CN102757443A

CN102757443A - 硫取代鬼臼类衍生物及其生物转化和分离纯化方法

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Publication number: CN102757443A
Application number: CN2011101061920A
Authority: CN
Inventors: 汤亚杰; 白佳珂
Original assignee: 汤亚杰
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2011-04-27
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2031-04-27
Also published as: CN102757443B

Abstract

本发明公开了硫取代鬼臼类衍生物及其生物转化和分离纯化方法。本发明通过生物转化方法对鬼臼毒素或4′-去甲表鬼臼毒素分子结构进行修饰，得到了具有抗肿瘤活性的式(I)或式(II)所示的硫取代鬼臼类衍生物。体外肿瘤细胞毒性的前期研究表明，本发明硫取代鬼臼类衍生物对BGC823、HepG2、A549等肿瘤细胞生长具有较强的抑制作用，因此能作为抗肿瘤化合物而具有药物开发的潜在价值。本发明采用生物转化方法将鬼臼毒素和4′-去甲基表鬼臼毒素转化为硫取代鬼臼类衍生物，具有成本低、E-factor低、操作简单、易培养、质量可控、可有效防止化学残留等优点。

Description

硫取代鬼臼类衍生物及其生物转化和分离纯化方法

技术领域

本发明涉及鬼臼类化合物及其制备方法，尤其涉及硫取代鬼臼类衍生物及其生物转化和分离纯化、含量检测方法，本发明还涉及该硫取代鬼臼类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途，属于鬼臼类化合物及其生物转化领域。

背景技术

硫取代鬼臼类衍生物是一类鬼臼类化合物，其结构式为图(I)和(II)所示。对鬼臼毒素的C环4位，以β碳硫键芳环取代作为修饰方向所得到的衍生物普遍具有良好的抗肿瘤活性和生物利用度。

目前针对鬼臼类衍生物的结构修饰研究，以化学合成方法为主。然而，随着人类需求的日益增长，化学合成法已显出较大弊端：一是规模小、产量低；二是化学残留难以除去，三是生产成本高。上述这些因素必将导致4-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-鬼臼毒素等五种硫取代鬼臼类衍生物的价格高昂，因此寻找一种适合大规模工业化生产4-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-鬼臼毒素等硫取代鬼臼类衍生物的方法，成为研发的重中之重。

基于生物转化技术具有反应条件温和、E-factor低、质量可控、分离过程简单等优点，越来越多的学者倡导以生物转化技术为代表的绿色制药过程(CurrOpin Chem Biol 2009；13：43-50)。研究证明利用生物转化对鬼臼毒素进行分子结构修饰具有可行性，如：果德安教授(J Aslan Nat Prod Res 1998；1(2)：99-120)利用掌叶大黄细胞和青霉菌转化鬼臼毒素，使鬼臼毒素D环的反式结构转化为顺式结构，得到鬼臼苦素；英国诺丁汉大学Broomhead等(Phytochemistry1991；30(5)：1511-1517)发现美国金钟连翘悬浮培养细胞具有将鬼臼毒素氧化为鬼臼毒酮的能力，同时产生少量的鬼臼苦酮。澳大利亚墨尔本大学Teng等(BiocatalyBiotransfor 2007；25(7)：1-8)以大麦悬浮培养细胞转化鬼臼毒素得到异鬼臼苦酮。

综上所述，提供一类具有良好的抗肿瘤活性的硫取代鬼臼类衍生物，该硫取代鬼臼类衍生物具有廉价易行的生物转化方法，将具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明目的之一是提供一类具有抗肿瘤活性的硫取代鬼臼类衍生物；

本发明目的之二是一种上述硫取代鬼臼类衍生物的生物转化方法，该方法切实可行、操作简单、质量可控、成本低、易规模化工业生产；

本发明目的之三是提供一种从上述生物转化产物中分离纯化及检测硫取代鬼臼类衍生物含量的方法；

本发明目的之四是将所述硫取代鬼臼类衍生物应用于制备成抗肿瘤药物。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

式(I)或式(II)所示的具有抗肿瘤活性的硫取代鬼臼类衍生物：

式(I)

其中，R₁为

R₂为CH₃或氢；

式(II)

一种将鬼臼毒素和4′-去甲表鬼臼毒素转化为式(I)所示的硫取代鬼臼类衍生物的生物转化方法，包括以下步骤：

(1)将鬼臼毒素或4′-去甲表鬼臼毒素加入到液体发酵培养基中，接种鬼臼类植物内生菌二级液体种子进行发酵培养；(2)发酵培养一段时间后再加入2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑继续进行发酵培养，得到含有式(I)所示的硫取代鬼臼类衍生物的生物转化产物。

本发明还提供了一种式(II)所示的4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼酸的生物转化方法，包括以下步骤：

