CN102586358A - 一种提高埃博霉素b产率的生物合成方法 - Google Patents
一种提高埃博霉素b产率的生物合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102586358A CN102586358A CN2012100069370A CN201210006937A CN102586358A CN 102586358 A CN102586358 A CN 102586358A CN 2012100069370 A CN2012100069370 A CN 2012100069370A CN 201210006937 A CN201210006937 A CN 201210006937A CN 102586358 A CN102586358 A CN 102586358A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- epothilone
- liquid
- shake
- growth
- days
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- QXRSDHAAWVKZLJ-PVYNADRNSA-N epothilone B Chemical compound C/C([C@@H]1C[C@@H]2O[C@]2(C)CCC[C@@H]([C@@H]([C@@H](C)C(=O)C(C)(C)[C@@H](O)CC(=O)O1)O)C)=C\C1=CSC(C)=N1 QXRSDHAAWVKZLJ-PVYNADRNSA-N 0.000 title claims abstract description 52
- QXRSDHAAWVKZLJ-OXZHEXMSSA-N Epothilone B Natural products O=C1[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)CCC[C@@]2(C)O[C@H]2C[C@@H](/C(=C\c2nc(C)sc2)/C)OC(=O)C[C@H](O)C1(C)C QXRSDHAAWVKZLJ-OXZHEXMSSA-N 0.000 title claims abstract description 51
- HESCAJZNRMSMJG-HGYUPSKWSA-N epothilone A Natural products O=C1[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)CCC[C@H]2O[C@H]2C[C@@H](/C(=C\c2nc(C)sc2)/C)OC(=O)C[C@H](O)C1(C)C HESCAJZNRMSMJG-HGYUPSKWSA-N 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title abstract description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 38
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 13
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 25
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 15
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 claims description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 10
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 10
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 8
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 8
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 8
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 8
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 5
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 5
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 claims description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 claims description 4
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical class C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 claims description 4
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 claims description 4
