CN112961783A - 一株植物内生真菌及其在制备螺环内酯衍生物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域,涉及一株植物内生真菌及其在制备螺环内酯衍生物中的应用。植物内生真菌Amorocoelophoma sp.YE3351,该菌株已于2020年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址为中国.武汉.武汉大学,保藏编号为CCTCC NO.M 2020407;分类学命名为Amorocoelophoma sp.。本发明首次从云南石梓根皮部位分离得到一株Amorocoelophoma sp.YE3351,并且从其代谢产物中分离得到螺环内酯衍生物,填补了现有技术空白。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,涉及一株植物内生真菌及其在制备螺环内酯衍生物中的应用。
背景技术
植物内生真菌(endophytic fungi)是从植物健康组织中分离得到的,经表面消毒实验证实不是表面附生菌或污染菌的真菌,普遍存在于高等植物中,木本、草本植物,单子叶植物和双子叶植物内均有内生真菌。植物内生真菌具有强大的生物合成能力,是药物先导化合物的重要来源,其次级代谢产物的结构类型多样,并且具有多种生物活性,对于微生物来源的药物先导化合物的发现具有较高的研究价值。
螺环化合物是由两个单环共用一个碳原子的多环化合物。螺环化合物具有刚性结构,结构稳定,其手性配体有较大的比旋光度,在生物和医药领域具有重要的应用价值,目前螺环化合物的来源主要依赖于天然途径。
民族药用植物云南石梓(Gmelina arborea)为马鞭草科石梓属的半落叶乔木。该种目前处于稀有状态,主要分布于中国南部省份、孟加拉和一些东南亚国家,在治疗慢性发热、出血、泌尿道感染、无尿等方面有应用报道,也可用于治疗发烧、消化不良等。云南石梓具有较高的药用和经济价值,但目前有关该植物的研究主要集中于叶、花、果实、茎皮等提取物的生物活性及化学成分方面。国内外还未见有关云南石梓内生真菌的研究报道。
真菌Amorocoelophoma属是Jayasiri等人在2019年2月新确立的一个属,分属于真菌界(Mycota)子囊菌门(Ascomycota)座囊菌纲(Dothideomycetes)格孢腔菌目(Pleosporales)Amorosiaceae科。Amorosiaceae科是由Thambugala等人于2015年从扁孔腔菌科(Lophiostomataceae)细分出来的。当时,Amorosiaceae科包含2个属Amorosia和Angustimassarina。关于Amorocoelophoma属的真菌还没有次生代谢产物方面的研究报道。
发明内容
本发明主要目的在于提供一株植物内生真菌Amorocoelophoma sp.YE3351及其在制备螺环内酯衍生物中的应用。本发明首次从云南石梓根皮部位分离得到一株Amorocoelophoma sp.YE3351,并且从其代谢产物中分离得到螺环内酯衍生物,填补了现有技术空白。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
本发明第一个方面提供一株植物内生真菌Amorocoelophoma sp.YE3351,该菌株已于2020年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址为中国.武汉.武汉大学,保藏编号为CCTCC NO.M 2020407;分类学命名为Amorocoelophoma sp.。
本发明第二个方面,提供以上所述Amorocoelophoma sp.YE3351在制备抗流感病毒药物中的应用。
进一步地,所述抗流感病毒药物为螺环内酯衍生物;
更进一步地,所述螺环内酯衍生物包括massarilactone D和massarilactone E,其结构式分别如式(I)、式(II)所示:
本发明第三个方面提供一种螺环内酯衍生物的微生物发酵制备方法,其包括以下步骤:
将Amorocoelophoma sp.YE3351菌株进行发酵,分别收集发酵液和菌丝体;
将发酵液、菌丝体分别用有机溶剂浸提,合并提取液,减压浓缩得发酵粗提物;
将发酵粗提物用硅胶柱进行色谱分离,用石油醚-丙酮体系进行洗脱;
收集洗脱得到的粗组分过反相硅胶RP-18色谱柱,用甲醇-水体系进行洗脱,纯化即得。
进一步地,Amorocoelophoma sp.YE3351菌株所用发酵培养基为PDB培养基,发酵温度为25-30℃。
进一步地,发酵液用乙酸乙酯萃取,菌丝体用甲醇浸提。
更进一步地,用石油醚-丙酮体系从体积比9:1至1:1对发酵粗提物进行梯度洗脱,收集石油醚-丙酮体系体积比4:1洗脱得到的粗组分。
更进一步地,用甲醇-水体系从体积比1:1至4:1对粗组分进行梯度洗脱,收集甲醇-水体积比为6:4时洗脱得到的馏分,可制备得到螺环内酯衍生物massarilactone D;收集甲醇-水体积比为7:3时洗脱得到的馏分,可制备得到螺环内酯衍生物massarilactoneE。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明首次从云南石梓中分离得到一株Amorocoelophoma属真菌YE3351,并且从该菌株可代谢产生螺环内酯衍生物massarilactone D和massarilactone E;这是关于Amorocoelophoma属真菌可代谢产生螺环内酯衍生物的首次报道。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明中植物内生真菌Amorocoelophoma sp.YE3351的菌丝形态图;
图2为本发明中植物内生真菌Amorocoelophoma sp.YE3351的菌落形态图;
图3为本发明中植物内生真菌Amorocoelophoma sp.YE3351的***发育树。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
(1)用自来水将新鲜采集的、无病症的云南石梓的根皮冲洗干净,清除表面附着的泥土和灰尘。将晾干后的植物材料放入经紫外线消毒过的超净工作台内,选择75%的酒精和2%的次氯酸钠作为表面消毒剂。先将植物材料用75%的酒精浸泡30-60s,无菌水漂洗2次;再用2%的次氯酸钠处理1.5-3min,无菌水漂洗3次。无菌滤纸吸干水分。
(2)将经过步骤(1)消毒处理的云南石梓根皮切成长约1cm的小块,将小块植物组织接种于PDA培养基上,28±2℃恒温培养。所述PDA培养基包括去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水1000mL、pH自然。
(3)观察植物组织块的培养基表面菌落生长情况,用无菌竹签将组织块边缘处新长出的菌丝挑取至新鲜的PDA培养基平板上,28 2℃恒温培养,待挑出的单菌落在平板中长到直径约4-5cm时,对平板进行拍照记录,并转接至斜面保藏。
(4)将步骤(3)分离得到的单一菌落,利用插片法制作显微玻片,光学显微镜下观察菌株的显微形态,菌株YE3351的菌丝形态图如图1所示。
(5)所述内生真菌YE3351在PDA培养基上生长较缓慢,14d左右形成直径约3cm的不规则圆。菌丝黑绿色,绒状,质地稠密。菌落表面***,高低不平,中间较厚,四周较薄。培养一周后可见露珠状分泌物。菌落背面颜色不均,可见放射状沟纹。菌株YE3351的菌落形态图如图2所示。
(6)所述菌株YE3351的分子生物学特征:采用分子生物学PCR技术,DNA序列测定分析,菌株YE3351的ITS rDNA基因组由951个碱基(bp)组成,LSU rDNA基因组由884个碱基(bp)组成,延伸因子EF1a基因片段序列由977个碱基(bp)组成。将菌株LSU、EF1a、ITS序列逐个拼接,使每个菌株的LSU、EF1a、ITS序列形成一条核苷酸链。利用Mega 6.0软件,MaximumLikelihood(M-L)法构建***发育树,将菌株YE3351归为Amorocoelophoma属。菌株YE3351的***发育树如图3所示。
实施例2
Amorocoelophoma sp.YE3351发酵制备螺环内酯衍生物的方法,包括以下步骤:
(1)配制PDB培养基:称量去皮马铃薯200g,切成小块,加入1000mL蒸馏水煮沸,纱布过滤,得马铃薯滤液,加入葡萄糖20g,pH自然,121℃灭菌30min,制得PDB培养基备用,其中PDB培养基中马铃薯的浓度为0.2g/mL,葡萄糖的浓度为0.02g/mL。
(2)将Amorocoelophoma sp.YE3351菌株接入PDB培养基中,在28±2℃、200r/min摇床培养4d,得种子液,再将制得的种子液按10%的接种量接入发酵培养基中,于28±2℃、200r/min摇床培养7d,得发酵产物。
(3)将步骤(2)得到的发酵产物用纱布过滤,得发酵液和菌丝体,发酵液用乙酸乙酯萃取,菌丝体用甲醇浸提,合并提取液,减压浓缩得发酵粗提物。
(4)将发酵粗提物用硅胶柱(200-300目)进行色谱分离,以石油醚-丙酮溶剂体系以体积比从9:1至1:1对发酵粗提物进行梯度洗脱,收集石油醚-丙酮体系体积比4:1洗脱得到的粗组分。用反相硅胶RP-18色谱柱,以甲醇-水体系从体积比1:1至4:1对粗组分进行梯度洗脱,收集甲醇-水体积比为6:4时洗脱得到的馏分,可制备得到螺环内酯衍生物massarilactone D;收集甲醇-水体积比为7:3时洗脱得到的馏分,可制备得到螺环内酯衍生物massarilactone E。
取上述制备得到的螺环内酯衍生物massarilactone D(I)和massarilactone E(II),通过1D/2D NMR(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)以及HR-ESI-MS(高分辨电喷雾电离质谱)鉴定得到螺环内酯衍生物massarilactone D(I)和massarilactone E(II),分别具有式(I)、(II)所示的结构:
Massarilactone D(I)为白色固体,溶于甲醇,分子式为C11H12O5,化合物结构分析测试的核磁共振数据为:
1H NMR(600MHz,CD3OD):δ1.35(3H,d,J=7.4Hz,H-12),2.99(1H,m,H-6),4.58(1H,dd,J=2.4,2.1Hz,H-11b),4.60(1H,dd,J=2.7,2.4Hz,H-11a),4.72(1H,s,H-10),4.99(1H,br t,J=2.1Hz,H-4),6.02(1H,dd,J=9.2,1.0Hz,H-8),6.96(1H,dd,J=10,5.0Hz,H-7);13C NMR(150MHz,CD3OD):14.2(C-12),35.8(C-6),56.5(C-5),69.4(C-4),71.4(C-10),85.9(C-11),124.8(C-8),152.4(C-7),158.6(C-3),173.8(C-1),197.4(C-9)。
Massarilactone E(II)为无色晶体,溶于氯仿,分子式为C11H12O5,化合物结构分析测试的核磁共振数据为:
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ1.31(3H,d,J=7.0Hz,H-12),2.62(1H,q,J=7.0Hz,H-6),2.67(1H,dt,J=17.5,2.0Hz,H-8α),2.92(1H,dd,J=17.5,2.5Hz,H-8β),3.76(1H,d,J=1.0Hz,10-OH),4.49(1H,t,J=2.5Hz,H-7),4.60(1H,br s,10-H),4.64(1H,dd,J=3.0,2.5Hz,H-11a),4.91(1H,dd,J=3.0,2.5,H-11b),4.96(1H,dd,J=2.0,1.5Hz,H-4);13C NMR(125MHz,CDCl3):14.0(C-12),45.6(C-6),47.3(C-8),61.5(C-5),76.1(C-10),78.0(C-7),85.0(C-4),91.1(C-11),154.8(C-3),168.7(C-1),206.3(C-9)。
实施例3:
螺环内酯衍生物massarilactone D和massarilactone E的抗病毒活性测定:
(1)细胞病变效应(CPE)测定:
CPE分析用于评估螺环内酯衍生物massarilactone D和massarilactone E的抗H1N1流感病毒活性。收集MDCK细胞并计数,用2%DMEM准备20ml105/ml细胞,将MDCK细胞以2×104个细胞/孔的密度接种到96孔板中,并在37℃下孵育,在感染前于5%CO2中放置24h。分别将两倍连续稀释的螺环内酯衍生物massarilactone D和massarilactone E与甲型流感病毒(100TCID50)混合,并在37℃下孵育30min,然后将混合物转移到96孔板中的细胞中,再孵育30min。孵育后,将MDCK细胞用PBS洗涤两次以去除未吸收的病毒,然后添加补充有1μg/ml TPCK-胰蛋白酶和0.2%BSA的DMEM。温育48h后,在显微镜下观察到抗病毒作用。使用MTT分析进一步确认数据,实验至少重复三次,并使用奥司他韦作为阳性对照。
(2)通过MTT法检测MDCK细胞:
将浓度为1×104/孔的MDCK细胞在96孔板中生长24h,然后分别将连续两次稀释的螺环内酯衍生物massarilactone D和massarilactone E加入MDCK细胞中,然后在37℃湿润的5%CO 2中孵育48h。温育后,通过MTT测定法测定细胞的活力。将DMEM中浓度为0.5mg/ml的100μl MTT加入每个孔中,并于37℃孵育另外4h。随后,将150μl/孔的DMSO加入平板中以提取经热处理的MTT,然后在微量滴定板读数器上测量提取物在570nm波长处的吸光度。通过比较用螺环内酯衍生物massarilactone D和massarilactone E处理的细胞与用溶剂处理的细胞(0.3%甲醇)的细胞存活率,确定了massarilactone D和massarilactone E的细胞毒性。
本发明的植物内生真菌Amorocoelophoma sp.YE3351产生的螺环内酯衍生物massarilactone D和massarilactone E对H1N1流感病毒的IC50(半数抑制浓度)和CC50(半数毒性浓度)如表1所示。
表1化合物massarilactone D和massarilactone E对H1N1流感病毒的抑制活性
以上实验结果表明,螺环内酯衍生物massarilactone D和massarilactone E对H1N1流感病毒显示高效低毒的特点,半数抑制浓度值与阳性对照药物奥司他韦的数值相当,尤其是massarilactone D对H1N1流感病毒的半数抑制浓度值比奥司他韦低,具有作为制备新的抗H1N1流感病毒药物的潜在用途。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一株植物内生真菌Amorocoelophoma sp.YE3351,该菌株已于2020年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO.M 2020407。
2.权利要求1所述Amorocoelophoma sp.YE3351在制备抗流感病毒药物中的应用。
4.一种螺环内酯衍生物的微生物发酵制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将Amorocoelophoma sp.YE3351菌株进行发酵,分别收集发酵液和菌丝体;
将发酵液、菌丝体分别用有机溶剂浸提,合并提取液,减压浓缩得发酵粗提物;
将发酵粗提物用硅胶柱进行色谱分离,用石油醚-丙酮体系进行洗脱;
收集洗脱得到的粗组分过反相硅胶RP-18色谱柱,用甲醇-水体系进行洗脱,纯化即得。
5.根据权利要求4所述方法,其特征在于,Amorocoelophoma sp.YE3351菌株所用发酵培养基为PDB培养基,发酵温度为25-30℃。
6.根据权利要求4所述方法,其特征在于,发酵液用乙酸乙酯萃取,菌丝体用甲醇浸提。
7.根据权利要求4所述方法,其特征在于,用石油醚-丙酮体系从体积比9:1至1:1进行梯度洗脱,收集石油醚-丙酮体系体积比4:1洗脱得到的粗组分。
8.根据权利要求4所述方法,其特征在于,将所得粗组分,用甲醇-水体系进行从体积比1:1至4:1梯度洗脱,收集甲醇-水体积比为6:4时洗脱得到的馏分,可制备得到螺环内酯衍生物massarilactone D;收集甲醇-水体积比为7:3时洗脱得到的馏分,可制备得到螺环内酯衍生物massarilactone E。
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