(1)将4′-去甲表鬼臼毒素加入到液体发酵培养基中，接种鬼臼类植物内生菌二级液体种子进行发酵培养；(2)发酵培养一段时间后再加入3-巯基-1，2，4-三氮唑继续进行发酵培养，得到含有4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素的生物转化产物；(3)将4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素分离纯化后加入到液体发酵培养基中，接种腐殖性土壤真菌二级液体种子进行发酵培养，得到含有4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼酸的生物转化产物。

上述生物转化方法中，所述的鬼臼类植物内生菌可从小檗科植物(如：八角莲属(Dysosma)、桃儿七属(podophyllum)、山荷叶(Diphylleia)或沙地柏(Sabinavulgaris Ant)等)中分离得到的鬼臼类植物内生菌。本发明人通过大量的试验发现，采用不同的鬼臼类植物内生菌进行上述生物转化，在转化的效果上存在较大的差异，本发明人采用了不同的鬼臼类植物内生菌进行了对比和摸索，最终发现，采用微生物保藏号是CCTCC NO：M 2010262的产紫青霉菌(Penicilliumpurpurogenum Y.J.Tang)进行生物转化，相比其它的鬼臼类植物内生菌，具有最高的生物转化率。该产紫青霉菌(Penicillium purpurogenumY.J.Tang)从取自湖北省恩施州湖北农业科学院中药材研究所的华中药用植物园采集的山荷叶植物叶部中分离得到。采用的分离方法为无菌条件下，将山荷叶叶部撕开平铺于土豆琼脂平板，28℃下富集培养后，依次进行液体培养、平板划线、挑取单菌落于土豆琼脂斜面，得到纯培养物。

所述的腐殖性土壤菌优选是藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)，更优选为微生物保藏号是CCTCC NO：M2010038的藤仓赤霉SH-f13(Gibberella fujikuroiSH-f13)，其分类命名是：藤仓赤霉SH-f13(Gibberella fujikuroi SH-f13)；该藤仓赤霉SH-f13从取自湖北神农架的腐殖性土壤中分离得到。

优选的，步骤(2)中发酵培养4天后再加入2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑继续进行发酵培养；

上述生物转化方法中，所述发酵培养包括摇瓶级或生物反应器规模的发酵培养；其中，步骤(1)、(2)或步骤(3)中所述的发酵培养温度优选为15-40℃，更优选为30℃；当采用摇瓶进行时发酵培养，所述的摇床转速优选为50-300转/分钟；更优选的，所述的摇床转速为120转/分钟。

步骤(1)中将鬼臼毒素作为底物加入到液体发酵培养基时，优选的，所加入的鬼臼毒素用量至终浓度0.01-5克/升，更优选为0.2克/升；将4′-去甲基表鬼臼毒素作为底物加入到液体发酵培养基时，所加入的终浓度优选至0.05-5克/升，更优选为0.2克/升；

步骤(2)中在向转化体系中添加2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑时，所添加的用量优选至终浓度为0.01-5克/升，更优选为0.1克/升。

步骤(3)中将4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素作为底物加入到液体发酵培养基时，所加入的终浓度优选至0.01-5克/升，更优选为0.1克/升。

本发明中所述的液体发酵培养基可以是任何一种微生物发酵所通用的液体发酵培养基，优选的，所述的液体发酵培养基的组成为：

酵母膏1-100克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、硫酸亚铁0.01-10克/升、氯化钾0.5-40克/升、pH值2-9；优选的，所述的液体发酵培养基的组成是：酵母膏3克/升，硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.02克/升、氯化钾0.5克/升、pH值为7；

所述的腐殖性土壤菌二级液体种子或鬼臼类植物内生菌二级液体种子的制备，包括以下步骤：(1)培养斜面菌种；(2)培养一级液体种子；(3)培养二级液体种子；

作为参考，上述各个步骤所述的培养基和培养条件可以是：

(1)培养斜面菌种

培养基：葡萄糖10-500克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸二氢钾1-40克/升、盐酸硫胺0.05-10克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；

培养条件：培养温度为15-40℃。

(2)培养一级液体种子：

培养基：葡萄糖10-500克/升、酵母膏1-100克/升、硝酸钠1-50克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、硫酸亚铁0.01-10克/升、氯化钾0.5-40克/升；pH值2-9；

培养条件：培养温度15-40℃，摇床转速为50-300转/分钟；

(3)培养二级液体种子：

培养基：同一级液体种子培养基；

培养条件：同一级液体种子培养。

为了使微生物发酵朝着更有利于4-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-鬼臼毒素等五种硫取代鬼臼类衍生物生物合成的方向发展，本发明对各个阶段的培养基和培养条件进行了优化，最终发现，当各个培养阶段分别采用以下培养基和培养条件时，相比于其它的培养基和培养条件，发酵产物中硫取代鬼臼类衍生物的含量有了明显的提高：

(1)培养斜面菌种：

培养基：葡萄糖30克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸二氢钾1.5克/升、盐酸硫胺0.1克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；培养条件：培养温度为30℃。

(2)培养一级、二级液体种子：

培养基：葡萄糖30克/升、硝酸钠2克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.01克/升、氯化钾0.5克/升，pH值7；