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 3
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 claims description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 2
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 abstract 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBHLXXMDOGRQOQ-FCIKGTDHSA-N Epothilone B10 Natural products O=C1[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)CCC[C@@]2(C)O[C@H]2C[C@@H](/C(=C\c2nc(CC)sc2)/C)OC(=O)C[C@H](O)C1(C)C FBHLXXMDOGRQOQ-FCIKGTDHSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229930013356 epothilone Natural products 0.000 description 1
- 150000003883 epothilone derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000010812 external standard method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000013580 millipore water Substances 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000024053 secondary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，其步骤是采用离心法选出健壮的产埃博霉素B菌种接种于灭菌的种子培养基中，在30℃的摇床振荡培养后再发酵；并向发酵培养基中添加前体诱导物苯丙氨酸；在30℃培养10～11天后收获培养液；再经大孔树脂收集吸附饱和，乙酸乙酯洗脱，分离纯化、真空浓缩、萃取、低温结晶、真空干燥。本发明将动态洗脱法用于埃博霉素B的工业化生产，使规模化生产成为可能。通过液相制备柱可有效地提纯埃博霉素B的纯度，其纯度可达99.5％以上，同时采用甲醇进行萃取分离，使埃博霉素B在甲醇中结晶，成品能达到医药级水平。本方法大幅度提高埃博霉素B产率达到30～45％，具有良好的工业化生产前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种埃博霉素的生物合成方法，具体地说是一种工业化生产提高埃博霉素B产率的生物合成方法，属于抗生素微生物发酵培养领域。
背景技术
埃博霉素B属于大环内脂类抗生素新成员，埃博霉素是一类具有独特结构和独特生物活性的抗生素。其分子结构如下：
埃博霉素A
埃博霉素B
其中埃博霉素B是由粘细菌(纤维对囊菌)产生的大环内酯类化合物，埃博霉素B不但具有抗肿瘤作用，对于真菌感染的皮肤病也有良好的拮抗、治疗作用，埃博霉素B毒性低、副作用小，具有良好的应用前景，但目前通过发酵制备埃博霉素B的方法生产成本高，培养所产生的活性物质中埃博霉素B产率低，生产波动性大，最高只占22％以下，有的甚至只有痕迹量。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中埃博霉素B生产成本高及低产率的问题，而提供一种高产率的、能适应工业化生产并能有效地降低生产成本的埃博霉素的生物合成方法，采用本方法扩培、发酵产生的活性产物中埃博霉素B的产率高达到30～45％，具有良好的工业化生产前景。
为了实现上述的目的，本发明所采取的技术方案是：提供一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，包括如下步骤：
(1)、生产出发菌种，Soce90-G15：通过3000rpm离心摇瓶菌液选取生长健壮的粘细菌作为生产出发菌种；
(2)、固体斜面扩培：培养基的组分按质量％计为，葡萄糖0.5～1％、蛋白胨0.3～0.5％、淀粉0.5～1％、氯化钠0.1～0.5％、赤霉素0.002％和琼脂粉2％，余量为水；培养基在120℃、30分钟灭菌冷却后布置成斜面，24小时后把生产出发菌种涂布于斜面上，在30±2℃、相对湿度55％，7～9天可见生长丰满、金黄色的菌苔，冷藏待用；
(3)、摇瓶扩培：摇瓶培养基为淀粉5～8g/L、酵母提取物2～4g/L、葡萄糖0.5～1.5g/L、MgSO4 1g/L、CaCl2 1g/L、甘油0.5～1g/L、磷酸二氢钠0.05g/L、豆饼粉2～4g/L，饮用水1升，调PH为7.20、在120℃、30分钟灭菌；把固体斜面的菌苔轻轻刮下接入摇瓶培养基，在29℃±1℃、转速150rpm下，生长5～6天；选取菌体生长健壮的摇瓶菌种液转接入一级种子罐；
(4)、一级种子培养：一级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；把生长好的摇瓶菌种液通过压差法接入一级种子罐中扩培，培养温度29±2℃、转速120rpm、空气流量比1比0.4、罐压0.04kg/cm2，培养5～6天，将生长旺盛的菌种液转接入二级种子罐；
