻止配体/受体结合，通过抑制增殖和增强凋亡导致生长抑制和肿瘤消退。在一些情况下，也可以使用单克隆抗体的组合。使用单克隆抗体的策略允许针对HGF/c-Met的排他特异性、与小分子激酶抑制剂相比相对长的比半寿期和激发针对肿瘤细胞的宿主免疫反应的潜力。AMG102是选择性结合并中和HGF的完全人IgG2单克隆抗体，以防止HGF结合至c-Met并随后活化c-Met。当联用时，AMG102已经在体外和在异体移植中显示增强多种标准化疗药如替莫唑胺和多西紫杉醇的作用。MetMAb是一种衍生自激动性单克隆抗体5D5的人源化、一价、拮抗性抗c-Met抗体。MetMAb以高亲和力与c-Met结合并且随c-Met一起留在细胞表面上，防止结合HGF和后续c-Met磷酸化以及下游信号传导活性及细胞反应。最近的临床前研究显示，MetMAb是在人类癌症中作为治疗性抗体有前景的抗c-Met强力抑制剂，尤其与EGFR和/或VEGF抑制剂组合时。
c-Met的小分子抑制剂包括但不限于ARQ197(ArQule)，它是对c-Met受体高度选择的非ATP竞争性药物。其他选择性c-Met抑制剂最近已经进入初步临床评价并且包括：JNJ-38877605(Johnson&Johnson)，其是c-Met的催化活性的小分子ATP-竞争性抑制剂；PF-04217903(Pfizer)，其是c-Met的口服可获得的ATP-竞争性小分子抑制剂，与超过150种蛋白激酶的筛查组(screening panel)相比，对c-Met的选择性大于1000倍；SGX523(SGXPharmaceuticals)，其是c-Met的另一种高度选择性ATP-竞争性抑制剂，与213种蛋白激酶筛选组中的全部其他激酶相比，对c-Met的选择性超过1000倍并且在人异体移植模型中口服给药时显示强力抗肿瘤活性，而无明显毒性。
GSK1363089/XL880(Exelixis)是以0.4nM的IC50靶向c-Met的c-Met的小分子抑制剂的另一个例子。针对c-Met和VEGFR2的结合亲和力均高，在这种激酶中造成构象变化以将XL880更深移动至ATP-结合袋中。对于两种受体，靶上时间是大于24小时。XL880具有良好的口服生物利用率，并且它是CYP450底物，但不是抑制剂或诱导物。两个I期临床试验检验XL880的不同施用方案，基于5日服用/9日停用方案(研究1)或作为每日固定剂量(研究2)。XL880在不同时间点作用于两条用于增殖和存活的协同途径，这已经为肿瘤对初始攻击肿瘤血管生成的反应提供治疗性解决方案。II期试验已经在多个肿瘤类型(包括***状肾癌、胃癌和头颈癌中)启动。
XL184(Exelixis)是一种新的经口施用的小分子抗癌化合物，在临床前模型中，其已经显示强力抑制c-Met和VEGFR2。MP470(SuperGen)是一种新的口服可生物利用的小分子，具有针对c-Met以及几种其他蛋白酪氨酸激酶靶(包括突变形式的c-Kit、突变PDGFRa和突变Flt-3)的抑制活性。MGCD265(Methylgene)在体外强力抑制c-Met，Ron，VEGFRs，和Tie-2酶活性并且已经报道消除HGF依赖性细胞终点，如细胞散布和伤口愈合，以及VEGF依赖性反应如体外血管生成和体内血管通透性。MK-2461(Merck)是c-Met、KDR、FGFR1/2/3和Flt1/3/4的强力抑制剂，它在c-Met组成型磷酸化的存在MET基因放大的临床前模型中特别有活性。MK-2461已经在早I期评价中充分耐受。
在某些情况下，可以通过HGF或c-Met中可以充当诱饵或拮抗剂的亚区域抑制HGF配体与c-Met受体的结合。这些诱饵和拮抗剂以化学计量方式与配体或受体竞争而不导致c-Met活化，因而防止下游途径活化和生物学结果。几种HGF和c-Met变体已经作为拮抗剂在体外和体内实验地验证，并且通过阻断配体结合或防止c-Met二聚化发挥作用。此外，已经开发了显示与HGF竞争c-Met结合的HGF的分子类似物。
V.抗体阵列的构建
在某些方面，使用基于抗体的阵列检测一种或多种(例如，多种)分析物(例如，信号转导分子)在肿瘤细胞(如肺癌细胞)的细胞提取物中的表达水平和/或活化状态，其中所述阵列包含约束于固相支持物上的捕获抗体的稀释系列。该阵列一般包含在不同可寻址位置与固相支持物表面偶联的以一系列捕获抗体浓度存在的多种不同的捕获抗体。
在一个具体实施方案中，本发明提供具有优越动态范围的可寻址阵列，其包含约束于固相支持物的捕获抗体的多个稀释系列，其中每个稀释系列中的捕获抗体是对与信号转导途径组分和其他靶蛋白相对应的一种或多种分析物特异的。在多个方面，这个实施方案包括多种阵列，所述多种阵列包含作为特定肿瘤之特征的信号转导途径(例如，在肺癌细胞中活跃的信号转导途径(例如，c-Met途径))的组分。因此，本发明可以有利地如下实施，其中在单个阵列或芯片上呈现出具有造成癌症的潜在表达或活化缺陷的每种信号转导分子或其他目的蛋白。在一些方面，在特定肿瘤细胞中活跃的给定信号转导途径的组分以线性顺序排列，其中所述线性顺序对应于信息在细胞内部经信号转导途径中继的顺序。这类阵列的例子在本文描述并且也在PCT公开号WO2009/108637的图5-9中显示，所述专利的公开内容出于全部目的通过引用的方式完整并入本文作为参考。对特定肿瘤细胞中活跃的给定信号转导途径的一种或多种组分特异的捕获抗体也可以按随机化方式印刷以便使任何表面相关的人为假象最小化。
固相支持物可以包括用于固定蛋白质的任何适合基底。固相支持物的例子包括但不限于玻璃(例如，载玻片)、塑料、芯片、针、滤器、珠、纸、膜、纤维束、凝胶、金属、陶瓷等。膜如尼龙(BiotransTM,ICN Biomedicals,Inc.(Costa Mesa,CA)；Bio-Rad Laboratories(Hercules,CA))、硝酸纤维素(
Figure BDA00003704294600692
Whatman Inc.(FlorhamPark，NJ))和PVDF(ImmobilonTM,Millipore Corp.(Billerica，MA))适合用作本发明阵列中的固相支持物。优选地，将捕获抗体约束于硝酸纤维素聚合物包被的载玻片上，例如，
Figure BDA00003704294600693
载玻片，其从Whatman Inc.(Florham Park,NJ)可商业获得。
固相支持物的合乎需要的特定方面包括结合大量捕获抗体的能力和在变性最小的情况下结合捕获抗体的能力。另一个合适方面是当含有捕获抗体的抗体溶液施加至载体时，固相支持物显示最小“芯吸(wicking)”。具有最小芯吸的固相支持物允许捕获抗体溶液的少量等分式样应用至支持物以产生固定的捕获抗体的限定小点。
这些捕获抗体一般借助共价或非共价相互作用(例如，离子键、疏水相互作用、氢键、范德瓦尔斯力、偶极-偶极键)直接或间接地约束于固相支持物上。在一些实施方案中，使用同双功能或异双功能交联剂，利用标准交联方法和条件，使捕获抗体与固相支持物共价连接。合适的交联剂从供应商例如，Pierce Biotechnology(Rockford,IL)可商业获得。
用于产生适用于本发明中的阵列的方法包括但不限于用来构建蛋白阵列或核酸阵列的任何技术。在一些实施方案中，使用微量点样器，将捕获抗体点滴到阵列上，所述微量点样器一般是配备开口针(split pin)、钝头针(blunt pin)或喷墨印刷的自动打印机。用于印刷本文所述的抗体阵列的合适自动***包括PixSys 5000 robot(Cartesian Technologies；Irvine,CA)，其具备ChipMaker2开口针(TeleChem International；Sunnyvale,CA)，以及从BioRobics(Woburn,MA)和Packard Instrument Co.(Meriden,CT)可获得的其他自动打印机。优选地，将每种捕获抗体稀释物的至少2、3、4、5或6个复制品点滴到阵列上。
用于产生适用本发明中的阵列的另一种方法包括：通过在有效吸引限定体积的液体到支持物的条件下使毛细管分配器接触到固相支持物上，在每个选择的阵列位置处分配已知体积的捕获抗体稀释物，其中，在每个选择的阵列位置使用选择的捕获抗体稀释物重复这个过程以产生完整阵列。这种方法可以按形成多个此类阵列的方式实施，其中将放置溶液步骤在每种重复循环应用至多个固相支持物的每一者上的选定位置。可以例如在美国专利号5,807,522中找到这种方法的进一步描述。
在某些情况下，用于在纸上印刷的装置可以用来产生抗体阵列。例如，可以将所需的捕获抗体稀释物加载至台式喷墨打印机的打印头中并且印刷到合适的固相支持物上(见，例如，Silzel等人,Clin.Chem.,44:2036-2043(1998))。
在一些实施方案中，在固相支持物上产生的阵列具有至少约5点/cm2和优选地至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000或9000或10000点/cm2的密度。
在某些情况下，固相支持物上的点各自代表不同的捕获抗体。在某些其他情况下，固相支持物上的多个点代表相同的捕获抗体，例如，包含一系列递降捕获抗体浓度的稀释系列。
用于固相支持物上制备和构建抗体阵列的方法的额外例子在美国专利号6,197,599、6,777,239、6,780,582、6,897,073、7,179,638和7,192,720；美国专利公开号20060115810、20060263837、20060292680和20070054326；以及Varnum等人,Methods Mol.Biol.,264:161-172(2004)中描述。
用于扫描抗体阵列的方法是本领域已知的并且包括但不限于用来扫描蛋白质阵列或核酸阵列的任何技术。适用本发明中的微阵列扫描仪从PerkinElmer(Boston,MA)、Agilent Technologies(Palo Alto,CA)、AppliedPrecision(Issaquah,WA)、GSI Lumonics Inc.(Billerica,MA)和AxonInstruments(Union City,CA)可获得。作为一个非限制性例子，用于荧光检测的GSI ScanArray3000可以随用于定量的ImaGene软件一起使用。
VI.单一检测测定法
在一些实施方案中，用于检测细胞(如肿瘤细胞)的细胞提取物中一种或多种目的分析物(例如，一种或多种信号转导分子，如HER3和/或c-Met信号传导途径的一种或多种组分)的表达和/或活化水平的测定法是具有优越动态范围的多通道、高通量双抗体测定法。作为非限制性例子，该测定法中所用的两种抗体可以包括：(1)对特定目的分析物特异的捕获抗体；和(2)对该分析物活化形式特异的检测抗体(即，活化状态依赖性抗体)。活化状态依赖性抗体能够检测例如分析物的磷酸化、遍在蛋白化和/或复合状态。备选地，检测抗体包括检测分析物在细胞提取物中总量的活化状态非依赖性抗体。活化状态非依赖性抗体总体上能够检测分析物的活化形式和非活化形式。
在一个具体实施方案中，用于检测目的分析物的表达或活化水平的双抗体测定法包括：
(i)将细胞提取物与捕获抗体的一个或多个稀释系列孵育以形成多种捕获的分析物；
(ii)将多种捕获的分析物与对相应分析物特异的检测抗体孵育，以形成多种可检测的捕获的分析物，其中所述检测抗体包括用于检测分析物的活化(例如，磷酸化)水平的活化状态依赖性抗体或用于检测分析物的表达水平(例如，总量)的活化状态非依赖性抗体；
(iii)将多个可检测的捕获的分析物与信号放大对子的第一和第二成员孵育以产生放大信号；和
(iv)检测从信号放大对子的第一和第二成员中产生的放大信号。
本文所述的双抗体测定法一般是基于抗体的测定法，所述测定法包含在不同可寻址位置与固相支持物表面偶联的以一系列捕获抗体浓度存在的多种不同的捕获抗体。上文描述了用于本发明中的合适固相支持物的例子。
优选地选择捕获抗体和检测抗体，以便最小化它们之间就结合分析物方面的竞争(即，捕获和检测抗体可以同时结合它们的相应信号转导分子)。
在一个实施方案中，检测抗体包含结合对子的第一成员(例如，生物素)并且信号放大对子的第一成员包含该结合对子的第二成员(例如，链霉亲和素)。使用本领域熟知的方法，可以将结合对子成员直接或间接地与检测抗体偶联或与信号放大对子的第一成员偶联。在某些情况下，信号放大对子的第一成员是过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、细胞色素c过氧化物酶、嗜酸性粒细胞过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、乳过氧化物酶、髓过氧化物酶、甲状腺过氧化物酶、脱碘酶等)，并且信号放大对子的第二成员是酪酰胺试剂(例如，生物素-酪酰胺（tyramide）)。在这些情况下，通过在过氧化氢(H2O2)存在时过氧化物酶氧化酪酰胺试剂以产生活化的酪酰胺，生成放大的信号。
直接检测到或者在添加信号检测试剂(例如，链霉亲和素标记的荧光团或链霉亲和素标记的过氧化物酶和生色试剂的组合)时检测到活化的酪酰胺。适用于本发明中的荧光团的例子包括但不限于Alexa
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染料(例如，Alexa
Figure BDA00003704294600722
)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、俄勒冈绿TM；罗丹明、德克萨斯红、四罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、CyDyeTM荧光素(例如，Cy2、Cy3、Cy5)等。使用本领域熟知的方法，可以将链霉亲和素标记物直接或间接地与荧光团或过氧化物酶偶联。适用于本发明中的生色试剂的非限制性例子包括3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)、3,3′-二氨基联苯胺(DAB)、2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、4-氯-1-萘酚(4CN)和/或卟啉原。
一个用于进行本文所述的双抗体测定法的示例性操作方案在PCT公开号WO2009/108637的实施例3中提供，所述专利的公开内容出于全部目的通过引用的方式完整并入本文作为参考。
在双抗体方案的另一个实施方案中，本发明提供一种用于检测截短受体的表达或活化水平的方法，所述方法包括：
(i)将细胞提取物与对全长受体胞外结构域(ECD)结合区特异的多粒珠孵育；
(ii)从细胞提取物中移除所述多粒珠，因而移除全长受体以形成缺少全长受体的细胞提取物；
(iii)将缺少全长受体的细胞提取物与对全长受体胞内结构域(ICD)结合区特异的一种或多种捕获抗体的稀释系列孵育以形成多个捕获的截短受体；
(iv)将多个捕获的截短受体与对全长受体的ICD结合区特异的检测抗体孵育，以形成多个可检测的捕获的截短受体，其中所述检测抗体包含用于检测截短受体的活化(例如，磷酸化)水平的活化状态依赖性抗体或用于检测截短受体的表达水平(例如，总量)的活化状态非依赖性抗体；
(v)将多个可检测的捕获的截短受体与信号放大对子的第一和第二成员孵育以产生放大信号；并且
(vi)检测从信号放大对子的第一和第二成员中产生的放大信号。
在某些实施方案中，截短的受体是p95HER2并且全长受体是HER2。在其他实施方案中，截短的受体是截短形式的HER3并且全长受体是HER3。在另外的其他实施方案中，截短的受体是截短形式的c-Met并且全长受体是c-Met。在其他实施方案中，对胞外结构域(ECD)结合区特异的多粒珠包含链霉亲和素-生物素对子，其中生物素是与所述珠连接并且生物素是与抗体连接(例如，其中所述抗体是对全长受体的ECD结合区特异的)。
PCT公开号WO2009/108637的图14A(所述专利的公开内容出于全部目的通过引用的方式完整并入本文作为参考)显示，用针对目的受体的胞外结构域(ECD)的抗体所包被的珠结合全长受体(例如，HER2)，但是不结合截短的受体(例如，p95HER2)，以便从测定法中移除任何全长受体。PCT公开号WO2009/108637的图14B显示，一旦与捕获抗体结合，则截短的受体(例如，p95HER2)可以由检测抗体检测到，其中所述检测抗体是对全长受体(例如，HER2)的胞内结构域(ICD)特异的。检测抗体可以直接与辣根过氧化物酶(HRP)缀合。可随后以进行酪酰胺信号放大(TSA)以生成待检测的信号。可以探查截短受体(例如，p95HER2)的表达水平或活化状态以确定例如其总浓度或其磷酸化状态、遍在蛋白化状态和/或复合状态。