培养条件：培养温度30℃，摇床转速为120转/分钟。

基于真菌的生物转化法中的生物催化剂具有可培养性，通过控制培养条件，菌丝体能够利用培养基成分中的鬼臼毒素和4′-去甲基表鬼臼毒素作为碳源进行代谢。因此，采用生物转化的方法，利用廉价的培养基在摇瓶中培养菌丝体，具有周期短、成本低、操作简单、易培养、能够按照需求人为的控制原料供应量等众多优势。本发明利用微生物代谢工程的原理，可以有针对性地对菌丝体的生长进行代谢调控，使生物转化朝着有利于硫取代鬼臼类衍生物生成的方向发展。

上述方法中，步骤(1)中从发酵液中分离纯化4-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-鬼臼毒素、4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素的方法，包括以下步骤：

(1)将生物转化基质离心备用；(2)制备发酵上清液待分离纯化样品；(3)使用硅胶柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化，即得。

优选的，步骤(2)所述发酵上清液待分离纯化样品的制备方法，包括：将发酵上清液通过液液萃取，收集有机层，浓缩挥干，得到发酵上清液待分离纯化样品；

优选的，步骤(3)中所述硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析；正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱液平衡；反相硅胶以甲醇拌匀后装柱，以洗脱液平衡；更优选的，步骤(3)中将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，采用硅胶柱层析吸附，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；将凝胶以甲醇浸泡，将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶，即得。

本发明还提供了一种从上述发酵液或菌丝体中分离纯化4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素、4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素的方法。

所述的分离纯化依次包括以下步骤：

本发明又提供了一种从上述发酵液或菌丝体中分离纯化4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼酸的方法，所述的分离纯化依次包括以下步骤：

本发明进一步提供一种从上述发酵液或菌丝体中检测五种硫取代鬼臼类衍生物含量的方法。

一种从上述发酵液或菌丝体中检测所述硫取代鬼臼类衍生物含量的方法，包括：

(1)收集样品：将生物转化产物离心，分别收集上清液和菌丝体沉淀；

(2)制备待测样品：

(A)发酵上清液待测样品的制备：将发酵上清液与有机溶剂进行混合过滤或将发酵上清液通过液液萃取，收集有机层，浓缩挥干后以流动相复溶，得发酵液待测样品；

(B)菌丝体待测样品的制备：将菌丝体蒸馏回流提取，用有机溶剂富集蒸馏液中的非极性成分，得菌丝体待测样品；

(3)检测：待测样品使用液相色谱-紫外检测器或二极管阵列检测器或荧光检测器或电化学检测器或蒸发光检测器或示差折光检测器或质谱检测器检测，色谱柱为高效反相液相色谱住或高效正相液相色谱柱或Innovation高效液相色谱柱；通过对比相同色谱条件下五种硫取代鬼臼类衍生物对照品出峰时间和离子碎片信息对样品中五种硫取代鬼臼类衍生物进行定性，通过内标法或外标法对待测样品中以上五种目标产物的含量进行定量。

优选的，步骤(1)中将发酵产物在8000-15000转/分钟的转速下离心；

优选的，步骤(2)中所述的发酵液待测样品按照以下步骤制备：将发酵上清液与乙腈以1∶2进行混合后，在8000-15000转/分钟的转速下离心，取上清液；或以乙酸乙酯对发酵液中目标产物进行萃取，收集有机层，浓缩挥干后以流动相复溶，作为发酵液待测样品；

步骤(2)中所述的菌丝体待测样品优选按照以下步骤制备：将菌丝体进行回流提取，控制温度在30-150℃；用氯仿富集非极性成分，得菌丝体待测样品；

步骤(3)中所述的检测优选按照以下条件进行：色谱柱温度为0-80℃；进样方式为分流或不分流方式，体积1-20微升，流速0.2-2毫升/分钟；紫外检测器的检测波长为200-400nm；质谱所采用的电离方式为ESI电离，扫描离子质荷比范围为50-650，4-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-鬼臼毒素、4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素、4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素、4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素和4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼酸特征碎片离子质荷比为分别为497、515、483、501、501。

按照上述方法对本发明所制备的发酵液或菌丝体中的五种硫取代鬼臼类衍生物含量进行检测，其结果为每升发酵液中4-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-鬼臼毒素含量达到0.1-50毫克、4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素含量达到0.1-30毫克、4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素含量达到0.1-40毫克、4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素含量达到0.1-50毫克、4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼酸含量达到0.1-60毫克。

当然，上述检测方法中，供试样品可用其他的预处理方法进行处理，如对样品衍生化等；对供试样品进行分析时，也可采用其它的检测方法，如用液相色谱-质谱联用、液相色谱-荧光检测器联用等。

体外肿瘤细胞毒性的前期研究表明，本发明式(I)或式(II)所示的硫取代鬼臼类衍生物对BGC823、HepG2、A549等肿瘤细胞生长具有较强的抑制作用，因此作为抗肿瘤化合物而具有药物开发的潜在价值。

本发明采用生物转化方法将鬼臼毒素和4′-去甲基表鬼臼毒素转化为五种硫取代鬼臼类衍生物，至少从两方面解决了该五种硫取代鬼臼类衍生物产业化的难题。首先，本发明将生物转化技术应用于鬼臼类化合物和噻二唑及三氮唑化合物的改造，在很大程度对以天然活性先导化合物为资源的药物开发提供了一种新思路。其次，生物转化技术属于绿色技术，避免了化学合成导致有机残留、规模小、产量低、成本高等不利因素，同时作为一种绿色安全的大规模生产方式有着无可比拟的巨大优势，利用生物转化法生产硫取代鬼臼类衍生物具有成本低、E-factor低、操作简单、易培养、质量可控、可有效防止化学残留等优点。

附图说明

图14-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-鬼臼毒素和4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素的生物转化路线图。

图24-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素和4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素的生物转化路线图。

图34-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼酸的生物转化路线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验材料

1、生物转化所用菌种：

鬼臼类植物内生菌：产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)Y.J.Tang，其微生物保藏号是CCTCC NO.M 2010262；

腐殖性土壤菌：藤仓赤霉SH-f13(Gibberella fujikuroi SH-f13)，其微生物保藏号是CCTCC NO.M2010038。

2、鬼臼毒素和4′-去甲基表鬼臼毒素：均从西安和霖生物工程有限公司购买，纯度98％；2-巯基-1，3，4-噻二唑和3-巯基-1，2，4-三氮唑：均购自阿拉丁试剂，纯度98％。

实施例1

1、鬼臼毒素转化为4-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-鬼臼毒素和4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素

1)、斜面菌种培养：本实施例中所采用的斜面菌种培养基配方为(营养PDA斜面)：葡萄糖30克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸二氢钾1.5克/升、盐酸硫胺0.1克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；马铃薯浸汁的制备方法：200g新鲜土豆去皮并切成边长约1cm的正方体小块，加1L去离子水，煮沸15min，用八层纱布过滤，取滤液并再次定容至1L，所得溶液用于配置PDA培养基。

用接种针以两点法将产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)Y.J.Tang接种于PDA斜面，培养条件：培养温度为30℃。灭菌条件为：121℃、20分钟。培养温度为30℃，培养时间为5天；

2)、一级液体种子培养

一级液体种子、二级液体种子培养基的配方均为：葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸钠2克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.01克/升、氯化钾0.5克/升，pH值7；一级液体种子培养：无菌操作下，精密吸取5ml无菌水至产紫青霉菌培养斜面中，以接种铲沿着菌苔表面刮取长度菌丝，将得到的5ml均匀菌丝悬液，接种于装有45ml霉菌基本培养基的250ml三角摇瓶中。28℃下，120rpm恒温摇床中培养5天。

3)、二级液体种子培养：二级液体种子的培养基配方和一级液体种子培养基的配方相同，无菌操作下，精密吸取5ml均匀的产紫青霉菌一级液体种子悬液，接种量按体积比计为10％，以10％接种量接种于装有45ml霉菌基本培养基的250ml三角摇瓶中。28℃下，120rpm恒温摇床中培养5天。

4)、生物转化

发酵培养基的配方为：酵母膏3克/升，硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.01克/升、氯化钾0.5克/升，pH值为7；鬼臼毒素母液的配制：称取鬼臼毒素250毫克于50毫升容量瓶中，加70％酒精定容至刻度，即得5毫克/毫升鬼臼毒素母液。

2-巯基-1，3，4-噻二唑和3-巯基-1，2，4-三氮唑母液的配制：称取2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑各125mg于50ml容量瓶中，加70％酒精定容至刻度，即得2.5毫克/毫升2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑母液。

无菌操作下，将1毫升鬼臼毒素母液加入装有43毫升发酵培养基的250毫升三角摇瓶中。然后精密吸取5毫升均匀的产紫青霉菌二级液体种子悬液，接种量按体积比计为10％，以10％接种量接种于装有45毫升发酵培养基和底物的250毫升三角摇瓶中，28℃下，120rpm恒温摇床中培养4天后，加入1毫升2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑母液，继续培养3天。

2、4-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-鬼臼毒素和4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素的分离纯化

(1)、制备待分离样品：取步骤1所得发酵液1升样品于2升的分液漏斗中，加入乙酸乙酯500毫升。手摇震荡至水相与有机相充分混合，静置15分钟后收集有机层，水相中再次加入乙酸乙酯500毫升，共萃取三次。将经过分液后的乙酸乙酯层旋转蒸发，并对样品进行真空干燥，将干燥后的样品保存于4℃的冰箱中作为待分离样品。

(2)分离纯化4-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-鬼臼毒素和4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素的分离纯化：依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化。