(5)、二级种子罐培养：二级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；把生长好的一级菌种液通过压差法接入二级种子罐中扩培，培养温度29±2℃、转速120rpm、空气流量比1比0.5、罐压0.04kg/cm2，培养2～3天，将生长旺盛的菌种液转接入发酵罐；
(6)、发酵罐培养：发酵培养基的组成与摇瓶培养基相同，但外加前体诱导物0.2～0.5g/L、大孔吸附树脂20g/L；PH调整至7.30，120℃、30分钟灭菌；把生长好的二级菌种液通过压差法接入发酵罐中扩培，培养产品的温度29±2℃、转速150rpm、空气流量比1比0.8、罐压0.04kg/cm2、培养10～11天；
(7)、洗涤、洗脱：发酵至残糖低于0.2％，在代谢活性物质产出高点时终止发酵，将发酵液中的的树脂分离出来淘洗干净装入树脂床内；用50％甲醇洗涤1倍柱床量、流速25ml/min，脱色、除杂；再用6倍柱床量乙酸乙酯，流速15ml/min洗脱埃博霉素A、埃博霉素B活性物质，收集洗脱液；
(8)、真空浓缩：把收集的含活性物质的洗脱液真空浓缩，温度40～45℃、真空度-0.085～-0.095MPa，浓缩至原始体积量的1/15以下；
(9)、液相制备柱分离：把浓缩液通过液相制备柱分离收集埃博霉素B部份分离液；
(10)、萃取：把收集的含埃博霉素B分离液真空浓缩至剩余水相，加入有机溶剂进行萃取分离收集有机相；
(11)、结晶：把收集的有机相真空浓缩，温度40～45℃、真空度-0.085～-0.09MPa、浓缩至原始体积量的1/10以下；把浓缩液放入洁净的结晶器中-20℃低温结晶；
(12)、真空干燥；收集结晶体放入洁净的真空干燥箱，温度45～50℃、真空度-0.085～-0.09MPa；干燥得到含量99.5％以上的活性产物埃博霉素B成品。
本发明所述的扩培采用摇瓶振荡培养或搅拌沉没培养方式，工业化生产首选搅拌沉没方式。
本发明所述在发酵培养基中外加的前体诱导物为苯丙氨酸，或是它的有机盐，其加入培养基的方法为一次投入或是间歇流加。
本发明用于培养微生物的培养基中应加入可被利用的碳源如淀粉、葡萄糖、甘油等，氮源如豆饼粉、鱼骨粉、酵母粉等，无机盐和能被利用的各种微量元素及前体物质。这些成分可一次性的加入培养基中或连续性的补入以实现埃博霉素B的高产率。本发明所用的发酵培养基成分与种子培养基的组成基本相同，只是要添加前体物质。在发酵培养基中加入埃博霉素B的前体物质为苯丙氨酸，其加入量为0.2～0.5g/L；具体地说，发酵培养基的组分为淀粉5～8g/L、酵母提取物2～4g/L、葡萄糖0.5～1.5g/L、MgSO41g/L、CaCl21g/L、甘油0.5～1g/L、磷酸二氢钠0.05g/L、豆饼粉2～4g/L、苯丙氨酸0.2～0.5g/L大孔吸附树脂20g/L；PH调整至7.30、120℃、30分钟灭菌。
本发明所用培养基都需灭菌处理，一般于120℃灭菌30分钟即可。所述的扩培可采用摇瓶振荡培养或搅拌沉没培养方式，工业化生产首选搅拌沉没方式。培养条件随代谢情况做出相应变化，使培养基成分变化有所不同。当发酵液中的代谢生物活性达到最高、残糖0.2％以下时终止培养。经液相制备分离纯化所得活性产物埃博霉素B，所得埃博霉素B含量比能够达到30～50％。
简言之，本发明的一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，是将产生埃博霉素B的粘细菌，接种于配置灭菌好的种子培养基中，在30℃的摇床振荡培养后再用于发酵；发酵培养时向粘细菌的发酵培养基中添加埃博霉素B的前体诱导物苯丙氨酸，使其生长代谢发酵培养；在30℃培养10～11天后收获培养液，并从培养基中回收埃博霉素B；再经收集吸附饱和的大孔树脂；用乙酸乙酯对溶液分离纯化、真空浓缩、萃取、低温结晶、真空干燥，得到含量达到30～50％埃博霉素B。
本发明的方法与现有技术相比具有如下优点：
1、本发明的方法中采用离心方式选取生长健壮的摇瓶菌液，可有效地分离出营养液，更有利于菌种的保存，防止菌种退化和保存中变异。
2、本发明的方法中在细菌培养基中加入赤霉素这类生长激素，提高和均衡粘细菌的生长，有利于缩短生产周期，提高次级代谢的产出率。在培养基加入苯丙氨酸作为前体诱导物，提高了目的代谢产物埃博霉素的产出率。
3、本发明的方法中把动态洗脱法用于埃博霉素B的工业化生产，使这一产品规模化生产成为可能。通过液相制备柱可以有效的提纯埃博霉素B的纯度，成品纯度可达99.5％，同时采用甲醇进行萃取分离，使埃博霉素B在甲醇中结晶，结晶体具有良好的晶形和色基，成品能达到医药级水平。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明方法作进一步详述。
实施例1：本发明的一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，合成步骤包括：
(1)、生产出发菌种，通过3000rpm离心摇瓶菌液选取生长健壮的出发粘细菌菌种为生产菌种；
(2)、固体斜面扩培：其斜面培养基组分按质量％计为，葡萄糖0.5％、蛋白胨0.5％、淀粉1％、氯化钠0.5％、赤霉素0.002％和琼脂粉2％，余量为水；于120℃灭菌30分钟，24小时后将生长良好的生产出发菌种涂布于固体斜面培养基上，在30℃±2℃、相对湿度55％培养8天；
(3)、将生长良好的菌种接种于经过120℃灭菌30分钟的摇瓶扩培基中，摇瓶扩培基的组分为淀粉5g/L、酵母提取物2g/L、葡萄糖1g/L、MgSO4 1g/L、CaCl2 1g/L、甘油1g/L、磷酸二氢钠0.05g/L、豆饼粉2g/L，饮用水1升，PH调节为7.20，在29℃±1℃旋转培养120小时后；选取菌体生长健壮的摇瓶菌种液转接入一级种子罐；
