CN104593444B - 一种发酵制备埃博霉素b的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用活性炭替代大孔树脂发酵合成埃博霉素B的方法，发酵过程中，向发酵培养基中添加活性碳作为目标产物的吸附剂，并且每升培养基中活性碳的添加量为10‑30g。本发明的操作简单，条件温和，原材料来源广泛价格便宜，设备要求低，降低了生产成本，并且提高了发酵产量，特别适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于埃博霉素B 的生产技术领域，具体涉及一种通过发酵制备获得埃博霉素B的方法。
背景技术
埃博霉素B(Epothilone B) 是粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum) 产生的一种聚酮次级代谢产物，是一种大环内酯类的化合物，它与临床上广泛应用的抗肿瘤化疗药物紫杉醇具有相同的稳定微管活性，且对紫杉醇耐药的肿瘤细胞具有活性。另外埃博霉素B来源于微生物代谢产物的特征使其被人们认为是一种比紫杉醇类药物更具市场前途的抗癌药物。埃博霉素B分子式为C27H41NO6S，相对分子量为507.68，结构式如下：
与临床研究相比，埃博霉素B的生产技术还远远落后。其主要瓶颈在于发酵水平低下，目前粘细菌发酵制备埃博霉素B的产量仅在200mg/L发酵液的水平。这是由于埃博霉素B及其同系物对生产菌株的毒性和反馈抑制作用较大，导致埃博霉素B的发酵水平很难提高。
对于上述问题，现在比较普遍的解决方法是在发酵培养基中加入大孔树脂如XAD-16、AB-8或DA201等吸附产物，从而降低产物对菌株的毒性抑制作用，同时刺激微生物不断代谢产生埃博霉素B。
但这种方法存在以下缺点：树脂在发酵液中分布不均，导致发酵过程取样失去参考价值；树脂是多空渗水物质，有比较大的内表面积，在高压灭菌过程中，内部的空气无法灭菌完全，容易导致发酵因染菌而失败；发酵罐的阀门极易被树脂堵塞；树脂价格昂贵，增加生产成本。
因此找到一种可以替代树脂的材料对埃博霉素B的产业化具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于，针对目前埃博霉素B发酵工艺普遍使用大孔树脂吸附产物的缺点，提供一种发酵水平高，生产成本低的方法，其主要以活性炭替代大孔树脂，具体技术方案如下：
1）在种子罐中培养种子培养液；
所述的种子培养基配制方法：
淀粉10g/L，奶粉5g/L，蛋白胨5g/L，黄豆粉4g/L,硫酸镁1g/L，氯化钙1g/L，碳酸钙3g/L，pH7.5。
配制适量的种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至29-31℃，按种子培养基体积比5-10%的接种量接入60-70h种龄的摇瓶种子，培养过程中控制温度为29-31℃，压力为0.04-0.06Mpa，通气为0.5-1.0VVM，转速为100-300rpm，设种子罐初始溶氧为100%，培养过程中保持溶氧在30%以上，持续培养60-70h。
2）在发酵罐中接入种子培养液，并添加活性炭，持续发酵获得埃博霉素B。
所述的发酵培养基配制方法：
发酵培养基A：淀粉40g/L，奶粉10g/L，蛋白胨10g/L，黄豆粉4g/L，硫酸镁1g/L，氯化钙1g/L，碳酸钙3g/L，活性碳10-30g/L，PH7.5。
所述的活性碳为粉末状或颗粒状。
优选地，发酵培养基A中活性碳为20g/L，活性碳为粉末状。
配制适量的发酵培养基A，120℃灭菌30min后冷却至29-31℃，按发酵培养基体积比5-10%的接种量接入种子培养液，发酵过程中保持温度为29-31℃，压力为0.04-0.06Mpa，通气为0.5-1.0VVM，转速为50-200rpm，设发酵罐初始溶氧量为100%，发酵过程中保持溶氧在30%以上，发酵11-13天。
优选地，按发酵培养基体积比8%的接种量接入种子培养液。
发酵培养基B：淀粉40g/L，奶粉10g/L，蛋白胨10g/L，黄豆粉4g/L，硫酸镁1g/L，氯化钙1g/L，碳酸钙3g/L，活性碳5-10g/L，PH7.5。
所述的活性碳为粉末状或颗粒状。
优选地，发酵培养基B中活性碳为10g/L，活性碳为粉末状。
配制适量的发酵培养基B，120℃灭菌30min后冷却至29-31℃，按发酵培养基体积比5-10%的接种量接入种子培养液，发酵过程中保持温度为29-31℃，压力为0.04-0.06Mpa，通气为0.5-1.0VVM，转速为50-200rpm，设初始溶氧为100%，控制溶氧在30%以上，发酵培养过程中，一次或分次补加活性碳，补加总量为5-20 g/L，发酵11-13天。
优选地，发酵培养过程中，通过取样检测，当发酵单位达到50mg/L以上时，添加10g/L的活性碳；当发酵单位达到100mg/L以上时，再添加10g/L 的活性碳。
优选地，补入的活性碳为粉末状。
所述的取样检测条件为：250nm波长下，流动相乙腈︰水=1︰1，C18柱，HPLC检测。
配制活性碳补料液：将活性碳倒入补料罐内，加入适量水，120℃灭菌30min，冷却至29-31℃，待用。