在另一个实施方案中，本发明提供用于进行上文描述的双抗体测定法的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)约束于固相支持物上的一种或多种捕获抗体的稀释系列；和(b)一种或多种检测抗体(例如，活化状态非依赖性抗体和/或活化状态依赖性抗体)。在一些情况下，试剂盒还可以含有使用所述试剂盒检测细胞(如肿瘤细胞)的一种或多种信号转导分子的表达水平和/或活化状态的方法的说明书。试剂盒也可以含有上文描述的关于实施本发明具体方法的额外试剂的任一种试剂，例如，信号放大对子的第一和第二成员、酪酰胺信号放大试剂、洗涤缓冲剂等。
VII.邻近双重检测测定法
在一些实施方案中，用于检测细胞(如肿瘤细胞)的细胞提取物中一种或多种目的分析物(例如，一种或多种信号转导分子，如HER3和/或c-Met信号传导途径的一种或多种组分)的表达和/或活化水平的测定法是具有优越动态范围的多通道（multiplex）、高通量邻近(即，三抗体)测定法。作为非限制性例子，所述邻近测定法中所用的三种抗体可以包含：(1)对特定目的分析物特异的捕获抗体；(2)对该分析物活化形式特异的检测抗体(即，活化状态依赖性抗体)；和(3)检测分析物总量的检测抗体(即，活化状态非依赖性抗体)。活化状态依赖性抗体能够检测例如分析物的磷酸化、遍在蛋白化和/或复合状态，而活化状态非依赖性抗体能够检测分析物的总量(即，活化形式和非活化形式)。本文所述的邻近测定法也称作协同酶增强反应性免疫测定法(CEER)或协同性邻近免疫测定法(Collaborative ProximityImmunoassay，COPIA)。
在一个具体实施方案中，用于检测目的分析物的活化水平或状态的邻近测定法包括：
(i)将细胞提取物与捕获抗体的一个或多个稀释系列孵育以形成多种捕获的分析物；
(ii)将多种捕获的分析物与检测抗体孵育以形成多种可检测的捕获的分析物，其中所述检测抗体包含对相应分析物特异的一种或多种活化状态非依赖性抗体和一种或多种活化状态依赖性抗体，
其中所述活化状态非依赖性抗体用促进部分标记，所述活化状态依赖性抗体用信号放大对子的第一成员标记，并且所述促进部分产生导向信号放大对子的第一成员并与之反应的氧化剂；
(iii)将多个可检测的捕获的分析物与信号放大对子的第二成员孵育以产生放大信号；并且
(iv)检测从信号放大对子的第一和第二成员中产生的放大信号。
在另一个具体实施方案中，用于检测作为截短受体的目的分析物的活化水平或状态的邻近测定法包括：
(i)将细胞提取物与对全长受体胞外结构域(ECD)结合区特异的多粒珠孵育；
(ii)从细胞提取物中移除所述多粒珠，因而移除全长受体以形成缺少全长受体的细胞提取物；
(iii)将缺少全长受体的细胞提取物与对全长受体胞内结构域(ICD)结合区特异的一种或多种捕获抗体孵育以形成多个捕获的截短受体；
(iv)将多种捕获的截短受体与检测抗体孵育以形成多种可检测的捕获的截短受体，其中所述检测抗体包含对全长受体的ICD结合区特异的一种或多种活化状态非依赖性抗体和一种或多种活化状态依赖性抗体，
其中所述活化状态非依赖性抗体用促进部分标记，所述活化状态依赖性抗体用信号放大对子的第一成员标记，并且所述促进部分产生导向信号放大对子的第一成员并与之反应的氧化剂；
(v)将多个可检测的捕获的截短受体与信号放大对子的第二成员孵育以产生放大信号；并且
(vi)检测从信号放大对子的第一和第二成员中产生的放大信号。
在某些实施方案中，截短的受体是p95HER2并且全长受体是HER2。在其他实施方案中，截短的受体是截短形式的HER3并且全长受体是HER3。在另外的其他实施方案中，截短的受体是截短形式的c-Met并且全长受体是c-Met。在其他实施方案中，对胞外结构域(ECD)结合区特异的多粒珠包含链霉亲和素-生物素对子，其中生物素是与所述珠连接并且生物素是与抗体连接(例如，其中所述抗体是对全长受体的ECD结合区特异的)。
在备选实施方案中，活化状态依赖性抗体可以用促进部分标记，并且活化状态非依赖性抗体可以用信号放大对子的第一成员标记。
作为另一个非限制性例子，所述邻近测定法中所用的三种抗体可以包含：(1)对特定目的分析物特异的捕获抗体；(2)检测所述分析物总量的第一检测抗体(即，第一活化状态非依赖性抗体)；和(3)检测所述分析物总量的第二检测抗体(即，第二活化状态非依赖性抗体)。在优选的实施方案中，第一和第二活化状态非依赖性抗体识别分析物上的不同(例如，区别性)表位。
在一个具体实施方案中，用于检测目的分析物的表达水平的邻近测定法包括：
(i)将细胞提取物与捕获抗体的一个或多个稀释系列孵育以形成多种捕获的分析物；
(ii)将多种捕获的分析物与检测抗体孵育以形成多种可检测的捕获的分析物，其中所述检测抗体包含对相应分析物特异的一种或多种第一和第二活化状态非依赖性抗体，
其中所述第一活化状态非依赖性抗体用促进部分标记，所述第二活化状态非依赖性抗体用信号放大对子的第一成员标记，并且所述促进部分产生导向信号放大对子的第一成员并与之反应的氧化剂；
(iii)将多个可检测的捕获的分析物与信号放大对子的第二成员孵育以产生放大信号；并且
(iv)检测从信号放大对子的第一和第二成员中产生的放大信号。
在另一个具体实施方案中，用于检测作为截短受体的目的分析物的表达水平的邻近测定法包括：
(i)将细胞提取物与对全长受体胞外结构域(ECD)结合区特异的多粒珠孵育；
(ii)从细胞提取物中移除所述多粒珠，因而移除全长受体以形成缺少全长受体的细胞提取物；
(iii)将缺少全长受体的细胞提取物与对全长受体胞内结构域(ICD)结合区特异的一种或多种捕获抗体孵育以形成多个捕获的截短受体；
(iv)将多种捕获的截短受体与检测抗体孵育以形成多种可检测的捕获的截短受体，其中所述检测抗体包含对全长受体的ICD结合区特异的一种或多种第一和第二活化状态非依赖性抗体，
其中所述第一活化状态非依赖性抗体用促进部分标记，所述第二活化状态非依赖性抗体用信号放大对子的第一成员标记，并且所述促进部分产生导向信号放大对子的第一成员并与之反应的氧化剂；
(v)将多个可检测的捕获的截短受体与信号放大对子的第二成员孵育以产生放大信号；并且
(vi)检测从信号放大对子的第一和第二成员中产生的放大信号。
在某些实施方案中，截短的受体是p95HER2并且全长受体是HER2。在其他实施方案中，截短的受体是截短形式的HER3并且全长受体是HER3。在另外的其他实施方案中，截短的受体是截短形式的c-Met并且全长受体是c-Met。在其他实施方案中，对胞外结构域(ECD)结合区特异的多粒珠包含链霉亲和素-生物素对子，其中生物素是与所述珠连接并且生物素是与抗体连接(例如，其中所述抗体是对全长受体的ECD结合区特异的)。
在备选实施方案中，第一活化状态非依赖性抗体可以用信号放大对子的第一成员标记，并且第二活化状态非依赖性抗体可以用促进部分标记。
本文所述的邻近测定法一般是基于抗体的测定法，所述测定法包含在不同可寻址位置与固相支持物表面偶联的以一系列捕获抗体浓度存在的一种或多种不同的捕获抗体。上文描述了用于本发明中的合适固相支持物的例子。
优选地选择捕获抗体、活化状态非依赖性抗体和活化状态依赖性抗体，以便最小化它们之间就结合分析物方面的竞争(即，全部抗体均可以同时结合它们的相应信号转导分子)。
在一些实施方案中，用于检测一种或多种分析物的活化水平的活化状态非依赖性抗体或，备选地，用于检测一种或多种分析物的表达水平的第一活化状态非依赖性抗体还包含可检测部分。在这类情况下，可检测部分的量与一种或多种分析物在细胞提取物中的量相关。可检测部分的例子包括但不限于荧光标记物、化学活性标记物、酶标记物、放射性标记物等。优选地，可检测部分是荧光团如Alexa染料(例如，Alexa
Figure BDA00003704294600782
)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、俄勒冈绿TM；罗丹明、德克萨斯红、四罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、CyDyeTM荧光素(例如，Cy2、Cy3、Cy5)等。使用本领域熟知的方法，可以将可检测部分直接或间接地与活化状态非依赖性抗体偶联。
在某些情况下，用促进部分直接标记用于检测一种或多种分析物的活化水平的活化状态非依赖性抗体或，备选地，用于检测一种或多种分析物的表达水平的第一活化状态非依赖性抗体。使用本领域熟知的方法，可以将促进部分与活化状态非依赖性抗体偶联。用于本发明中的合适的促进部分包括能够产生氧化剂的任何分子，其中所述氧化剂导向(即，指向)邻近于(即，空间上靠近或接近于)所述促进部分的另一个分子并与所述另一个分子反应(即，结合、被结合或与所述另一个分子形成复合物)。促进部分的例子包括但不限于酶如葡萄糖氧化酶或催化涉及分子氧(O2)作为电子接纳体的氧化/还原反应的任何其他酶，和光敏剂如亚甲基蓝、虎红、卟啉、方酸酯染料、酞菁等。氧化剂的非限制性例子包括过氧化氢(H2O2)、单线态氧和在氧化/还原反应中转移氧原子或获得电子的任何其他化合物。优选地，在合适底物(例如，葡萄糖，光等)存在下，当这两个部分彼此邻近时，促进部分(例如，葡萄糖氧化酶、光敏剂等)产生导向信号放大对子的第一成员(例如，辣根过氧化物酶(HRP)，受保护基保护的半抗原、由针对酶抑制剂的硫醚键失活的酶等)并与之反应的氧化剂(例如，过氧化氢(H2O2)、单线态氧等)。
在某些其他情况下，通过与活化状态非依赖性抗体缀合的寡核苷酸接头和与促进部分缀合的互补寡核苷酸接头之间的杂交，用促进部分间接标记用于检测一种或多种分析物的活化水平的活化状态非依赖性抗体或，备选地，用于检测一种或多种分析物的表达水平的第一活化状态非依赖性抗体。使用本领域熟知的方法，可以将寡核苷酸接头与促进部分偶联或与活化状态非依赖性抗体偶联。在一些实施方案中，缀合于促进部分的寡核苷酸接头与缀合于活化状态非依赖性抗体的寡核苷酸接头具有100%互补性。在其他实施方案中，例如，在严格杂交条件下杂交时，寡核苷酸接头对子包含至少1、2、3、4、5、6个或更多个错配区域。本领域技术人员将理解，对不同分析物特异的活化状态非依赖性抗体可以与相同的寡核苷酸接头或与不同的寡核苷酸接头缀合。
与促进部分或与活化状态非依赖性抗体缀合的寡核苷酸接头的长度可以变动。通常，接头序列可以是至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100个核苷酸长度。一般地，生成用于偶联的随机核酸序列。作为一个非限制性例子，寡核苷酸接头文库可以设计成具有3种不同连续结构域：间隔结构域；标签结构域；和缀合结构域。优选地，将寡核苷酸接头设计成在不破坏与其缀合的促进部分或活化状态非依赖性抗体的功能的情况下高效偶联。
寡核苷酸接头序列可以设计成在多种分析条件下防止或最小化任何二级结构的形成。一般仔细监测接头内部每种区段的解链温度以允许它们参与总体分析过程。通常地，接头序列的区段解链温度的范围在1-10℃之间。用于在定义的离子浓度下确定解链温度、二级结构和发夹结构的计算机算法(例如，OLIGO6.0)可以用来分析每个接头内部3个不同结构域的每一个结构域。也可以对总体合并的序列分析它们的结构特征和它们与其他缀合的寡核苷酸接头序列可比性，例如，它们是否将在严格杂交条件下与互补寡核苷酸接头杂交。
寡核苷酸接头的间隔区提供缀合结构域与寡核苷酸交联位点的足够隔离。缀合结构域发挥作用以便通过核酸杂交作用使得用互补寡核苷酸接头序列标记的分子与缀合结构域连接。核酸介导的杂交可以在抗体-分析物(即，抗原)复合物形成之前或之后进行，从而提供更灵活的分析模式。不同于许多直接抗体缀合方法，相对小的寡核苷酸与抗体或其他分子的连接最少地影响抗体针对其靶分析物的特异性亲和力或缀合分子的功能。
在一些实施方案中，寡核苷酸接头的标签序列结构域可以用于复杂的多通道蛋白测定法中。多种抗体可以与具有不同标签序列的寡核苷酸接头缀合。在多通道免疫测定法中，用适宜探针标记的报道寡核苷酸序列可以用来以多通道分析模式检测抗体与其抗原之间的交叉反应性。
使用几种不同方法，可以将寡核苷酸接头与抗体或其他分子缀合。例如，可以合成在5′或3′末端上带巯基的寡核苷酸接头。所述巯基可以使用还原剂(例如，TCEP-HCl)去保护并且可以通过使用脱盐离心柱纯化所得到的接头。使用异双功能***联接头如SMCC，可以将所得到的去保护的寡核苷酸接头与抗体或其他类型蛋白质的伯胺缀合。备选地，寡核苷酸上的5′-磷酸酯基可以用水溶性碳二亚胺EDC处理以形成磷酸酯并且随后与含胺分子偶连。在某些情况下，3′-核糖残基上的二醇可以氧化成醛基并且随后利用还原性胺化，与抗体或其他类型蛋白质的胺基缀合。在某些其它情况下，可以合成在3′或5′末端上存在生物素修饰的寡核苷酸接头并且使其与链霉亲和素标记的分子缀合。
可以使用本领域已知的多种技术(如在Usman等人,J.Am.Chem.Soc.,109:7845(1987)；Scaringe等人,Nucl.Acids Res.,18:5433(1990)；Wincott等人,Nucl.Acids Res.,23:2677-2684(1995)；和Wincott等人,Methods Mol.Bio.,74:59(1997)中描述的那些技术)中的任一项技术合成寡核苷酸接头。通常，寡核苷酸的合成利用常见核酸保护基团和偶联基团，如在5′-端的二甲氧基三苯甲基和在3′-端的磷酰亚胺。用于寡核苷酸合成的合适试剂、用于核酸脱保护的方法和用于核酸纯化的方法是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，用信号放大对子的第一成员直接标记用于检测一种或多种分析物的活化水平的活化状态依赖性抗体或备选地用于检测一种或多种分析物的表达水平的第二活化状态非依赖性抗体。使用本领域熟知的方法，信号放大对子成员可以与检测活化水平的活化状态依赖性抗体或检测表达水平的第二活化状态非依赖性抗体偶连。在某些其他情况下，通过与活化状态依赖性抗体或第二活化状态非依赖性抗体缀合的结合对子的第一成员和与信号放大对子的第一成员缀合的结合对子的第二成员之间结合，将活化状态依赖性抗体或第二活化状态非依赖性抗体间接地用信号放大对子的第一成员标记。使用本领域熟知的方法，结合对子成员(例如，生物素/链霉亲和素)可以与信号放大对子成员或与活化状态依赖性抗体或第二活化状态非依赖性抗体偶连。信号放大对子成员的例子包括但不限于过氧化物酶类，如辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、细胞色素c过氧化物酶、嗜酸性粒细胞过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、乳过氧化物酶、髓过氧化物酶、甲状腺过氧化物酶、脱碘酶等。信号放大对子成员的其他例子包括由保护基保护的半抗原和由酶抑制剂键接的硫醚键失活的酶。
在邻近导向的一个例子中，促进部分是葡萄糖氧化酶(GO)并且信号放大对子的第一成员是辣根过氧化物酶(HRP)。当GO与底物如葡萄糖接触时，它产生氧化剂(即，过氧化氢(H2O2))。如果HRP处于导向邻近于GO的范围内，则由GO产生的H2O2被导向至HRP并与之复合以形成HRP-H2O2复合物，所述复合物在信号放大对子的第二成员(例如，化学发光底物如鲁米诺或异鲁米诺或荧光底物如酪酰胺(例如，生物素-酪酰胺)、高香草酸或4-羟苯基乙酸)存在下产生放大信号。在邻近测定法中使用GO和HRP的方法在例如，Langry等人,美国能源部报告第UCRL-ID-136797号(1999)中描述。当使用生物素-酪酰胺作为信号放大对子的第二成员时，HRP-H2O2复合物氧化酪酰胺以产生在亲核性残基附近共价结合的活泼酪酰胺自由基。直接检测或者在添加信号检测试剂(例如，链霉亲和素标记的荧光团或链霉亲和素标记的过氧化物酶和生色试剂的组合)时检测活化的酪酰胺。适用于本发明中的荧光团的例子包括但不限于Alexa
Figure BDA00003704294600811
染料(例如，Alexa
Figure BDA00003704294600812
)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、俄勒冈绿TM；罗丹明、德克萨斯红、四罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、CyDyeTM荧光素(例如，Cy2、Cy3、Cy5)等。使用本领域熟知的方法，可以将链霉亲和素标记物直接或间接地与荧光团或过氧化物酶偶联。适用于本发明中的生色试剂的非限制性例子包括3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)、3,3′-二氨基联苯胺(DAB)、2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、4-氯-1-萘酚(4CN)和/或卟啉原。