(4)、一级种子培养：一级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；灭菌后接种、培养温度29±2℃、转速120rpm、空气流量比1比0.4、罐压0.04kg/cm2、培养5天，在菌体生长旺盛时转接入二级种子罐；
(5)、二级种子罐培养：二级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；把生长好的一级菌种液通过压差法接入二级种子罐中扩培培养温度29±2℃、转速120rpm、空气流量比1比0.4、罐压0.04kg/cm2、培养3天，在菌体生长旺盛时转接入发酵罐；
(6)、发酵罐培养：发酵培养基的组成与摇瓶培养基相同，只是另加苯丙氨酸0.2g/L、大孔树脂20g/L，调PH7.30，同样于120℃灭菌，灭菌30分钟；将培养好的二级种子培养液接入发酵培养基中29℃±2℃、转速120rpm、空气流量比1比0.8、罐压0.04kg/cm2、培养10天后收获培养液；采用大孔树脂收集吸附复合活性产物；
(7)、洗涤、洗脱：发酵至残糖低于0.2％，代谢活性物质产出最高点终止发酵，将发酵液中的的树脂分离出来淘洗干净装入树脂床内；用50％甲醇洗涤1倍柱床量、流速25ml/min，脱色、除杂；再用6倍柱床量乙酸乙酯，流速15ml/min洗脱埃博霉素A、埃博霉素B活性物质，收集洗脱液；
(8)、真空浓缩：把收集的含活性物质的洗脱液真空浓缩，温度45℃、真空度-0.095MPa，浓缩至原始体积量的1/15以下；
(9)、液相制备柱分离：把浓缩液通过液相制备柱分离收集埃博霉素B部分分离液；
(10)、萃取：把收集的埃博霉素B分离液加入有机溶剂进行萃取分离收集有机相；
(11)、结晶：把收集的有机相真空浓缩温度45℃、真空度-0.09MPa、浓缩至原始体积量的1/10以下；把浓缩液放入洁净的结晶器中-20℃低温结晶；
(12)、真空干燥；收集结晶体放入洁净的真空干燥箱，温度50℃、真空度-0.085MPa；干燥得到高含量的活性产物埃博霉素B成品。
采用本发明方法，所得主要组分为埃博霉素B，经液相检测埃博霉素B的产率在活性复合物中所占比率可达45％。
经HPLC检验其产物保留时间与埃博霉素B标准品相同，紫外最大吸收度与埃博霉素B标准品相同。液相与埃博霉素B标准品保留时间一致。
附检测方法：
1.主要仪器与材料
1.11色谱仪：Shimadzu 10A-Tvp HPLC。
1.12色谱柱：Shim-pack MRC-ODS(250mm×4.6mm，4.60μm)分析柱或KromasilC18(250mm×4.6mm)大连依利特科学仪器有限公司。
1.13EpoB对照品：Sigma E2656，(-)-Epothilone B 10μg。
1.2色谱条件
以65％甲醇(HPLC级，Merck Co.，)和35％缓冲液(0.2％A.P.acetate acid/18MRMillipore Water)为流动相，流速为1.0ml/min，进样量为10μl。检测波长为249nm，柱温28℃。主要色谱峰的出峰顺序依次为埃博霉素A(相对保留时间为0.8)与埃博霉素B(相对保留时间为1.0)。
1.3操作方法
取本发明方法所得产物适量作样品，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为供试样品溶液。另取埃博霉素B对照品10μg，加甲醇20μl定容，得对照品溶液(0.5mg/ml)。
分别取本发明样品溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。
1.4计算和结果的表示
式中：A样：本发明样品的峰面积；C样：本发明样品的浓度，mg/ml；
A对：对照品的峰面积；C对：对照品的浓度，mg/ml。
1.5判定标准
本发明样品按干燥品计算，含C27H41NO6S不得少于96.0％。
紫外吸收光谱
2.1仪器用具
UV-7502PCS紫外-可见分分光度计、AL104万分之一电子天平、容量瓶(10ml、100ml)、称量瓶、移液管(1ml)、石英比色皿。
2.2操作方法
取本发明样品10mg，置于100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，取1ml至10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，即得本发明样品液。照“紫外-可见分光光度法”测定，在200nm～300nm波长范围内扫描，记录图谱。
2.3判定标准
在211nm与249nm的波长处有最大吸收。
发明样品：加入苯丙氨酸用产埃博B的粘细菌发酵200L发酵产出产品达到6克。
对比例：在相同条件下，不加苯丙氨酸。用产埃博B的粘细菌发酵。200L发酵产出产品仅为3.3克左右。产率低了45％。
Claims (3)
1.一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)、生产出发菌种，Soce90-G15：通过3000rpm离心摇瓶菌液选取生长健壮的粘细菌作为生产出发菌种；
(2)、固体斜面扩培：培养基的组分按质量％计为，葡萄糖0.5～1％、蛋白胨0.3～0.5％、淀粉0.5～1％、氯化钠0.1～0.5％、赤霉素0.002％和琼脂粉2％，余量为水；培养基在120℃、30分钟灭菌冷却后布置成斜面，24小时后把生产出发菌种涂布于斜面上，在30±2℃、相对湿度55％，7～9天可见生长丰满、金黄色的菌苔，冷藏待用；