本发明中，发酵使用的菌株为纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)，该菌种可通过商业途径购买，菌株保藏编号：ATCC15384。
更进一步的，将上述发酵液进行分离纯化，得到高纯度的埃博霉素B。
本发明的操作简单，条件温和，原材料来源广泛价格便宜，设备要求低，降低了生产成本，并且提高了发酵产量。
特别是申请人意外的发现，通过添加活性碳替代现有技术中普遍使用的树脂作为发酵过程中的吸附剂，不仅活性碳灭菌更加充分，降低了发酵过程中染菌的风险，而且在发酵液不断搅拌的条件下，活性碳吸附剂分布均匀，不断的吸附产物，降低产物对菌株的毒性抑制作用，提高了目标产物的产量，同时活性碳的市场价格比较低廉，极其适合工业化生产。
附图说明 实施例5发酵液中埃博霉素B HPLC检测的色谱图，其中埃博霉素B的保留时间为3.358min。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不意味着对本发明有任何限制。将纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)低温保存。摇瓶培养：2L摇瓶装200ml种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至30℃，接入低温保存的菌种，在30℃，转速200rpm下摇瓶培养60-70h。
实施例1 不添加产物吸附剂发酵生产埃博霉素B
发酵培养基Ⅰ：淀粉40g/L，奶粉10g/L，蛋白胨10g/L，黄豆粉4g/L，硫酸镁1g/L，氯化钙1g/L，碳酸钙3g/L，pH7.5。
在5L种子罐中配制3.5L种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至30℃，按种子培养基体积比8%的接种量接入65h种龄的摇瓶种子，控制温度为30℃，压力为0.05Mpa，通气为0.7VVM，转速为100-300rpm，控制溶氧在30%以上，持续培养65h。
50L发酵罐中配制35L发酵培养基Ⅰ，120℃灭菌30min后冷却至30℃，按发酵培养基体积比8%的接种量接入种子培养液，发酵过程中保持温度为30℃，压力为0.05Mpa，通气为0.8VVM，转速为50-200rpm，发酵过程中保持溶氧在30%以上，发酵培养12天放罐，波长250nm，HPLC检测发酵单位5mg/L。
实施例2 添加产物吸附剂大孔树脂发酵生产埃博霉素B
发酵培养基Ⅱ：淀粉40g/L，奶粉10g/L，蛋白胨10g/L，黄豆粉4g/L，硫酸镁1g/L，氯化钙1g/L，碳酸钙3g/L，XAD-16树脂2.0-3.0%(树脂体积与发酵培养基体积之比)，pH7.5。
在5L种子罐中配制3.5L种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至30℃，按种子培养基体积比8%的接种量接入65h种龄的摇瓶种子，控制温度为30℃，压力为0.05Mpa，通气为0.7VVM，控制转速在100-300rpm，控制溶氧在30%以上，持续培养65h。
在50L发酵罐中配制35L发酵培养基Ⅱ，120℃灭菌30min后冷却至30℃，按发酵培养基Ⅱ体积比8%的接种量接入种子培养液，发酵过程中保持温度为30℃，压力为0.05Mpa，通气为0.8VVM，转速为50-200rpm，发酵过程中保持溶氧在30%以上，发酵培养12天放罐，波长250nm，HPLC检测发酵单位110mg/L。
实施例3 添加产物吸附剂粉状活性碳发酵生产埃博霉素B
在5L种子罐中配制3.5L种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至29℃，按种子培养基体积比5%的接种量接入70h种龄的摇瓶种子，控制温度为31℃，压力为0.04Mpa，通气为0.5VVM，转速为100-300rpm，控制溶氧在30%以上，持续培养时间60h。
在50L发酵罐中配制35L发酵培养基A，其中活性碳为粉状活性碳，120℃灭菌30min后冷却至29℃，按发酵培养基体积比5%的接种量接入种子培养液，发酵过程中保持温度为31℃，压力为0.04Mpa，通气为0.5VVM，转速为50-200rpm，发酵过程中保持溶氧在30%以上，发酵培养13天放罐，波长250nm，HPLC检测发酵单位130mg/L。
实施例4 添加产物吸附剂颗粒状活性碳发酵生产埃博霉素B
在5L种子罐中配制3.5L种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至31℃，按种子培养基体积比10%的接种量接入60h种龄的摇瓶种子，控制温度为29℃，压力为0.06Mpa，通气为1.0VVM，转速为100-300rpm，控制溶氧在30%以上，持续培养70h。
在50L发酵罐中配制35L发酵培养基A，其中活性碳为颗粒状活性碳，120℃灭菌30min后冷却至31℃，按发酵培养基体积比10%的接种量接入种子培养液，发酵过程中保持温度为29℃，压力为0.06Mpa，通气为1.0VVM，转速为50-200rpm，发酵过程中保持溶氧在30%以上，发酵培养11天放罐，波长250nm，HPLC检测发酵单位105mg/L。
实施例5 分批添加产物吸附剂粉状活性碳发酵生产埃博霉素B
在5L种子罐中配制3.5L种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至29℃，按种子培养基体积比5%的接种量接入60h种龄的摇瓶种子，控制温度为29℃，压力为0.04Mpa，通气为0.5VVM，转速为100-300rpm，控制溶氧在30%以上，持续培养60h。
在50L发酵罐中配制35L发酵培养基B，其中活性碳为粉状活性碳，120℃灭菌30min后冷却至29℃，按发酵培养基体积比10%的接种量接入种子培养液，发酵过程中保持温度为29℃，压力为0.04Mpa，通气为0.5VVM，控制转速在50-200rpm，发酵过程中保持溶氧在30%以上，取样检测，发酵单位达到50mg/L时，添加10g/L的活性碳，当发酵单位达到100mg/L时，再添加10g/L 的活性碳，继续发酵，发酵第11天放罐，波长250nm，HPLC检测发酵单位145mg/L。
实施例6 分批添加产物吸附剂颗粒状活性碳发酵生产埃博霉素B
在5L种子罐中配制3.5L种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至31℃，按种子培养基体积比10%的接种量接入70h种龄的摇瓶种子，控制温度为31℃，压力为0.06Mpa，通气为1.0VVM，转速为100-300rpm，控制溶氧在30%以上，持续培养70h。
在50L发酵罐中配制35L发酵培养基B，其中活性碳为颗粒状活性碳，120℃灭菌30min后冷却至31℃，按发酵培养基体积比5%的接种量接入种子培养液，发酵过程中保持温度为31℃，压力为0.06Mpa，通气为1.0VVM，转速为50-200rpm，发酵过程中保持溶氧在30%以上，当发酵单位达到50mg/L时，添加10g/L的活性碳，当发酵单位达到100mg/L时，再添加10g/L 的活性碳，继续发酵，发酵第13天放罐，波长250nm，HPLC检测发酵单位120mg/L。
实施例7 分批添加产物吸附剂颗粒状活性碳发酵生产埃博霉素B 在5L种子罐中配制3.5L种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至31℃，按种子培养基体积比10%的接种量接入70h种龄的摇瓶种子，控制温度为31℃，压力为0.06Mpa，通气为1.0VVM，转速为100-300rpm，控制溶氧在30%以上，持续培养70h。
在50L发酵罐中配制35L发酵培养基B，其中活性碳为颗粒状活性碳，120℃灭菌30min后冷却至31℃，按发酵培养基体积比5%的接种量接入种子培养液，发酵过程中保持温度为31℃，压力为0.06Mpa，通气为1.0VVM，转速为50-200rpm，发酵过程中保持溶氧在30%以上，当发酵单位达到80mg/L时，添加20g/L的活性碳，继续发酵，发酵第13天放罐，波长250nm，HPLC检测发酵单位125mg/L。
应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种用发酵制备埃博霉素B的方法，其特征在于，所述的发酵过程包括：
1)在种子罐中培养种子培养液；
2)在发酵罐中接入种子培养液，并添加活性炭，持续发酵获得埃博霉素B；
所述的活性炭为粉末状或颗粒状，其中，当活性炭为粉末状时，所述的活性炭，在制备发酵培养基时添加，添加量为每升培养基添加10-30g的活性炭；或者，在制备发酵培养基时添加，添加量为每升培养基添加5-10g的活性炭，发酵过程中再一次或分次补加活性炭，补加总量为每升培养基添加5-20g的活性炭；
其中，当活性炭为颗粒状时，所述的活性炭，在制备发酵培养基时添加，添加量为每升培养基添加5-10g的活性炭，发酵过程中再一次或分次补加活性炭，补加总量为每升培养基添加5-20g的活性炭；
其中，发酵所用菌株为粘细菌纤维堆囊菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的活性炭为粉末状，在制备发酵培养基时添加，添加量为每升培养基添加5-10g的活性碳；发酵过程中再一次或分次补加活性碳，补加总量为每升培养基添加5-20g的活性碳。
3.如权利要求1所述的，其特征在于，步骤1)向种子罐中接入菌种，培养条件温度为29-31℃，压力为0.04-0.06Mpa，通气为0.5-1.0VVM，转速为100-300rpm，设种子罐初始溶氧量为100％，培养过程中保持溶氧在30％以上，培养时间60-70h。
4.如权利要求1所述的，其特征在于，步骤2)中发酵罐培养条件为按发酵培养基体积的5-10％接种量接入种子培养液，发酵温度为29-31℃，压力为0.04-0.06Mpa，通气为0.5-1.0VVM，转速为50-200rpm，设发酵罐初始溶氧量为100％，培养过程中保持溶氧在30％以上，发酵11-13天。
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