在一些实施方案中，葡萄糖氧化酶(GO)和检测抗体(例如，活化状态非依赖性抗体)可以与硫氢基活化的葡聚糖分子缀合，例如，PCT公开号2009/108637的实施例16-17中所述，所述专利的公开内容出于全部目的通过引用的方式完整并入本文作为参考。这种硫氢基活化的葡聚糖分子一般具有约500kDa(例如，约250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或750kDa)的分子量。在某些其他实施方案中，辣根过氧化物酶(HRP)和检测抗体(例如，活化状态依赖性抗体)可以与硫氢基活化的葡聚糖分子缀合。硫氢基活化的葡聚糖分子一般具有约70kDa(例如，约40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100kDa)的分子量。
在邻近导向的另一个例子中，促进部分是光敏剂并且信号放大对子的第一成员是用多种半抗原标记的大分子，其中所述多种半抗原用防止所述半抗原与特异性结合配偶物(例如，配体、抗体等)结合的保护基保护。例如，信号放大对子成员可以是用受保护的生物素、香豆素和/或荧光素分子标记的葡聚糖分子。合适的保护基包括但不限于苯氧基保护基、苯胺基保护基、烯烃保护基、硫醚保护基和硒醚保护基。美国专利号5,807,675中描述了适用于本发明的邻近测定法中的额外光敏剂和受保护的半抗原分子。当光敏剂用光激发时，它产生氧化剂(即，单线态氧)。如果半抗原分子处于导向邻近于光敏剂的范围内，则由光敏剂产生的单线态氧被导向至半抗原的保护基上的硫醚并与之反应以产生羰基(酮或醛)和亚磺酸，从半抗原释放保护基。未保护的半抗原随后可用于与信号放大对子的第二成员(例如，可以产生可检测信号的特异性结合配偶物)特异性结合。例如，当半抗原是生物素时，特异性结合配偶物可以是酶标记的链霉亲和素。示例性酶包括碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、HRP等。在洗涤以移除未结合的试剂后，可以通过添加该酶的可检测(例如，荧光、化学发光、生色性等)底物产生可检测信号并且使用本领域已知的合适方法和仪器检测之。备选地，可以使用酪酰胺信号放大法放大可检测信号并且直接检测或在添加如上文所述的信号检测试剂时检测活化的酪酰胺。
在邻近导向的又一个例子中，促进部分是光敏剂并且信号放大对子的第一成员是酶-抑制剂复合物。该酶和抑制剂(例如，膦酸标记的葡聚糖)由可切割接头(例如，硫醚)连接在一起。当光敏剂用光激发时，它产生氧化剂(即，单线态氧)。如果酶-抑制剂复合物处于导向邻近于光敏剂的范围内，则由光敏剂产生的单线态氧被导向至可切割接头并与之反应，从酶中释放抑制剂，因而活化该酶。添加酶底物以产生可检测信号，或备选地，添加放大试剂以产生放大的信号。
在邻近导向的再一个例子中，促进部分是HRP，信号放大对子的第一成员是如上文所述的保护的半抗原或酶-抑制剂复合物，并且保护基包含对烷氧基苯酚。苯二胺和H2O2的添加产生活泼苯二亚胺，所述活泼苯二亚胺导向受保护的半抗原或酶-抑制剂复合物并与对烷氧基苯酚保护基反应以产生暴露的半抗原或活泼酶。生成并如上文所述那样检测放大的信号(见例如美国专利号5,532,138和5,445,944)。
一个用于进行本文所述的邻近测定法的示例性操作方案在PCT公开号WO2009/108637的实施例4中提供，所述专利的公开内容出于全部目的通过引用的方式完整并入本文作为参考。
在另一个实施方案中，本发明提供用于实施上文描述的邻近测定法的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)约束于固相支持物上的一种或多种捕获抗体的稀释系列；和(b)一种或多种检测抗体(例如，用于检测活化水平的活化状态非依赖性抗体和活化状态依赖性抗体的组合和/或用于检测表达水平的第一和第二活化状态非依赖性抗体的组合)。在一些情况下，该试剂盒还可以含有使用所述试剂盒检测细胞(如肿瘤细胞)的一种或多种信号转导分子的表达和/或活化状态的方法的说明书。试剂盒也可以含有上文描述的关于进行本发明具体方法的额外试剂中的任一种试剂，例如，信号放大对子的第一和第二成员、酪酰胺信号放大试剂、促进部分的底物、洗涤缓冲液等。
VIII.抗体的产生
可以通过几种方式实现尚未市售的根据本发明分析细胞(如非小细胞肺癌肿瘤细胞)中信号转导分子(例如，HER3和/或c-MET信号传导途径组分)的表达水平和/或活化水平的抗体的生成和选择。例如，一种方式是使用本领域已知的蛋白表达和纯化方法表达和/或纯化目的多肽(即，抗原)，而另一种方式是使用本领域已知的固相肽合成方法合成目的多肽。见，例如，Guide to Protein Purification,Murray P.Deutcher编著,Meth.Enzymol.,Vol.182(1990)；Solid Phase Peptide Synthesis,Greg B.Fields编著,Meth.Enzymol.,Vol.289(1997)；Kiso等人,Chem.Pharm.Bull.,38:1192-99(1990)；Mostafavi等人,Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids,1:255-60,(1995)；和Fujiwara等人,Chem.Pharm.Bull.,44:1326-31(1996)。随后可以将纯化或合成的多肽注射至例如小鼠或兔中，以产生多克隆或单克隆抗体。本领域技术人员会认识到许多方法可用于抗体的产生，例如，如Antibodies,A Laboratory Manual,Harlow和Lane编著,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)中所述。本领域技术人员将也理解，也可以通过各种方法从遗传信息制备模拟抗体(例如，保留抗体的功能结合区)的结合性片段或Fab片段。见，例如，AntibodyEngineering:A Practical Approach,Borrebaeck编著,Oxford UniversityPress,Oxford(1995)；和Huse等人,J.Immunol.,149:3914-3920(1992)。
此外，众多出版物已经报道了使用噬菌体展示技术针对与选定靶抗原的结合而产生和筛选多肽文库(见例如Cwirla等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378-6382(1990)；Devlin等人,Science,249:404-406(1990)；Scott等人,Science,249:386-388(1990)；和Ladner等人,美国专利号5,571,698)。噬菌体展示法的基本概念是在噬菌体DNA所编码的多肽和靶抗原之间建立物理联系。这种物理联系由噬菌体粒子提供，其中所述噬菌体粒子将多肽展示为包围噬菌体基因组的衣壳的部分，所述噬菌体基因组编码这种多肽。多肽与其遗传物质之间建立物理联系允许同时大规模筛选数目非常庞大的携带不同多肽的噬菌体。展示对靶抗原具有亲和力的多肽的噬菌体与这种靶抗原结合，并且通过针对这种靶抗原的亲和力筛选，富集这些噬菌体。从这些噬菌体展示的多肽的身份可以从它们相应的基因组中确定。使用这些方法，随后可以通过常规手段大量合成经鉴定为对所需靶抗原具有结合亲和力的多肽(见，例如，美国专利号6,057,098)。
随后可以通过以下方式选择由这些方法产生的抗体：首先用纯化的目的多肽抗原筛选亲和力和特异性并且(如果需要)，将抗体的亲和力和特异性的结果与希望从结合作用中排除的其他多肽抗原的结果比较。筛选方法可以涉及在微量滴定平板的独立孔中固定纯化的多肽抗原。随后将含有潜在抗体或抗体群组的溶液置于相应的微量滴定孔中并且孵育约30分钟至2小时。随后洗涤微量滴定孔并且将标记的第二抗体(例如，如果生成的抗体是小鼠抗体，第二抗体是与碱性磷酸酶缀合的抗小鼠抗体)添加至各孔并且孵育约30分钟并且随后洗涤。将底物添加至各孔并且当针对固定的多肽抗原的抗体存在时，颜色反应将出现。
随后可以对如此鉴定的抗体进一步分析亲和力和特异性。在开发针对靶蛋白的免疫测定法时，纯化的靶蛋白充当标准，其中针对所述标准，判断使用已经选择的抗体的免疫测定法的灵敏度和特异性。因为多种抗体的结合亲和力可以不同；例如某些抗体组合可以在空间上彼此干扰，所以抗体的分析性能可能是比抗体的绝对亲和力和特异性更重要的量度。
本领域技术人员会认识到，可以在产生抗体或结合性片段以及筛选和选择各种目的多肽的亲和力及特异性时采用许多方案，但是这些方案不改变本发明的范围。
A.多克隆抗体
优选地在动物中通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射目的多肽和佐剂产生多克隆抗体。可能有用的是，使用双官能或衍化剂，使目的多肽与蛋白质载体缀合，所述蛋白质载体是在待免疫的物种中有免疫原性的，例如，匙孔槭血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。双官能或衍化剂的非限制性例子包括马来酰亚胺苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(经半胱氨酸残基缀合)、N-羟琥珀酰亚胺(经赖氨酸残基缀合)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2和R1N=C=NR，其中R和R1是不同的烷基。
通过以下方式将动物针对目的多肽或免疫原性缀合物或其衍生物免疫：将例如100μg(对于兔)或5μg(对于小鼠)抗原或缀合物与3体积的弗氏完全佐剂合并，并且在多个部位皮内注射该溶液。一个月后，通过在多个部位下用弗氏不完全佐剂中的约1/5至1/10原始量的多肽或缀合物皮下注射，强化免疫该动物。7至14日后，将动物放血并且对血清测定抗体滴度。一般将动物强化免疫直至滴度平台期。优选地，将动物用相同多肽的缀合物强化免疫，不过可以使用与不同免疫原性蛋白的缀合和/或借助不同交联试剂的缀合。缀合物也可以在重组细胞培养物中作为融合蛋白产生。在某些情况下，聚集剂如明矾可以用来增强免疫反应。
B.单克隆抗体
单克隆抗体通常从基本上同质的抗体群体中获得，即，构成该群体的各个抗体是基本上相同的，除了可能以微小量出现的可能天然存在的突变之外。因此，修饰语“单克隆”表明该抗体的特征为不是分立抗体的混合物。例如，单克隆抗体可以使用首先由Kohler等人,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法产生，或可以通过本领域已知的重组DNA方法产生(例如，美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤方法中，使小鼠或其他适宜的宿主动物(例如仓鼠)如上所述那样免疫，以激发出产生或能够产生抗体的淋巴细胞，其中所述的抗体与用于免疫的目的多肽特异性结合。备选地，体外免疫淋巴细胞。随后使用合适的融合剂如聚乙二醇，使免疫的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(见，例如，Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice(单克隆抗体：原理与实践),Academic Press,第59-103页(1986))。将如此制备的杂交瘤细胞铺种并且在合适的培养基中培育，其中所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)，则用于杂交瘤细胞的培养基一般将包括防止HGPRT缺陷型细胞生长的次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)。
优选的骨髓瘤细胞是这些细胞，它们高效融合、支持由所选择的抗体产生细胞稳定高水平地产生抗体和/或对培养基(如HAT培养基)敏感。用于产生人单克隆抗体的这类优选的骨髓瘤细胞系的例子包括但不限于鼠骨髓瘤系，如源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些(从Salk InstituteCell Distribution Center；San Diego,CA可获得)、SP-2或X63-Ag8-653细胞(从美国典型培养物保藏中心；Rockville，MD可获得)，和人骨髓瘤或小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系(见，例如，Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；和Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,Marcel Dekker,Inc.,New York,第51-63页(1987))。
可以对其中杂交瘤细胞正在生长的培养基分析针对目的多肽的单克隆抗体的产生。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法如放射免疫测定法(RIA)或酶-联免疫吸附测定法(ELISA)确定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。可以使用例如Munson等人,Anal.Biochem.,107:220(1980)的斯卡查德分析法测定单克隆抗体的结合亲和力。
在鉴定到产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可以通过有限稀释法亚克隆并且通过标准方法培育(见，例如，Goding,Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications(单克隆抗体生产技术及应用),Academic Press,第59-103页(1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为腹水肿瘤在动物中体内培育。可以通过常规的抗体纯化方法，例如，蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析法、凝胶电泳法、透析或亲和层析法，将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水液或血清分离。
使用常规方法(例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，可以轻易地分离出编码所述单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞可以充当此DNA的优选来源。一旦分离，则可以将这种DNA置入表达载体中，随后将所述表达载体转染至不产生抗体的宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以诱导单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。见，例如，Skerra等人,Curr.Opin.Immunol.,5:256-262(1993)；和Pluckthun,Immunol Rev.,130:151-188(1992)。也可以例如通过以下方式修饰这种DNA：将人重链恒定域和轻链恒定域的编码序列替换同源的鼠序列(见，例如，美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851(1984))或将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分与免疫球蛋白编码序列共价接合。
在又一个实施方案中，单克隆抗体或抗体片段可以从抗体噬菌体文库分离，其中使用例如McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)；Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；和Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术产生所述抗体噬菌体文库。在Marks等人,BioTechnology,10:779-783(1992)中描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人单克隆抗体。在Waterhouse等人,Nuc.Acids Res.,21:2265-2266(1993)中描述了组合型感染和体内重组作为构建非常大庞大的噬菌体文库的策略的用途。因而，这些技术是用于产生单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤方法的有效替代。
C.人源化抗体
用于人源化非人抗体的方法是本领域已知的。优选地，人源化抗体使得来自非人类来源的一个或多个氨基酸残基导入其中。这些非人类氨基酸残基经常称作“输入”残基，它们一般取自“输入”可变域。可以基本上通过将非人抗体的高变区序列替换为相应的人抗体序列进行人源化。见，例如，Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；和Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(见，例如，美国专利号4,816,567)，其中比完整人可变域大幅度小的区域已经由来自非人物种的相应序列替换。在实践中，人源化抗体一般是其中一些高变区残基和可能一些构架区(FR)残基由来自啮齿动物抗体的类似位点的残基所替换的人抗体。
对于降低抗原性，重要的是考虑在产生本文所述的人源化抗体中选择待使用的人可变域(重链和轻链)。根据所谓“最佳配合”方法，针对已知的人可变域序列的完整文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。随后接受与啮齿动物序列最接近的人序列作为用于人源化抗体的人FR(见，例如，Sims等人,J.Immunol.,151:2296(1993)；和Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。另一种方法使用从具有特定亚组轻链或重链的全部人类抗体的共有序列所衍生的特殊FR。相同的FR可以用于几种不同的人源化抗体(见，例如，Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))。
还重要的是对抗体人源化，同时保留针对抗原的高结合亲和力和其他有利生物学特性。为实现这个目的。可以通过以下方法制备人源化抗体：利用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。说明并展示所选择候选免疫球蛋白序列的可能三维构象性结构的计算机程序是可获得的。对这些展示结果的检验允许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥作用中的可能角色，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体序列和输入序列选出并且组合FR残基，从而实现想要的抗体特征，如对靶抗原增加的亲和力。通常，高变区残基直接并且特别参与影响抗原结合。
根据本发明构思了多种形式的人源化抗体。例如，人源化抗体可以是抗体片段，如Fab片段。备选地，人源化抗体可以是完整的抗体，如完整的IgA、IgG或IgM抗体。
D.人抗体
作为人源化的备选，可以产生人抗体。在一些实施方案中，可以产生转基因动物(例如，小鼠)，其中所述转基因动物一旦免疫就能够在不存在内源免疫球蛋白生产的情况下产生完整的人抗体库。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重-链铰链区(JH)基因的纯合缺失导致完全抑制内源抗体产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移至此类种系突变小鼠中将导致一旦抗原攻击则产生人抗体。见，例如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann等人,Year in Immun.,7:33(1993)；和美国专利号5,591,669，5,589,369和5,545,807。
备选地，使用未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因库，噬菌体展示技术(见，例如，McCafferty等人,Nature,348:552-553(1990))可以用来在体外产生人抗体和抗体片段。根据这项技术，将抗体V基因符合读码框地克隆到丝状噬菌体(如M13或fd)的主要衣壳蛋白基因或次要衣壳蛋白基因中并且作为功能性抗体片段展示在噬菌体粒子的表面上。因为丝状粒子含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，故基于抗体功能特性的选择也导致选出编码展示这些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B细胞的一些特征。噬菌体展示可以如Johnson等人,Curr.Opin.Struct.Biol.,3:564-571(1993)中所述那样以多种模式进行。几种来源的V-基因节段可以用于噬菌体展示。见，例如，Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)。可以从未免疫的人供体中构建V基因库，并且可以基本上按照Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)；Griffith等人,EMBO J.,12:725-734(1993)；和美国专利号5,565,332和5,573,905中描述的技术分离针对多样化抗原组(包括自身抗原)的抗体。
在某些情况下，人抗体也可以由体外活化的B细胞产生，如美国专利号5,567,610和5,229,275中所述。
E.抗体片段
已经开发了用于产生抗体片段的多种技术。常规地，这些片段通过蛋白酶解消化完整抗体来衍生(见，例如，Morimoto等人,J.Biochem.Biophys.Meth.,24:107-117(1992)；和Brennan等人,Science,229:81(1985))。然而，现在可以直接使用重组宿主细胞产生这些片段。例如，抗体片段可以从上文讨论的抗体噬菌体文库分离。备选地，Fab′-SH片段可以从大肠杆菌细胞直接回收并且经化学偶联以形成F(ab′)2片段(见，例如，Carter等人,BioTechnology,10:163-167(1992))。根据另一个方案，F(ab′)2片段可以从重组宿主细胞培养物直接分离。用于产生抗体片段的其他技术将是本领域技术人员显而易见的。在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。见，例如，PCT公开号WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。抗体片段也可以是线性抗体，如美国专利号5,641,870中所描述。此类线型抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
F.双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以与相同目的多肽的两个不同表位结合。其他双特异性抗体可以将目的多肽的结合位点与一种或多种额外抗原的结合位点组合。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。
用于产生双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的常规生产基于共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中所述两种链具有不同特异性(见，例如，Millstein等人,Nature,305:537-539(1983))。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四合瘤(quadroma)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种分子具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析进行正确分子的纯化。PCT公开号WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中公开了相似的方法。
根据一种不同方案，具有所需结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定域序列融合。这种融合物优选地具有免疫球蛋白重链恒定域，包含至少铰合部、CH2区和CH3区的部分。优选的是使得第一重链恒定区(CH1)含有对于所述融合物至少之一中存在轻链结合的必需位点。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果所需)免疫球蛋白轻链的DNA***分别的表达载体中并且共转染至合适的宿主生物中。在构建中所用的比率不等的3种多肽链提供最佳产率时的实施方案中，这在调节3种多肽片段的相互比例方面提供大的灵活性。然而，当至少两条多肽链以等比率的表达导致高产率时或当该比率没有特定意义时，可能将2条或全部3条多肽链的编码序列***一个表达载体中。
在这种方案的一个优选实施方案中，双特异性抗体由在一条臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。这种非对称结构利于所需的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分离，因为免疫球蛋白轻链在所述双特异性分子的仅一半中的存在提供了便利的分离方式。见，例如，PCT公开号WO 94/04690和Suresh等人,Meth.Enzymol.,121:210(1986)。
根据美国专利号5,731,168中描述的另一个方案，工程化设计一对抗体分子之间的界面以便最大化从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比。优选的界面包含抗体恒定域的CH3结构域的至少一部分。在这种方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链由较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链替换为较小侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链的相同或相似尺寸的补偿“腔”。这提供了相对于其他不想要的终产物(如同型二聚体)而言增加异二聚体产率的机制。
双特异性抗体包括交联或“异质缀合”抗体。例如，异质缀合下的抗体之一可以偶联于抗生物素蛋白，另一种抗体偶联于生物素。可以使用任何便利的交联方法产生异质缀合抗体。合适的交联剂和技术是本领域熟知的，并且在例如美国专利号4,676,980中公开。
用于从抗体片段产生双特异性抗体的合适技术也是本领域已知的。例如，可以利用化学键制备双特异性抗体。在某些情况下，双特异性抗体可以通过其中以蛋白酶解方式切割完整抗体以产生F(ab′)2片段的方法产生(见，例如，Brennan等人,Science,229:81(1985))。这些片段在稳定邻位二硫醇并防止分子间二硫化物形成的二硫醇络合剂***存在下还原。产生的Fab′片段随后转化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。随后将Fab′-TNB衍生物之一通过用巯基乙胺还原再转化成Fab′-巯基并且与等摩尔量的其他Fab′-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。
在一些实施方案中，Fab′-SH片段可以从大肠杆菌直接回收并且化学地偶联以形成双特异性抗体。例如，完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子可以通过Shalaby等人,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)中所述的方法产生。每种Fab片段分别从大肠杆菌分泌并经历体外定向化学偶联以形成双特异性抗体。
也已经描述了用于从重组细胞培养物直接产生并分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。见，例如，Kostelny等人,J.Immunol.,148:1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两个不同抗体的Fab′部分相连接。抗体同型二聚体在铰链区经还原以形成单体和随后再氧化以形成抗体异二聚体。也可以将这种方法用于抗体同型二聚体的产生。由Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)描述的“双体抗体(diabody)”技术已经为产生双特异性抗体片段提供备选的机制。这些片段包含通过接头与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)，其中所述接头太短，以至于不允许相同链上的这两个结构域之间配对。因而，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一个片段的互补性VL和VH结构域配对，因而形成两个抗原结合位点。在Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994)中描述了通过使用单链Fv(sFv)二聚体产生双特异性抗体片段的另一种策略。
也构思了大于二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。见，例如，Tutt等人,J.Immunol.,147:60(1991)。
G.抗体纯化
当使用重组技术时，抗体可以在分离的宿主细胞内部、在宿主细胞的周质间隙中产生或从宿主细胞直接分泌至培养基中。如果抗体以胞内方式产生，首先移除颗粒状残片，例如，通过离心或超滤。Carter等人,BioTech.,10:163-167(1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌周质间隙的抗体的方法。简而言之，将细胞糊状物在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下融化约30分钟。通过离心移除细胞残片。在抗体分泌入培养基的情况下，使用市售的蛋白浓缩滤器，例如，Amicon或MilliporePellicon超滤装置，总体地浓缩来自这类表达***的上清液。可以在前述任意步骤中包括蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白酶解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物增长。
例如，使用羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析，可以纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和力配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用来纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(见，例如，Lindmark等人,J.Immunol.Meth.,62:1-13(1983))。推荐将蛋白G用于全部小鼠同种型和用于人γ3(见，例如，Guss等人,EMBO J.,5:1567-1575(1986))。亲和力配体所粘附的基质最经常是琼脂糖，但是其他基质是可用的。力学稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯)苯允许比可以用琼脂糖所实现的更快的流速和更短的处理时间。在抗体包含CH3结构域的情况下，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker；Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。取决于待回收的抗体，用于蛋白纯化的其他技术如在离子交换柱上分级、乙醇沉淀、反相HPLC，在二氧化硅上层析、在肝素SEPHAROSETM上层析、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上层析、聚焦层析，SDS-PAGE和硫酸铵沉淀法也是可用的。
在任何初步纯化步骤后，对包含目的抗体和杂质的混合物可以进行低pH疏水相互作用层析，所述低pH疏水相互作用层析使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选地以低盐浓度(例如，约0至0.25M盐)进行。
本领域技术人员将理解，也可以在本发明的方法和组合物中使用与抗体具有相似功能的任何结合分子，例如，对样品中一种或多种目的分析物特异的结合分子或结合配偶物。合适的抗体样分子的例子包括但不限于结构域抗体、单一抗体(unibody)、纳米体、鲨鱼抗原反应性蛋白、avimers、adnectin、anticalm、亲和配体、phylomer、适配体、亲和体、三连接素(trinectin)等。
IX.施用方法
根据本发明的方法，本文所述的抗癌药物通过本领域已知的任何便利手段向受试者施用。本发明的方法可以用来选择用于治疗受试者中肿瘤(例如，非小细胞肺癌肿瘤)的合适抗癌药物或抗癌药物组合。本发明的方法也可以用来鉴定受试者中肿瘤(例如，非小细胞肺癌肿瘤)对用抗癌药物或抗癌药物组合治疗的反应。此外，本发明的方法也可以用来预测患有肿瘤(例如，非小细胞肺癌肿瘤)的受试者对用抗癌药物或抗癌药物组合治疗的反应。本发明的方法也可以用来监测受试者中肿瘤(例如，非小细胞肺癌肿瘤)的状态或用来监测患有肿瘤的患者如何对用抗癌药物或抗癌药物组合治疗作出反应。本领域技术人员将理解本文所述的抗癌药物可以是单独施用或用作与常规化疗、放疗、激素疗法、免疫疗法和/或手术联合的治疗方案的部分。
在某些实施方案中，抗癌药物包括抗信号传导剂(即，细胞生长抑制药)如单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂；抗增殖剂；化疗药(即，细胞毒药物)；激素治疗药；放疗药；疫苗；和/或具有减少或消除异常细胞(如癌细胞)失控生长的能力的任何其他化合物。在一些实施方案中，受试者用与至少一种化疗药组合的一种或多种抗信号传导药、抗增殖剂和/或激素治疗药治疗。上文描述了示例性单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、抗增殖剂、化疗药、激素治疗药、放疗药和疫苗。
在一些实施方案中，本文所述的抗癌药物可以与常规免疫治疗药和放射免疫疗法(例如，与111In、90Y或131I缀合的抗CD20单克隆抗体等)共施用，所述常规免疫治疗药包括但不限于免疫刺激剂(例如，芽孢杆菌属(Bacillus)卡介苗(Calmette-Guérin，BCG)、左旋咪唑、白介素-2、α-干扰素等)，免疫毒素(例如，抗CD33单克隆抗体-刺孢霉素缀合物，抗CD22单克隆抗体-假单胞菌外毒素缀合物等)。
抗癌药物可以根据需要与合适药物赋形剂一起施用并且可以通过任何可接受的施用模式实施。因此，施用可以例如是口服施用、颊部施用、舌下施用、齿龈施用、腭施用、静脉内施用、局部用药施用、皮下施用、经皮肤施用、透皮施用、肌内施用、关节内施用、肠胃外施用、微动脉内施用、皮内施用、心室内施用、颅内施用、腹内施用、膀胱内施用、鞘内施用、病灶内施用、鼻内施用、直肠施用、***施用或吸入。“共施用”意指抗癌药物与施用第二种药物(例如，另一种抗癌药物、用于减少与抗癌药物疗法相关的副作用的药物、放疗药、激素治疗药，免疫治疗药等)同时、紧接其之前或紧接期之后施用。
抗癌药物的治疗有效量可以反复地施用，例如，施用至少2、3、4、5、6、7、8次或更多次，或该剂量可以通过连续输注施用。剂量可以采取固体、半固体、冻干粉末或液体剂型的形式，例如片剂、丸剂、丸粒剂、胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、栓剂、滞留灌肠剂、乳膏剂、油膏剂、洗剂、凝胶剂、气溶胶剂、泡沫剂等，优选处于适于简单施用精确剂量的单位剂量形式。
如本文所用，术语“单位剂量形式”指适合作为用于人类受试者和其他哺乳动物的单一剂量的物理分立单元；每个单元含有预定量的抗癌药物，所述的预定量经计算以便与适宜药用赋形剂(如，安瓿)结合时产生所需攻击、耐受性和/或治疗作用。此外，可以制备更浓缩的剂型，从中随后可以产生更稀的单位剂量形式。更浓缩的剂型因此将含有明显多于所述量的抗癌药物，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多倍数量的所述抗癌药物。
用于制备这类剂型的方法是本领域技术人员已知的(见，REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990))。这些剂型一般包括常规的药用载体或赋形剂并且可以额外地包括其他医用物质、载体、辅药、稀释剂、组织渗透增进剂、增溶剂等。可以通过本领域熟知的方法针对特定剂型和施用途径定制适宜的赋形剂(见，例如，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES,上文)。
合适赋形剂的例子包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿位伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和聚丙烯酸如卡波普，例如，卡波普941、卡波普980、卡波普981等。剂型可以额外地包括润滑剂如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；助悬剂；防腐剂如羟苯甲酸甲酯、乙酯和丙酯(即，尼泊金酯类)；pH调节剂如无机酸及有机酸和碱；甜味剂；和矫味剂。这些剂型也可以包含生物可降解聚合物珠、葡聚糖和环糊精包合物。
对于经口施用，治疗有效剂量可以处于以下形式：片剂、胶囊剂、乳剂、混悬剂、溶液剂、糖浆剂、喷雾剂、糖锭剂、散剂和持续释放制剂。用于经口施用的合适赋形剂包括药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。
在一些实施方案中，治疗有效剂量采取丸剂、片剂或胶囊剂形式，并且因此，连同抗癌药物一起，所述剂型可以含有以下任一种：稀释剂如乳糖，蔗糖，磷酸二钙等；崩解剂如淀粉或其衍生物；润滑剂如硬脂酸镁等；和粘合剂如淀粉、阿位伯树胶、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素及其衍生物。也可以将抗癌药物配制成例如布置在聚乙二醇(PEG)载体中的栓剂。
液体剂型可以通过以下方式制备：在载体例如含水盐水(例如，0.9%w/v氯化钠)、含水右旋糖、甘油、乙醇等中溶解或分散抗癌药物和任选地一种或多种可药用的辅助剂，以形成例如用于经口、局部或静脉内施用的溶液剂或混悬剂。也可以将抗癌药物配制成滞留灌肠剂。
对于局部施用，治疗有效剂量可以以下形式：乳剂、洗剂、凝胶剂、泡沫剂、乳膏剂、啫喱剂、溶液剂、混悬剂、油膏剂和透皮贴剂。对于吸入施用，抗癌药物可以作为干燥粉末或以液体形式经雾化器递送。对于肠胃外施用，治疗有效剂量可以处于无菌可注射溶液剂和无菌包装散剂的形式。优选地，在约4.5至约7.5的pH配制可注射溶液剂。
治疗有效剂量也可以冻干的形式提供。这类剂型可以包含用于在施用之前重构的缓冲剂，例如，重碳酸盐，或可以在冻干剂型中包含所述缓冲剂以便例如用水重构。冻干剂型还可以包含合适的血管收缩药，例如，肾上腺素。冻干剂型可以在注射器中提供，任选地与用于重构的缓冲剂组合包装，从而重构的剂型可以立即地施用至受试者。
也可以以定期时间间隔监测受试者以评估某种治疗方案的功效。例如，某些信号转导分子的活化状态可以基于用本文所述的一种或多种抗癌药物治疗的治疗作用而变化。可以监测受试者以评估反应并且认识某些药物或疗法在个体化方案中的作用。另外，起初对特定抗癌药物或抗癌药物组合作出反应的受试者可以变得耐受这种药物或药物联合，这表明这些受试者已经形成获得性耐药。可以对这些受试者中断现有疗法并且根据本发明的方法开具替代性疗法。
在某些方面，本文所述的方法可以与预测多种群体中胃癌预后和/或复发的可能性的基因表达标志物群联合使用。这些基因群可以用于鉴定不可能遭遇复发并因此不可能从辅助化疗中受益的个体。这些表达群可以用来鉴定出这样的个体，所述个体可以安全地避开辅助化疗，而没有不利影响无病和总体生存结果。合适的***包括但不限于Oncotype DXTM，其为来自Genomic Health,Inc的21个基因群；Mamma
Figure BDA00003704294600981
其为来自Agendia的70个基因群；和来自Veridex的76个基因群。
此外，在某些其他方面，本文所述的方法可以与鉴定未知原发癌症(CUP)的原始肿瘤的基因表达标志物群联合使用。这些基因群可以用于鉴定转移性癌症的患者，所述患者将从与给予起初诊断患有肺癌的患者的疗法一致的疗法中获益。合适的***包括但不限于，Aviara Cancer TYPE ID测定法，其测量92个基因以鉴定39个肿瘤类型的原始起源部位的基于RT-PCR的表达测定法；和
Figure BDA00003704294600982
组织起源试验，其在微阵列上测量超过1600个基因的表达并且将肿瘤基因表达“标签”针对15个已知组织类型的那些标签进行比较。
X.实施例
提供以下实施例旨在说明，但不用于限制要求保护的本发明。
将2010年7月15日提交的PCT申请号PCT/US2010/042182的实施例1和2出于全部目的通过引用的方式完整并入本文作为参考。
实施例1.采用酪酰胺信号放大的单一检测微阵列ELISA
本实施例显示一种具有优越动态范围的多通道、高通量、单一检测微阵列ELISA，其适用于分析信号转导分子在样品如全血(例如，罕有循环型细胞)或肿瘤组织(例如，细针头抽吸物)中的表达水平或活化水平：
1)将捕获抗体以2倍系列稀释印刷在16垫块FAST载玻片(WhatmanInc；FlorhamPark，NJ)上。
2)在干燥过夜后，载玻片用Whatman封闭缓冲液封闭。
3)将80μl细胞裂解物添加到存在10倍系列稀释物的每个垫块上。将载玻片在室温孵育约2小时。
4)在用TBS-Tween洗涤6次后，将80μl生物素标记的检测抗体(例如，识别磷酸化c-Met的单克隆抗体或识别c-Met(无论其活化状态如何)的单克隆抗体)在室温孵育2小时。
5)在洗涤6次后，添加链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)并孵育1小时以允许SA-HRP与生物素标记的检测抗体结合。
6)对于信号放大，将80μl生物素-酪酰胺以5μg/ml添加并且反应15分钟。将载玻片用TBS-Tween洗涤6次、用20%DMSO/TBS-Tween洗涤2次，并且用TBS洗涤1次。
7)添加80μl的SA-Alexa 555并且孵育30分钟。随后将载玻片洗涤2次，干燥5分钟，并且在微阵列扫描仪(Perkin-Elmer,Inc.;Waltham,MA)上扫描。
实施例2.采用酪酰胺信号放大的邻近双重检测微阵列ELISA
本实施例显示一种具有优越动态范围的多通道、高通量、邻近双重检测微阵列ELISA(例如，协同酶增强反应性免疫测定法(CEER))，其适用于分析信号转导分子在样品如全血(例如，罕有循环型细胞)或肿瘤组织(例如，细针头抽吸物)中的表达水平和/或活化水平：
1)将捕获抗体以范围从1mg/ml至0.004mg/ml的系列稀释物印刷在16垫块FAST载玻片(Whatman Inc)上。
2)在干燥过夜后，载玻片用Whatman封闭缓冲液封闭。
3)将80μl A431细胞裂解物添加到存在10倍系列稀释物的每个垫块上。将载玻片在室温孵育约2小时。
4)在用TBS-Tween洗涤6次后，将稀释于TBS-Tween/2%BSA/1%FBS中的用于所述邻近测定法的80μl检测抗体添加至载玻片。孵育在室温进行2小时。
a)作为非限制性例子，检测抗体可以包含以下抗体：(i)识别c-Met(无论其活化状态如何)的单克隆抗体，其与葡萄糖氧化酶(GO)直接缀合；和(ii)与辣根过氧化物酶(HRP)直接缀合的识别磷酸化c-Met的单克隆抗体或在与HRP直接缀合的第一检测抗体不同的表位处识别c-Met(无论其活化状态如何)的单克隆抗体。
b)备选地，检测步骤可以利用第二检测抗体的生物素-缀合物。在这些实施方案中，在洗涤6次后，包括与链霉亲和素-HRP孵育1小时的额外后续步骤。
c)备选地，该检测步骤可以利用第一检测抗体的寡核苷酸介导的葡萄糖氧化酶(GO)缀合物。可以使用直接缀合的或生物素-链霉亲和素(SA)连接的HRP与第二检测抗体缀合物。
5)对于信号放大，将80μl生物素-酪酰胺以5μg/ml添加并且反应15分钟。将载玻片用TBS-Tween洗涤6次、用20%DMSO/TBS-Tween洗涤2次，并且用TBS洗涤1次。
6)添加80μl的SA-Alexa 555并且孵育30分钟。随后将载玻片洗涤2次，干燥5分钟，并且在微阵列扫描仪(Perkin-Elmer,Inc.；Waltham,MA)上扫描。
实施例3.用于药物选择的活化谱的产生。
本发明的方法和组合物可以用于选择药物以便治疗癌症。常见方案要求产生两个谱，参比活化谱和测试活化谱，其中随后比较所述谱以确定特定药物治疗方案的功效(见，2010年7月15日提交的PCT申请号PCT/US2010/042182的图2，所述专利出于全部目的通过引用的方式完整并入本文作为参考)。
参比活化谱
为获得参比活化谱，在抗癌药物治疗之前从患有特定类型癌症(例如，肺癌)的患者获得肿瘤组织、血液或细针头抽吸物(FNA)样品。从肿瘤、血液或FNA样品分离肿瘤细胞。分离的细胞可以在体外用一种或多种生长因子刺激。随后裂解受刺激的细胞以产生细胞提取物。将细胞提取物施加至含有一组对信号转导分子特异的捕获抗体的稀释系列的可寻址阵列，其中所述信号转导分子的活化状态可以在患者的癌症类型中被改变。使用适宜的检测抗体(例如，活化状态非依赖性抗体和/或活化状态依赖性抗体)进行单一检测或邻近测定法以确定每种目的信号转导分子的活化状态。表2中显示的“途径选择”特别可用于基于患者的癌症类型选择哪种待检测的活化状态。例如，一位患者可以患有显示在表2“途径1”中所述的EGFR途径的活化状态的一个癌症类型。备选地，另一位患者可以患有显示在表2“途径2”中所述的EGFR途径的活化状态的另一个癌症类型。因此产生参比活化谱，其提供在任何抗癌药物不存在下信号转导分子在患者癌症中的活化状态。
测试活化谱
为获得测试活化谱，在抗癌药物治疗之前或在施用抗癌药物(例如，在整个癌症治疗过程期间的任何时间)后从患有特定类型癌症(例如，肺癌)的患者获得第二肿瘤组织、血液或FNA样品。从肿瘤、血液或FNA样品分离肿瘤细胞。如果分离细胞从未曾接受抗癌药物治疗的患者获得，则将分离的细胞与抗癌药物孵育，所述抗癌药物靶向从上文描述的参比活化谱中所确定的一种或多种活化的信号转导分子。“药物选择”表(表1)特别可用于选择经批准或处于临床试验的适宜抗癌药物，所述抗癌药物抑制特定的活化靶信号转导分子。例如，如果从参比活化谱确定EGFR活化，则细胞可以与表1的列A”或“B”中列出的一种或多种药物孵育。分离的细胞可以随后在体外用一种或多种生长因子刺激。随后裂解分离的细胞以产生细胞提取物。将细胞提取物施加至可寻址阵列并且实施邻近测定法以确定每种目的信号转导分子的活化状态。因此产生该患者的测试活化谱，其提供在特定抗癌药物存在下信号转导分子在患者癌症中的活化状态。
药物选择
通过比较测试活化谱与参比活化谱，确定该抗癌药物适于或不适于治疗患者的癌症。例如，与该药物不存在下相比较，如果药物治疗造成大部分或全部信号转导分子实质上较少活化，例如，从在该药物不存在下的强烈活化变化为该药物存在下的弱或非常弱活化，则确定该治疗适于患者的癌症。在这类情况下，在未曾接受药物疗法的患者中用合适的抗癌药物启动治疗或在已经接受药物的患者中用合适的抗癌药物继续后续治疗。然而，如果认为这种药物治疗不适于治疗患者的癌症，则选择不同的药物并用来产生新的测试活化谱，所述新的测试活化谱随后与参比活化谱比较。在这类情况下，在未曾接受药物疗法的患者中用合适的抗癌药物启动治疗或将后续治疗在目前正在接受不适宜药物的患者中改换成合适的抗癌药物。
实施例4.为抗癌药物疗法选择而检测c-Met活化的方法
本实施例显示本文所述的多通道蛋白质微阵列平台的用途，用于鉴定将对抗c-Met抑制剂作出反应的患者和用于鉴定将从抗c-Met抑制剂与其他靶向药物的组合中获益的患者。
多种人类恶性肿瘤显示持久的cMet刺激、过量表达或突变，包括乳腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、肾癌和甲状腺癌。值得注意地，已经在患有特定遗传形式的***状肾癌的患者中肯定地鉴定到c-Met中的激活性突变，这直接暗示c-Met参与人类肿瘤形成。因c-Met受体失调或其配体(肝细胞生长因子(HGF))过量表达所致的c-Met信号传导途径异常信号传导已经与浸润性表型相关。
c-Met信号传导参与几种癌症的进展和扩散的广泛证据和增强对它在疾病中作用的理解已经在c-Met和HGF作为癌症药物开发中的主要靶方面激发巨大兴趣。这已经导致开发多种具有潜在临床应用的c-Met途径拮抗药。开发途径选择性抗癌药物的三种主要方案包括拮抗配体/受体相互作用、抑制酪氨酸激酶催化活性和阻断受体/效应子相互作用。
几种c-Met拮抗药目前处于临床研究中。这些药剂中有几种(包括单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂)的初步临床结果已经是令人鼓舞的。有趣地，存在c-Met放大的患者对酪氨酸激酶抑制剂不作出反应。几种多重靶向疗法也已经处于临床研究中并且已经展示前景，尤其就酪氨酸激酶抑制而言。
c-Met受体酪氨酸激酶可以在许多恶性肿瘤中过量表达并且在生物学功能和生物化学功能方面是重要的。c-Met受体的活化可以导致增加的细胞生长、侵入、血管生成和转移。对于c-Met，已经在酪氨酸激酶结构域、近膜结构域或脑信号蛋白结构域内部鉴定到扩增和/或激活突变。众多治疗策略已经用来抑制c-Met。几个临床试验正在对各种恶性肿瘤研究c-Met和其配体(肝细胞生长因子)。就这一点而论，用于剖析患者肿瘤组织、全血或细针头抽吸物(FNA)样品中存在的癌细胞中c-Met表达和/或磷酸化的方法为总体疾病发病机理提供了有价值的深入了解，并且因此导致更好地选择抗癌疗法。见，例如，PCT公开号2011/008990的图3和图4，所述专利出于全部目的通过引用的方式完整并入本文作为参考。
一旦在微阵列表面上捕获靶蛋白，则本文所述的多通道蛋白质微阵列平台(例如，CEER)利用独特的免疫复合物的形成，其中所述独特的免疫复合物的形成要求两种探测物和酶缀合的抗体共定位。邻近的两种探测酶(葡萄糖氧化酶(GO)和辣根过氧化物酶(HRP))之间的信道事件使得以极端灵敏度剖析受体酪氨酸激酶(RTK)如c-Met成为可能。鉴于要求3种不同抗体同时结合，故分析特异性大大增强。具体而言，这种多通道邻近测定法基于(1)多通道蛋白质微阵列平台，其与(2)三重抗体-酶信道信号放大过程组合。三重抗体-酶方案提供了独特和新颖的设计，所述方案赋予超高灵敏度，同时保留特异性：
(1)选择的靶由微阵列表面上以系列稀释物方式印刷的靶特异性抗体捕获。对于后续信道事件/每个结合的靶蛋白，这种模式要求两个额外探测物-与酶连接的抗体共定位(见，例如，PCT公开号2011/008990的图5，所述专利出于全部目的通过引用的方式完整并入本文作为参考)。
(2)通过捕获抗体初始靶结合和GO(105/分钟的TON)缀合抗体次级结合所形成的免疫复合物可以在GO底物葡萄糖存在下产生H2O2，其中所述GO缀合抗体识别所捕获的靶分子上的另一个表位。
(3)靶特异性H2O2局部流随后被用HRP缀合的磷酸肽特异性抗体(104/分钟的TON)利用，其中所述磷酸肽特异性抗体与所捕获靶上的磷酸化肽结合，因此放大靶特异性信号。鉴于要求3种不同类型的抗体同时结合，检测磷酸化靶的特异性通过协同性免疫检测和扩增过程而大大增加。通过这种方法常规地实现对少至约2-3x104个磷酸化事件的检测和定量，使其检测达到“单”细胞水平。在某些情况下，这种协同性免疫测定设计可以进一步适用于研究蛋白相互作用和活化。
表3显示患有存在c-Met表达、突变或活化的原发肿瘤的患者的百分比。有趣地，在胃癌中存在MET扩增的患者对c-Met抑制剂不作出反应。
表3
Figure BDA00003704294601041
已经展示c-Met与激酶如RON、EGFR、HER2、HER3、PI3K和SHC相互作用并磷酸化激酶。c-Met可以也与其他激酶(例如，p95HER2、IGF-1R、c-KIT和其他)相互作用。使用患者的肿瘤组织、全血(例如，循环型肿瘤细胞)或FNA样品，本文所述的多通道蛋白质微阵列可以用来探查这些激酶及其途径中的一种或多种的状态。这种测定法的结果使得为每位个体患者确定正确抗癌疗成为可能。
PCT公开号2011/008990(所述专利出于全部目的通过引用的方式完整并入本文作为参考)的图6显示用于确定以下标志物的表达和/或活化状态的本发明示例性可寻址阵列：c-MET、HER1/ErbB1、HER2/ErbB2、p95ErbB2、HER3/ErbB3、IGF-1R、RON、c-KIT、PI3K、SHC、VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。使用邻近测定法微阵列模式查询这些受体酪氨酸激酶和它们的途径可以有利地预测患者对特定c-Met抑制剂疗法的反应。作为非限制性例子，对XL-880作出反应的患者将具有活化的c-MET和VEGFR2，而非应答个体将具有活化的多种RTK的组合。重要地，这种邻近测定法微阵列平台也可以用来选择适宜的联合疗法。例如，具有活化的c-MET、VEGFR2和EGFR的患者应当用易瑞沙+XL880的组合治疗，而具有活化的c-MET、VEGFR2、ErbB1、ErbB2、ErbB3和p95ErbB2的患者应当用Tykerb+XL880治疗。
这种多通道邻近介导的平台有利地为检测有限量的样品中RTK(如c-Met)的活化提供单细胞级灵敏度。就这一点而论，可以剖析从转移性癌症患者获得的肿瘤组织、循环型肿瘤细胞(CTC)和/或mFNA样品以便为制定疗法和影响临床实践提供有价值的信息。
实施例5.癌症疗法的系列剖析和监测
基于肿瘤组织系列采样的激酶和其他信号转导途径分子的表达/活化谱提供了关于肿瘤细胞中随时间和疗法变化而出现的变化的有价值信息。对肿瘤进展的这种时序剖析使得临床医生能够快速监测每位患者中正在演变的癌症标签。本实施例显示一种检测参与癌症的受体酪氨酸激酶(RTK)途径的表达水平和磷酸化程度的新颖和稳健的测定法，并且展示使用这种具有单细胞水平灵敏度的指导治疗的诊断***的优点。这种测定法总体上依赖于样品如肿瘤组织(例如，肺肿瘤)、细针头抽吸物(FNAs)和血液，并且为探查从这类样品所获得的有限量的癌细胞实现高灵敏度和特异性。
本文所述的多通道蛋白质微阵列平台(例如，CEER)可以用来探查与涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤(例如，肺癌)相关的激酶和其他信号转导途径分子的表达/活化。就这一点而论，用于剖析患者肿瘤组织、全血或细针头抽吸物(FNA)样品中存在的癌细胞中癌症标志物的方法为总体疾病发病机理提供了有价值的深入了解，并且因此导致更好地选择抗癌疗法。
作为非限制性例子，可以从肺癌患者获得使用本文所述的邻近测定法(例如，CEER)进行RTK途径探查的肿瘤组织、全血或FNA样品。备选地，用于途径分析的样品可以通过切割或进行冷冻FNA操作而从冷冻的组织获得。在某些情况下，组织切片法是用于后续谱分析的冷冻标本的优选方法，而相对地非侵入性FNA操作是用于临床环境下从患者(和异体移植物)获得样品的优选方法。
可以通过以下方法收集冷冻的组织样品：
选项#1.组织切片采集：
1.保持塑料称量舟于干冰上，在所述塑料称量舟中将进行样品的切割。
a.为冷冻材料，使剃须刀片或切片机刀片、细镊子和预标记样品采集小瓶保持在干冰上。
2.从-80℃冰箱取出冷冻的人癌组织并且将样品立即转移到干冰上。
3.将冷冻的组织置于干冰上的称量舟，使用剃须刀片或切片机刀片切成冷冻组织小片(10μm切片x3)，并且使用预冷的镊子，将组织转移至预冷和预标记的样品采集小瓶中。
4.关闭瓶盖并使其保持在干冰上。
5.将采集的标本首先置入双层塑料袋并随后置入存在足够量干冰的聚苯乙烯容器泡沫塑料（styrofoam）(主容器)中。
a.使用至少6-8磅干冰。在夏季月份使用更多干冰。
注：确切干冰量将在咨询货运公司后确定。
b.向从事国际货运流程的货运公司咨询必要的许可和文件记录。
c.不得使用水冰(wet ice)或冷却剂(即，冷却包（Cool Packs）)。
6.确信申请和样品清单置于盒子中但是在双层袋之外。
7.牢固密封容器并且标示“冷冻组织-不得融化”。
选项#2.来自冷冻组织的FNA制备物：
1.从-80℃冰箱取出冷冻的人癌组织并且将样品小瓶立即转移到干冰上。
2.准备的用于FNA操作的样品应当置于水冰上10分钟以软化这种组织。
3.应当通过以下方式进行FNA样品采集：将23或25号针头穿过软化的冷冻组织5至10次。将剩余的样品小瓶返回至干冰。
4.用醇擦拭FNA样品采集小瓶盖。
5.应当通过直接注射至含有100μl“蛋白质晚期溶液”(PrometheusLaboratories；San Diego,CA)的采集小瓶中收集冷冻的FNA组织。通过温和混合内容物分配采集的组织材料。
6.用一只手牢固握住FNA采集小瓶并且用手指快速叩击(约15次)以确保彻底的细胞裂解(如果可能，涡旋混合10秒)。
7.将采集的标本首先置入双层塑料袋并随后置入存在足够量冷却包的聚苯乙烯泡沫塑料容器(主容器)中。
a.向从事国际货运流程的货运公司咨询必要的许可和文件记录。
8.确信申请和样品清单置于盒子中但是在双层袋之外。
9.牢固密封容器并且标示“生物标本”。
这种多通道邻近介导的平台有利地为检测多种RTK及其途径随时间推移的表达和/或活化以便检测肿瘤细胞中随时间和疗法变化而出现的变化提供了单细胞级灵敏度。对肿瘤状态的这种时序剖析(例如，通过随时间推移进行肿瘤组织或其他样品的系列采样)使得临床医生能够快速监测每位患者中正在演变的癌症标签，并且为制定疗法和影响临床实践提供有价值的信息。
实施例6.通过基因表达群确定原发起源组织后选择用于治疗的患者
大约3%至5%的全部转移性肿瘤划归为原发不明的癌症(CUP)的类型。正确诊断来源组织在治疗决策中重要，因为当前疗法很大程度上基于解剖部位。例如，基因表达群可以用于鉴定转移性肺癌的患者，所述患者将从与给予起初诊断患有肺癌的患者的疗法一致的疗法中获益。合适的***包括但不限于Rosetta Genomics CUP测定法，其通过分析微RNA的表达模式将癌症和起源组织分类(见，例如，PCT公开号WO 08/117278)；Aviara DX(Carlsbad,CA)Cancer TYPE IDTM测定法，一种测量92个基因以鉴定39个肿瘤类型的原始起源部位的基于RT-PCR的表达测定法；和PathworkTM组织起源试验(Sunnyvale,CA)，其在微阵列上测量超过1600个基因的表达并且将肿瘤基因表达“标签”针对15个已知组织类型的那些标签进行比较。一旦已经鉴定患者以肺作为原发性癌症的组织，则途径活化谱可以用来选择在治疗方案中包括适宜的靶向疗法。
以下操作方案提供了本发明的示例性实施方案，其中基因表达谱与活化状态谱联合使用，以便选择适宜的靶向疗法或靶向疗法组合，用于治疗涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤如肺癌：
1)从患者获得具有7μm厚组织切片的两块或更多块载玻片，所述组织切片以手术方式或通过细针头活组织检查法从转移性肿瘤取得。将这些细胞在***中固定并且在石蜡(FFPE)中包埋。用H&E染色相同肿瘤的一块额外载玻片。
2)病理学家查看H&E载玻片并且指出用于CancerTYPE IDTM测定法待采集的区域。将载玻片送至Aviara DX用于分析。
3)来自Aviara DX的检验报告显示了如从k-最近邻域分析所测定的前5个最有可能的起源部位，并且获得预测。作为非限制性例子，如果患者的预测结果是肺作为未知来源的肿瘤，则可以对患者的肿瘤细胞评估途径活化。
4)将肿瘤细胞(例如，CTC)从血液分离并且如PCT公开号WO2011/0089900的实施例1(所述专利出于全部目的通过引用的方式完整并入本文作为参考)中所述那样制备用于分析。备选地，细针头活组织检查样品可以用来如PCT公开号WO 2011/008990的实施例2(所述专利出于全部目的通过引用的方式完整并入本文作为参考)中所述那样制备肿瘤细胞提取物。如本文中实施例1或实施例2中所述那样分析细胞制备物。将活化谱按照与如本文实施例4或实施例5中所述的相似方式评价。随后选择适宜的靶向疗法或靶向疗法组合。
实施例7.用于定量癌细胞中信号转导途径蛋白的数据分析。
本实施例显示针对特定目的分析物所产生的标准曲线定量一种或多种分析物如一种或多种信号转导蛋白在生物样品(例如，血液或肿瘤组织)中的表达水平和/或活化水平。
在一些实施方案中，每块CEER载玻片以3种光电倍增器(PMT)增益设置扫描以改善灵敏度并且减少饱和度的影响。Perkin Elmer ScanArrayExpress软件用于点找寻和信号定量。从GenePix Array List(.gal)文件输入每个点的识别码。将载玻片上每份临床样品的去识别研究专用编号并入所得到的数据集中。
在其他实施方案中，将背景校正的信号强度针对一式三份印刷的重复点进行平均化。从每份样品扣除相应试剂空白的相对荧光值。将几项品质标准用来过滤来自其他分析的数据，所述数据包括对点覆盖区(spotfootprint)的限值、点重复(spot replicate)的变异系数、总垫块背景和试剂空白的强度。
对于每个测定法，可以从多个(例如，2、3、4、5、6、7个等)浓度的系列稀释的细胞裂解物产生S形标准曲线，其中所述细胞裂解物从细胞系如MD-468(HER1阳性)、SKBr3(HER2阳性)、BT474(HER2和p95HER2阳性)、HCC827(c-MET和HER1阳性)、以IGF刺激的T47D(IGF1R阳性)和/或以HRG刺激的T47D(HER3阳性)制备。可以将每条曲线作为信号强度的函数相对于对数浓度衍生单位CU(计算的单位)作图。数据可以通过非线性回归对一个5参数方程(5PL)拟合(Ritz,C.和Streibig,J.C.,J.Statistical Software,12,1-22(2005))，同时拟合捕获抗体的全部3种稀释物。使用R(一种开放源统计软件包)(Development Core Team,R:A languageand environment for statistical computing(R：一种用于统计计算的语言和环境).R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria.ISBN3-900051-07-0,URL http://www.R-project.org.R(2008))实施拟合。为了避免数学模型过度参数化并因而改善准确度，可以约束4个参数，同时可以对单个拐点解析每种稀释物。这个过程可以对45、50和60的每个PMT增益设定进行重复。从捕获抗体的3种稀释物和3次PMT扫描中，这导致每个测定法生成的9条标准曲线。该测定法中的内置冗余性允许消除一种或多种稀释物/扫描组合(如果标准曲线的拟合具有小于0.95的R2)，并且因此改善后续预测。
(基于标准曲线的)CU计算－来自每一条标准曲线(例如，3个捕获抗体稀释物和3次PMT增益设定扫描)的各个预测可以合并成单一最终预测。对于每个预测，计算标准曲线上点的斜率。这个斜率用x-轴上的对数单位求取，即，斜率的分母中的单位是对数计算的单位(CU)。接着，计算各预测的加权平均数，其中从斜率确定权重。具体而言，将权重加合，并且给予每个点一个与其斜率除以总斜率相等的权重。每个测定法可以针对已知对照的预测结果来验证。
实施例8.检测和定量高加索人患者NSCLC样品中致癌蛋白总水平和活化蛋白水平。
本实施例显示一种用于检测和定量恶性肿瘤组织中蛋白质水平的方法，所述恶性肿瘤组织从患有非小细胞肺癌(NSCLC)的高加索人患者中以活组织检查法取得。在一个具体实施方案中，本发明方法使检测并计量与NSCLC相关的多种生物标志物的表达水平成为可能，所述生物标志物是例如但不限于cMET、HER1、HER2、HER3、PI3K、SHC和CK。该方法也可以检测和定量总蛋白和活化(例如，磷酸化)蛋白在从患者肺肿瘤组织收获的相同生物样品中的水平。
在某些实施方案中，使用多通道蛋白质微阵列平台测定法如CEER确定蛋白质水平和活化的蛋白水平。可以检测和定量多种全长蛋白和修饰(即，截短、磷酸化和/或甲基化)蛋白的表达水平。可以通过与对照蛋白(如但不限于IgG和CK)的比较定量蛋白质的表达水平。在某些实施方案中，可以确定和直接比较多种致癌蛋白如配体、受体和下游信号传导效应子的共表达水平。
在某些实施方案中，本发明中使用的生物样品可以从收集自NSCLC患者的肿瘤组织样品中分离。这种肺肿瘤组织可携带与酪氨酸激酶抑制剂耐药性相关的激活性遗传突变。在NSCLC中，KRAS突变(例如，G12C、G12D、G12R和/或G12V)与EGFR TKI的原发耐药性相关并且EGFR突变T790M主要与继发或获得耐药性相关。
图1显示，HER1和HER2蛋白的水平在来自高加索人患者的大部分NSCLC肿瘤样品中非常低。相反，HER3蛋白和cMet蛋白在超过50%患者的样品中以中等至高水平表达。在图1中，在阵列上清晰地可见到HER1、HER2、HER3、cMET、CK、PI3K和SHC蛋白的总水平。图1也显示本文所述的方法可以用来检测在具有KRAS突变如但不限于G12C、G12D、G12V、或者G12R，G12C的纯合突变NSCLC样品中的蛋白质表达。图2C、图2D、图3C和图3D提供在NSCLC肿瘤样品中检测到的蛋白质表达谱的更多图示。具体而言，这些图显示，HER1、HER2、HER3和cMET的表达水平可以划分成3个不同类别的表达：高、中等和低水平表达。图4B提供HER1、HER2、HER3、cMET和CK在从51位患有NSCLC的高加索人患者所收集的肿瘤组织中的表达水平的汇总图。图5显示可以比较多种蛋白的蛋白水平以确定致癌性信号传导分子之间的关系。图5显示高cMET表达与来自高加索人患者的NSCLC样品中的中等至高HER3表达相关。图5也显示与亚洲人患者相比，高加索人患者倾向于具有高的cMet水平。图6显示表达高水平总cMET和HER3蛋白的两位患者的例子，所述患者也表达磷酸化的cMET、HER3和PI3K。
实施例9.检测和定量亚洲人患者样品中致癌蛋白总水平和活化蛋白水平
本实施例显示一种用于同时检测和定量恶性肿瘤组织中致癌蛋白水平的方法，所述恶性肿瘤组织从患有非小细胞肺癌(NSCLC)的亚洲人患者中以活组织检查法取得。在一个具体实施方案中，本发明方法使检测并计量从患者肿瘤组织中收获的生物样品中多种致癌蛋白(例如，cMET、HER1、HER2、HER3、PI3K、SHC和CK)的表达水平以及其活化(例如，磷酸化)形式的表达水平成为可能。
在某些实施方案中，使用COPIA(也称作CEER)阵列确定总蛋白水平和活化蛋白水平。可以检测和定量多种全长蛋白和修饰(即，截短、磷酸化和/或甲基化)蛋白的表达水平。可以通过与对照蛋白(如但不限于IgG)的比较定量总蛋白的表达水平。在某些实施方案中，可以测量并且在生物样品之间直接比较多种致癌蛋白如配体、受体和下游信号传导效应子的共表达水平。
在某些实施方案中，本发明中使用的生物样品可以从患有NSCLC的患者分离。从这些患者收获的肺肿瘤样品可含有与酪氨酸激酶抑制剂耐药性相关的激活性遗传突变。在NSCLC中，KRAS突变与EGFR TKI的原发耐药性相关并且EGFR突变T790M主要与继发或获得耐药性相关。
在某些实施方案中，使用CEER测定法检测到的蛋白质表达的动态范围可以基于相对荧光单元(RFU)值划分成3个独立组。确立了HER1表达的范围，对于低水平表达是1-10,000RFU；对于中等水平表达是10,000-36,000RFU；并且对于高水平表达是36,000和以上。低于50,000RFU的HER2表达定义为低，并且高于50,000RFU设定为中等表达。对于HER3，低于5,000RFU视为低表达；5,000-30,000RFU是中等表达；并且超过30,000RFU是高表达。在某些实施方案中，cMET的低水平处于小于10,000RFU；中等水平为10,000-40,000RFU；并且高水平为超过40,000RFU。
图7显示HER1、HER2、HER3、cMET、PI3K、SHC和CK在29位患有NSCLC的亚洲人患者样品中的表达水平的动态范围。具体而言，约48%的患者表达高水平的HER1，并且大部分患者表达低水平的HER2、HER3和cMET。非常低百分比的采样患者共表达高水平的cMET和HER3(29位患者中有1位)。这与高加索人患者中进行的研究相反，在所述研究中，51份NSCLC肿瘤样品中有27份共表达高水平的cMET和中等至高水平的HER3。图2A、图2B、图3A和图3B提供来自NSCLC亚洲人患者的组织样品中HER1、HER2、HER3和cMET表达谱的更多图示。基于来自CEER测定法的扩展的RFU值，可以将表达水平划分成3个不同类别。图4A提供HER1、HER2、HER3、cMET和CK的表达谱的汇总图。图5显示低表达的cMET在亚洲人患者样品的队列中最占优势。图5也显示4位患有NSCLC的亚洲人患者表达中等水平的cMET和高水平的HER3。图8说明从亚洲人患者收获的NSCLC肿瘤样品显示出变化的VEGFR2表达水平。具体而言，29份患者样品中有6份显示高水平的VEGR2并且3位患者显示中等水平的VEGR2。
实施例10.检测cMET、HER1、HER2、HER3、IGF-1R、c-Kit、PI3K、SHC和CK在多种癌细胞系中的活化水平
本实施例显示了对cMET、HER1、HER2、HER3、IGF-1R、c-Kit、PI3K、SHC和CK蛋白在刺激或抑制cMET后的癌细胞系中的活化(磷酸化)水平的检测。在一些实施方案中，使用邻近测定法如CEER，可以测量与针对EGFR TKI疗法的原发和/或继发性耐药性相关的致癌蛋白的存在和/或活化状态。
在一个具体实施方案中，来自人癌细胞系的细胞(例如，从来自患者的胃癌的肝转移灶中建立的NCI-N87细胞系；Park等人,Cancer Res.,50:2773-2780,1990)用不同浓度的cMET抑制剂处理。使用高度灵敏的CEER阵列，检测了细胞中与癌症相关的蛋白质的表达水平和活化水平。剂量反应曲线用来计算指示所分析蛋白质的抑制状态和活化状态的EC50值。
图9显示cMET抑制剂特异性抑制N87细胞中的cMET活化。比较图9A、图9B和图9C中的药物应答曲线以及图9D中的汇总图，显示增加的抑制剂浓度造成磷酸cMET的EC50值增加，这表明cMET抑制。使细胞暴露于1x浓度的cMET抑制剂明显地诱导PI3K活化，如EC50剧烈下降所指示。图9D也显示HER3在cMET抑制剂存在下略微活化。增加cMET抑制剂的浓度至2x引起PI3K活化进一步增加，表明本实验中的磷酸化PI3K归因于一条cMET非依赖性信号传导途径。
在一个具体实施方案中，来自NSCLC细胞系(例如，具有EGFR-激活性突变的HCC827细胞或其他吉非替尼敏感性肺腺癌细胞；美国典型培养物保藏中心，Manassas,VA)的细胞用不同的浓度的配体或信号传导分子(例如，cMET受体配体，HGF)处理。使用CEER阵列以高度灵敏测量了处理过的细胞中与癌症相关的蛋白质的表达水平和活化水平。通过变动暴露于癌细胞的配体量，使所分析蛋白质的表达谱与用来刺激细胞的配体的量相关。剂量反应曲线用来计算EC50值，所述EC50值可以用来解读所分析蛋白质的抑制状态和活化状态。
图10显示在HGF刺激后的HCC827细胞中蛋白表达的差异。图10A显示活化的cMET、HER1、HER2、HER3、IGF-1R、c-Kit、PI3K、SHC和CK蛋白的表达水平响应于变动的HGF水平。图10B显示HGF有效活化cMET，而另一方面，HGF减少HER1、HER2和HER3活化，如HGF处理后增加的EC50值所确定。图10E显示HGF和cMET结合作用干扰HER3活化，并且较低程度地干扰HER1和HER2(也见图10C和10D)。
本实施例显示cMET与HER1、HER2和HER3相互作用。虽然这种相互作用微弱，但它足以转磷酸化并激活HER1、HER2和HER3。当cMET与HGF结合时，复合物形成稳定的同型二聚体，后者不与HER1、HER2和HER3相互作用。这导致HGF刺激后减少了磷酸化的HER1、HER2和HER3。
实施例11.对患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤的患者选择抗癌药物疗法
本实施例显示一种对患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤的受试者确定适宜疗法选择的方法。这种方法基于使用例如本文所述的协同酶增强反应性免疫测定法(CEER)时，信号传导转导途径蛋白(例如，HER1，HER2、HER3、cMet、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、截短的cMet和/或截短的HER3)的分析物在受试者肿瘤组织样品中的表达/活化谱。此外，基于从受试者中对肿瘤组织系列采样的激酶和其他信号转导途径组分的表达/活化谱提供了关于肿瘤细胞中随时间和治疗方案变化而出现的变化的有价值信息。对肿瘤进展的这种时序剖析使得临床医生能够快速监测每位受试者中正在演变的癌症标签。本实施例显示了使用本发明的方法，基于多种信号传导途径组分在受试者肿瘤组织样品中的表达/活化谱而预测受试者对疗法的反应。
作为一个非限制性例子，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤(如，但不限于乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌和甲状腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC))的患者将因表达HER3、HGF/SF和cMet转录物和蛋白而可能对cMet抑制剂作出反应。cMet抑制剂的例子包括但不限于单克隆抗体，如AMG102和MetMAb；cMet的小分子抑制剂，如ARQ197、JNJ-38877605、PF-04217903、SGX523、GSK1363089/XL880、XL184、MGCD265和MK-2461，及其组合。在另一个方面，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤如NSCLC的患者将因表达HER3、HGF/SF和cMet而可能对cMet抑制剂作出反应，其中所述恶性肿瘤具有KRAS突变。在本发明的另一个方面，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤如NSCLC并且表达活化型PI3K的患者将因表达cMet和HGF/SF而可能对cMet抑制剂作出反应。在另一个非限制性例子中，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤如NSCLC的患者将因cMet的活化(例如，磷酸cMet)或cMet和HER3的共激活(例如，磷酸cMet和磷酸HER3)而可能对cMet抑制剂作出反应。在另一个方面，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤如NSCLC的患者将因表达截短的cMet蛋白和高表达HER3而可能对cMet抑制剂作出反应。在又一个方面，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤如NSCLC的患者将因表达截短的HER3蛋白和高表达cMet而可能对cMet抑制剂作出反应。在另一个非限制性例子中，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤如NSCLC的患者将因cMet表达和活化而可能对cMet抑制剂作出反应。在一个额外的非限制性例子中，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤如NSCLC的患者将因cMet和HER3的表达和活化，连同HER1和HER2的低表达而可能对cMet抑制剂作出反应。
本实施例说明，基于使用如本文所述的协同酶增强反应性免疫测定法(CEER)时，信号传导转导途径蛋白(例如，HER1，HER2、HER3、cMet、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、截短的cMet和/或截短的HER3)的分析物在受试者肿瘤组织样品中的表达之间的差异，确定是否向患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤的受试者仅施用cMet抑制剂或施用与途径定向疗法组合的cMet抑制剂。
途径定向疗法包括使用治疗药治疗患者的疾病，其中所述治疗药可以改变一种或多种信号传导途径组分的表达水平和/或活化水平。途径定向疗法的非限制性例子包括cMet抑制剂、EGFR抑制剂、VEGFR抑制剂、泛HER抑制剂及其组合。cMet抑制剂的例子包括但不限于中和抗体如MAG102(Amgen)和MetMab(Roche)以及酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)如ARQ 197、XL 184、PF-02341066，GSK1363089/XL880、MP470、MGCD265、SGX523、PF04217903、JNJ38877605及其组合。EGFR抑制剂的例子包括但不限于西妥昔单抗、帕尼单抗、马妥珠单抗、尼妥珠单抗、ErbB1疫苗、厄洛替尼、吉非替尼、EKB569、CL-387-785及其组合。VEGF抑制剂的例子包括但不限于贝伐珠单抗(阿瓦斯汀)、HuMV833、VEGF-Trap、AZD2171、AMG-706、舒尼替尼(SU11248)、索拉替尼(BAY43-9006)、AE-941(Neovastat)、瓦他拉尼(PTK787/ZK222584)及其组合。泛HER抑制剂的非限制性例子包括PF-00299804、奈拉替尼(HKI-272)、AC480(BMS-599626)、BMS-690154、PF-02341066、HM781-36B、CI-1033、BIBW-2992及其组合。
作为一个非限制性例子，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤(如，但不限于乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌和甲状腺癌和非小细胞肺癌)的患者将因EGFR、HER2和HER3的共激活，连同表达cMet可能对cMet抑制剂与途径定向疗法的组合作出反应并且应当接受包含cMet抑制剂与途径定向疗法的组合。在一个具体情况下，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤(如NSCLC)的患者将因cMet、EGFR和HER2的表达和活化而可能对包含cMet抑制剂和EGFR抑制剂的联合疗法作出反应。在另一方面，如果在患者的肿瘤样品中确定了HER2和HER3的共激活，则确定该患者将可能耐受包含cMet抑制剂和EGFR抑制剂的联合疗法。在另一个方面，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤(如NSCLC)的患者将因cMet、HER2和HER3的共表达以及PI3K的活化而可能对与途径定向疗法组合的cMet抑制剂作出反应。在另一个具体情况下，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤(如NSCLC)的患者将因cMet和HER3的表达和活化，连同VEGFR1、VEGFR2和/或VEGFR3的表达和活化而可能响应于并且应当接受包含cMet抑制剂和EGFR抑制剂的联合疗法。在另一个非限制性例子中，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤(如NSCLC)的患者将可能对cMet抑制剂和途径定向疗法的联合疗法作出反应，其中所述恶性肿瘤具有EGFR突变和cMet的表达。
在一个非限制性例子中，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤(如，但不限于乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌和甲状腺癌和非小细胞肺癌)的患者将因cMet、VEGFR2(见例如图8)，和EGFR的共激活而可能对与易瑞沙(即，吉非替尼)和VEGFR抑制剂组合的cMet抑制剂作出反应。在另一个非限制性例子中，患有涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤如NSCLC的患者将因cMet、VEGFR2、EGFR、HER2、HER3和截短HER2蛋白(例如，p95HER2)的共激活而可能对采用cMet抑制剂、VEGFR抑制剂和Tykerb(即，拉帕替尼)的联合疗法作出反应。
实施例12.在NSCLC患者中基于匹配差异性蛋白表达谱和突变谱选择靶向剂
本实施例提供一项随访研究，所述研究进一步显示一种用于检测和定量恶性肿瘤组织中蛋白质水平的方法，所述恶性肿瘤组织从患有非小细胞肺癌(NSCLC)的亚洲人患者和高加索人患者中以活组织检查法取得。在一个实施方案中，本发明方法使得检测并计量与NSCLC相关的多种生物标志物的表达水平和/或活化水平成为可能，所述生物标志物包括但不限于EGFR、ErbB2、ErbB3、cMET、IGF1R、cKIT、Shc、PI3K、AKT、ERK、VEGFR2、Src、FAK、Stat5、JAK2和CrKL。该方法也可以检测和定量总蛋白和活化(例如，磷酸化)蛋白在从患者肺肿瘤组织收获的相同生物样品中的水平。
背景：
用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗非小细胞肺癌(NSCLC)显示最初的缓解，但是大部分肿瘤对TKI形成获得性耐药抗性，原因在于继发性耐药突变(例如，T790M)和其他RTK的扩增。仅基于基因型针对单药疗法分层的患者不是充分的，因为其他激酶对肿瘤细胞的存活有贡献，并且因此有必要抑制多种激酶。
方法：
协同酶增强反应性免疫测定法(CEER)是要求两种检测物-酶缀合的抗体共定位的多通道蛋白质微阵列平台。CEER能够从活组织样品如细针头抽吸物(FNA)和循环型肿瘤细胞(CTC)进行高灵敏度检测。在一些情况下，使用23-35号针采集样品。从冷冻的组织制备裂解物，其中所述冷冻的组织从71位高加索人和29位亚洲人NSCLC患者手术获得。剖析EGFR、ErbB2、ErbB3、cMET、IGF1R、cKIT、Shc、PI3K、AKT、ERK、VEGFR2、Src、FAK、Stat5、JAK2、CrKL和其他途径蛋白的表达和活化。对全部样品就KRAS、EGFR和BRAF中的突变群进行基因分型。
结果：
我们已经在亚洲人患者和高加索人患者之间观察到差异性表达模式。KRAS在30%的全部患者中突变。在亚洲人患者中，与高加索人(3%)相比，EGFR过量表达更高(27%)。高加索人患者表现出高的HER3(58%)、cMET(25%)，以及cMET和HER3共表达(27%)。VEGFR2在17%的全部患者中高度表达。过量表达cMET、HER3和HER2的患者将从泛HER抑制剂和cMET抑制剂的组合中获益。过量表达cMET和EGFR的那些患者将从cMET抑制剂和EGFR抑制剂中获益。最后，过量表达VEGFR2和cMET的那些患者将从cMET和VEGFR抑制剂中获益。本文所述的方法可以针对所测试的全部RTK蛋白和信号传导蛋白，为每种NSCLC亚群体提供综合差异性生物标志物现患率分析。
结论：
基于基因型的单药疗法和患者选择不是疗法选择的有效标准。取而代之的是，使用FNA/CTC的综合性途径谱应当指导适宜疗法(例如，组合或按顺序)的选择，并且应当就适宜的反应监测途径谱中的变动。
本说明书中引用的全部出版物和专利申请通过引用的方式并入本文，如同特别地且逐一地指明每份单独的出版物或专利申请皆通过引用方式并入一样。虽然出于清楚理解目的，已经通过例示和实施例以某种细节描述了前述发明，但是本领域普通技术人员在本发明教导内容的影响下将轻易地明白，可以对本发明作出某些变化和修改而不脱离所附权利要求的精神或范围。

Claims (53)

1.用于对患有涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤的受试者选择疗法的方法，所述方法包括
(a)检测和/或定量cMet蛋白在取自所述受试者的样品中的表达水平和/或活化水平；
(b)检测和/或定量HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平；
(c)将cMet蛋白和/或HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平与(i)对照蛋白的表达水平和/或活化水平和/或(ii)cMet蛋白和/或HER3蛋白在对照样品中的表达水平和/或活化水平比较；和
(d)基于cMet蛋白和/或HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平相比于所述对照蛋白和/或对照样品之间的差异，确定是否仅施用cMet抑制剂或施用与途径定向疗法组合的cMet抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照蛋白包括IgG。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述对照样品包含不具有涉及异常c-Met信号传导的所述恶性肿瘤的细胞系或组织样品。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述cMet抑制剂选自多重激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体、和它们的组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂选自ARQ197、XL184、PF-02341066、GSK1363089/XL880、MP470、MGCD265、SGX523、PF04217903、JNJ38877605、和它们的组合。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述单克隆抗体选自MetMab、AMG102、和它们的组合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤是选自乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌、和它们的组合的成员。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括当确定cMet蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述受试者是高加索人。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中cMet蛋白的活化水平对应于cMet蛋白的磷酸化水平。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括当确定HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中HER3蛋白的活化水平对应于HER3蛋白的磷酸化水平。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，还包括检测和/或定量HER1蛋白、HER2蛋白、HGF/SF蛋白的表达水平或它们的组合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(d)还包括当在所述样品中HER1蛋白的表达水平和HER2蛋白的表达水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比低时，确定应当仅施用cMet抑制剂。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中步骤(d)包括当确定HGF/SF蛋白在所述样品中的表达水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述受试者具有KRAS突变。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述KRAS突变是选自G12C、G12D、G13D、G12R、G12V的成员、和它们的组合。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中步骤(d)包括当所述KRAS突变存在于所述样品中并且各自独立地确定cMet蛋白、HER3蛋白和HGF/SF蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括当确定cMet蛋白在所述样品中的表达水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比范围从低至中等时并且当cMet蛋白的活化水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括当确定HER3蛋白在所述样品中的表达水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比范围从低至中等时并且当HER3蛋白的活化水平与所述对照蛋白或对照样品相比高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，还包括检测和/或定量截短的cMet蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平。
23.根据权利要求22所述的方法，其中步骤(d)包括当所述截短的cMet蛋白在所述样品中的表达水平是可检测的并且确定HER3蛋白在所述样品中的表达水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，还包括检测和/或定量截短的HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平。
25.根据权利要求24所述的方法，其中步骤(d)包括当所述截短的HER3蛋白在所述样品中的表达水平是可检测的并且确定cMet蛋白在所述样品中的表达水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，还包括检测和/或定量PI3K蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平。
27.根据权利要求26所述的方法，其中步骤(d)包括当所述样品中PI3K蛋白被活化并且各自独立地确定cMet蛋白和HGF/SF蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定应当仅施用cMet抑制剂。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，还包括用EGFR突变对所述受试者基因分型。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述EGFR突变是选自外显子19中缺失、L858R、G719S、G719A、G719C、L861Q、S768I、外显子20中***、T790M的成员、和它们的组合。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中步骤(d)包括当所述EGFR突变存在时并且当确定cMet蛋白在所述样品中的表达水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定所述cMet抑制剂应当与途径定向疗法组合施用。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述途径定向疗法是EGFR抑制剂。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，还包括检测并定量EGFR蛋白、HER2蛋白、PI3K蛋白、VEGFR1蛋白、VEGFR2蛋白和/或VEGFR3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平。
33.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(d)包括当各自独立地确定EGFR蛋白、HER2蛋白和HER3蛋白在所述样品中的活化水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高并且确定cMet蛋白在所述样品中的表达水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定cMet抑制剂应当与途径定向疗法组合施用。
34.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(d)包括当确定PI3K蛋白在所述样品中的活化水平与所述对照蛋白或对照样品相比范围从中等至高并且各自独立地确定HER2蛋白、HER3蛋白和cMet蛋白在所述样品中的表达水平与所述对照蛋白或对照样品相比范围从中等至高时，确定cMet抑制剂应当与途径定向疗法组合施用。
35.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(d)包括当各自独立地确定cMet蛋白、EGFR蛋白和HER2蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定cMet抑制剂应当与途径定向疗法组合施用。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述途径定向疗法是EGFR抑制剂、泛HER抑制剂或它们的组合。
37.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(d)包括当各自独立地确定cMet蛋白、HER3蛋白和任意一种、两种或全部三种VEGFR1-3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平与所述对照蛋白和/或对照样品相比范围从中等至高时，确定cMet抑制剂应当与途径定向疗法组合施用。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述途径定向疗法是VEGFR抑制剂。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中用邻近双重检测测定法检测和定量cMet蛋白和/或HER3蛋白的表达水平和/或活化水平。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述邻近双重检测测定法是协同酶增强反应性免疫测定法(CEER)。
41.一种用于监测受试者中涉及异常cMet信号传导的恶性肿瘤的状态或监测具有所述恶性肿瘤的患者如何对疗法做出反应的方法，所述方法包括：
(a)检测和/或定量cMet蛋白在取自所述受试者的样品中的表达水平和/或活化水平的系列变化；
(b)检测和/或定量HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平的系列变化；和
(c)将cMet蛋白和/或HER3蛋白在所述样品中的表达水平和/或活化水平与(i)对照蛋白随时间推移的表达水平和/或活化水平和/或(ii)cMet蛋白和/或HER3蛋白在对照样品中随时间推移的表达水平和/或活化水平比较，
其中cMet蛋白和/或HER3蛋白随时间推移的增加表达水平和/或活化水平指示疾病进展或对所述疗法消极应答，和
其中cMet蛋白和/或HER3蛋白随时间推移的减少表达水平和/或活化水平指示疾病缓解或对所述疗法积极应答。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述对照蛋白包含IgG。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述对照样品包含不具有涉及异常c-Met信号传导的所述恶性肿瘤的细胞系或组织样品。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述疗法包括用cMet抑制剂治疗。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述cMet抑制剂选自多重激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体、和它们的组合。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂选自ARQ197、XL184、PF-02341066、GSK1363089/XL880、MP470、MGCD265、SGX523、PF04217903、JNJ38877605、和它们的组合。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述单克隆抗体选自MetMab、AMG102、和它们的组合。
48.根据权利要求41至47中任一项所述的方法，其中所述涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤是选自乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌、和它们的组合的成员。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述涉及异常c-Met信号传导的恶性肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)。
50.根据权利要求41至49中任一项所述的方法，其中使用临床结果指示所述疾病缓解或积极应答。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述临床结果选自应答率(RR)、完全应答(CR)、部分应答(PR)、稳定的疾病(SD)、直至进展的时间(TTP)、无进展生存(PFS)和总生存(OS)。
52.根据权利要求41至51中任一项所述的方法，其中用邻近双重检测测定法检测和/或定量cMet蛋白和/或HER3蛋白的表达水平和/或活化水平。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述邻近双重检测测定法是协同酶增强反应性免疫测定法(CEER)。
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