(3)、摇瓶扩培：摇瓶培养基为淀粉5～8g/L、酵母提取物2～4g/L、葡萄糖0.5～1.5g/L、MgSO4 1g/L、CaCl2 1g/L、甘油0.5～1g/L、磷酸二氢钠0.05g/L、豆饼粉2～4g/L，饮用水1升，调PH为7.20、在120℃、30分钟灭菌；把固体斜面的菌苔轻轻刮下接入摇瓶培养基，在29℃±1℃、转速150rpm下，生长5～6天；选取菌体生长健壮的摇瓶菌种液转接入一级种子罐；
(4)、一级种子培养：一级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；把生长好的摇瓶菌种液通过压差法接入一级种子罐中扩培，培养温度29±2℃、转速120rpm、空气流量比1比0.4、罐压0.04kg/cm2，培养5～6天，将生长旺盛的菌种液转接入二级种子罐；
(5)、二级种子罐培养：二级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；把生长好的一级菌种液通过压差法接入二级种子罐中扩培，培养温度29±2℃、转速120rpm、空气流量比1比0.5、罐压0.04kg/cm2，培养2～3天，将生长旺盛的菌种液转接入发酵罐；
(6)、发酵罐培养：发酵培养基的组成与摇瓶培养基相同，但外加前体诱导物0.2～0.5g/L、大孔吸附树脂20g/L；PH调整至7.30，120℃、30分钟灭菌；把生长好的二级菌种液通过压差法接入发酵罐中扩培，培养产品的温度29±2℃、转速150rpm、空气流量比1比0.8、罐压0.04kg/cm2、培养10～11天；
(7)、洗涤、洗脱：发酵至残糖低于0.2％，在代谢活性物质产出高点时终止发酵，将发酵液中的的树脂分离出来淘洗干净装入树脂床内；用50％甲醇洗涤1倍柱床量、流速25ml/min，脱色、除杂；再用6倍柱床量乙酸乙酯，流速15ml/min洗脱埃博霉素A、埃博霉素B活性物质，收集洗脱液；
(8)、真空浓缩：把收集的含活性物质的洗脱液真空浓缩，温度40～45℃、真空度-0.085～-0.095MPa，浓缩至原始体积量的1/15以下；
(9)、液相制备柱分离：把浓缩液通过液相制备柱分离收集埃博霉素B部份分离液；
(10)、萃取：把收集的含埃博霉素B分离液真空浓缩至剩余水相，加入有机溶剂进行萃取分离收集有机相；
(11)、结晶：把收集的有机相真空浓缩，温度40～45℃、真空度-0.085～-0.09MPa、浓缩至原始体积量的1/10以下；把浓缩液放入洁净的结晶器中-20℃低温结晶；
(12)、真空干燥；收集结晶体放入洁净的真空干燥箱，温度45～50℃、真空度-0.085～-0.09MPa；干燥得到含量99.5％以上的活性产物埃博霉素B成品。
2.根据权利要求1所述的一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，其特征在于：所述的扩培可采用摇瓶振荡培养或搅拌沉没培养方式，工业化生产首选搅拌沉没方式。
3.根据权利要求1所述的一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，其特征在于：所述在发酵培养基中外加的前体诱导物为苯丙氨酸，或是它的有机盐，其加入培养基的方法为一次投入或是间歇流加。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210006937 CN102586358B (zh) | 2012-01-11 | 2012-01-11 | 一种提高埃博霉素b产率的生物合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210006937 CN102586358B (zh) | 2012-01-11 | 2012-01-11 | 一种提高埃博霉素b产率的生物合成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102586358A true CN102586358A (zh) | 2012-07-18 |
| CN102586358B CN102586358B (zh) | 2013-06-12 |
Family
ID=46475582
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201210006937 Active CN102586358B (zh) | 2012-01-11 | 2012-01-11 | 一种提高埃博霉素b产率的生物合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102586358B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103014092A (zh) * | 2012-12-15 | 2013-04-03 | 湖北宏中药业有限公司 | 一种提高丝裂霉素c产率的制备方法 |
| CN103243134A (zh) * | 2013-04-15 | 2013-08-14 | 陕西科技大学 | 一种基于埃博霉素b代谢途径的发酵生产方法 |
| CN103667387A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-03-26 | 陕西科技大学 | 一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素b的方法 |
| CN103772407A (zh) * | 2014-01-23 | 2014-05-07 | 陕西科技大学 | 一种基于膜过滤技术的埃博霉素b分离提取方法 |