(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离***：瑞士步琪等度快速色谱***：色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿∶丙酮(40∶1)***作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮15∶1***作为展开剂，将Rf值0.7的馏分进行合并；氯仿∶丙酮2∶1***作为展开剂，收集Rf值为0.5的馏分，将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品以溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮15∶1***作为展开剂，将Rf值0.7的馏分进行合并；氯仿∶丙酮2∶1***作为展开剂，收集Rf值为0.5的馏分；将合并后的样品真空干燥并重结晶，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供鉴定样品。

4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧鬼臼毒素(化合物(1))：白色粉末，C24H23O7N3S1；497，1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.191(s，1H)，7.015(s，1H)，6.500(s，1H)，6.472(s，2H)，6.313(s，2H)，5.973(d，2H)，5.380(s，1H)，4.603(d，1H)，4.353(d，1H)，3.990(s，1H)，3.796(s，9H)，3.282(s，1H)；13C-NMR(300MHz，CDCl3)：δ174.829(C-12；C)，152.795(C-2”；C)，148.558(C-7；C)，147.684(C-6；C)，146.066(C-3’，C-5’；C)，137.405(C-4’；C)，135.758(C-9；C)，132.537(C-1’；C)，127.942(C-10，C)，110.475(C-8；CH)，110.117(C-5，C-8；CH)，108.571(C-2’，C-6’；CH)，101.842(-OCH2O)，70.789(C-11；CH2)，61.025(4’-OCH3；CH3)，56.487(3’，5’-OCH3；CH3)，48.828(C-4)，43.974(C-1；CH)，42.457(C-2，CH)，37.532(C-3；CH)。

4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素(化合物(2))：白色粉末，C24H23O7N2S2；515，1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ9.079(s，1H)，6.960(s，1H)，6.500(s，1H)，6.486(s，1H)，6.291(s，2H)，5.975(d，2H)，5.789(d，1H)，4.554(t，1H)，4.30(d，1H)，4.117(q，1H)，3.856(q，9H)，3.353(s，1H)，3.175(q，1H)；13C-NMR(600MHz，CDCl3)：δ174.358(C-12；C)，165.128(C-1”；C)，152.865(C-2”；C)，148.878(C-6，C-7；C)，147.823(C-3’，C-5’；C)，137.438(C-4’；C)，135.271(C-9；C)，133.076(C-1’；C)，126.807(C-10，C)，110.354(C-8；CH)，110.253(C-5，C-8；CH)，108.347(C-2’，C-6’；CH)，101.977(-OCH2O)，70.950(C-11；CH2)，60.998(4’-OCH3；CH3)，56.433(3’，5’-OCH3；CH3)，50.713(C-4)，43.924(C-1；CH)，42.783(C-2，CH)，37.309(C-3；CH)。

实施例2

1、4′-去甲基表鬼臼毒素转化为4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素和4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素

用接种针以两点法将产紫青霉菌Y.J.Tang接种于PDA斜面，培养条件：培养温度为30℃。灭菌条件为：121℃、20分钟。培养温度为30℃，培养时间为5天；

2)、一级液体种子培养

4)、生物转化

发酵培养基的配方为：酵母膏3克/升，硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.01克/升、氯化钾0.5克/升，pH值为7；

4′-去甲基表鬼臼毒素母液的配制：称4′-去甲基表鬼臼毒素250mg于50ml容量瓶中，加70％酒精定容至刻度，即得5mg/ml 4′-去甲基表鬼臼毒素母液。

2-巯基-1，3，4-噻二唑和3-巯基-1，2，4-三氮唑母液的配制：称取2-巯基-1，3，4-噻二唑和3-巯基-1，2，4-三氮唑各125mg于50ml容量瓶中，加70％酒精定容至刻度，即得2.5毫克/毫升2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑母液。

无菌操作下，将1毫升4′-去甲基表鬼臼毒素母液加入装有43毫升发酵培养基的250毫升三角摇瓶中。然后精密吸取5毫升均匀的产紫青霉菌二级液体种子悬液，接种量按体积比计为10％，以10％接种量接种于装有45毫升发酵培养基和底物的250毫升三角摇瓶中，28℃下，120rpm恒温摇床中培养4天后，加入1毫升2-巯基-1，3，4-噻二唑和3-巯基-1，2，4-三氮唑母液，继续培养3天。

2、4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素和4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素的分离纯化

(1)、制备待分离样品：取步骤l所得发酵液1升样品于2升的分液漏斗中，加入乙酸乙酯500毫升。手摇震荡至水相与有机相充分混合，静置15分钟后收集有机层，水相中再次加入乙酸乙酯500毫升，共萃取三次。将经过分液后的乙酸乙酯层旋转蒸发，并对样品进行真空干燥，将干燥后的样品保存于4℃的冰箱中作为待分离样品。

(2)分离纯化4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素和4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素：依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化。

(A)用正相硅胶柱或者相似极性柱分离；氯仿∶丙酮(40∶1)***作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮20∶1***作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；氯仿∶丙酮3∶1***作为展开剂，收集Rf值为0.6的馏分，将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

(B)用凝胶柱层析分离：将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品以溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮20∶1***作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；氯仿∶丙酮3∶1***作为展开剂，收集Rf值为0.6的馏分；将合并后的样品真空干燥并重结晶，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供鉴定样品。

4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(化合物(3))：白色晶体；C23H21O7N3S1；483，1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ9.072(s，1H)，δ6.970(s，1H)，6.500(s，1H)，6.315(s，2H)，5.994(d，2H)，5.805(d，1H)，5.439(s，1H)，4.691(d，1H)，4.618(d，1H)，4.522(t，1H)，3.896(t，1H)，3.796(s，6H)，3.379(t，1H)，3.190(dd，1H)；13C-NMR(300MHz，CDCl3)：δ174.106(C-12；C)，164.897(C-1”；C)，151.789(C-2”；C)，148.681(C-7；C)，147.588(C-6；C)，146.538(C-3’，C-5’；C)，134.258(C-4’；C)，133.087(C-9；C)，130.536(C-1’；C)，126.657(C-10，C)，110.091(C-5，C-8；CH)，107.927(C-2’，C-6’；CH)，101.733(-OCH2O)，70.665(C-11；CH2)，56.492(3’，5’-OCH3；CH3)，50.584(C-4)，43.591(C-1；CH)，42.712(C-2，CH)，37.061(C-3；CH)。

4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(化合物(4))：白色针状晶体；C23H21O7N2S2；501，1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.196(s，1H)，δ6.989(s，1H)，6.446(s，1H)，6.319(s，2H)，5.950(d，2H)，5.367(s，1H)，4.571(s，1H)，4.294(d，1H)，3.976(t，1H，)，3.758(d，6H)，3.267(s，2H)；13C-NMR(300MHz，CDCl3)：δ174.556(C-12；C)，158.418(C-1”；C)，148.324(C-7；C)，147.417(C-6；C)，146.452(C-3’，C-5’；C)，134.130(C-4’；C)，132.544(C-9；C)，130.958(C-1’；C)，127.700(C-10，C)，110.191(C-5；CH)，109.920(C-8；CH)，108.019(C-2’，C-6’；CH)，101.590(-OCH2O)，70.494(C-11；CH2)，56.492(3’，5’-OCH3；CH3)，48.677(C-4)，43.591(C-1；CH)，42.384(C-2，CH)，37.211C-3；CH)。

实施例3

1、4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素转化为4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼酸(化合物(5))

用接种针以两点法将藤仓赤霉SH-f13接种于PDA斜面，培养条件：培养温度为30℃。灭菌条件为：121℃、20分钟。培养温度为30℃，培养时间为5天；

2)、一级液体种子培养

一级液体种子、二级液体种子培养基的配方均为：葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸钠2克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.01克/升、氯化钾0.5克/升，pH值7；一级液体种子培养：无菌操作下，精密吸取5ml无菌水至藤仓赤霉培养斜面中，以接种铲沿着菌苔表面刮取长度菌丝，将得到的5ml均匀菌丝悬液，接种于装有45ml霉菌基本培养基的250ml三角摇瓶中。28℃下，120rpm恒温摇床中培养5天。

3)、二级液体种子培养：二级液体种子的培养基配方和一级液体种子培养基的配方相同，无菌操作下，精密吸取5ml均匀的藤仓赤霉一级液体种子悬液，接种量按体积比计为10％，以10％接种量接种于装有45ml霉菌基本培养基的250ml三角摇瓶中。28℃下，120rpm恒温摇床中培养5天。

4)、生物转化

4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素母液的配制：称取实施例3中生物转化产物4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素250mg于50ml容量瓶中，加70％酒精定容至刻度，即得5mg/ml4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素母液。

无菌操作下，将1毫升4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素母液加入装有43毫升发酵培养基的250毫升三角摇瓶中。然后精密吸取5毫升均匀的藤仓赤霉SH-f13二级液体种子悬液，接种量按体积比计为10％，以10％接种量接种于装有45毫升发酵培养基和底物的250毫升三角摇瓶中，28℃下，120rpm恒温摇床中培养6天。

2、4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼酸的分离纯化

(2)分离纯化4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼酸：依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化。

(A)用正相硅胶柱或者相似极性柱分离；氯仿∶丙酮(40∶1)***作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮8∶1***作为展开剂，将Rf值0.4的馏分进行合并，将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

(B)用凝胶柱层析分离：将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品以溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶丙酮8∶1***作为展开剂，将Rf值0.4的馏分进行合并，将合并后的样品真空干燥并重结晶，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供鉴定样品。

4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼酸(化合物(5))：淡黄色粉末；C23H23O8N3S1；501，1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.137(s，1H)，7.011(s，1H)，6.559(s，1H)，6.427(s，2H)，5.951(d，2H)，5.145(d，1H)，4.435(s，2H)，4.157(d，1H)，3.822(s，6H)，3.529(s，2H)；13C-NMR(300MHz，CDCl3)：δ179.226(C-12；C)，147.852(C-6，C-7；C)，147.419(C-3’，C-5’；C)，133.754(C-4’；C)，132.613(C-9；C)，131.718(C-l’；C)，128.439(C-10，C)，109.935(C-5；CH)，108.318(C-8；CH)，105.024(C-2’，C-6’；CH)，101.587(-OCH2O)，69.664(C-11；CH2)，56.592(3’，5’-OCH3；CH3)，48.041(C-4)，46.134(C-1；CH)，45.802(C-2，CH)，39.417(C-3；CH)。

实施例4五种硫取代鬼臼类衍生物含量的测定

(1)、将实施例1、2、3中所获得的发酵液离心(10000转/分钟、20分钟、4℃)，取2毫升上清液用于各种发酵液中硫取代鬼臼类衍生物的测定；将4毫升乙腈加入2毫升发酵液，并进行离心(13000转/分钟、20分钟)；取上清液经0.45微米针头滤膜过滤，保存于4℃的冰箱中作为发酵液供试样品。

(2)、供试样品用液相色谱进行检测：进样量20微升，用反相高效色谱柱(美国安捷伦科技，长150毫米，内径4.5毫米，液膜厚度0.5微米)或者相似极性柱分离；紫外检测波长254纳米；甲醇-水***作为流动相，流速恒流0.8毫升/分钟；色谱柱温度45℃。

根据与同样条件下4-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-鬼臼毒素、4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素、4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素、4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素和4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼酸对照品的出峰时间确定各硫取代鬼臼类衍生物后，根据两者的峰面积比与浓度比得出样品中各硫取代鬼臼类衍生物的浓度，通过外标法得出原发酵液中各硫取代鬼臼类衍生物的浓度。

(4)、检测结果：实施例1所制备的发酵液中4-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-鬼臼毒素产量为8.9毫克/升，4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧鬼臼毒素产量为5.4毫克/升；实施例2所制备的发酵液中，4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素产量为7.6毫克/升，4-S-(1，3，4-噻二唑-2)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素产量为9.4毫克/升；实施例3所制备的发酵液中，4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼酸产量为50毫克/升。

试验例1本发明硫取代鬼臼类衍生物的抗肿瘤活性试验

一、试验材料

1、供试化合物：实施例1-3所制备的化合物，分别编号为化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)和化合物(5)；

2、对照化合物：鬼臼毒素和4′-去甲表鬼臼毒素购自西安和霖生物工程有限公司，纯度98％；依托泊苷，替尼泊苷；

3、细胞株：BGC823株、A549株、HepG2株和HK-2细胞株购自上海安普生物科技有限公司；

二、试验方法

将对数生长期的BGC823、A549、HepG2、HK-2细胞，1,000rpm离心5分钟，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至3.5×10³/孔。将细胞接种于96孔培养板中，分成阴性对照组和8个同浓度同序列的试验组，即：化合物(1)组，化合物(2)组，化合物(3)组，化合物(4)组，化合物(5)组，鬼臼毒素组，4′-去甲表鬼臼毒素组，依托泊苷组和替尼泊苷组；每孔0.10mL，用含有10％小牛血清的RPMI1640作为培养液，37℃、5％CO₂及饱和湿度下培养24h接近长满时，弃去培养液，分别加入化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)、化合物(5)、鬼臼毒素、4′-去甲表鬼臼毒素、依托泊苷10％小牛血清的RPMI164培养液0.15mL，阴性对照组加入终浓度为0.5％DMSO；各组均设3个复孔，继续培养48h，每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，37℃放置4h。每孔加入200μl DMSO，37℃摇床振荡30min，492nm/620nm测吸光度(OD)，计算MTT比值＝药物组OD值/阴性对照组OD值。

三、试验结果

试验结果见表1。由表1可知，化合物(5)的抗肿瘤活性较差，其余四个硫取代鬼臼类衍生物除化合物(2)在A549细胞株上不溶解，化合物(4)在BGC823细胞株上不溶解外，均对BGC823、A549、HepG2细胞株具有明显的生长抑制作用，与目前已做为抗肿瘤药物上市的鬼臼类衍生物依托泊苷和替尼泊苷抗肿瘤活性均有所提高。毒副作用实验表明，除化合物(4)外，其余四个化合物的毒副作用均有大幅度降低，具有较好的成药性。

表1硫取代鬼臼类衍生物对体外肿瘤株以及对正常细胞株的EC50值

Claims

1.式(I)或式(II)所示的具有抗肿瘤活性的硫取代鬼臼类衍生物：

式(I)

其中，R₁为R₂为CH₃或氢；

式(II)。

2.一种制备含有权利要求1式(I)所示的具有抗肿瘤活性的硫取代鬼臼类衍生物的生物转化产物的方法，包括：

3.一种制备含有权利要求1式(II)所示的具有抗肿瘤活性的硫取代鬼臼类衍生物的生物转化产物的方法，包括：(1)将4′-去甲表鬼臼毒素加入到液体发酵培养基中，接种鬼臼类植物内生菌二级液体种子进行发酵培养；(2)发酵培养4天后再加入3-巯基-1，2，4-三氮唑继续进行发酵培养，得到含有4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素的生物转化产物；(3)将4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素分离纯化后加入到液体发酵培养基中，接种腐殖性土壤真菌二级液体种子进行发酵培养，得到含有4-S-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼酸的生物转化产物。

4.按照权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述的鬼臼类植物内生菌从八角莲属(Dysosma)、桃儿七属(podophyllum)、山荷叶(Diphylleia)或沙地柏(Sabina vulgaris Ant)中分离得到；优选的，所述的鬼臼类植物内生菌是产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)Y.J.Tang，其微生物保藏号是CCTCC NO.M2010262；所述的腐殖性土壤菌是从湖北恩施或神农架等地的土壤中分离得到；优选的，所述的腐殖性土壤菌是藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)SH-f13，其微生物保藏号是CCTCC NO.M2010038。

5.按照权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中将鬼臼毒素或4′-去甲基表鬼臼毒素作为底物加入到发酵培养基时，所加入用量为至终浓度0.05-5克/升，优选为0.2克/升；步骤(2)中在发酵培养基中添加2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑至其终浓度分别为0.01-5克/升，优选为0.1克/升；步骤(2)中发酵培养4天后再加入2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑继续进行发酵培养；所述的发酵培养包括摇瓶级或生物反应器规模的发酵培养；其中，所述的发酵培养温度为15-40℃，优选为30℃；当采用摇瓶进行发酵培养时，所述的摇床转速为50-300转/分钟，优选的，所述的摇床转速为120转/分钟。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中或步骤(2)中所述的液体发酵培养基组成是：酵母膏1-50克/升、硫酸镁0.5-20克/升、磷酸氢二钾1-20克/升、硫酸亚铁0.01-10克/升、氯化钾0.5-20克/升、pH值3-9；优选的，所述的液体发酵培养基的组成是：酵母膏3克/升，硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.02克/升、氯化钾0.5克/升、pH值为7；

所述的腐殖性土壤菌二级液体种子或鬼臼类植物内生菌二级液体种子的制备包括以下步骤：(1)培养斜面菌种；(2)培养一级液体种子；(3)培养二级液体种子；

其中，培养斜面菌种中所用到的培养基和培养条件为：

培养条件：培养温度为15-40℃；

培养一级液体种子所用到的培养基和培养条件为：

培养条件：培养温度15-40℃，摇床转速为50-300转/分钟；

培养二级液体种子所用到的培养基和培养条件为：

培养条件：培养温度15-40℃，摇床转速为50-300转/分钟。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养斜面菌种中所用到的培养基和培养条件为：

培养基：葡萄糖30克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸二氢钾1.5克/升、盐酸硫胺0.1克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；培养条件：培养温度为30℃；

所述培养一级液体种子所用到的培养基和培养条件为：培养基：葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸钠2克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.01克/升、氯化钾0.5克/升，pH值7；培养条件：培养温度30℃，摇床转速为120转/分钟；

所述培养二级液体种子所用到的培养基和培养条件为：培养基：葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸钠2克/升、硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、硫酸亚铁0.01克/升、氯化钾0.5克/升，pH值7；培养条件：培养温度30℃，摇床转速为120转/分钟。

8.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的分离纯化包括：(1)将生物转化产物离心，收集发酵上清液备用；(2)制备发酵上清液待分离纯化样品；(3)依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化，即得；其中，步骤(2)所述发酵上清液待分离纯化样品的制备方法，包括：将发酵上清液通过液液萃取，收集有机层，浓缩挥干，得到发酵上清液待分离纯化样品；步骤(3)中所述硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析；正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱液平衡；反相硅胶以甲醇拌匀后装柱，以洗脱液平衡；优选的，步骤(3)中将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，采用硅胶柱层析吸附，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；其中，以体积比为20∶1的氯仿∶丙酮作为洗脱液；将凝胶以甲醇浸泡，将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶，即得。

9.从权利要求2所述的生物转化产物中分离纯化式(I)所示的具有抗肿瘤活性的硫取代鬼臼类衍生物的方法，其特征在于，包括：

(1)将生物转化产物离心，收集发酵上清液备用；(2)制备发酵上清液待分离纯化样品或菌丝体待分离纯化样品；(3)使用硅胶柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化，即得；

步骤(2)所述发酵上清液待分离纯化样品的制备方法，包括：将发酵上清液通过液液萃取，收集有机层，浓缩挥干，得到发酵上清液待分离纯化样品；步骤(3)中所述硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析；正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱液平衡；反相硅胶以甲醇拌匀后装柱，以洗脱液平衡；优选的，步骤(3)中将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，采用硅胶柱层析吸附，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；以体积比为40∶1的氯仿∶丙酮***作为洗脱液；

将凝胶以甲醇浸泡，将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶，即得。

10.权利要求1所述的硫取代鬼臼类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。