CN105891496A - 酪氨酸激酶抑制剂类靶向用药指导抗体芯片和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了两种用于酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物相关靶点蛋白活性检测的抗体芯片，包括基于基片的固相抗体芯片以及基于微珠的液态悬浮芯片，该抗体芯片所包含的检测指标涵盖了目前已上市的酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物的相关靶点。本发明还公开了四种运用该抗体芯片的检测方法，包括基于样本标记的单色荧光检测法、基于样本标记的双色荧光检测法、双抗夹心检测法以及利用液相悬浮芯片检测的方法。运用本发明对肿瘤患者手术切除样本进行检测，实现个性化有效治疗的用药指导。
Description
技术领域
本发明涉及生化医药技术领域，尤其涉及酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物个性化治疗指导的药物靶点蛋白活性检测的抗体芯片和检测方法。
背景技术
蛋白酪氨酸激酶(PTKs，protein tyrosine kinases)或酪氨酸激酶(TKs，tyrosine kinases)，特异地将蛋白质底物上的某些酪氨酸残基磷酸化，从而调节其功能的酶。可分为三类：①受体酪氨酸激酶，为单次跨膜蛋白；②胞质酪氨酸激酶，如Src家族、Tec家族、ZAP70家族、JAK家族等；③核内酪氨酸激酶，如Abl和Wee。根据PTK是否是细胞膜受体，分成受体型和非受体型。
受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)是最大的一类酶联受体，它既是受体，又是激酶，能够与配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。所有的RTKs都是由三个部分组成的：含有配体结合位点的细胞外结构域、单次跨膜的疏水α螺旋区、含有酪氨酸蛋白激酶活性的细胞内结构域。主要有表皮生长因子(EGF)受体，包括EGFR、HER2、ErbB4等成员；血小板生长因子(PDGF)受体和集落刺激因子1(CSF-1)受体，包括PDGFRA、PDGFRB、CSF1R、KIT等成员；胰岛素和***-1(IGF-1)受体，包括IGF1R等成员；神经生长因子(NGF)受体、成纤维细胞生长因子(FGF)受体、血管内皮生长因子(VEGF)受体和肝细胞生长因子(HGF)受体，包括VEGFR1(FLT-1)、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT-4)等成员。
迄今发现的蛋白酪氨酸激酶中多数是属于致癌RNA病毒的癌基因产物，也可由脊椎动物的原癌基因产生。超过50％的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，调节正常细胞的信号传递和发育，也与肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和凋亡密切相关。PTK功能的失调会导致其下游信号通路的激活，进而引起细胞增殖调节紊乱，导致肿瘤的形成。因此，以PTK为靶点的药物研发已经成为当前抗肿瘤药物研究的热点之一。
目前主要有两种途径可以终止酪氨酸激酶所介导的信号转导通路，一类是单克隆抗体，如曲妥珠单抗(Trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)；另一类是酪氨酸激酶抑制剂类(TyrosineKinase Inhibitors，TKIs)小分子药物。已经批准上市的TKI类抗肿瘤药物包括伊马替尼(Imatinib)、吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)、索拉非尼(Sorafenib)、达沙替尼(Dasatinib)、舒尼替尼(Sunitinib)、尼洛替尼(Nilotinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、鲁索利替尼(Ruxolitinib)、克唑替尼(Crizotinib)、维罗非尼(Vemurafenib)、凡德他尼(Vandetanib)、埃克替尼(Icotinib)、普纳替尼(Ponatinib)、卡波替尼(Cabozantinib)、瑞格非尼(Regorafenib)、伯舒替尼(Bosutinib)、阿西替尼(Axitinib)、拉多替尼(Radotinib)、阿法替尼(Afatinib)、曲美替尼(Trametinib)、达拉菲尼(Dabrafenib)、依鲁替尼(Ibrutinib)共24种，见表1，包括各自药物作用的靶点。恒瑞医药的重磅新药阿帕替尼(Apatinib)可抑制VEGFR酪氨酸激酶活性，阻断VEGF结合后的信号传导，导致肿瘤血管生成抑制。这是由中国肿瘤专家团队与民族制药企业历经10年，共同创新研发的全球第一个小分子抗血管生成靶向药物，该药物第一次在晚期胃癌被证实有确切疗效和安全性。目前进入三合一综合审评，获批进入倒计时。
表1目前上市的TKIs抗肿瘤药物[1]
[1]，作用靶点查询自DrugBank(http：//www.drugbank.ca/)与Therapeutic target database(http：//bidd.nus.edu.sg/group/TTD/ttd.asp)。
TKI类靶向药物的疗效虽得到广泛认可，但患者用药后的药效个体差异很大。大量的临床研究已经证实，TKIs的疗效/毒副作用与患者体内某些酪氨酸激酶的活性直接相关，见表1。因此，在患者接受抗肿瘤药物之前，对这些酪氨酸激酶的活性进行鉴定将有助于临床医生判别患者是否适合使用此类药物，减少药物毒副作用的发生，同时避免医疗资源的浪费。
同时，肿瘤作为一种复杂的疾病，其生长和存活不仅仅依赖于一种受体或信号通路，这使得作用于单一靶点的药物不能完全杀灭肿瘤细胞。研究表明不同靶点药物的联合使用能够抑制多个信号转导通路，诱导肿瘤细胞的凋亡，阻断新生血管的生成，抑制肿瘤细胞的增殖。因此，在患者接受抗肿瘤药物之前，对这些酪氨酸激酶的活性进行鉴定也有助于医生判别是否需要联合用药。
目前，影响酪氨酸激酶的活性包括其表达水平以及修饰水平的检测主要基于免疫印迹法(Western blot，WB)。然而WB法耗时、费力，难以同时进行批量蛋白的检测，不适合用于临床应用。尽管有些药物是针对靶点的突变而设计，然而这些突变归根结底也是模拟活性位点的修饰，或者促进活性位点的修饰。因此，迫切需要一种能同时检测酪氨酸激酶表达与修饰水平的高通量技术。
抗体芯片技术与基因芯片类似，利用抗原抗体结合的原理，在基片上将相应的抗体按照一定的规则固定排列，具备高通量的特点。尽管Full Moon、RayBio、R&D、CST、Merck公司拥有用于科研的类似产品，但所包含的检测指标只包括少量的TKI类抗肿瘤药物的作用靶点，产品并不聚焦于TKI类作用靶点，且基本不包括修饰位点的检测，难以应用于临床(表2)。
表2目前市场上类似的产品
发明内容
本发明提供了用于个性化治疗指导的酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物的相关靶点蛋白活性检测的抗体芯片以及检测方法。该抗体芯片利用抗原抗体结合的原理，可用于检测目前已上市的抗肿瘤药物相关靶点的蛋白活性，即以下46种药物相关靶点蛋白的表达水平和(或)修饰水平：Bcr-Abl、ABL1、ABL2、ALK、BTK、CSF1R、DDR1、DDR2、EGFR、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、ERBB2、ERBB3、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT1、FLT3、FLT4、FRK、FYN、HCK、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、KDR、KIT、LCK、LYN、MET、NTRK1、PDGFRA、PDGFRB、PTK6、RET、SRC、TEK、YES1、BRAF、RAF1、MAPK11、MAP2K1、MAP2K2、MAP3K2(包含6种丝氨酸/苏氨酸激酶，见表3)。
表3本发明所包含的检测指标
为了实现上述目的，本发明所采用的一种技术方案是：
采用固相抗体芯片，即通过芯片点样仪将上述检测指标对应的各自抗体点制在基片上，每种抗体设置重复。点制的内参抗体为β-actin、α-tubulin以及GAPDH等。选择荧光基团作为阳性对照，点样缓冲液作为阴性对照(表4)。
优先地，所述抗体包括：针对上述指标的单克隆抗体和(或)多克隆抗体。
所述抗体也包括：检测上述指标的蛋白表达水平的抗体，和(或)检测上述指标的各位点磷酸化修饰水平的抗体。
所述基片包括：醛基、环氧树脂、聚糖或其他高分子修饰的玻片式或膜式基片。
表4本发明抗体芯片的设计方案(包含各修饰位点抗体)
| Antibody Name | Swiss Prot | Antibody Name | Swiss Prot |
| Positive Marker | P | HCK(Ab-522) | P08631 |
| Empty | E | HCK(Phospho-Tyr522) | P08631 |
| Bcr-Abl(Ab-177) | A9UF02 | ITK(Ab-512) | Q08881 |
| Bcr-Abl(Phospho-Tyr177) | A9UF02 | ITK(Phospho-Tyr512) | Q08881 |
| Bcr-Abl(Ab-245) | A9UF02 | JAK1(Ab-1022) | P23458 |
| Bcr-Abl(Phospho-Tyr245) | A9UF02 | JAK1(Phospho-Tyr1022) | P23458 |
| Abl1(Ab-204) | P00519 | JAK2(Ab-1007) | O60674 |
| Abl1(Ab-754/735) | P00519 | JAK2(Ab-221) | O60674 |
| Abl1(Phospho-Thr754/735) | P00519 | JAK2(Phospho-Tyr1007) | O60674 |
| Abl1(Phospho-Tyr204) | P00519 | JAK2(Phospho-Tyr221) | O60674 |
| Abl1(Ab-412) | P00519 | JAK3(Ab-785) | P52333 |
| Abl1(Ab-245) | P00519 | JAK3(Ab-904) | P52333 |
| Abl1(Phospho-Tyr412) | P00519 | JAK3(Ab-939) | P52333 |
| Abl1(Phospho-Tyr245) | P00519 | JAK3(Ab-981) | P52333 |
| ABL2(Ab-261) | P42684 | JAK3(Phospho-Tyr785) | P52333 |
| ABL2(Ab-439) | P42684 | JAK3(Phospho-Tyr904) | P52333 |
| ABL2(Phospho-Tyr261) | P42684 | JAK3(Phospho-Tyr939) | P52333 |
| ABL2(Phospho-Tyr439) | P42684 | JAK3(Phospho-Tyr981) | P52333 |
| ALK(Ab-1507) | Q9UM73 | VEGFR2(Ab-1054) | P35968 |
| ALK(Ab-1604) | Q9UM73 | VEGFR2(Phospho-Tyr1054) | P35968 |
| ALK(Phospho-Tyr1507) | Q9UM73 | VEGFR2(Ab-1059) | P35968 |
| ALK(Phospho-Tyr1604) | Q9UM73 | VEGFR2(Phospho-Tyr1059) | P35968 |
| BTK(Ab-222) | Q06187 | VEGFR2(Ab-1175) | P35968 |
| BTK(Ab-550) | Q06187 | VEGFR2(Ab-1214) | P35968 |
| BTK(Phospho-Tyr222) | Q06187 | VEGFR2(Ab-951) | P35968 |
| BTK(Phospho-Tyr550) | Q06187 | VEGFR2(Phospho-Tyr1175) | P35968 |
| CSFR(Ab-561) | P07333 | VEGFR2(Phospho-Tyr1214) | P35968 |
| CSFR(Phospho-Tyr561) | P07333 | VEGFR2(Phospho-Tyr951) | P35968 |
| CSFR(Ab-809) | P07333 | KIT(Ab-703) | P10721 |
| CSFR(Phospho-Tyr809) | P07333 | KIT(Ab-936) | P10721 |
| DDR1(Ab-513) | Q08345 | KIT(Phospho-Tyr703) | P10721 |
| DDR1(Ab-796) | Q08345 | KIT(Phospho-Tyr936) | P10721 |
| DDR1(Phospho-Tyr513) | Q08345 | KIT(Ab-721) | P10721 |
| DDR1(Phospho-Tyr796) | Q08345 | KIT(Phospho-Tyr721) | P10721 |
| DDR2(Ab-471) | Q16832 | LCK(Ab-192) | P06239 |
| DDR2(Ab-740) | Q16832 | LCK(Ab-393) | P06239 |
| DDR2(Phospho-Tyr471) | Q16832 | LCK(Ab-504) | P06239 |
| DDR2(Phospho-Tyr740) | Q16832 | LCK(Ab-59) | P06239 |
| EGFR(Ab-1016) | P00533 | LCK(Phospho-Ser59) | P06239 |
| EGFR(Ab-1069) | P00533 | LCK(Phospho-Tyr192) | P06239 |
| EGFR(Ab-678) | P00533 | Lck(Phospho-Tyr393) | P06239 |
| EGFR(Ab-693) | P00533 | LCK(Phospho-Tyr504) | P06239 |
| EGFR(Ab-998) | P00533 | LYN(Ab-507) | P07948 |
| EGFR(Phospho-Tyr998) | P00533 | LYN(Phospho-Tyr507) | P07948 |
| EGFR(Phospho-Thr678) | P00533 | Met(Ab-1003) | P08581 |
| EGFR(Phospho-Thr693) | P00533 | Met(Phospho-Tyr1003) | P08581 |
| EGFR(Phospho-Tyr1016) | P00533 | Met(Ab-1234) | P08581 |
| EGFR(Phospho-Tyr1069) | P00533 | Met(Ab-1349) | P08581 |
| EGFR(Ab-1070) | P00533 | Met(Phospho-Tyr1234) | P08581 |
| EGFR(Ab-1092) | P00533 | Met(Phospho-Tyr1349) | P08581 |
| EGFR(Ab-1110) | P00533 | NTRK1(Ab-496) | P04629 |
| EGFR(Ab-1172) | P00533 | NTRK1(Ab-680) | P04629 |
| EGFR(Ab-1197) | P00533 | NTRK1(Ab-681) | P04629 |
| EGFR(Ab-869) | P00533 | NTRK1(Ab-701) | P04629 |
| EGFR(Phospho-Ser1070) | P00533 | NTRK1(Ab-791) | P04629 |
| EGFR(Phospho-Tyr1092) | P00533 | NTRK1(Phospho-Tyr496) | P04629 |
| EGFR(Phospho-Tyr1110) | P00533 | NTRK1(Phospho-Tyr680) | P04629 |
| EGFR(Phospho-Tyr1172) | P00533 | NTRK1(Phospho-Tyr681) | P04629 |
| EGFR(Phospho-Tyr1197) | P00533 | NTRK1(Phospho-Tyr701) | P04629 |
| EGFR(Phospho-Tyr869) | P00533 | NTRK1(Phospho-Tyr791) | P04629 |
| EphA2(Ab-588) | P29317 | PDGF R alpha(Ab-849) | P16234 |
| EphA2(Ab-594) | P29317 | PDGF R alpha(Phospho-Tyr849) | P16234 |
| EphA2(Ab-735) | P29317 | PDGF R beta(Ab-1009) | P09619 |
| EphA2(Ab-930) | P29317 | PDGF R beta(Ab-1021) | P09619 |
| EphA2(Phospho-Tyr588) | P29317 | PDGF R beta(Ab-740) | P09619 |
| EphA2(Phospho-Tyr594) | P29317 | PDGF R beta(Ab-751) | P09619 |
| EphA2(Phospho-Tyr735) | P29317 | PDGF R beta(Phospho-Tyr1009) | P09619 |
| EphA2(Phospho-Tyr930) | P29317 | PDGF R beta(Phospho-Tyr1021) | P09619 |
| FRK(Ab-387) | P42685 | PDGF R beta(Phospho-Tyr740) | P09619 |
| FRK(Phospho-Tyr387) | P42685 | PDGF R beta(Phospho-Tyr751) | P09619 |
| HER2(Ab-686) | P04626 | PTK6(Ab-342) | Q13882 |
| HER2(Phospho-Thr686) | P04626 | PTK6(Ab-447) | Q13882 |
| HER2(Ab-1112) | P04626 | PTK6(Phospho-Tyr342) | Q13882 |
| HER2(Phospho-Tyr1112) | P04626 | PTK6(Phospho-Tyr447) | Q13882 |
| HER2(Ab-1221/1222) | P04626 | Ret(Ab-905) | P07949 |
| HER2(Ab-1248) | P04626 | Ret(Phospho-Tyr905) | P07949 |
| HER2(Ab-877) | P04626 | Src(Ab-418) | P12931 |
| HER2(Phospho-Tyr1221/1222) | P04626 | Src(Ab-529) | P12931 |
| HER2(Phospho-Tyr1248) | P04626 | Src(Phospho-Tyr418) | P12931 |
| HER2(Phospho-Tyr877) | P04626 | Src(Phospho-Tyr529) | P12931 |
| HER3(Ab-1222) | P21860 | Src(Ab-75) | P12931 |
| HER3(Ab-1289) | P21860 | Src(Ab-216) | P12931 |
| HER3(Phospho-Tyr1222) | P21860 | Src(Phospho-Ser75) | P12931 |
| HER3(Phospho-Tyr1289) | P21860 | Src(Phospho-Tyr216) | P12931 |
| HER4(Ab-1056) | Q15303 | TEK(Ab-1102) | Q02763 |
| HER4(Phospho-Tyr1056) | Q15303 | TEK(Ab-1108) | Q02763 |
| HER4(Ab-1284) | Q15303 | TEK(Phospho-Tyr1102) | Q02763 |
| HER4(Phospho-Tyr1284) | Q15303 | TEK(Phospho-Tyr1108) | Q02763 |
| FGFR1(Ab-154) | P11362 | Yes(Ab-537) | P07947 |
| FGFR1(Ab-654) | P11362 | Yes(Phospho-Tyr537) | P07947 |
| FGFR1(Ab-766) | P11362 | B-RAF(Ab-446) | P15056 |
| FGFR1(Phospho-Tyr154) | P11362 | B-RAF(Ab-598) | P15056 |
| FGFR1(Phospho-Tyr654) | P11362 | B-RAF(Ab-601) | P15056 |
| FGFR1(Phospho-Tyr766) | P11362 | B-RAF(Phospho-Ser446) | P15056 |
| FGFR2(Ab-769) | P21802 | B-RAF(Phospho-Ser601) | P15056 |
| FGFR2(Ab-782) | P21802 | B-RAF(Phospho-Thr598) | P15056 |
| FGFR2(Phospho-Tyr769) | P21802 | Raf1(Ab-259) | P04049 |
| FGFR2(Phospho-Ser782) | P21802 | Raf1(Ab-289) | P04049 |
| FGFR3(Ab-724) | P22607 | Raf1(Ab-338) | P04049 |
| FGFR3(Ab-760) | P22607 | Raf1(Ab-341) | P04049 |
| FGFR3(Phospho-Tyr724) | P22607 | Raf1(Ab-621) | P04049 |
| FGFR3(Phospho-Tyr760) | P22607 | Raf1(Phospho-Ser259) | P04049 |
| FGFR4(Ab-642) | P22455 | Raf1(Phospho-Ser289) | P04049 |
| FGFR4(Ab-643) | P22455 | Raf1(Phospho-Ser338) | P04049 |
| FGFR4(Phospho-Tyr642) | P22455 | Raf1(Phospho-Tyr341) | P04049 |
| FGFR4(Phospho-Tyr643) | P22455 | Raf1(Phospho-Ser621) | P04049 |
| VEGFR-1(Ab-1213) | P17948 | MAPK11(Ab-182) | Q15759 |
| VEGFR-1(Phospho-Tyr1213) | P17948 | MAPK11(Phospho-Tyr182) | Q15759 |
| VEGFR-1(Ab-1333) | P17948 | MEK1(Ab-217) | Q02750 |
| VEGFR-1(Phospho-Tyr1333) | P17948 | MEK1(Ab-221) | Q02750 |
| FLT3(Ab-599) | P36888 | MEK1(Ab286) | Q02750 |
| FLT3(Ab-842) | P36888 | MEK1(Ab-291) | Q02750 |
| FLT3(Ab-969) | P36888 | MEK1(Ab-298) | Q02750 |
| FLT3(Phospho-Tyr599) | P36888 | MEK1(Phospho-Ser217) | Q02750 |
| FLT3(Phospho-Tyr842) | P36888 | MEK1(Phospho-Ser221) | Q02750 |
| FLT3(Phospho-Tyr969) | P36888 | MEK1(Phospho-Ser298) | Q02750 |
| FLT4(Ab-1063) | P35916 | MEK1(Phospho-Thr286) | Q02750 |
| FLT4(Ab-1230) | P35916 | MEK1(Phospho-Thr291) | Q02750 |
| FLT4(Ab-1231) | P35916 | MEK-2(Ab-394) | P36507 |
| FLT4(Ab-1337) | P35916 | MEK-2(Phospho-Thr394) | P36507 |
| FLT4(Phospho-Tyr1063) | P35916 | MAP3K2(Ab-520) | Q9Y2U5 |
| FLT4(Phospho-Tyr1230) | P35916 | MAP3K2(Ab-522) | Q9Y2U5 |
| FLT4(Phospho-Tyr1231) | P35916 | MAP3K2(Ab-524) | Q9Y2U5 |
| FLT4(Phospho-Tyr1337) | P35916 | MAP3K2(Phospho-Ser520) | Q9Y2U5 |
| Fyn(Ab-420) | P06241 | MAP3K2(Phospho-Thr522) | Q9Y2U5 |
| Fyn(Phospho-Tyr420) | P06241 | MAP3K2(Phospho-Thr524) | Q9Y2U5 |
| Fyn(Ab-531) | P06241 | Beta actin | A |
| Fyn(Phospho-Tyr531) | P06241 | Alpha tubulin | T |
| HCK(Ab-411) | P08631 | GAPDH | G |
| HCK(Phospho-Tyr411) | P08631 | Negative control | N |
本发明所采用的另一种技术方案是：
采用液相悬浮芯片实现上述多重指标的检测，液相悬浮芯片的基质包括直径1-10微米的以不同荧光标记的微珠，由于微珠携带荧光不同，可用于制备芯片的微珠多达1000种。每一种颜色的微珠上偶联一种特异性的上述检测指标对应的各自抗体。将偶联了特异性抗体的微珠与样本中的蛋白反应，加入检测抗体进行检测。
本发明的另一方面，还提供了利用上述抗体芯片检测的方法。
包括基于样本标记法的单色荧光进行检测，即各自样本分别进行生物素标记，分别与各自芯片杂交，最后通过加入荧光标记的(链霉)亲和素((strept)avidin)进行检测，步骤如下：
包含脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭芯片，洗涤；
接着用生物素标记的样本与芯片室温孵育，洗涤；
再用荧光标记的(链霉)亲和素与芯片室温孵育，洗涤，甩干；
最后用芯片扫描仪扫描芯片，检测各自的荧光强度，并利用软件读取数据，获得抗肿瘤药物相关靶点蛋白的表达水平和(或)修饰水平。通过肿瘤病人手术样本中癌与癌旁芯片数据的比较，对筛选出来的差异表达水平以及修饰水平的靶点蛋白进行专家解读，帮助临床医生根据患者的个体差异制定个体化用药方案，以提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。
优先地，所述生物素标记的样本，标记基团不限于生物素，还可以是荧光基团或辣根过氧化物酶等。
所述荧光标记的(链霉)亲和素，荧光不限于Cy3、Cy5，还可以是AlexaFluor荧光等。
或者，采用基于样本标记法的双色荧光进行检测(图1)，即各自样本分别进行生物素标记，各自加入不同荧光标记的(链霉)亲和素，取等份与同一芯片进行杂交，步骤如下：
生物素标记样本；
不同荧光标记的(链霉)亲和素与各自生物素标记样本孵育；
包含脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭芯片，洗涤；
取等份样本与同一芯片进行孵育，洗涤，甩干；
最后用芯片扫描仪扫描芯片，检测荧光强度，并利用软件读取数据，获得抗肿瘤药物相关靶点蛋白的表达水平和(或)修饰水平的调变情况。
优先地，所述生物素标记样本，标记基团不限于生物素，还可以是荧光基团等。
或者，采用双抗夹心法进行检测，即样本与芯片孵育，加入生物素标记的检测抗体混合物，最后通过加入荧光标记的(链霉)亲和素进行检测，步骤如下：
包含脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭芯片，洗涤；
接着样本与芯片室温孵育，洗涤；
加入生物素标记的检测抗体混合物，与芯片室温孵育，洗涤；
再用荧光标记的(链霉)亲和素与芯片室温孵育，洗涤，甩干；
最后用芯片扫描仪扫描芯片，检测各自的荧光强度，利用软件读取数据，获得抗肿瘤药物相关靶点蛋白的表达水平和(或)修饰水平的调变情况。
其中，检测抗体是与芯片上的捕获抗体相对应的识别另一表位的抗体混合物。
本发明还提供了利用上述液相悬浮芯片检测的方法，包括以下步骤：
反应孔中加入微珠，磁力洗板器洗涤；
加入样品，贴上封口膜，放置在平板摇床上振荡，避光室温孵育，洗涤；
加入生物素标记的检测抗体，贴上封口膜，放置在平板摇床上振荡，避光室温孵育，洗涤；
加入藻红蛋白(phycoerythrin)标记的(链霉)亲和素，贴上封口膜，放置在平板摇床上振荡，避光室温孵育，洗涤；
用反应缓冲液重悬，贴上封口膜，避光室温振荡；
送入已校正的液相芯片分析仪中读值，获得抗肿瘤药物相关靶点蛋白的表达水平和(或)修饰水平的调变情况。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明可在一次反应中实现批量药物靶点的同步并行检测，实现真正的高通量高内涵检测。
(2)本发明不仅能检测各药物靶点的蛋白表达水平，而且能检测各药物靶点蛋白位点的修饰水平。
(3)本发明对肿瘤样本的检测能给药物研发提供新靶点、新思路。
(4)本发明操作简单、检测快速，易于临床应用。
(5)本发明专门针对检测目前已上市的酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物相关靶点的蛋白活性，可用于肿瘤患者用药的个性化治疗指导。
(6)本发明对肿瘤样本的检测能为联合用药提供指导。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明基于样本标记法的双色荧光检测原理图；
图2是本发明实施例2的抗体芯片结果扫描图像；
图3是本发明实施例2的抗体芯片结果运用免疫印迹法验证的灰度图。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙等译校。北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
实施例1抗体芯片的制备
1.免疫印迹实验：对药物靶点各自对应的候选抗体进行特异性和效价鉴定，筛选高质量的抗体；
2.纯化抗体：通过proteinA/G柱子以及透析纯化抗体，超滤调整抗体浓度为2mg/mL，5μL分装，-20℃保存；
3.准备点样板：5μL抗体中加入5μL 2×点样缓冲液，吸入点样板，避免产生气泡；同样，10μL阳性对照(包括0.25mg荧光基团标记蛋白、0.75mg BSA以及1×点样缓冲液)以及10μL阴性对照(包括5μL2×点样缓冲液与5μL PBS)也吸入点样板；漩涡器混匀，1,000×g2min离心，4℃保存；
4.点样：按照芯片点样仪操作要求，做好点样前准备，包括洗液、湿度、温度、点样针、基片以及点样板等，点样后基片在50％的湿度下暂放至少2个小时后转入4℃过夜保存。
实施例2应用抗体芯片对临床样本的检测
一、蛋白质提取
肿瘤患者手术切除样本，进行石蜡切片制作，苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色)，通过病理专家的判读，分离癌旁组织部分与肿瘤组织部分，利用组织裂解液与匀浆器分别提取其总蛋白。
二、生物素标记
1.每1mg生物素加入100μL DMF (N，N-Dimethylformamide)，终浓度为10μg/μL，标记为Biotin/DMF；
2.每个样本各取100μg蛋白样品进行标记，分两管，每管50μg蛋白样品中加入3μLBiotin/DMF进行标记，终体积为70μL；
3.混合均匀，室温下震荡反应2h；
4.加入30μL终止液，室温下震荡反应30min；
进入下一步的芯片检测或将样品储存在-80℃。
三、芯片检测
A.封闭
1.将上述点制的抗体芯片从冰箱取出，室温平衡45min；
2.在100×15mm培养皿中加入30mL封闭溶液，将芯片完全浸没。确保芯片表面向上，将培养皿放到摇床上，室温55rpm封闭1h；
3.使用Milli-Q水按照下面步骤洗涤：
a)将芯片放入50mL圆形离心管，加入45mL Milli-Q水，旋紧盖子；
b)用手上下颠倒震摇管子10s，倒掉Milli-Q水；
c)离心管中换入新的Milli-Q水，震摇管子10s，倒掉Milli-Q水；
d)重复10次；
4.甩掉芯片表面多余的Milli-Q水，马上进入下一步反应。
B.杂交
1.在一个试管中，加入6mL杂交缓冲液，再加入生物素标记的蛋白(50μg)，混合均匀。标记为Protein Coupling Mix；
2.将芯片放入干净的培养皿，芯片表面向上，缓慢的将6mL Protein Coupling Mix加到芯片表面，将芯片完全浸没，盖上Coupling Chamber，室温35rpm孵育2h；
3.将芯片移到一个盛有30mL 1×Wash Solution的100×15mm培养皿中，室温55rpm洗10min，倒掉洗液，重复此步骤三次；
4.使用Milli-Q水按照下面步骤洗涤：
a)将芯片放入50mL圆形离心管，加入45mL Milli-Q水，旋紧盖子；
b)用手上下颠倒震摇管子10s，倒掉Milli-Q水；
c)离心管中换入新的Milli-Q水，震摇管子10s，倒掉Milli-Q水；
d)重复10次；
5.甩掉芯片表面多余的Milli-Q水，马上进入下一步反应。
C.检测
1.向60mL Detection Buffer中加入60μL Cy3-Streptavidin(0.5mg/mL)；
2.在一个100×15mm培养皿中加入30mL上述Cy3-Streptavidn Solution；
将芯片浸没入Cy3-Streptavidin solution。室温避光，摇床上55rpm反应20min；
3.将芯片移入一个新的盛有30mL 1×Wash Solution的100×15mm培养皿中；室温摇床上55rpm洗10min。重复此步骤三次；
4.使用Milli-Q水按照下面步骤洗涤：
a)将芯片放入50mL圆形离心管，加入45mL Milli-Q水，旋紧盖子；
b)用手上下颠倒震摇管子10s，倒掉Milli-Q水；
c)离心管中换入新的Milli-Q水，震摇管子10s，倒掉Milli-Q水；
d)重复10次；
5.将芯片置于芯片小型离心机中，离心2min甩干；
6.避光，GenePix 4000B扫描仪于532nm处扫描芯片(图2)。
四、数据分析
使用GenePix Pro软件读取原始数据，通过扫描获得的图像发现芯片上有多种抗体检测到荧光信号，代表该样品中含有这些抗体对应的蛋白质，荧光信号的强弱反应了蛋白质的含量。本次实验通过对肿瘤病人手术切除样本中癌与癌旁芯片数据的比较，发现EGFR、ALK等蛋白磷酸化水平增强，提示不仅需要使用针对EGFR的抗肿瘤药物，还需要使用针对ALK的抗肿瘤药物，达到有针对性的联合治疗的目的。
五、免疫印迹法结果验证
利用提取的癌旁组织部分与肿瘤组织部分蛋白样本进行免疫印迹实验(图3)。结果证实了不仅EGFR(Y869)的磷酸化水平增强，而且ALK(Y1604)的磷酸化水平也增强。同时，下游信号通路蛋白JAK1(Y1022)、Akt1(S473)以及MEK2(T394)的磷酸化水平同样增强。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.两种用于酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物相关靶点蛋白活性检测的抗体芯片，其特征在于，所述抗体芯片包括基于基片的固相抗体芯片以及基于微珠的液态悬浮芯片。
2.根据权利要求1所述的抗体芯片，其特征在于，所述基片包括：醛基、环氧树脂、聚糖或其他高分子修饰的玻片式或膜式基片。
3.根据权利要求1所述的抗体芯片，其特征在于，所述抗体芯片包括的检测指标涵盖了目前已上市的酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物的相关靶点，即46种药物相关靶点蛋白的表达水平和(或)修饰水平。
4.根据权利要求3所述的抗体芯片，其特征在于，所述46种药物相关靶点蛋白包含：Bcr-Ab1、ABL1、ABL2、ALK、BTK、CSF1R、DDR1、DDR2、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERBB3、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT1、FLT3、FLT4、FRK、FYN、HCK、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、KDR、KIT、LCK、LYN、MET、NTRK1、PDGFRA、PDGFRB、PTK6、RET、SRC、TEK、YES1、BRAF、RAF1、MAPK11、MAP2K1、MAP2K2、MAP3K2。
5.根据权利要求3所述的抗体芯片，其特征在于，所述抗体芯片上固着的抗体包含：检测药物相关靶点蛋白表达水平和(或)各位点磷酸化修饰水平的单克隆抗体和(或)多克隆抗体。
6.一种基于样本标记法的单色荧光进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将样本进行生物素标记；
用权利要求1所述的抗体芯片，对标记的样本进行检测；
再用荧光标记的(链霉)亲和素进行检测；
根据检测到荧光信号的抗体，确定待测样品中的药物相关靶点蛋白的表达水平和(或)修饰水平。
7.一种基于样本标记法的双色荧光进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将样本分别进行生物素标记；
不同荧光标记的(链霉)亲和素与各自生物素标记样本孵育；
用权利要求1所述的抗体芯片，对等份标记样本的混合物进行检测；
根据检测到荧光信号的抗体，确定待测样品中的药物相关靶点蛋白的表达水平和(或)修饰水平的调变情况。
8.一种采用双抗夹心法进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
用权利要求1所述的抗体芯片，对样本进行检测；
加入生物素标记的检测抗体混合物；
再用荧光标记的(链霉)亲和素进行检测；
根据检测到荧光信号的抗体，确定待测样品中的药物相关靶点蛋白的表达水平和(或)修饰水平。
9.权利要求1所述抗体芯片的应用，其特征在于，用于对肿瘤患者手术切除样本进行检测，实现个性化有效治疗的用药指导。
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