| CN104593444A (zh) * | 2013-10-31 | 2015-05-06 | 重庆乾泰生物医药有限公司 | 一种发酵制备埃博霉素b的方法 |
| CN104694601A (zh) * | 2013-12-30 | 2015-06-10 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种高效制备伊枯草菌素a及其同系物的方法 |
| CN110964029A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-07 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种埃博霉素b发酵液的预处理方法 |
| CN112630369A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-04-09 | 卓和药业集团有限公司 | 一种埃博霉素b含量的高效液相色谱检测分析方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1769468A (zh) * | 2005-10-19 | 2006-05-10 | 华南理工大学 | 一种利用纤维堆囊菌高效生产埃博霉素的方法 |
-
2012
- 2012-01-11 CN CN 201210006937 patent/CN102586358B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1769468A (zh) * | 2005-10-19 | 2006-05-10 | 华南理工大学 | 一种利用纤维堆囊菌高效生产埃博霉素的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 罗立新等: "纤维堆囊菌发酵产生埃博霉素条件的优化", 《华南理工大学学报(自然科学版)》, vol. 34, no. 5, 31 May 2006 (2006-05-31), pages 48 - 51 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103014092A (zh) * | 2012-12-15 | 2013-04-03 | 湖北宏中药业有限公司 | 一种提高丝裂霉素c产率的制备方法 |
| CN103014092B (zh) * | 2012-12-15 | 2014-10-01 | 湖北宏中药业有限公司 | 一种提高丝裂霉素c产率的制备方法 |
| CN103243134A (zh) * | 2013-04-15 | 2013-08-14 | 陕西科技大学 | 一种基于埃博霉素b代谢途径的发酵生产方法 |
| CN103243134B (zh) * | 2013-04-15 | 2015-04-22 | 陕西科技大学 | 一种基于埃博霉素b代谢途径的发酵生产方法 |
| CN104593444A (zh) * | 2013-10-31 | 2015-05-06 | 重庆乾泰生物医药有限公司 | 一种发酵制备埃博霉素b的方法 |
| CN103667387A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-03-26 | 陕西科技大学 | 一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素b的方法 |
| CN103667387B (zh) * | 2013-11-27 | 2015-09-30 | 陕西科技大学 | 一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素b的方法 |
| CN104694601A (zh) * | 2013-12-30 | 2015-06-10 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种高效制备伊枯草菌素a及其同系物的方法 |
| CN103772407A (zh) * | 2014-01-23 | 2014-05-07 | 陕西科技大学 | 一种基于膜过滤技术的埃博霉素b分离提取方法 |
| CN103772407B (zh) * | 2014-01-23 | 2016-05-18 | 陕西科技大学 | 一种基于膜过滤技术的埃博霉素b分离提取方法 |
| CN110964029A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-07 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种埃博霉素b发酵液的预处理方法 |
| CN112630369A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-04-09 | 卓和药业集团有限公司 | 一种埃博霉素b含量的高效液相色谱检测分析方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102586358B (zh) | 2013-06-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102586358B (zh) | 一种提高埃博霉素b产率的生物合成方法 | |
| CN105524840B (zh) | 一株新的藤仓镰刀菌及其发酵生产赤霉素a4的方法 | |
| CN106222098B (zh) | 一株红曲霉菌株及其应用 | |
| CN104342390B (zh) | 一种苜蓿中华根瘤菌株及其组合物与应用 | |
| CN102433364B (zh) | 一种微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺 | |
| CN103898004B (zh) | 假诺卡氏菌及其发酵生产骨化二醇的方法 | |
| CN107502555A (zh) | 一种地顶孢霉的发酵培养基及其发酵工艺 | |
| CN103882080A (zh) | 一种制备阿维菌素的有效方法 | |
| CN102399837A (zh) | 微生物发酵合成阿卡波糖的方法 | |
| CN103740606A (zh) | 植生链霉菌及其产生新抗生素诺沃巢霉素的方法与应用 | |
| CN103571756A (zh) | 一种蝉棒束孢菌株的试管筛选方法及培养基 | |
| CN101928671B (zh) | 一种链格孢属菌及其发酵人参茎叶总皂苷制备人参皂苷Rg3的方法 | |
| CN102965288A (zh) | 一株生物合成3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的菌株及其应用 | |
| CN104774888A (zh) | 一种虫草素发酵固体培养基及其制备方法与应用 | |
| CN107177659A (zh) | 一种发酵法生产赤霉素a7的方法 | |
| CN105296357B (zh) | 一种通过补料提高冬虫夏草菌液体发酵菌丝体产量的方法 | |
| CN103146595B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及用于发酵生产d-核糖的方法 | |
| CN101319199B (zh) | 一种利用中国红豆杉细胞诱导产生紫杉烷的方法 | |
| CN103146594B (zh) | 纤维堆囊菌菌株及其在埃博霉素合成方面的应用 | |
| CN103014092B (zh) | 一种提高丝裂霉素c产率的制备方法 | |
| CN101407767A (zh) | 一种通过发酵生产冬虫夏草的方法 | |
| CN1259414C (zh) | 产生高组分冠菌素的菌株及其发酵生产冠菌素的方法 | |
| CN105624229B (zh) | 一种提高尼莫克汀产量的方法 | |
| CN103276028A (zh) | 一种发酵法制取埃博霉素b的方法 | |
| CN106831696A (zh) | 大环内酯类衍生物及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 435300 Li Shizhen Pharmaceutical Industrial Park, Qichun, Huanggang, Hubei Patentee after: HUBEI HONCH PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: 435300 Li Shizhen Pharmaceutical Industrial Park, Qichun, Huanggang, Hubei Patentee before: HUBEI HONCH PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A Biosynthetic Method to Improve the Yield of Epsomycin B Effective date of registration: 20230105 Granted publication date: 20130612 Pledgee: Bank of China Limited Huanggang branch Pledgor: HUBEI HONCH PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2023420000006 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20230823 Granted publication date: 20130612 Pledgee: Bank of China Limited Huanggang branch Pledgor: HUBEI HONCH PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2023420000006 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A Biosynthetic Method for Improving the Yield of Ebomycin B Effective date of registration: 20230825 Granted publication date: 20130612 Pledgee: Bank of China Limited Huanggang branch Pledgor: HUBEI HONCH PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2023980053856 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |