CN103080130B - 制备具有改进特性的抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生包含Fc的多肽的方法和其组合物，所述包含Fc的多肽具有改进的特性并且在Fc区的243和264位包含突变。

Description

制备具有改进特性的抗体的方法
发明领域
本发明涉及用于产生糖基化蛋白(糖蛋白)以及具体而言包含Fc的多肽的方法及其组合物，所述包含Fc的多肽用作人或动物的治疗药物。
发明背景
单克隆抗体经常通过两个结合事件获得它们的治疗效果。首先，抗体的可变结构域结合靶细胞上的特定蛋白，例如，癌症细胞的表面上的CD20。这随后招募效应细胞如自然杀伤(NK)细胞，该自然杀伤(NK)细胞结合抗体的恒定区(Fc)并破坏该抗体结合的细胞。这个过程，被称为抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)，其取决于IgG1重链的Fc结构域中Asn297的特定N-糖基化事件，Rothman等,Mol. Immunol. 26:1113-1123 (1989)。缺乏这种N-糖基化结构的抗体仍然结合抗原，但不能介导ADCC，显然是由于抗体的Fc结构域对NK细胞表面上Fc受体FcγRIIIa的亲和力降低的结果。
不仅N-糖基化的存在在抗体的效应功能中起作用，N-连接的寡糖的特定组成对其最终功能同样重要。岩藻糖的缺乏或二分的(bisecting)N-乙酰基葡萄糖胺的存在与ADCC的效力正相关，Rothman (1989), Umana等,Nat. Biotech. 17:176-180 (1999),Shields等,J. Biol. Chem. 277:26733-26740 (2002), 和Shinkawa等,J. Biol. Chem. 278:3466-3473 (2003).。也有证据表明，Fc区的唾液酸化与静脉内免疫球蛋白(IVIG)的抗炎特性正相关。见，例如，Kaneko等,Science, 313:670-673, 2006;Nimmerjahn和Ravetch.,J. Exp. Med., 204:11-15, 2007。
鉴于特定N-糖基化在抗体的功能和效力中的实用性，用于修饰N-连接的寡糖的组成和修饰抗体的效应功能的方法是期望的。
酵母和其它真菌宿主是用于产生重组蛋白的重要的生产平台。酵母是真核生物，因此，和更高等真核生物具有共同的进化过程，包括许多在分泌途径中发生的翻译后修饰。糖工程化中的最新进展产生了具有转基因修饰的糖基化途径的酵母株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的细胞系，该糖基化途径允许它们进行一系列的酶反应，所述酶反应模拟人中糖基化的过程。见，例如，美国专利号7,029,872, 7,326,681和7,449,308，其中记载了用于在低等真核宿主细胞中产生与它们的人对应物基本相同的重组糖蛋白的方法。人样唾液酸化双向触角复合物N-连接的聚糖，如前述方法在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中产生的那些聚糖，已经显示了产生治疗性糖蛋白的实用性。因此，用于进一步修饰或改进酵母如巴斯德毕赤酵母中的抗体的生产方法是期望的。
发明概述
本发明涉及包含Fc的多肽，所述包含Fc的多肽包含Fc区的243和264位氨基酸的突变，其中243位的突变选自：F243A, F243G, F243S, F243T, F243V, F243L, F243I,F243D, F243Y, F243E, F243R, F243W和F243K，264位的突变选自：V264A, V264G, V264S,V264T, V264D, V264E, V264K, V264W, V264H, V264P, V264N, V264Q和V264L，其中根据如Kabat中的EU索引编号。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243A和V264A。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243Y和V264G。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243T和V264G。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243L和V264A。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243L和V264N。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243V和V264G。在一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:18的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:19的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽是由(或基本上由)SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19组成的抗体片段。
在一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:9的重链氨基酸序列或其变体以及SEQ ID NO:2的轻链氨基酸序列或其变体的抗体。在一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:9的重链氨基酸序列减去SEQ ID NO:9中列出的最后的赖氨酸(K)残基的抗体。
在一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列或其变体以及SEQ ID NO:11的轻链氨基酸序列或其变体的抗体。
在一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列或其变体以及SEQ ID NO:14的轻链氨基酸序列或其变体的抗体。
在一些实施方案中，本发明的包含Fc的多肽含有包含唾液酸(包括NANA，NGNA及其类似物和衍生物)的N-聚糖。在一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽是α-2,3和α-2,6连接的唾液酸的混合物。在另一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽仅包含α-2,6连接的唾液酸。在一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽包含α-2,6连接的唾液酸，不包含可检测水平的α-2,3连接的唾液酸。在一个实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)或N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)或其混合物。在另一个实施方案中，唾液酸是在唾液酸的9位具有乙酰化的NANA或NGNA的类似物或衍生物。在一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽的N-聚糖包含NANA并且不包含NGNA。
本发明的包含Fc的多肽上的N-聚糖可以任选地包含岩藻糖。在一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽上的N-聚糖将包含岩藻糖基化的和非岩藻糖基化的N-聚糖的混合物。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽上的N-聚糖缺乏岩藻糖。
在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽具有下列特性中的一种或多种：(i)降低的效应功能；(ii)增加的抗炎特性；(iii)增加的唾液酸化；(iv)增加的生物利用度(吸收或暴露)，以及(v)与FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa (FcγRIIIa-V158或FcγRIIIa-F158),和FcγRIIIb结合的降低。在一个实施方案中，与母体的包含Fc的多肽相比，本发明的包含Fc的多肽具有效应功能的至少7, 10, 15,30, 50, 100, 500或1000倍降低。在一个实施方案中，效应功能是ADCC。在另一个实施方案中，效应功能是CDC。
在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽具有降低的ADCC活性。在一个实施方案中，包含Fc的多肽具有ADCC活性的至少7, 10, 15,30, 50 100, 500或1000倍降低。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽具有ADCC活性的至少100倍降低。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽具有ADCC活性的至少500倍降低。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽具有ADCC活性的至少1000倍降低。
在另一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽具有降低的CDC活性。在一个实施方案中，包含Fc的多肽具有CDC活性的至少100倍降低。
在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽以降低的亲和力结合FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa (FcγRIIIa-V158或FcγRIIIa-F158),和FcγRIIIb。在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽以至少50倍降低的亲和力结合FcγRIIa。在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽以至少20倍降低的亲和力结合FcγRIIb。在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽以至少10倍降低的亲和力结合FcγRIIIa LF。在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽以至少1, 2或10倍降低的亲和力结合FcγRIIIa LV。在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽以降低的亲和力结合FcγRIIb, FcγRIIIa LF和FcγRIIIa LV。
在一个实施方案中，与母体的包含Fc的多肽相比，本发明的包含Fc的多肽具有增加的抗炎特性。
在一个实施方案中，与母体的包含Fc的多肽相比，当肠胃外注射时，本发明的包含Fc的多肽具有增加的生物利用度(吸收或暴露)。在一个实施方案中，与母体的包含Fc的多肽相比，当皮下注射时，本发明的包含Fc的多肽具有增加的生物利用度(吸收或暴露)。
在一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含天然的Fc区。在另一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含F243A突变。在另一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含V264A突变。
本发明还包括用于在宿主细胞中产生包含Fc的多肽的方法，包括：(1) 提供已经被基因工程化以产生包含Fc的多肽的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码Fc区的243和264位氨基酸的突变的核酸，其中243位的突变选自：F243A, F243G, F243S, F243T,F243V, F243L, F243I, F243D, F243Y, F243E, F243R, F243W和F243K，264位的突变选自：V264A, V264G, V264S, V264T, V264D, V264E, V264K, V264W, V264H, V264P,V264N, V264Q和V264L，其中根据如Kabat中的EU索引编号；(ⅱ) 在引起包含Fc的多肽的表达的条件下培养宿主细胞；以及(iii)从宿主细胞分离包含Fc的多肽。在一个实施方案中，核酸编码突变F243A和V264A。在另一个实施方案中，核酸编码突变F243Y和V264G。在另一个实施方案中，核酸编码突变243T和V264G。在另一个实施方案中，核酸编码突变F243L和V264A。在另一个实施方案中，核酸编码突变F243L和V264N。在另一个实施方案中，核酸编码突变F243V和V264G。在一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:18的抗体片段。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:19的抗体片段。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽是由(或基本上由)SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19组成的抗体片段。
在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中进行产生包含Fc的多肽的方法。在另一个实施方案中，在植物细胞中进行产生包含Fc的多肽的方法。在另一个实施方案中，在细菌中进行产生包含Fc的多肽的方法。在另一个实施方案中，在昆虫细胞中进行产生包含Fc的多肽的方法。在另一个实施方案中，在低等真核细胞中进行产生包含Fc的多肽的方法。在另一个实施方案中，在酵母细胞中进行产生包含Fc的多肽的方法。在一个实施方案中，在巴斯德毕赤酵母中进行产生包含Fc的多肽的方法。
在一个实施方案中，通过要求保护的方法产生的包含Fc的多肽包含含有唾液酸(包括NANA，NGNA及其类似物和衍生物)的N-聚糖。在一个实施方案中，通过要求保护的方法产生的包含Fc的多肽具有N-聚糖组合物，其中至少40摩尔％，70摩尔％或90摩尔％的包含Fc的多肽上的N-聚糖被唾液酸化(具有选自SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2的结构)。在一个实施方案中，至少47摩尔％的抗体上的N-聚糖具有结构SA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在另一个实施方案中，至少47摩尔％的抗体上的N-聚糖具有结构NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在另一个实施方案中，至少66摩尔％的抗体上的N-聚糖具有结构SA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在另一个实施方案中，至少66摩尔％的抗体上的N-聚糖具有结构NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在一个实施方案中，通过要求保护的方法产生的包含Fc的多肽包含α-2,3和α-2,6连接的唾液酸的混合物。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽仅包含α-2,6连接的唾液酸。在一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽包含α-2,6连接的唾液酸，不包含可检测水平的α-2,3连接的唾液酸。在一个实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)或N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)或其混合物。在另一个实施方案中，唾液酸是在唾液酸的9位具有乙酰化的NANA或NGNA的类似物或衍生物。在一个实施方案中，通过要求保护的方法产生的包含Fc的多肽上的N-聚糖包含NANA并且不包含NGNA。
通过要求保护的方法产生的包含Fc的多肽上的N-聚糖可以任选地包含岩藻糖。在一个实施方案中，通过要求保护的方法产生的包含Fc的多肽上的N-聚糖包含岩藻糖基化的和非岩藻糖基化的N-聚糖的混合物。在一个实施方案中，通过要求保护的方法产生的包含Fc的多肽的N-聚糖包含缺乏岩藻糖。
在一个实施方案中，通过要求保护的方法产生的包含Fc的多肽具有N-聚糖组合物，其中相对于母体的包含Fc的多肽，总的唾液酸化的N-聚糖的量和百分比增加。
在一些实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，通过要求保护的方法产生的包含Fc的多肽具有下列特性中的一种或多种：(i)降低的效应功能；(ii)增加的抗炎特性；(iii)增加的唾液酸化；(iv)增加的生物利用度(吸收或暴露)，以及(v)与FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb和FcγRIIIa结合的降低。在一个实施方案中，相对于母体的包含Fc的多肽，本发明的包含Fc的多肽具有效应功能的至少7, 10, 15, 30, 50, 100, 500或1000倍降低。在一个实施方案中，效应功能是ADCC。在另一个实施方案中，效应功能是CDC。
在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽具有降低的ADCC活性。在一个实施方案中，包含Fc的多肽具有ADCC活性的至少7, 10, 15,30, 50 100, 500或1000倍降低。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽具有ADCC活性的至少100倍降低。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽具有ADCC活性的至少500倍降低。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽具有ADCC活性的至少1000倍降低。
在另一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，通过要求保护的方法产生的包含Fc的多肽具有降低的CDC活性。在一个实施方案中，包含Fc的多肽具有CDC活性的至少100倍降低。
在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，通过要求保护的方法产生的包含Fc的多肽以降低的亲和力结合FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa (FcγRIIIa-V158或FcγRIIIa-F158),和FcγRIIIb。在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽以至少50倍降低的亲和力结合FcγRIIa。在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽以至少20倍降低的亲和力结合FcγRIIb。在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽以至少10倍降低的亲和力结合FcγRIIIa LF。在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽以至少1, 2或10倍降低的亲和力结合FcγRIIIa LV。在一个实施方案中，当与母体的包含Fc的多肽相比时，本发明的包含Fc的多肽以降低的亲和力结合FcγRIIb, FcγRIIIa LF和FcγRIIIa LV。
在一个实施方案中，当相对于母体的包含Fc的多肽，通过要求保护的方法产生的包含Fc的多肽具有增加的抗炎特性。
在一个实施方案中，与母体的包含Fc的多肽相比，当肠胃外注射时，通过要求保护的方法产生的包含Fc的多肽具有增加的生物利用度(吸收或暴露)。在一个实施方案中，与母体的包含Fc的多肽相比，当皮下注射时，通过要求保护的方法产生的包含Fc的多肽具有增加的生物利用度(吸收或暴露)。
在一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含天然的Fc区。在另一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含F243A突变。在另一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含V264A突变。
本发明还包括降低包含Fc的多肽的效应功能的方法，包括在母体的包含Fc的多肽的243和264位引入突变，其中当与母体的包含Fc的多肽相比时，所述包含Fc的多肽具有降低的效应功能，其中根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243A和V264A。在另一个实施方案中，核酸编码突变F243Y和V264G。在另一个实施方案中，核酸编码突变243T和V264G。在另一个实施方案中，核酸编码突变F243L和V264A。在另一个实施方案中，核酸编码突变F243L和V264N。在另一个实施方案中，核酸编码突变F243V和V264G。在一个实施方案中，效应功能是ADCC。在另一个实施方案中，效应功能是CDC。在一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:18的抗体片段。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:19的抗体片段。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽是由(或基本上由)SEQ ID NO:18或SEQID NO:19组成的抗体片段。在一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含天然的Fc区。在另一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含F243A突变。在另一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含V264A突变。
本发明还包括增加包含Fc的多肽的抗炎特性的方法，包括在母体的包含Fc的多肽的243和264位引入突变，其中根据如Kabat中的EU索引编号，其中当与母体的包含Fc的多肽相比时，所述包含Fc的多肽具有增加的抗炎活性。在一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243A和V264A。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243Y和V264G。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变243T和V264G。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243L和V264A。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243L和V264N。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243V和V264G。在一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，包含Fc的多肽是结合选自如下的抗原的抗体或其抗原结合片段：TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-23R, IL-25, IL-27,IL-33, CD2, CD4, CD11A, CD14, CD18, CD19, CD23, CD25, CD40, CD40L, CD20,CD52, CD64, CD80, CD147, CD200, CD200R, TSLP, TSLPR, PD-1, PDL1, CTLA4, VLA-4, VEGF, PCSK9, α4β7-整合素, E-选凝素, Fact II, ICAM-3, β2-整合素, IFNγ, C5,CBL, LCAT, CR3, MDL-1, GITR, ADDL, CGRP, TRKA, IGF1R, RANKL, GTC,或上述分子中任一种的受体。在一个实施方案中，包含Fc的多肽将结合TNF-α。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽将结合Her2。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽将结合PCSK9。在一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:18的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:19的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽是由(或基本上由)SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19组成的抗体片段。在一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含天然的Fc区。在另一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含F243A突变。在另一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含V264A突变。
本发明还包括增加包含Fc的多肽的抗炎特性的方法，包括：选择用于治疗炎症的母体的包含Fc的多肽(例如，结合参与炎症的抗原的抗体或免疫黏附素)并且在Fc区的243和264位引入突变，其中根据如Kabat中的EU索引编号，其中当与母体的包含Fc的多肽相比时，所述包含Fc的多肽具有增加的抗炎活性。在一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243A和V264A。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243Y和V264G。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变243T和V264G。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243L和V264A。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243L和V264N。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243V和V264G。在一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，包含Fc的多肽是结合选自如下的抗原的抗体或其抗原结合片段：TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12,IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-23R, IL-25, IL-27, IL-33,CD2, CD4, CD11A, CD14, CD18, CD19, CD23, CD25, CD40, CD40L, CD20, CD52, CD64,CD80, CD147, CD200, CD200R, TSLP, TSLPR, PD-1, PDL1, CTLA4, VLA-4, VEGF,PCSK9, α4β7-整合素, E-选凝素, Fact II, ICAM-3, β2-整合素, IFNγ, C5, CBL,LCAT, CR3, MDL-1, GITR, ADDL, CGRP, TRKA, IGF1R, RANKL, GTC,或上述分子中任一种的受体。在一个实施方案中，包含Fc的多肽将结合TNF-α。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽将结合Her2。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽将结合PCSK9。在一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:18的抗体片段。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:19的抗体片段。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽是由(或基本上由)SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:19组成的抗体片段。在一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含天然的Fc区。在另一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含F243A突变。在另一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含V264A突变。
本发明还包括在需要治疗的受试者中治疗炎症状况的方法，包括：将治疗有效量的包含Fc的多肽施用于受试者，所述包含Fc的多肽在243和264位包含突变，其中根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施方案中，包含Fc的多肽降低选自如下的基因的表达：IL-1β, IL-6, RANKL, TRAP, ATP6v0d2, MDL-1, DAP12, CD11b, TIMP-1, MMP9, CTSK, PU-1, MCP1, MIP1α, Cxcl1-Groa, CXcl2-Grob, CD18, TNF, FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII和FcγRIV。在一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243A和V264A。在另一个实施方案中，核酸编码突变F243Y和V264G。在另一个实施方案中，核酸编码突变243T和V264G。在另一个实施方案中，核酸编码突变F243L和V264A。在另一个实施方案中，核酸编码突变F243L和V264N。在另一个实施方案中，核酸编码突变F243V和V264G。在另一个实施方案中，肠胃外施用包含Fc的多肽。在一个实施方案中，皮下施用包含Fc的多肽。在一个实施方案中，包含Fc的多肽是抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，包含Fc的多肽是用于治疗炎症状况的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合选自如下的抗原：TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-23R, IL-25, IL-27, IL-33, CD2, CD4,CD11A, CD14, CD18, CD19, CD23, CD25, CD40, CD40L, CD20, CD52, CD64, CD80,CD147, CD200, CD200R, TSLP, TSLPR, PD-1, PDL1, CTLA4, VLA-4, VEGF, PCSK9, α4β7-整合素, E-选凝素, Fact II, ICAM-3, β2-整合素, IFNγ, C5, CBL, LCAT, CR3,MDL-1, GITR, ADDL, CGRP, TRKA, IGF1R, RANKL, GTC,或上述分子中任一种的受体。在一个实施方案中，包含Fc的多肽将结合TNF-α。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽将结合Her2。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽将结合PCSK9。在一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:18的抗体片段。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:19的抗体片段。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽是由(或基本上由)SEQ ID NO:18或SEQID NO:19组成的抗体片段。
本文公开的另一个发明涉及含有包含Fc的多肽的药物组合物，其中，至少70％的包含Fc的多肽上的N-聚糖包含选自SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2和SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2的寡糖结构，其中包含Fc的多肽包含Fc区的243和264位氨基酸的突变，其中根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施方案中，突变是F243A和V264A。在另一个实施方案中，突变是F243Y和V264G。在另一个实施方案中，核酸编码突变243T和V264G。在另一个实施方案中，突变是F243L和V264A。在另一个实施方案中，突变是F243L和V264N。在另一个实施方案中，突变是F243V和V264G。在一个实施方案中，至少47摩尔％的N-聚糖具有结构SA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在另一个实施方案中，至少47摩尔％的N-聚糖具有结构NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖包含α-2,3和α-2,6连接的唾液酸的混合物。在另一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖仅包含α-2,6连接的唾液酸。在另一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖包含α-2,6连接的唾液酸，不包含可检测水平的α-2,3连接的唾液酸。在一个实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)或N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)或其混合物。在另一个实施方案中，唾液酸是在唾液酸的9位具有乙酰化的NANA或NGNA的类似物或衍生物。在一个实施方案中，包含Fc的多肽上的N-聚糖包含NANA并且不包含NGNA。在一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:18的抗体片段。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:19的抗体片段。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽是由(或基本上由)SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19组成的抗体片段。
本文公开的另一个发明涉及含有包含Fc的多肽的药物组合物，其中，至少70％的包含Fc的多肽上的N-聚糖包含选自SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2和SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2的寡糖结构，其中唾液酸残基唯一地通过α-2,6连接而连接，其中N-聚糖缺乏岩藻糖，其中包含Fc的多肽包含Fc区的243和264位氨基酸的突变，其中根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施方案中，突变是F243A和V264A。在另一个实施方案中，突变是F243Y和V264G。在另一个实施方案中，核酸编码突变243T和V264G。在另一个实施方案中，突变是F243L和V264A。在另一个实施方案中，突变是F243L和V264N。在另一个实施方案中，突变是F243V和V264G。在一个实施方案中，至少47摩尔％的N-聚糖具有结构SA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在另一个实施方案中，至少47摩尔％的N-聚糖具有结构NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖包含α-2,3和α-2,6连接的唾液酸的混合物。在另一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖仅包含α-2,6连接的唾液酸。在另一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖包含α-2,6连接的唾液酸，不包含可检测水平的α-2,3连接的唾液酸。在一个实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)或N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)或其混合物。在另一个实施方案中，唾液酸是在唾液酸的9位具有乙酰化的NANA或NGNA的类似物或衍生物。在一个实施方案中，包含Fc的多肽上的N-聚糖包含NANA并且不包含NGNA。在一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:18的抗体片段。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽是包含SEQ ID NO:19的抗体片段。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽是由(或基本上由)SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19组成的抗体片段。
本发明还包括包含重链和轻链的包含Fc的多肽，其中重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其变体，轻链包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其变体，其中当与包含SEQ IDNO:1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:2的轻链氨基酸序列的抗体相比时，所述变体包含以下特性中的一种或多种：降低的效应功能，增加的抗炎特性；增加的唾液酸化；当胃肠外给药时增加的生物利用度(吸收或暴露)，以及与FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb和FcγRIIIa结合的降低。本发明还包括包含重链和轻链的包含Fc的多肽，其中重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或其变体，轻链包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其变体，其中当与包含SEQID NO:10的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:11的轻链氨基酸序列的抗体相比时，所述变体包含以下特性中的一种或多种：降低的效应功能，增加的抗炎特性，增加的唾液酸化，当胃肠外给药时增加的生物利用度(吸收或暴露)，以及与FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa和FcγRIIIb结合的降低。本发明还包括包含重链和轻链的包含Fc的多肽，其中重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或其变体，轻链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其变体，其中当与包含SEQ ID NO:13的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:14的轻链氨基酸序列的抗体相比时，所述变体包含以下特性中的一种或多种：降低的效应功能，增加的抗炎特性，增加的唾液酸化，当胃肠外给药时增加的生物利用度(吸收或暴露)，以及与FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa和FcγRIIIb结合的降低。在一个实施方案中，所述变体包含最多达0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10或更多个保守或非保守的氨基酸取代。在一个实施方案中，所述变体包含与要求保护的序列至少75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%或99%序列同一性。
本发明还包括增加包含Fc的多肽的抗炎特性的方法，包括在母体的包含Fc的多肽引入243位的突变或264位的突变，其中根据如Kabat中的EU索引编号，其中当与母体的包含Fc的多肽相比时，所述包含Fc的多肽具有增加的抗炎功能。本发明还包括增加包含Fc的多肽的抗炎特性的方法，包括：选择用于治疗炎症的母体的包含Fc的多肽(例如，结合参与炎症的抗原的抗体或免疫黏附素)并且在母体的包含Fc的多肽引入243位的突变或264位的突变，其中根据如Kabat中的EU索引编号，其中当与母体的包含Fc的多肽相比时，所述包含Fc的多肽具有增加的抗炎特性。在一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243A。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变V264A。在一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含天然的Fc区。
本发明还包括在需要治疗的受试者中治疗炎症状况的方法，包括：将治疗有效量的包含Fc的多肽施用于受试者，所述包含Fc的多肽在母体的包含Fc的多肽的243位包含突变或264位包含突变，其中根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施方案中，肠胃外施用包含Fc的多肽。在一个实施方案中，皮下施用包含Fc的多肽。在一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243A。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变V264A。在一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含天然的Fc区。
在上述实施方案的任一个中，可以使用本领域中已知的任何方法检测抗炎活性的增加。在一个实施方案中，通过测定选自如下的基因的表达的降低检测抗炎活性的增加：IL-1β, IL-6, RANKL, TRAP, ATP6v0d2, MDL-1, DAP12, CD11b, TIMP-1, MMP9, CTSK,PU-1, MCP1, MIP1α, Cxcl1-Groa, CXcl2-Grob, CD18, TNF, FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII和FcγRIV。
附图简要说明
图1是pGLY3483，F243A和V264A双突变蛋白表达质粒的示意图。重链和轻链都在甲醇诱导型启动子，AOX1的控制下。PpTrp2基因是用于整合整个盒的基因座。除了重链上的突变以外，对于野生型(母体的)、单F243A突变蛋白、单V264A突变蛋白和双突变蛋白表达质粒，表达质粒的结构是相同的。
图2是来自SDS-PAGE分析的凝胶的示意图，其表征由本文的材料和方法产生的非还原(NR)和还原的(R)抗体。第1道包含抗-Her2单克隆抗体，Her2；第2道包含单Fc突变蛋白，F243A；第3道包含单Fc突变蛋白，V264A；以及第4道包含双Fc突变蛋白，F243A/V264A。
图3表示用SK-BR3细胞系(Her2过表达的人乳腺癌系)通过基于细胞的分析测定的本文的材料和方法产生的各种抗体的抗原亲和力。■ – Her2;♦ - F243A/V264A GS6.0糖基化；▲ - F243A，具有GS6.0糖基化；▼ - V264A，具有GS6.0糖基化；◊- 对照IgG; x- 产生的巴斯德毕赤酵母Her2，具有GS6.0糖基化。
图4显示GFI 5.0菌株YDX477中产生的巴斯德毕赤酵母Her2抗体的N-聚糖的MALDI-TOF MS分析。峰为Man5GlcNAc2,1261.24 (GS2.0), GlcNAc2Man3GlcNAc2, 1343.50(G0) (主要的), GalGlcNAc2Man3GlcNAc2,1505.97 (G1),和Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2,1668.47 (G2)。
图5显示GFI 5.0菌株YDX551中产生的单Fc突变蛋白F243A抗体的N-聚糖的MALDI-TOF MS分析。峰为Man5GlcNAc2,1261.05, GlcNAc2Man3GlcNAc2, 1343.71,GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, 1506.62, 和Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2,1668.97 (主要的)。
图6显示GFI 5.0菌株YDX551中产生的单Fc突变蛋白V264A抗体的N-聚糖的MALDI-TOF MS分析。峰为Man5GlcNAc2, 1261.98, GalGlcNAc2Man3GlcNAc2,1505.45, 和Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, 1668.85 (主要的)。
图7显示GFI 5.0菌株YDX557中产生的双Fc突变蛋白F243A/V264A抗体的N-聚糖的MALDI-TOF MS分析。主要峰对应于Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2,1668.39。
图8显示GFI 6.0菌株YGLY4563中产生的双Fc突变蛋白F243A/V264A抗体的N-聚糖的MALDI-TOF MS分析。在2224.28和2245.83(主要的)的双峰分别对应于NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
图9A-9D是实施例11中所述的材料和方法中产生的各种抗体的FcγR结合的示意图：FcγRIIIaLF (图9A); FcγRI (图9B); FcγRIIb/c (图9C);和FcγRIIIaLV (图9D)。对于9A-9D：■ - Her2；▲ - GFI 6.0中产生的F243A；▼ - GFI 6.0中产生的V264A；♦ -GFI 6.0中产生的F243A/V264A；● - GFI 6.0中产生并用PNGase处理的F243A/V264A。
图10是实施例12中所述的材料和方法中产生的各种抗体的C1q结合的示意图： ◊- 抗-CD20抗体，阳性对照；■ - Her2；▲ – 产生的具有GS6.0糖基化的F243A；▼- 产生的具有GS6.0糖基化的V264A；♦ - 产生的具有GS6.0糖基化的F243A/V264A；● - 具有GS6.0糖基化并用PNGase处理的F243A/V264A。
图11是实施例13中所述的材料和方法中产生的各种抗体的ADCC响应的示意图：■- Her2；▲ - 产生的具有GS6.0糖基化的F243A；▼ - 产生的具有GS6.0糖基化的V264A；♦- 产生的具有GS6.0糖基化的F243A/V264A；◊ - 没有抗体的NK细胞杀伤；X - GFI2.0中产生的Her2。
图12是如实施例14中所述用下列注射的小鼠的血清单克隆抗体浓度随着时间的示意图：■ - Her2; X - GFI 5.0中产生的Her2；♦ - GFI 6.0中产生的F243A/V264A。
图13A-13E是实施例15中所述的各种抗体的FcγR结合的示意图。
图14是实施例16中所述的材料和方法中产生的各种抗体的ADCC响应的示意图。图14A和14B的结果是来自使用杂合的F/V效应细胞的实验。图14C和14D的结果是来自使用F/F效应细胞的实验。图14E的结果是来自使用V/V效应细胞的实验。
图15是实施例17中所述的抗-Her2 Fc双突变体的ADCC活性与每种单突变体的假设的累加的参照曲线相比的示意图。
图16是实施例18中所述的材料和方法中产生的各种抗体的ADCC响应的示意图。
图17是实施例19中所述的材料和方法中产生的各种抗体的CDC响应的示意图。
图18是实施例20中所述的本发明的Fc突变蛋白在AIA模型中的效果的示意图。
图19是实施例21中所述的本发明的Fc突变蛋白在AIA模型中的效果的示意图。
图20是实施例22中所述的抗-TNFα抗体的FcγR结合的示意图。
图21是实施例23中所述的抗-TNFα抗体的FcγR结合的示意图。
图22是实施例24中所述的本发明的Fc突变蛋白在AIA模型中的效果的示意图。
发明的详细说明
定义
当本文中使用时，术语“G0”是指没有半乳糖或岩藻糖的复杂的双向触角寡糖，GlcNAc2Man3GlcNAc2。
当本文中使用时，术语“G1”是指没有岩藻糖并且包含一个半乳糖残基的复杂的双向触角寡糖，GalGlcNAc2Man3GlcNAc2。
当本文中使用时，术语“G2”是指没有岩藻糖并且包含两个半乳糖残基的复杂的双向触角寡糖，Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
当本文中使用时，术语“G0F”是指包含一个核心岩藻糖并且没有半乳糖的复杂的双向触角寡糖，GlcNAc2Man3GlcNAc2F。
当本文中使用时，术语“G1F”是指包含一个核心岩藻糖以及一个半乳糖残基的复杂的双向触角寡糖，GalGlcNAc2Man3GlcNAc2F。
当本文中使用时，术语“G2F”是指包含一个核心岩藻糖以及两个半乳糖残基的复杂的双向触角寡糖，Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2F。
当本文中使用时，术语“Man5”是指如下所示的寡糖结构
当本文中使用时，术语“GFI 5.0”是指产生主要具有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的糖工程化的巴斯德毕赤酵母株。
当本文中使用时，术语“GFI 6.0”是指产生主要具有NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白的糖工程化的巴斯德毕赤酵母株。
当本文中使用时，术语“GS5.0”是指N-糖基化结构Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
当本文中使用时，术语“GS5.5”是指N-糖基化结构NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，当在已经糖工程化α 2,6唾液酸转移酶的巴斯德毕赤酵母株中产生时，其产生α 2,6-连接的唾液酸，当在已经糖工程化α 2,3唾液酸转移酶的巴斯德毕赤酵母株中产生时，其产生α2,3-连接的唾液酸。
当本文中使用时，术语“GS6.0”是指N-糖基化结构NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，当在已经糖工程化α 2,6唾液酸转移酶的巴斯德毕赤酵母株中产生时，其产生α 2,6-连接的唾液酸，当在已经糖工程化α 2,3唾液酸转移酶的巴斯德毕赤酵母株中产生时，其产生α2,3-连接的唾液酸。
当本文中使用时，关于巴斯德毕赤酵母菌株的术语“野生型”或“wt”是指没有经过基因修饰以控制糖基化的天然的巴斯德毕赤酵母株。
当本文中使用时，术语“抗体”是指能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点结合特定抗原的免疫球蛋白分子。如本文中所用的，该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，其由四条多肽链组成，即两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链(LC)(约25 kDa)和一条“重”链(HC)(约50-70 kDa)，而且涵盖其片段，如Fab, Fab',F(ab')2, Fv, 单链(ScFv), 其突变体，包含抗体部分的融合蛋白，以及免疫球蛋白分子的任何其它修饰的结构或其变体，所述结构包含抗原识别位点和至少免疫球蛋白恒定区的CH2结构域的部分(其包含CH2结构域的N-连接的糖基化位点)。如本文中所用的，该术语包括任何类型的抗体，分别如IgG(例如，IgG1, IgG2, IgG3或IgG4), IgM, IgA, IgD和IgE。
当本文中使用时，术语“CH2的共有序列”是指包含N-连接的糖基化位点的重链恒定区的CH2结构域的氨基酸序列，其源自来自多种抗体的CH2结构域中发现的最常见的氨基酸序列。
使用术语“Fc区”来定义免疫球蛋白重链的C-末端区域。“Fc区”可以是天然的序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，人IgG重链Fc区通常定义为从Cys226位的氨基酸残基，或从Pro230延伸至其羧基末端。免疫球蛋白的Fc区包含两个恒定结构域，CH2和CH3，可以任选地包含一个铰链区。在一个实施方案中，Fc区包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列。在一个实施方案中，Fc区包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一个实施方案中，Fc区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，其在5'末端具有增加的赖氨酸(K)残基。Fc区在Ch2结构域中包含单一的N-连接的糖基化位点，其对应于抗体的全长重链的Asn297位点。
术语“包含Fc的多肽”是指包含Fc区的多肽，如抗体或免疫黏附素。该术语涵盖包含或由(或基本上由)Fc区组成的多肽。可以通过抗体的木瓜蛋白酶消化或通过重组DNA技术产生包含Fc区的多肽。
当本文中使用时，术语“母体的抗体”，“母体的免疫球蛋白”或“母体的包含Fc的多肽”是指缺乏本文公开的Fc区突变的抗体或包含Fc的多肽。母体的包含Fc的多肽可以包括天然序列的Fc区或具有预先存在的氨基酸序列修饰的Fc区。天然序列的Fc区包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列的Fc区包括天然序列的人IgG1Fc区，天然序列的人IgG2 Fc区，天然序列的人IgG3 Fc区和天然序列的人IgG4 Fc区，以及其天然存在的变体。当用作比较对象时，可以在任何细胞中表达母体的抗体或母体的包含Fc的多肽。在一个实施方案中，在与本发明的包含Fc的多肽相同的细胞中表达母体抗体或母体的包含Fc的多肽。
如本文所用，术语“免疫黏附素”是指将异源的“黏附素”蛋白(例如，受体，配体或酶)的“结合结构域”与免疫球蛋白恒定结构域组合的抗体样分子。在结构上，免疫黏附素包括具有除了抗体的抗原识别和结合位点(抗原组合位点)(即“异源的”)以外的期望的结合特异性的黏附素氨基酸序列和免疫球蛋白恒定结构域序列的融合体。如本文所用的，术语“配体结合结构域”是指至少保留对应的天然受体的定性的配体结合能力的任何天然的细胞表面受体或其任何区域或衍生物。在一个特定的实施方案中，受体是来自具有胞外结构域的细胞表面多肽，其与免疫球蛋白超基因家族的一个成员是同源的。其它受体(其不是免疫球蛋白超基因家族的成员，尽管如此但是被本发明特定地涵盖)是细胞因子的受体，尤其是具有酪氨酸激酶活性的受体(受体酪氨酸激酶)，使哺乳动物易患所讨论的病症的***和神经生长因子的成员。在一个实施方案中，病症是癌症。制备免疫黏附素的方法是本领域中熟知的。见，例如，WO00/42072。
当本文中使用时，术语“Her2”或“Her2抗体”是指具有与商业上获得的哺乳动物细胞即CHO细胞中产生的Her2抗体(被称为曲妥珠单抗)相似的氨基酸序列的抗体。
当本文中使用时，术语“毕赤酵母Her2抗体”或“毕赤酵母抗-Her2抗体”是指具有与商业上获得的糖工程化的巴斯德毕赤酵母中产生的Her2抗体(曲妥珠单抗)相似的氨基酸序列的抗体。
当本文中使用时，术语“Fc突变蛋白抗体”是指包含本文所述的单Fc突变蛋白或双Fc突变蛋白中一种的抗体。
当本文中使用时，术语“Fc突变蛋白”是指包含Fc的多肽，其中已经对Fc区进行了一个或多个点突变。
当本文中使用时，术语“Fc突变”是指对包含Fc的多肽的Fc区进行的突变。这种突变的例子包括本文所述的F243A或V264A突变。
当本文中使用时，术语“单Fc突变蛋白”是指在Fc区的243或264位引入突变的包含Fc的多肽。术语“F243A”是指包含Fc的多肽的Fc区的243位从F(野生型)至A的突变。术语“V264A”是指包含Fc的多肽的Fc区的264位从V(野生型)至A的突变。243和264位代表包含Fc的多肽的Fc区的CH2结构域中的氨基酸位置。
当本文中使用时，术语“双Fc突变蛋白”是指在Fc区的243和264位包含突变的包含Fc的多肽。术语“F243A/V264A”是指包含两个特定突变的双Fc突变蛋白。
在本说明书和权利要求书的通篇，免疫球蛋白重链或包含Fc的多肽中的残基的编号是根据如Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)(其通过引用清楚地并入本文)中的EU索引编号。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
本文所用的术语“效应功能”是指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用导致的生化事件。示例性的“效应功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调，等等。可以使用本领域中已知的各种测定评价这种效应功能。
当本文中使用时，术语“糖工程化的巴斯德毕赤酵母”是指已经基因改变以表达人样N-聚糖的巴斯德毕赤酵母的菌株。例如，GFI 5.0, GFI 5.5和GFI 6.0菌株如上所述。
当本文中使用时，术语“N-聚糖”，“糖蛋白”和“糖形式”是指N-连接的寡糖，例如，通过将天冬酰胺-N-​​乙酰葡糖胺连接至多肽的天冬酰胺残基而连接的N-连接的寡糖。糖蛋白发现的主要糖是葡萄糖，半乳糖，甘露糖，岩藻糖，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(SA，包括NANA，NGNA及其衍生物和类似物，包括乙酰化的NANA或乙酰化的NGNA)。在糖工程化的巴斯德毕赤酵母中，唾液酸是唯一地N-乙酰基-神经氨酸(NANA)( Hamilton等,Science 313 (5792):1441-1443 (2006))。N-聚糖具有通用的五糖核心Man3GlcNAc2，其中，“Man”是指甘露糖，“Glc”是指葡萄糖，“NAc”是指N-乙酰基，GlcNAc是指N-乙酰葡糖胺。就增加至Man3GlcNAc2 (“Man3”)核心结构的包含外周糖类(例如，GlcNAc，半乳糖，岩藻糖和唾液酸)的支链(触角)的数量而言，N-聚糖是变化的，所述Man3GlcNAc2 (“Man3”)核心也被称为“三甘露糖核心”，“五糖核心”或“寡甘露糖核心(paucimannose core)”。根据它们的分枝组成分类N-聚糖(例如，高甘露糖，复杂的或杂合的)。
如本文所用，术语“唾液酸”或“SA”是指唾液酸家族的任何成员，包括但不限于：N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac或NANA)，N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)，及其任何类似物或衍生物(包括在唾液酸分子上的任何位置处的乙酰化产生的那些)。唾液酸是一组约30种天然存在的酸性糖类的通用名称，所述糖类是大量糖缀合物的主要成分。Schauer,Biochem. Society Transactions, 11, 270-271 (1983)。唾液酸通常是寡糖的末端残基。N-乙酰神经氨酸(NANA)是最常见的唾液酸形式，N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)是第二最常见的形式。Schauer,Glycobiology, 1, 449-452 (1991)。NGNA在整个动物界广泛存在，根据物种和组织，经常构成显著比例的糖缀合物结合的唾液酸。某些物种如鸡和人是例外的，因为它们在正常组织中缺乏NGNA。Corfield,等, Cell Biology Monographs, 10, 5-50 (1982)。在人血清样品中，NGNA形式的唾液酸的百分比据报道为总唾液酸的0.01％。The MolecularImmunology of Complex Carbohydrates, (Plenum Press, New York, 1988)中可见Schauer, "Sialic Acids as Antigenic Determinants of Complex Carbohydrates"。
如本文所用，术语“人样N-聚糖”是指N-连接的寡糖，其与非工程化的野生型人细胞产生的寡糖密切相似。例如，野生型巴斯德毕赤酵母和其它低等真核细胞通常产生在N-糖基化位点的高甘露糖基化的蛋白。本文所述的宿主细胞产生糖蛋白(例如，抗体)，所述糖蛋白包含非高甘露糖基化的人样N-聚糖。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞能够产生具有杂合和/或复杂的N-聚糖的人样N-聚糖。本发明的宿主细胞产生的特定糖蛋白上存在的“人样”聚糖的特定类型将取决于宿主细胞中进行的特定的糖工程化步骤。
当本文中使用时，术语“高甘露糖”型N-聚糖是指具有五个或更多个甘露糖残基的N-聚糖。
当本文中使用时，术语“复杂”型N-聚糖是指具有至少一个连接至“三甘露糖”核心的1,3甘露臂的GlcNAc和至少一个连接至“三甘露糖”核心的1,6甘露臂的GlcNAc的N-聚糖。复杂的N-聚糖也可以具有任选地用唾液酸或衍生物修饰的半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)残基(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经氨酸，“Ac”是指乙酰基)。复杂的N-聚糖也可以具有链内的取代，包括“二分的”的GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)。作为例子，当N-聚糖在三甘露糖核心上包含二分的GlcNAc时，该结构可以表示为Man3GlcNAc2(GlcNAc)或Man3GlcNAc3。当N-聚糖包含连接至三甘露糖核心的核心岩藻糖时，该结构可以表示为Man3GlcNAc2(Fuc)。复杂的N-聚糖也可以具有“三甘露糖核心”上的多个触角，通常被称为“多个触角的聚糖”。
当本文中使用时，术语“杂合的”N-聚糖是指具有至少一个在三甘露糖核心的1,3甘露臂的末端上的GlcNAc和0个或更多个三甘露糖核心的1,6甘露臂上的甘露糖的N-聚糖。
当提到糖蛋白的制剂中存在的聚糖 “摩尔％”时，该术语是指当用PNGase处理蛋白制剂并然后用不受糖形式组成影响的方法定量时，释放的N-连接的寡糖的混合物中存在的特定聚糖的摩尔％，(例如，用荧光标记如2 - 氨基苯甲酰胺标记PNGase释放的聚糖混合物，然后通过高效液相色谱法或毛细管电泳分离，然后通过荧光强度定量聚糖)。例如，50摩尔％NANA2 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2意味着50％释放的聚糖是NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，剩余的50％是由其它的N-连接寡糖构成的。
如本文所用，术语“抗炎抗体”是指旨在用于治疗炎症的抗体。可以使用本领域中已知的任何方法测量包含Fc的多肽的抗炎特性。在一个实施方案中，使用动物模型测定包含Fc的多肽的抗炎特性，如Kaneko等,Science 313:670-673 (2006), Anthony等,Science 320:373-376 (2008)，和本文的实施例20-21中所述的模型。在另一个实施方案中，通过测定与炎症相关的生物标记(包括但不限于：CRP，促炎症细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)，γ-干扰素，白细胞介素6(IL-6，IL-8，IL-10，趋化因子，凝血标记D-二聚体，sCD14，肠脂肪酸结合肽(IFABP)，和透明质酸)的水平测定包含Fc的多肽的抗炎特性。在一个实施方案中，通过使用本领域中已知的方法测定C-反应蛋白(CRP)的水平而测定包含Fc的多肽的抗炎特性。C-反应蛋白的水平的下降表明，包含Fc的多肽具有抗炎特性。
“保守修饰的变体”或“保守取代”是指用具有相似的特性(例如电荷，侧链大小，疏水性/亲水性，骨架构象和刚性等)的其它氨基酸取代蛋白中的氨基酸，使得在不改变蛋白的生物活性的情况下频繁地进行变化。本领域技术人员认识到，通常，多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(例如，见Watson等.(1987)Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub.Co., p.224 (4th Ed.))。此外，结构上或功能上相似的氨基酸的取代破坏生物活性的可能性更小。示例性的保守取代列举如下：
已经显示在Fc区，Asn297(根据EU编号***)中免疫球蛋白G(IgG)的糖基化是效应途径包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的最佳识别和活化的要​​求，Wright & Morrison,Trends in Biotechnology, 15:26-31 (1997), Tao &Morrison,J. Immunol., 143(8):2595-2601 (1989)。因此，IgG恒定区中的糖基化工程化已经变成开发治疗性单克隆抗体(mAbs)中的一个活跃的研究领域。已经确定，在Asn297处N-连接的糖基化的存在对于免疫效应功能测定是至关重要的，所述免疫效应功能测定包括ADCC，Rothman (1989),Lifely等, Glycobiology, 5:813-822 (1995), Umana (1999),Shields (2002),和Shinkawa (2003),以及补体依赖性细胞毒性(CDC) , Hodoniczky等,Biotechnol.Prog., 21(6):1644-1652 (2005),和Jefferis等,Chem.Immunol., 65:111-128 (1997)。这种对功能的影响已经被归因于糖基化的Fc结构域所采用的特定构象，当糖基化缺乏时，所述特定构象似乎是不存在的。更具体地，在Fc CH2结构域中缺乏糖基化的IgG 不结合FcγR，包括FcγRI, FcγRII,和FcγRIII, Rothman (1989)。
不仅糖基化的存在似乎在抗体的效应功能中起作用，N-连接的寡糖的特定组成也是重要的。例如，岩藻糖的存在显示出对体外FcγRIIIa结合和体外ADCC活性的显着影响，Rothman (1989),和Li等,Nat. Biotechnol. 24(2):2100-215 (2006)。通过哺乳动物细胞培养如CHO或NS0产生的重组抗体包含主要岩藻糖基化的N-连接的寡糖，Hossler等,Biotechnology and Bioengineering,95(5):946-960 (2006), Umana (1999),和Jefferis等,Biotechnol. Prog. 21:11-16 (2005)。此外，有证据表明，Fc区中的唾液酸化可以赋予抗体抗炎特性。在用于富集唾液酸化的形式的凝集素柱纯化的静脉内使用的免疫球蛋白(IVIG)显示出限定为唾液酸化的Fc片段的独特的抗炎效果，并与抑制性受体FcγRIIb的表达的增加相联系，Nimmerjahn和Ravetch.,J. Exp. Med. 204:11-15 (2007)。
源自哺乳动物细胞系的抗体的Fc区的糖基化通常由糖形式的异种混合物组成，主要形式通常由复杂的岩藻糖基化的糖形式：G0F、G1F，和，在较小程度上，G2F，所构成。导致向G0F结构不完整的半乳糖转移的可能条件包括但不限于，非优化的半乳糖转移机制，如β-1,4半乳糖基转移酶，和UDP-半乳糖较差地转运进入高尔基体，次最优的细胞培养和蛋白表达条件，以及邻近寡糖的氨基酸残基的空间位阻。尽管这些条件中的每一种都可以调节末端半乳糖的最终程度，随后的向Fc寡糖的唾液酸转移被认为受CH2结构域的封闭口袋结构所抑制。见，例如，图1, Jefferis, R.,Nature Biotech., 24 (10):1230-1231, 2006。如果没有正确的末端单糖，尤其是半乳糖，或者没有足够的末端半乳糖基化形式，产生唾液酸化形式的能够作为治疗性蛋白起作用的可能性很小，即使当在唾液酸转移酶存在的情况下。人IgG-Fc糖形式的蛋白工程化和结构分析已经显示，糖基化模式受Fc构象的影响，如发现当来自Fc口袋的特定氨基酸(包括F241, F243, V264, D265和R301)被突变为丙氨酸时，可以实现源自CHO产生的IgG3的寡糖上半乳糖和唾液酸水平的增加。Lund等,J. Immunol.157(11); 4963-4969 (1996)。进一步显示，某些突变对细胞介导的超氧化物生成和补体介导的红细胞裂解(这被分别用作FcγRI和C1q结合的替代标记)具有一些影响。
已经报道了已经将酵母基因工程化以产生能够分泌具有高度均匀糖基化的糖蛋白的宿主菌株。Choi等,PNAS, USA 100(9):5022-5027 (2003)描述了使用α1,2甘露糖苷酶催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的文库组合真菌II型膜蛋白前导序列(将催化结构域定位至分泌途径)的文库的用途。以这种方式，分离体内产生具有均匀的Man5GlcNAc2或GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖结构的糖蛋白的菌株。Hamilton等,Science313 (5792):1441-1443 (2006)描述了巴斯德毕赤酵母中产生的糖蛋白***的产生，其具有主要由双唾液酸化的聚糖结构，GS6.0, NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 (90.5%)和单唾液酸化的聚糖结构，GS5.5, NANAGal2GlcNAc2 Man3GlcNAc2 (7.9%)组成的聚糖组成。然而，由于图4中可见的抗体中相对低水平的末端半乳糖底物，类似菌株中产生的抗体将具有显著更低含量的唾液酸化的N-聚糖。最近还表明，Fc寡糖的唾液酸化为治疗性静脉内施用的丙种球蛋白及其Fc片段赋予了抗炎特性，Kaneko等,Science 313(5787):670-673 (2006)，抗炎活性取决于唾液酸的α2,6-连接的形式，但不是α2,3形式，Anthony等,Science, 320:373-376 (2008)。
宿主生物体和细胞系
可以在任何宿主生物体或细胞系中制备本发明的包含Fc的多肽。在一个实施方案中，在能够产生唾液酸化的N-聚糖的宿主细胞中制备本发明的包含Fc的多肽。
在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中制备本发明的包含Fc的多肽，其中所述细胞或内源地或通过遗传或方法操作产生包含或末端的α2-6和α2-3唾液酸的混合物或仅仅末端的α2-6唾液酸的糖蛋白。在培养(组织培养)中繁殖哺乳动物细胞已经成为常规操作。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293细胞或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO)；小鼠睾丸支持细胞(TM4，)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞( Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；杂交瘤细胞系；NS0；SP2/0；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
在一个实施方案中，可以在被工程化以产生唾液酸化的N-聚糖的植物细胞中制备本发明的包含Fc的多肽。见，例如，Cox等,Nature Biotechnology (2006) 24, 1591 -1597 (2006)和Castilho等,J. Biol. Chem. 285(21):15923-15930 (2010)。
在一个实施方案中，可以在被工程化以产生唾液酸化的N-聚糖的昆虫细胞中制备本发明的包含Fc的多肽。见，例如，Harrison和Jarvis,Adv. Virus Res. 68:159-91(2006)。
在一个实施方案中，可以在被工程化以产生唾液酸化的N-聚糖的细菌细胞中制备本发明的包含Fc的多肽。见，例如，Lizak等,Bioconjugate Chem. 22:488-496 (2011)。
在一个实施方案中，可以在低等真核宿主细胞或生物体中制备本发明的包含Fc的多肽。最近的发展允许在低等真核宿主生物体、酵母和丝状真菌如巴斯德毕赤酵母中产生完全人源化的治疗剂，Gerngross等，美国专利7,029,872和美国专利号7,449,308，其公开内容通过引用并入本文。也参见Jacobs等,Nature Protocols 4(1):58-70 (2009)。申请人在本文已经进一步开发了修饰的巴斯德毕赤酵母宿主生物体和细胞系，其能够表达包含针对重链Fc区的243和264位氨基酸的两个突变的抗体。当与母体抗体相比时，具有这些突变的抗体具有α 2,6-连接的唾液酸化的N-聚糖的增加的水平和更均匀的组合物。申请人还惊讶地发现，在重链Fc区的243和264位氨基酸的突变产生抗体，该抗体与所有Fcγ受体的结合降低并且与C1q结合降低，其中前者代表ADCC，这不依赖于增加水平的α2,6-连接的唾液酸。因此，基于末端的α 2,6-连接的唾液酸N-聚糖的增加的水平和更好的均匀性，本领域普通技术人员将认识并理解，可以使用本文所述的材料和方法以便在低等真核细胞如酵母和丝状真菌以及尤其是巴斯德毕赤酵母中产生重组的糖基化的抗体，当与母体抗体相比时，所述抗体具有增强的抗炎特性。
由于与FcγR和C1q结合降低，可以使用本文所述的材料和方法以产生重组的糖基化的抗体，当与母体抗体相比时，所述抗体具有降低的效应功能。与在糖工程化的巴斯德毕赤酵母细胞中产生的缺乏特定Fc突变的抗体或保留它们的内源糖基化机构的巴斯德毕赤酵母宿主细胞中产生的抗体相比，通过本发明的方法在巴斯德毕赤酵母中如此产生的抗体以高产量产生，具有降低的效应功能，所述抗体具有主要的具有末端的α2,6-连接的唾液酸的糖蛋白的种类。
在一个实施方案中，在已经工程化以产生具有包含末端唾液酸的主要N-聚糖的糖蛋白的宿主细胞，更优选酵母或丝状真菌宿主细胞中制备本发明的包含Fc的多肽。在本发明的一个实施方案中，主要的N-聚糖是用不产生任何α 2,3连接的唾液酸的α 2,6唾液酸转移酶糖工程化的株中产生的SA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的α 2,6连接的形式。在其它实施方案中，将株工程化以表达单独的α 2,3唾液酸转移酶或α 2,3唾液酸转移酶与α 2,6,唾液酸转移酶的组合，产生作为主要的N-聚糖的α 2,3连接的或α 2,6和α 2,3的组合连接的唾液酸。
用于制备本发明的包含Fc的多肽的细胞系可以是任何细胞系，尤其是具有产生一种或多种唾液酸化的糖蛋白的能力的细胞系。本领域普通技术人员将认识并理解，本文所述的材料和方法不限于如本文的实施例提供的巴斯德毕赤酵母的特定菌株，而且可以包括其中产生具有一个或多个末端半乳糖的N-聚糖如Gal2GlcNAc2Man3的任何巴斯德毕赤酵母株或其它酵母或丝状真菌菌株。末端的半乳糖作为产生α 2,6-连接的唾液酸的底物，产生N-聚糖结构NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。美国专利号7,029,872, US 2006-0286637和Hamilton等,Science 313 (5792):1441-1443 (2006)(其描述如同详细记载地并入本文)中描述了合适的菌株的例子。
通常，低等真核生物如酵母用于表达蛋白，尤其是糖蛋白，因为它们可以经济地培养，产生高产量，当适当修饰时能够合适地糖基化。酵母尤其提供了允许快速转化的确立的遗传学，测试的蛋白的定位策略以及容易的基因敲除技术。合适的载体具有表达控制序列，如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖解酶，复制起点，终止序列以及根据需要的类似序列。
尽管本文显示了使用甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母的本发明，其它有用的低等真核生物宿主细胞包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichiafinlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(Pichia minula)(Ogataea minuta,Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母(Pichiasalictaria)、Pichia guercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichi apijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、嗜甲毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母种(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母菌(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans.)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporiumi lucknowense、Fusarium sp.、Fusariumgramineum、Fusarium venenatum和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。各种酵母，如乳酸克鲁维酵母(K. Lactis), 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、嗜甲毕赤酵母(Pichiamethanolica)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)尤其适合用于细胞培养，因为它们能够生长至高细胞密度并分泌大量的重组蛋白。同样，丝状真菌，如黑曲霉，Fusarium sp，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)以及其它菌可用于在工业规模产生本发明的糖蛋白。
可以将低等真核生物，尤其是酵母和丝状真菌基因修饰以便它们表达其中糖基化模式为人样或人源化的糖蛋白。如上所指出的，如本文所用的术语“人样N-聚糖”是指N-连接的寡糖，其与非工程化的野生型人细胞产生的寡糖密切相似。在本发明的优选的实施方案中，本发明的宿主细胞能够产生具有杂合和/或复杂的N-聚糖；即，“人样N-糖基化”的人样糖蛋白。本发明的宿主细胞产生的糖蛋白上主要存在的特定的“人样”聚糖将取决于进行的特定的工程化步骤。以这种方式，可以产生糖蛋白组合物，其中特定的期望的糖形式为组合物中主要的。这可以通过去除选择的内源糖基化酶和/或基因工程化宿主细胞和/或提供外源酶以模拟如美国专利号7,449,308中所述的哺乳动物糖基化途径中的全部或部分而实现。如果需要，可以进行额外的糖基化的基因工程化，使得产生有或没有核心岩藻糖基化的糖蛋白。使用低等真核宿主细胞更有利，因为这些细胞能够产生糖蛋白的高度均一的组合物，使得存在的糖蛋白的主要糖形式为组合物中糖蛋白的高于30摩尔%。在特定方面，存在的主要糖形式可以是组合物中存在的糖蛋白的高于40摩尔%、50摩尔%、60摩尔%、70摩尔%、更优选地高于80摩尔%。
可以将低等真核细胞，尤其是酵母基因修饰使得它们表达其中糖基化模式为人样或人源化的糖蛋白。这可以通过如Gerngross等，美国专利号7,449,308所述的去除选择的内源糖基化酶和/或提供外源酶而实现。例如，可以选择或工程化宿主细胞以剔除α1,6-甘露糖转移酶活性，否则该酶可能将甘露糖残基添加至糖蛋白的N-聚糖上。
在一个实施方案中，宿主细胞进一步包括融合至细胞靶向信号肽的αl ,2-甘露糖苷酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常与催化结构域无关并被选择将αl,2-甘露糖苷酶活性靶向至宿主细胞的内质网(ER)或高尔基体(Golgi apparatus)。将重组糖蛋白传递通过宿主细胞的ER或高尔基体产生了包含Man5GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白，例如主要包含Man5GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白组合物。例如，美国专利号7,029,872和7,449,308以及美国出版的专利申请号2005/0170452公开了能够产生包含Man5GlcNAc2糖形式的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。
在一个进一步的实施方案中，刚刚前面的宿主细胞进一步包括融合至细胞靶向信号肽的GlcNAc转移酶I(GnT I)催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常与催化结构域无关并被选择将GlcNAc转移酶I活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体。将重组糖蛋白传递通过宿主细胞的ER或高尔基体产生了包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白，例如主要包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白组合物。美国专利号7,029,872和7,449,308以及美国出版的专利申请号2005/0170452公开了能够产生包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖形式的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。可以在体外用氨基己糖苷酶处理上述细胞中产生的糖蛋白以产生包含Man5GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白。
在一个进一步的实施方案中，刚刚前面的宿主细胞进一步包括融合至细胞靶向信号肽的甘露糖苷酶II催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常与催化结构域无关并被选择将甘露糖苷酶II活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体。将重组糖蛋白传递通过宿主细胞的ER或高尔基体产生了包含GlcNAcMan3GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白，例如主要包含GlcNAcMan3GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白组合物。美国专利号7,029,872和美国出版的专利申请号2004/0230042公开了表达甘露糖苷酶II酶并且能够产生主要包含GlcNAcMan3GlcNAc2糖形式的糖蛋白的低等真核宿主细胞。可以在体外用氨基己糖苷酶处理上面细胞中产生的糖蛋白以产生包含Man3GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白。
在一个进一步的实施方案中，刚刚前面的宿主细胞进一步包括融合至细胞靶向信号肽的GlcNAc转移酶II(GnT II)催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常与催化结构域无关并被选择将GlcNAc转移酶II活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体。将重组糖蛋白传递通过宿主细胞的ER或高尔基体产生了包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白，例如主要包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白组合物。美国专利号7,029,872和7,449,308以及美国出版的专利申请号2005/0170452公开了能够产生包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。可以在体外用氨基己糖苷酶处理上面细胞中产生的糖蛋白以产生包含Man3GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白。
在一个进一步的实施方案中，刚刚前面的宿主细胞进一步包括融合至细胞靶向信号肽的半乳糖基转移酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常与催化结构域无关并被选择将半乳糖基转移酶活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体。将重组糖蛋白传递通过宿主细胞的ER或高尔基体产生了包含GalGlcNAc2Man3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式或其混合物的重组糖蛋白，例如主要包含GalGlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式或其混合物的重组糖蛋白组合物。美国专利号7,029,872以及美国出版的专利申请号2006/0040353公开了能够产生包含Gal2GlcNAc2 Man3GlcNAc2糖形式的糖蛋白的低等真核宿主细胞。可以在体外用氨基己糖苷酶处理上述细胞中产生的糖蛋白以产生包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白,例如主要包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白组合物。
在一个进一步的实施方案中，刚刚前面的宿主细胞进一步包括融合至细胞靶向信号肽的唾液酸转移酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常与催化结构域无关并被选择将唾液酸转移酶活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体。在一个优选的实施方案中，唾液酸转移酶是α2,6-唾液酸转移酶。将重组糖蛋白传递通过宿主细胞的ER或高尔基体产生了主要包含NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式或NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式或其混合物的重组糖蛋白。对于低等真核宿主细胞如酵母和丝状真菌，宿主细胞进一步包括提供用于转移至N-聚糖的CMP-唾液酸的方式是有用的。美国出版的专利申请号2005/0260729公开了用于基因工程化低等真核生物以具有CMP-唾液酸合成途径的方法，美国出版的专利申请号2006/0286637公开了用于基因工程化低等真核生物以产生唾液酸化的糖蛋白的方法。为了增加唾液酸的量，构建宿主细胞以包括两个或更多个拷贝的CMP-唾液酸合成途径或两个或更多个拷贝的唾液酸转移酶是有利的。可以在体外用神经氨酸酶处理上述细胞中产生的糖蛋白以产生主要包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式或GalGlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式或其混合物的重组糖蛋白。
前述宿主细胞中任一种可以进一步包括一种或多种选自GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VI和GnT IX的GlcNAc转移酶以产生具有如美国出版的专利申请号2005/0208617和2007/0037248所公开的二分的(bisected)(GnT III)和/或多触角的(GnT IV、V、VI和IX)N-聚糖结构的糖蛋白。进一步地，前述宿主细胞可以产生包含SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2的重组糖蛋白(例如，抗体)，包括包含NANA (1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2, NGNA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或NANA (1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4) Man3GlcNAc2和NGNA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4) Man3GlcNAc2的组合的抗体。在一个实施方案中，重组糖蛋白将含有包含选自SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4) Man3GlcNAc2并且缺乏任何α2-3连接的SA的结构的N-聚糖。
在进一步的实施方案中，产生主要具有GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的宿主细胞进一步包括融合至细胞靶向信号肽的半乳糖基转移酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常与催化结构域无关并被选择将半乳糖基转移酶活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体。将重组糖蛋白传递通过宿主细胞的ER或高尔基体产生了主要包含GalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白。
在一个进一步的实施方案中，刚刚前面的产生主要具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的宿主细胞进一步包括融合至细胞靶向信号肽的唾液酸转移酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常与催化结构域无关并被选择将唾液酸转移酶活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体。将重组糖蛋白传递通过宿主细胞的ER或高尔基体产生了包含SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形式(例如NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2或NGNAGalGlcNAcMan5GlcNAc2或其混合物)的重组糖蛋白。
前述宿主细胞中任一种进一步包括一种或多种糖转运蛋白，如UDP-GlcNAc转运蛋白(例如乳酸克鲁维酵母和小鼠(Mus musculus)UDP-GlcNAc转运蛋白), UDP-半乳糖转运蛋白(例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster )UDP-半乳糖转运蛋白)和CMP-唾液酸转运蛋白(例如人唾液酸转运蛋白)。因为低等真核宿主细胞如酵母和丝状真菌缺乏上述转运蛋白，优选将低等真核宿主细胞如酵母和丝状真菌基因工程化以包含上述转运蛋白。
进一步地，可以进一步操作前述宿主细胞中任一种以增加N-聚糖占用(N-glycanoccupancy)。见，例如，Gaulitzek等,Biotechnol. Bioengin. 103:1164-1175 (2009);Jones等,Biochim. Biospyhs. Acta 1726:121-137 (2005); WO2006/107990。在一个实施方案中，可以进一步工程化前述宿主细胞中任一种以包含至少一种编码异源的单-亚基寡糖转移酶的核酸分子(例如，利什曼原虫属STT3A蛋白，STT3B蛋白，STT3C蛋白，STT3D蛋白或其组合)和编码异源的糖蛋白的核酸分子，其中宿主细胞表达内源的宿主细胞基因，所述内源的宿主细胞基因编码包括内源的OTase复合物的蛋白。在一个实施方案中，可以进一步工程化前述宿主细胞中任一种以包含至少一种编码利什曼原虫属STT3D蛋白的核酸分子和编码异源的糖蛋白的核酸分子，其中宿主细胞表达内源的宿主细胞基因，所述内源的宿主细胞基因编码包括内源的OTase复合物的蛋白。
宿主细胞进一步包括低等真核细胞(例如，酵母如巴斯德毕赤酵母)，所述低等真核细胞被基因工程化以产生不具有α-甘露糖苷酶耐受的N-聚糖的糖蛋白。可以通过缺失或破坏一种或多种β-甘露糖转移酶基因(例如BMT1, BMT2, BMT3和BMT4)(见美国出版的专利申请No.2006/0211085) 而实现这一点，通过缺失或破坏磷酸甘露糖基转移酶基因PNO1和MNN4B中的一种或两种（在进一步的方面，其还可以包括缺失或破坏MNN4A基因）而缺失或破坏具有磷酸甘露糖基残基的糖蛋白(例如见美国专利号7,198,921和7,259,007)。破坏包括破坏编码特定酶的开放阅读框或破坏开放阅读框的表达或用干扰RNA、反义RNA等废除(abrogating)编码一种或多种β-甘露糖基转移酶和/或磷酸甘露糖基转移酶的RNA的翻译。进一步地，可以通过增加化学hinhibios或通过改变细胞培养条件而使细胞产生具有α-甘露糖苷酶耐受的N-聚糖的糖蛋白。可以如上所述进一步修饰这些宿主细胞以产生特定的N-聚糖结构。
宿主细胞进一步包括低等真核细胞(例如，酵母如巴斯德毕赤酵母)，所述低等真核细胞通过缺失或破坏一种或多种蛋白O-甘露糖基转移酶(Dol-P-Man:蛋白(Ser/Thr)甘露糖基转移酶基因) (PMTs)(见美国专利号5,714,377)而被基因修饰以控制糖蛋白的O-糖基化，或如出版的国际申请号WO 2007/061631所述在Pmtp抑制剂和/或α-甘露糖苷酶存在的情况下生长，或者两者同时进行。破坏包括破坏编码Pmtp的开放阅读框或破坏开放阅读框的表达或用干扰RNA、反义RNA等废除编码一种或多种Pmtp的RNA的翻译。宿主细胞进一步包括前面提及的被修饰以产生特定N-聚糖结构的宿主细胞中任一种。
Pmtp抑制剂包括但不限于苯亚甲基噻唑烷二酮(benzylidenethiazolidinediones)。可以使用的苯亚甲基噻唑烷二酮的例子为5-[[3,4-双(苯甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；5-[[3-(1-苯乙氧基)-4-(2-苯乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；和5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸。
在特定的实施方案中，至少一种内源的PMT基因的功能或表达被降低、破坏或缺失。例如，在特定的实施方案中，至少一种选自PMT1、PMT2、PMT3和PMT4 基因的内源的PMT基因的功能或表达被降低、破坏或缺失；或者宿主细胞在一种或多种PMT抑制剂存在的情况下培养。在进一步的实施方案中，宿主细胞包括一种或多种PMT基因缺失或破坏，宿主细胞在一种或多种Pmtp抑制剂存在的情况下培养。在这些实施方案的特定方面，宿主细胞液也表达分泌的α-1,2-甘露糖苷酶。
PMT缺失或破坏和/或Pmtp抑制剂通过降低O-糖基化占用，也就是说，通过降低被糖基化的糖蛋白上的O-糖基化位点的总数而控制O-糖基化。进一步增加细胞分泌的α-1,2-甘露糖苷酶通过降低糖蛋白上的O-聚糖的甘露糖链长度而控制O-糖基化。因此，将PMT缺失或破坏和/或Pmtp抑制剂与分泌的α-1,2-甘露糖苷酶的表达相组合通过降低占用和链长度而控制O-糖基化。在特定环境下，PMT缺失或破坏、Pmtp抑制剂和α-1,2-甘露糖苷酶的特定组合在经验上被确定为，特定的异种糖蛋白(例如Fabs和抗体)，可以以不同程度的效率被表达并转运通过高尔基体，因此可能需要PMT缺失或破坏、Pmtp抑制剂和α-1,2-甘露糖苷酶的特定组合。在另一个方面，编码一种或多种内源甘露糖转移酶的基因缺失。这种缺失可以与提供分泌的α-1,2-甘露糖苷酶和/或PMT抑制剂相组合，或者可以取代提供分泌的α-1,2-甘露糖苷酶和/或PMT抑制剂。
因此，O-糖基化的控制可用于以更好的总产量或以适当装配的糖蛋白的产量在本文公开的宿主细胞中产生特定的糖蛋白。O-糖基化的减少或去除对于整个抗体和Fab片段的装配和转运具有有益的效果，因为它们穿过(traverse)整个分泌途径并被转运至细胞表面。因此，在控制O-糖基化的细胞中，适当装配的抗体或Fab片段的产量增加至高于其中没有控制O-糖基化的宿主细胞中获得的产量。
为了降低或消除具有对α-甘露糖苷酶耐受的β-连接的甘露糖残基的N-聚糖和O-聚糖的可能性，通过缺失或破坏一种或多种β-甘露糖基转移酶基因(例如，BMT1, BMT2,BMT3, 和BMT4)而将重组的糖工程化的巴斯德毕赤酵母宿主细胞基因工程化以消除具有α-甘露糖苷酶耐受的N-聚糖的糖蛋白(见，美国专利号7,465,577和美国专利号7,713,719)。BMT2以及BMT1, BMT3,和BMT4中一种或多种的缺失或破坏也降低或消除了对于针对宿主细胞蛋白的抗体的可检测的交叉反应性。
在一些情况下，可以通过过表达编码哺乳动物或人的伴侣蛋白的核酸分子或者用编码一种或多种哺乳动物或人的伴侣蛋白的核酸分子替换编码一种或多种内源***蛋白的基因而改进糖蛋白的产量。此外，宿主细胞中哺乳动物或人的伴侣蛋白的表达也似乎控制细胞中的O-糖基化。因此，还包括本文的宿主细胞，其中至少一种编码伴侣蛋白的内源性基因已经降低或消除，编码至少一种伴侣蛋白的哺乳动物或人的同源物的载体在宿主细胞中表达。还包括宿主细胞，其中表达内源性宿主细胞伴侣蛋白和哺乳动物或人的伴侣蛋白。在进一步的方面，低等真核宿主细胞是酵母或丝状真菌宿主细胞。出版的国际申请号WO2009105357和WO2010019487(其公开内容通过引用并入本文)已经公开了宿主细胞的伴侣蛋白的用途的例子，其中引入人伴侣蛋白以改进重组蛋白的产量并减少或控制重组蛋白的O-糖基化。和上面一样，还包括低等真核宿主细胞，其中，除了如上所述的用编码一种或多种哺乳动物或人的伴侣蛋白的核酸分子替代编码一种或多种内源***蛋白的基因或过表达一种或多种哺乳动物或人的伴侣蛋白，至少一种编码蛋白O-甘露糖基转移酶(PMT)蛋白的内源基因的功能或表达被降低、破坏或缺失。在特定的实施方案中，至少一种选自PMT1, PMT2, PMT3,和PMT4基因的内源的PMT基因的功能或表达被降低、破坏或缺失。
此外，O-糖基化可以对抗体或Fab片段对于抗原的亲和力和/或亲合力有影响。当用于产生抗体或Fab的最终宿主细胞与用于选择抗体的宿主细胞不相同时，这可以是特别重要的。例如，O-糖基化可以干扰抗体或Fab片段对于抗原的亲和力，因此，可能无法鉴别另外可能具有对于抗原的高亲和力的抗体或Fab片段，因为O-糖基化可能干扰抗体或Fab片段结合抗原的能力。在其它情况下，可能无法鉴别具有对于抗原的高亲合力的抗体或Fab片段，因为O-糖基化干扰抗体或Fab片段对于抗原的亲合力。在前述两种情况下，可能无法鉴别当在哺乳动物细胞系中产生时可能特别有效的抗体或Fab片段，因为用于鉴别并选择抗体或Fab片段的宿主细胞是另一种细胞类型，例如，酵母或真菌细胞(例如，巴斯德毕赤酵母宿主细胞)。众所周知的是，酵母中的O-糖基化可以与哺乳动物细胞中的O-糖基化明显不同。当比较野生型酵母O-糖基化与哺乳动物中的黏蛋白型或营养不良聚糖型(dystroglycan)O-糖基化时，这特别相关。在特定的情况下，O-糖基化可以增加抗体或Fab片段对于抗原的亲和力或亲合力，而不是干扰抗原结合。当生产宿主细胞与用于鉴别并选择抗体或Fab片段的宿主细胞不同时(例如，在酵母中进行鉴别并选择，生产宿主是哺乳动物细胞)，这种效果是期望的，因为在生产宿主中，O-糖基化将不再是引起增加的对于抗原的亲和力或亲合力的类型。因此，控制O-糖基化可以在抗体或Fab片段的鉴别和选择不受宿主细胞的O-糖基化***影响的情况下基于抗体或Fab片段对于抗原的亲和力或亲合力而实现本文的材料和方法来以对于特定抗原的特异性鉴别并选择抗体或Fab片段。因此，控制O-糖基化进一步提高了酵母或真菌宿主细胞对于鉴别并选择最终将在哺乳动物细胞系中产生的抗体或Fab片段的可用性。
本领域普通技术人员将进一步认识并理解如何利用本文所述的方法和材料连同其它巴斯德毕赤酵母和酵母细胞系，所述其它巴斯德毕赤酵母和酵母细胞系已经基因工程化以产生特定的N-聚糖或唾液酸化的糖蛋白，如，但并不限于，上述已经基因工程化以产生特定的半乳糖基化或唾液酸化的形式的宿主生物体和细胞系。见，例如，US 2006-0286637,Production of Sialylated N-Glycans in Lower Eukaryotes，其中用于半乳糖的摄取和利用作为碳源的途径已经被基因修饰，其中的描述如同完整记载地被并入本文。
此外，本文的方法可以用于在其它低等真核细胞系中产生上述重组的包含Fc的多肽，所述其它低等真核细胞系已经被工程化以产生不具有α2,6唾液酸转移酶活性的人样和人的糖蛋白。该方法也可用于在真核细胞系中产生上述重组的包含Fc的多肽，在所述真核细胞系中唾液酸化的N-聚糖的产生是一种固有特征。
可以使用众所周知的技术测定包含Fc的多肽上α2,3和α2,6连接的唾液酸的水平，包括核磁共振(NMR)，正相高效液相色谱(HPLC)，和具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)。
Fc突变蛋白的生物特性
对于许多包含Fc的多肽，如降低的FcγR和C1q结合所显示的效应功能的缺乏或显著降低(Idusogie等,J. Immunology, 164(8):4178-84 (2000)和Shields等,J. Biol. Chem., 276:6591-6604 (2001))，以及增加的抗炎特性是期望的特征。申请人本文中已经发现，IgG的Fc区的243和264位氨基酸的特定修饰可以使得效应功能的缺乏或显著降低，无论在末端聚糖位置是否存在唾液酸化。具体而言，申请人已经发现，Fc区中残基F243和V264修饰为丙氨酸导致抗体与Fcγ受体和C1q结合的降低。值得注意的是，产生的具有这些Fc区修饰的抗体表现出与Fcγ受体结合的降低，无论是否发现它们具有α2,6-连接的唾液酸形式的末端聚糖。
因此，申请人已经开发了双Fc突变蛋白，F243A/V264A，这将产生具有上述期望特性的包含Fc的多肽。本文的实施例包括用编码包含Fc的多肽的多核苷酸载体转化宿主细胞，并培养所述转化的宿主细胞以产生包含Fc的多肽，所述包含Fc的多肽在Fc区的243和264位包含突变。
包含Fc的多肽的产生
可以根据本领域中已知适合用于产生包含Fc区的多肽的任何方法制备本发明的包含Fc的多肽。在一个实施方案中，包含Fc的多肽是抗体或抗体片段(包括但不限于由或基本上由抗体的Fc区组成的多肽)。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽是免疫黏附素。制备抗体或抗体片段的方法是本领域中众所周知的。将点突变引入多肽的方法，例如，定向诱变，也是本领域中众所周知的。
在本文公开的实施例中，在两种不同的糖工程化的巴斯德毕赤酵母株中表达本文所述的包含共有的CH2序列的IgG1重链和轻链以及Fc双突变体。如下面的实施例中所述，重链和轻链基因序列在甲醇诱导型启动子AOX1的控制下，并引入博莱霉素(Zeocin)选择标记。这种策略通过同源DNA重组将整个表达盒整合进Trp2基因座。
通过蛋白A亲和色谱以及随后的Source 30S阳离子交换纯化步骤从发酵液体培养基中捕获分泌的抗体。通过SDS-PAGE(图2)和大小排阻色谱法(SEC)以及反相HPLC表征纯化的抗体以评价正确的装配。如图2中可见，本文的材料和方法中产生的抗体具有与哺乳动物细胞(CHO)产生的Her2抗体相同的SDS-PAGE上的纯度特征。通过SEC和反相HPLC的IgG分析进一步证明，从Fc突变蛋白糖工程化的菌株制备的抗体是正确装配的，就装配而言与哺乳动物细胞产生的抗体是相似的(数据未显示)。用SK-BR3细胞系(其在这种情况下是Her2过表达的人乳腺癌系)通过基于细胞的分析测定本文的材料和方法制备的各种抗体的抗原亲和力。正如预期的那样，所有的抗体，包括突变蛋白，同样很好地结合SK-BR3细胞系(图3)。
Fc突变蛋白的N-聚糖分析
对于许多糖蛋白，包括某些抗体，对于产生具有正确的构象以赋予治疗活性的糖蛋白和抗体，IgG Fc区的末端的N-连接的聚糖的唾液酸化是必要的。见，例如，Anthony等,Science, 320:373-376 (2008)，其中末端唾液酸化与IVIG制备物的抗炎活性相关。唾液酸化需要倒数第二个半乳糖的存在，在其上的唾液酸转移酶的作用是形成唾液酸化的聚糖。因此，缺乏一个或多个末端的半乳糖糖形式的糖蛋白不能产生与抗炎活性相关的具有α2,6-连接的唾液酸组合物的抗体。
通常，哺乳动物细胞培养物如CHO细胞中产生的抗体具有包含如下的糖形式组合物：G0F (37%), G1F (43%), G2F (9%), G0 (4%), G1 (3%)和Man5 (3%)，它具有很少或没有用来作为唾液酸转移的底物的末端半乳糖。在CHO细胞产生的情况下，产生的末端聚糖是α2,3-连接的形式；CHO细胞不表达对于产生唾液酸的α2,6-连接的形式(这与抗炎活性相关)所必要的α2,6唾液酸转移酶。然而，CHO中特定的α2,6唾液酸转移酶的过表达产生α2,3-连接的和α2,6-连接的唾液酸的混合物(Bragonzi等,BBA 1474:273-282 (2000);Biochem. Biophys. Res. Comm. 289:243-249 (2001))。糖工程化的巴斯德毕赤酵母GFI5.0菌株(其能够产生高水平的半乳糖基化的非抗体蛋白，如***(Hamilton等,Science, 313:1441-1443 (2006)))产生具有相对少量的末端半乳糖(其可以作用形成α2,6-连接的唾液酸化的形式)的抗体(图4)。在这种巴斯德毕赤酵母菌株中产生的抗体通常具有包括糖形式G0 (60%), G1 (17%), G2 (4%)和Man5 (8%)的组合物。甚至巴斯德毕赤酵母GFI6.0株中产生的抗体(其具有包括G0 (43.5%), G1 (20.8%), G2(2.7%),NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2(5.5%),和NANAGal2GlcNAc2 Man3GlcNAc2 (4.9%)的聚糖组合物)具有相对低水平的α2,6-连接的唾液酸化的形式。因此，与相同菌株中产生的非抗体蛋白(如***)相比，GFI 5.0和6.0株中产生的抗体具有低得多水平的半乳糖基化和唾液酸化。
在用肽-N-糖苷酶F从抗体释放后，通过基质辅助的激光解吸电离/飞行时间(MALDI-TOF)质谱法分析本文在糖工程化的巴斯德毕赤酵母GFI5.0和GFI6.0菌株中产生的Her2抗体和对应的Fc突变蛋白抗体的N-聚糖组合物4-8)。通过Allentech Prevail carbo(Alltech Associates, Deerfield IL)柱上的HPLC定量释放的Her2和Fc突变蛋白抗体的糖组合物。
来自GFI5.0菌株的巴斯德毕赤酵母Her2抗体的糖形式包括双向触角的G0，G1和G2以及其它中性聚糖，以G0为主要糖形式(图4)。这种糖组合物与商售的CHO细胞中产生的是一致的，除了巴斯德毕赤酵母衍生的抗体固有地缺乏岩藻糖。相反，GFI5.0中产生的Fc突变蛋白抗体的糖形式具有不同的聚糖组合物。单Fc突变蛋白抗体，或F243A或V264A，表现出半乳糖基化的N-聚糖的增加，它可以作为α2,6唾液酸转移酶的底物，正如从MALDI-TOF质谱的最高峰所见的 (图5和6)，而Fc双突变蛋白抗体F243A/V264A的N-聚糖组合物表现出超过80％的总的半乳糖基化的N-聚糖的甚至更大的增加 (图7)。Fc双突变蛋白抗体上存在的G2(双-半乳糖基化的N-聚糖)的水平代表了申请人评价的任何抗体中所见的G2的最大比例。当这些相同的Fc突变蛋白抗体在GFI6.0菌株中表达时，α2,6-连接的唾液酸被增加至G1(单-半乳糖基化的)或G2(双-半乳糖基化的)的N-聚糖。对于单Fc突变蛋白抗体，几乎所有的G2 N-聚糖已经被转化为唾液酸化的聚糖(数据未显示)。尽管从单Fc突变蛋白产生的抗体表现出非常高水平的α2,6-连接的唾液酸化(40-51％，见表3)，该水平低于从Fc双突变蛋白产生的抗体的水平(图8和表3)，其中用生物反应器发酵实现了74％唾液酸化，用小规模发酵实现了91％或更高的唾液酸化。
不希望被任何理论所束缚，申请人相信，与Fc单突变蛋白相比，Fc双突变蛋白赋予的CH2结构域的更开放的口袋结构增加了唾液酸向Fc寡糖的转移。还应当注意的是，从GFI6.0菌株产生的唾液酸的α2,6形式是人类中产生的相同的形式，与CHO细胞系中产生的抗体上存在的α2,3-连接的唾液酸形式不同，Jassal等,Biochem. Biophys. Res. Comm.289:243-249, 2001。
Fc突变蛋白的FcγR结合
使用基于ELISA的测定，申请人比较了巴斯德毕赤酵母Her2抗体，单和双Fc突变蛋白抗体以及Her2抗体的Fcγ受体(FcγR)结合。正如实施例11和15中所述的实验中所示，Fc双突变蛋白具有与FcγRI的降低的亲和力。由于FcγRI是显示在抗体结合之后刺激免疫响应的受体，这些数据表明，双突变蛋白抗体促进免疫响应的能力更弱。
对于FcγRIIb，具有与FcγRI相比更低的抗体亲和力并且已经显示抑制免疫响应的受体，双Fc突变蛋白以降低的亲和力结合。对于FcγRIIa，双Fc突变蛋白似乎也以降低的亲和力结合。这些数据表明，双突变蛋白抗体的构象结构已经改变，使得通过FcγRIIa和FcγRIIb/c抑制免疫响应的能力已经显著降低或消除。
FcγRIIIa-F158和FcγRIIIa-V158是已知刺激免疫响应的受体的多态性，但是具有与FcγRI相比更低的抗体亲和力。Fc双突变蛋白对于FcγRIIIa-F158具有很少的亲和力，同时仍保留了对于FcγRIIIa-V158的一些亲和力。总而言之，这些数据表明，与母体的抗体相比，双Fc突变蛋白更易于活化并招募免疫细胞如巨噬细胞，单核细胞和自然杀伤细胞。
Fc突变蛋白的C1q结合
抗体-C1q结合是对于补体依赖性细胞毒性的一个重要参数。可以通过基于细胞的测定如实施例13中提供的测定确定免疫球蛋白(IgG)分子与C1q的结合活性(亲和力)。本领域普通技术人员可以认识并理解，可以容易地调整所公开的测定以适于使用任何IgG分子的用途。
对Fc突变蛋白的ADCC效应
本领域技术人员公认，FcγRIIIa (CD16)受体负责抗体依赖性细胞介导的​​细胞毒性(ADCC) (Daeron等,Annu. Rev. Immunol. 15:203-234, 1997)。申请人已经发现，本文所述的从双Fc突变蛋白产生的抗体已经降低了FcγRIIIa结合(图9C和D；表4和5)，因此，可能失去影响FcγRIIIa介导的ADCC的能力。
实施例13提供了用于测量B细胞耗竭和释放荧光的ADCC的体外测定。
Fc突变蛋白的生物利用度
生物利用度是指活性部分，无论它是药物或代谢物，进入人体循环***并从而接近作用部位的程度和速率。与药物的理化特性相反，剂型特性主要影响药物的生物利用度，这依次可以确定其吸收潜能。化学等效性(Chemical equivalence)表明，药物产品包含相同的活性成分和相同的量，虽然其它的非活性成分可能不同。同样，生物等效性表明，两种药物产品，当在相同的给药方案中给予相同的患者时，在循环和组织中将产生等效的药物浓度。相反，当给予相同的患者时，不相同的两种药物产品可以能够产生相同的治疗效果(和副作用)。因此，药物的生物利用度是相对于任何等效性的测定的，因为甚至当生物利用度不同时，它可能实现治疗等效性。对于具有窄的治疗指数(即最低毒性浓度与中值有效浓度的比值)的药物，生物利用度的差异可能导致治疗非等效性。
申请人已经惊讶地发现，当皮下注射时，与通过已知的商业方法在CHO细胞中产生的相当的抗体相比，本文的材料和方法中在巴斯德毕赤酵母中产生的Fc双突变蛋白抗体具有更好的生物利用度(吸收或暴露)。通常，皮下施用优选于静脉内施用，因为患者可以自己施用皮下制剂。如图12中所示，来自Fc双突变蛋白抗体处理的小鼠的血清浓度(如实施例14中所述)相比于CHO产生的对应物的血清浓度增加约30％，比在巴斯德毕赤酵母中产生的缺乏增加的α2,6-唾液酸化形式的抗体的血清浓度更高。
具有增加的唾液酸化水平的人糖基化的抗体的产生
作为本文发现的结果，申请人已经开发了一种产生具有增加的α2,6-连接的唾液酸化的抗体的方法，其通过修饰所述抗体的Fc区，使得生成了可以在体内产生在Asn297位具有增加的半乳糖基化和唾液酸化的抗体的菌株。不希望受任何理论的束缚，申请人认为，抗体的Asn297位的N-聚糖上不存在唾液酸以及存在的低水平的半乳糖的原因，不是由于各自的糖基转移酶的低效率，而是由于在Fc区的结构中固有的空间位阻。申请人相信，当抗体通过分泌途径时，Fc区的结构防止在短时间内半乳糖和唾液酸的增加。以前的报道已经表明，当与半乳糖基转移酶在体外孵育比通常体内使用的时间更长的时间时，CD20 mAb的高水平的半乳糖基化是可能的，Li等,Nat. Biotechnol. 24(2):210-215 (2006)。据认为，当抗体是具有更小的空间位阻的开放结构中时，发生半乳糖转移。导致双突变即双Fc突变蛋白的结构或构象变化导致永久的开放构象，这允许半乳糖和唾液酸转移的大大增加。
根据本文的申请人的研究，似乎氨基酸F243或V264的单个突变对于增加IgG1分子的Fc区的半乳糖基化和唾液酸化具有相似的影响。Lund等,J. Immunology 157(11):4963-4969 (1996)报道，通过改变Fc区中单个氨基酸，Phe241, Phe243, Val264, Aps265或Tyr296，在CHO-K1细胞系中产生了中等增加的唾液酸化的IgG3，导致12-42％单唾液酸化的和4-31％双唾液酸化的形式。如本文所报道的，当特定位点F243或V264被改变为丙氨酸时，本文的材料和方法所产生的抗体具有唾液酸化的显著增加。此外，当两个位点同时突变时，实现了超过91%的α2,6-唾液酸化的种类水平(表3)。
生物目标
应当指出的是，尽管在下面的实施例中，申请人例举了本发明的材料和方法使用具有商业上可获得的抗-Her2和抗-TNF抗体相似的序列的IgG1抗体，本发明并不限于所公开的抗体。本领域普通技术人员可以认识并理解，可以使用本文的材料和方法来产生任何包含Fc的多肽，对于所述包含Fc的多肽，增加的抗炎活性或降低的效应功能的特性是期望的。还应当进一步指出的是，关于由本发明如此产生的包含Fc的多肽或抗体的类型没有任何限制。包含Fc的多肽的Fc区可以来自IgA, IgD, IgE, IgG或IgM。在一个实施方案中，包含Fc的多肽的Fc区来自IgG，包括IgG1, IgG2, IgG3或IgG4。在一个实施方案中，包含Fc的多肽的Fc区来自IgG1。在特定实施方案中，本文的材料和方法产生的抗体或抗体片段可以是人源化的，嵌合的或人的抗体。
在一些实施方案中，本发明的包含Fc的多肽将结合参与炎症的生物目标。
在一些实施方案中，本发明的包含Fc的多肽将结合促炎症细胞因子。在一些实施方案中，本发明的包含Fc的多肽将结合选自如下的分子：TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22,IL-23, IL-23R, IL-25, IL-27, IL-33, CD2, CD4, CD11A, CD14, CD18, CD19, CD23,CD25, CD40, CD40L, CD20, CD52, CD64, CD80, CD147, CD200, CD200R, TSLP, TSLPR,PD-1, PDL1, CTLA4, VLA-4, VEGF, PCSK9, α4β7-整合素, E-选凝素, Fact II, ICAM-3, β2-整合素, IFNγ, C5, CBL, LCAT, CR3, MDL-1, GITR, ADDL, CGRP, TRKA,IGF1R, RANKL, GTC, αBLys,或上述分子中任一种的受体。在一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽将结合TNF-α。在另一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽将结合Her2。在另一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽将结合PCSK9。在另一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽将结合TNFR。在另一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽将结合LCAT。在另一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽将结合TSLP。在另一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽将结合PD-1。在另一个实施方案中，本发明的包含Fc的多肽将结合IL-23。
在一些实施方案中，本发明的包含Fc的多肽对于选自自身免疫性抗原，过敏原，MHC分子或猕猴因子D抗原的抗原将是特异性的。见，例如，在WO2010/10910(其通过引用并入本文)的表1中列出的抗原。
增加抗炎特性或降低效应功能/细胞毒性的方法
本发明还包括增加包含Fc的多肽的抗炎特性的方法，包括：选择用于治疗炎症状况的母体的包含Fc的多肽(例如，结合参与炎症的抗原的抗体或免疫黏附素)并且在包含Fc的多肽的243和264位引入突变，其中根据如Kabat中的EU索引编号，其中当与母体的包含Fc的多肽相比时，所述包含Fc的多肽具有增加的抗炎特性。在一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243A和V264A。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243Y和V264G。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243T和V264G。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243L和V264A。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243L和V264N。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243V和V264G。在一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽是结合参与炎症的抗原的抗体、抗体片段或免疫黏附素。在一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽是已经上市或正在开发的用于治疗炎症状况的抗体、抗体片段或免疫黏附素。在另一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽是选自如下的抗体：莫罗单抗-CD3(抗-CD3受体抗体)，阿昔单抗(抗-CD41 7E3抗体)，利妥昔单抗(抗-CD20抗体)，达利珠单抗(抗-CD25抗体)，巴利昔单抗(抗-CD25抗体)，帕丽珠单抗(抗-RSV(呼吸道合胞病毒)抗体)，英夫利昔单抗​​(抗-TNFα抗体)，曲妥珠单抗(抗-Her2抗体)，吉妥单抗奥唑米星(抗-CD33抗体)，阿来组单抗(抗-CD52抗体)，替伊莫单抗tiuxeten(抗-CD20抗体)，阿达木单抗(抗-TNFα抗体)，奥马珠单抗(抗-IgE抗体)，托西莫单抗-131I(抗-CD20抗体的碘化衍生物)，依法珠单抗 (抗-CD11a抗体)，西妥昔单抗(抗-EGF受体抗体)，戈利木单抗(抗-TNFα抗体)，贝伐单抗(抗VEGF-A抗体)，那他珠单抗(抗α4整合素)，依法珠单抗(抗CD11a)，Cetolizumab(抗-TNFα抗体)，塔西单抗(抗-IL-6R)，Ustenkinu​​mab(抗IL-12/23)，阿仑单抗(抗CD52)，和那他珠单抗(抗α4整合素)，及其变体。在另一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽是选自如下的Fc-融合蛋白：Arcalyst/ rilonacept (IL1R-Fc融合体), Orencia/ abatacept (CTLA-4-Fc融合体), Amevive/ alefacept (LFA-3-Fc融合体), Anakinra-Fc融合体(IL-1Ra-Fc融合蛋白), etanercept (TNFR-Fc融合蛋白), FGF-21-Fc融合蛋白, GLP-1-Fc融合蛋白,RAGE-Fc融合蛋白, ActRIIA-Fc融合蛋白, ActRIIB-Fc融合蛋白, 胰高血糖素-Fc融合蛋白, oxyntomodulin-Fc-融合蛋白, GM-CSF-Fc融合蛋白, EPO-Fc融合蛋白, 胰岛素-Fc融合蛋白, 胰岛素原-Fc融合蛋白和胰岛素前体-Fc融合蛋白及其类似物和变体。
本发明还包括降低包含Fc的多肽的效应功能的方法，包括在母体的包含Fc的多肽的243和264位引入突变，其中当与母体的包含Fc的多肽相比时，所述包含Fc的多肽具有降低的效应功能，其中根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243A和V264A。在一个实施方案中，包含Fc的多肽是抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，效应功能是ADCC。在另一个实施方案中，效应功能是CDC。
本发明还包括降低包含Fc的多肽的细胞毒性的方法，包括：选择用于治疗炎症状况并且结合参与炎症的抗原的母体的包含Fc的多肽(例如，结合参与炎症的抗原的抗体或免疫黏附素)，并且在包含Fc的多肽的243和264位引入突变，其中根据如Kabat中的EU索引编号，其中当与母体的包含Fc的多肽相比时，所述包含Fc的多肽具有降低的细胞毒性。
在一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含天然的Fc区。在另一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含F243A突变。在另一个实施方案中，母体的包含Fc的多肽包含V264A突变。
治疗方法
本发明还包括在需要治疗的受试者中治疗炎症状况的方法，包括：将治疗有效量的包含Fc的多肽施用于受试者，所述包含Fc的多肽在243和264位包含突变，其中根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243A和V264A。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243Y和V264G。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243T和V264G。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243L和V264A。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243L和V264N。在另一个实施方案中，包含Fc的多肽包含突变F243V和V264G。可以通过任何途径施用本发明的包含Fc的多肽。在一个实施方案中，肠胃外施用包含Fc的多肽。在一个实施方案中，皮下施用包含Fc的多肽。
在一个实施方案中，炎症状况是有害的炎症免疫反应。
在一个实施方案中，炎症状况是自身免疫性疾病。在一个实施方案中，炎症状况是多发性硬化症。在一个实施方案中，炎症状况是***性红斑狼疮。在一个实施方案中，炎症状况是I型糖尿病。
在一个实施方案中，炎症状况是原发性免疫缺陷综合症，包括先天性丙种球蛋白缺乏血症和低丙种球蛋白血症，常见的变异型免疫缺陷症，严重的联合免疫缺陷症，或Wiskott Aldrich综合症。
在一个实施方案中，炎症状况是继发性免疫缺陷综合症，包括B-细胞淋巴细胞性白血病，HIV感染或同种异体骨髓移植。
在一个实施方案中，炎症状况是特发性血小板减少性紫癜。
在一个实施方案中，炎症状况是多发性骨髓瘤。
在一个实施方案中，炎症状况是Guillain-Barre综合症。
在一个实施方案中，炎症状况是川崎病(Kawasaki disease)。
在一个实施方案中，炎症状况是慢性炎症性脱髓鞘性多神经病(CIDP)。
在一个实施方案中，炎症状况是自身免疫性嗜中性白血球减少症(autoimmunenuetropenia)。
在一个实施方案中，炎症状况是溶血性贫血。
在一个实施方案中，炎症状况是抗因子VIII的自身免疫性疾病。
在一个实施方案中，炎症状况是多灶性神经病。
在一个实施方案中，炎症状况是***性血管炎(ANCA阳性的)。
在一个实施方案中，炎症状况是多肌炎。
在一个实施方案中，炎症状况是皮肌炎。
在一个实施方案中，炎症状况是抗磷脂综合症。
在一个实施方案中，炎症状况是败血症综合症。
在一个实施方案中，炎症状况是移植物抗宿主疾病(graft-v-host disease)。
在一个实施方案中，炎症状况是过敏。
在一个实施方案中，炎症状况是抗猕猴因子D反应。
在一个实施方案中，炎症状况是心血管***的炎症状况。本发明的包含Fc的多肽可用于治疗动脉粥样硬化，动脉粥样硬化血栓形成，冠状动脉高血压，急性冠脉综合症和心脏衰竭，所有这些都与炎症相关。
在一个实施方案中，炎症状况是中枢神经***的炎症状况。在另一个实施方案中，炎症状况是外周神经***的炎症状况。例如，本发明的包含Fc的多肽可用于治疗，例如，阿尔茨海默病，肌萎缩性侧索硬化症(又名ALS；Lou Gehrig氏病)，缺血性脑损伤，朊病毒疾病，和HIV相关性痴呆。
在一个实施方案中，炎症状况是胃肠道的炎症状况。例如，本发明的包含Fc的多肽可用于治疗炎症性肠疾病，例如，Crohn氏病，溃疡性结肠炎，乳糜泻和肠易激综合症。
在一个实施方案中，炎症状况是牛皮癣，特应性皮炎，关节炎，包括类风湿关节炎，骨关节炎，和牛皮癣关节炎。
在一个实施方案中，炎症状况是类固醇依赖的特应性皮炎。
在一个实施方案中，炎症状况是恶病质。
可以使用本发明的包含Fc的多肽的其它炎症疾病的例子还包括：寻常痤疮，哮喘，自身免疫性疾病，慢性***炎，肾小球性肾炎，超敏反应，***性疾病，再灌注损伤，肉状瘤病，移植排斥，血管炎，间质性膀胱炎和肌病。
在一个实施方案中，以1-100毫克/千克体重的剂量施用本发明的包含Fc的多肽。在一个实施方案中，以0.001-10毫克/千克体重的剂量施用本发明的包含Fc的多肽。在一个实施方案中，以0.001-0.1毫克/千克体重的剂量施用本发明的包含Fc的多肽。在一个实施方案中，以0.001-0.01毫克/千克体重的剂量施用本发明的包含Fc的多肽。
药物制剂
本发明还包括包含本发明的包含Fc的多肽和药学上可接受的载体的药物制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及含有包含Fc的多肽的药物组合物，其中，至少70％的包含Fc的多肽上的N-聚糖包含选自NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2的寡糖结构，其中包含Fc的多肽包含Fc区的243和264位氨基酸的突变，其中根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施方案中，突变是F243A和V264A。在一个实施方案中，至少47摩尔％的N-聚糖具有结构NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖中的唾液酸残基通过α-2,6连接而连接。在一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖中的唾液酸残基通过α-2,6连接而连接，没有可检测水平的α-2,3连接的唾液酸。在一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖不包含N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指无毒的材料，所述无毒的材料不干扰一种或多种活性成分的生物活性的效力，所述无毒的材料是由联邦或州政府的管理机构批准的或美国药典或其它普遍认可的药典所列出的用于在动物中，更尤其是，在人中使用的。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂，佐剂，赋形剂，或媒介，但不限于如水和油的无菌液体。载体的特征将取决于施用的途径。
可以通过以例如冻干粉末，浆料，水溶液或悬浮液的形式与可接受的载体，赋形剂，或稳定剂混合来制备治疗和诊断剂的药物制剂(见，例如，Hardman等 (2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, NewYork, NY; Gennaro (2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis,等 (eds.) (1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY;Lieberman, 等 (eds.) (1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets, MarcelDekker, NY; Lieberman,等 (eds.) (1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner和Kotkoskie (2000)Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY)。
施用的模式可以变化。合适的施用途径包括口服的，直肠的，经粘膜的，肠的，胃肠外的；肌内的，皮下的，皮内的，髓内的，鞘内的，直接心室内的，静脉内的，腹膜内的，鼻内的，眼内的，吸入，吹入，局部的，皮肤的，经皮的，或动脉内的。
在某些实施方案中，可以通过侵入途径如通过注射(见上文)施用本发明的包含Fc的多肽。在本发明的一些实施方案中，静脉内地，皮下地，肌内地，动脉内地，关节内地(例如，在关节炎的关节内)，肿瘤内地，或通过吸入，气溶胶递送而施用本发明的包含Fc的多肽，或其药物组合物。通过非侵入的途径(例如，口服地；例如，在丸剂，胶囊或片剂中)的施用也在本发明的范围内。
在某些实施方案中，可以通过侵入途径如通过注射(见上文)施用本发明的包含Fc的多肽。在本发明的一些实施方案中，静脉内地，皮下地，肌内地，动脉内地，关节内地(例如，在关节炎的关节内)，肿瘤内地，或通过吸入，气溶胶递送而施用本发明的包含Fc的多肽，或其药物组合物。通过非侵入的途径(例如，口服地；例如，在丸剂，胶囊或片剂中)的施用也在本发明的范围内。
可以用本领域中已知的医疗设备施用组合物。例如，可以通过使用皮下注射针，包括，例如，预充式注射器或自动注射器的注射施用本发明的药物组合物。
也可以使用无针皮下注射设备；如美国专利号6,620,135; 6,096,002; 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824或4,596,556中公开的设备施用本发明的药物组合物。
也可以通过输注施用本发明的药物组合物。众所周知的施用药物组合物的植入物和模块的例子包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以控制的速率分配药物的可植入的微输注泵；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续的药物递送的可变流植入式输注装置；美国专利4,439,196，其公开了具有多室的隔室的渗透药物递送***。许多其它这种植入物，递送***，和模块是本领域技术人员众所周知的。
或者，可以在局部而不是全身性方式施用抗体，例如，通过将通常以药效持久性或持续释放的制剂的抗体直接注射进关节炎的关节内。而且，可以在靶向药物递送***(例如，在组织特异性抗体包被的脂质体中)中施用抗体，所述靶向药物递送***靶向至，例如，具有免疫病理学特征的关节炎的关节或病原体诱导的病变。脂质体将被靶向至受折磨的组织并被该组织选择性摄取。
施用方案取决于若干因素，包括治疗性抗体的血清或组织的转换率，症状的水平，治疗性抗体的免疫原性，和靶细胞在生物基质中的可达性。优选地，施用方案递送足够的治疗性抗体以影响目标疾病状态的改善，同时使不良副作用最小化。因此，递送的生物剂的量部分取决于具体的治疗性抗体和被治疗的状况的严重性。可以获得选择治疗性抗体的适当剂量的指引(见，例如，Wawrzynczak (1996)Antibody Therapy, Bios Scientific Pub.Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991)Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, NewYork, NY; Baert,等. (2003)New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom等. (1999)New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon等. (2001)New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz等. (2000)New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh等. (2003)New Engl. J. Med.348:24-32; Lipsky等. (2000)New Engl. J. Med. 343:1594-1602)。
临床医生，例如，使用本领域中已知的或怀疑的影响治疗的参数或因素，可以确定适当的剂量。通常，以稍微低于最佳剂量的量开始剂量，其后以小的增量增加，直到获得相对于任何负面的副作用的期望的或最佳的效果。重要的诊断量度包括例如，炎症或产生的炎症细胞因子的水平的症状的那些量度。优选地，将使用的生物剂来自与治疗针对的动物相同的物种，从而使针对试剂的任何免疫反应最小化。在人受试者的情况下，例如，嵌合的，人源化的和完全人的包含Fc的多肽是优选的。
可以通过连续输注，或者通过施用的剂量，例如，每天一次，每周1-7次，每周一次，每两周一次，每个月一次，每两个月一次，每季一次，每半年一次，每年一次等提供包含Fc的多肽。可以，例如，静脉内地，皮下地，局部地，口服地，经鼻地，直肠地，肌内地，脑内地，脊柱内地，或通过吸入地提供剂量。总的每周剂量通常为至少0.05 μg/kg体重，更通常至少0.2μg/kg, 0.5 μg/kg, 1 μg/kg, 10 μg/kg, 100 μg/kg, 0.25 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0mg/kg, 5.0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg或更多。(见，例如，Yang等.,New Engl. J. Med.349:427-434 (2003); Herold等,New Engl. J. Med. 346:1692-1698(2002); Liu等,J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456 (1999); Portielji等,Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144 (2003).在其它实施方案中，皮下地或静脉内地，每周一次，每两周一次，“每4周一次”，每个月一次，每两个月一次，每季一次，以10, 20,50, 80, 100, 200, 500, 1000或2500 mg/受试者施用本发明的包含Fc的多肽。
如本文所用，术语“治疗有效量”，“治疗有效剂量”和“有效量”是指本发明的包含Fc的多肽的量，当单独或与额外的治疗剂组合施用于细胞、组织或受试者时，该量有效地引起疾病或状况的一种或多种症状或这种疾病或状况的进展的可测量的改善。治疗有效剂量进一步是指足以导致症状的至少部分改善，例如，相关医疗状况的治疗、愈合、预防或改善，或这种状况的治疗率、愈合率、预防率或改善率的增加的包含Fc的多肽的量。当应用于单独施用的单个活性组分时，治疗有效剂量是指该单独组分。当应用于组合时，治疗有效剂量是指导致治疗效果的活性组分的组合的量，无论组合地、连续地或同时地施用。有效量的治疗剂将导致诊断量度或参数的至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％，并且最优选至少50％的改善。在使用主观量度来评价疾病严重度的情况下，有效量也可以导致主观量度的改善。
实施例1
菌株和试剂
大肠杆菌菌株TOP 10或DH5α (Invitrogen, CA)用于重组DNA实验。从NewEngland Biolabs, Ipswich, MA获得限制性内切核酸酶，DNA修饰酶和PNGase F。从Integrated DNA Technologies, Coralville, LA订购寡核苷酸。
实施例2
抗-Her 2 IgG1 Fc突变蛋白和巴斯德毕赤酵母重组表达载体的构建
使用下面列出的序列和方案进行巴斯德毕赤酵母中Her2 IgG1单克隆抗体的单和双Fc突变蛋白的制备。
A.重链和轻链
分别用于制备Her2单克隆IgG1抗体的重链和轻链的序列，SEQ ID NO:1和2，如下所述。重链抗-Her2双突变蛋白抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9中所示。根据巴斯德毕赤酵母密码子使用对重链和轻链进行密码子优化，通过GeneArt AG (Josef-Engert-Str.11,D-93053 Regensburg, Germany)合成并克隆进pUC19中。
分别使用正向引物，反向引物，FcF243A-F (SEQ ID NO:3)和FcF243A-R (SEQ IDNO:4)用QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit (Strategene, CA)进行F243位氨基酸的丙氨酸Fc突变。同样，分别使用正向引物，反向引物，V254A-F (SEQ ID NO:5)和V264A-R (SEQ ID NO:6)进行V264位氨基酸的突变。通过使用来自每个单一的突变蛋白质粒的F243A和V264A位点之间的酶消化并随后连接而进行双突变。
B.信号序列
通过PCR融合将α-接合因子前结构域(α-Mating Factor predomain)的信号序列同框融合至轻链或重链的5'末端。如上所述对该序列进行密码子优化。将Kozak序列AAACG增加至甲硫氨酸的5'末端，在Kozak序列之前增加EcoR1位点用于克隆目的。DNA序列(SEQID NO：7)和氨基酸(SEQ ID NO：8)翻译如下所示。
C.用于表达IgG1和IgG1 Fc突变蛋白的重组质粒
将具有融合的IgG1的信号序列的重链和轻链及其突变蛋白分别克隆进巴斯德毕赤酵母AOX1启动子之后以及酿酒酵母Cyc终止子之前。将完成的重链和轻链的表达盒一起放入最终的表达载体中。通过用Spe1线性化载体并靶向整合进Trp2位点而实现基因组***巴斯德毕赤酵母。
本文使用的质粒的概述如下面的表1中给出。用于Her2双Fc突变蛋白的最终表达质粒的图示如图1中所述。
表 1
质粒 描述
pGLY2336 具有WT轻链以及α-MF前信号序列和Kozak序列的pCR2.1 topo
pGLY2337 具有WT重链以及α-MF前信号序列和Kozak序列的pCR2.1 topo
pGLY2338 WT轻链表达载体
pGLY2987 WT重链表达载体
pGLY2988 具有重链和轻链的WT IgG1表达最终载体
pGLY3067 具有IgG1重链F243A突变的pCR2.1 topo载体
pGLY3473 具有IgG1重链V264A突变的pCR2.1 topo载体
pGLY3474 F243A突变蛋白表达载体
pGLY3475 V264A突变蛋白表达载体
pGLY3479 F243和V264A双突变蛋白表达载体
pGLY3481 pGLY3474(BmHI/NotI) + pGLY2338(BglII/Not)，具有1个拷贝轻链的F243A突变体
pGLY3482 (BmHI/NotI) + pGLY2338(BglII/Not)，具有1个拷贝轻链的pGLY3475V264A突变体
pGLY3483 同时具有重链和轻链的F243A和V264A双突变最终表达载体
实施例3
用于产生抗Her2及其Fc突变蛋白的糖工程化的毕赤酵母GFI5.0和GFI6.0宿主
在本发明中应用两种不同的糖工程化的毕赤酵母宿主，GFI5.0和GFI 6.0。根据Gerngross, US 7,029,872和Gerngross, US 7,449,308中公开的操作，可以构建用于基因工程化低等真核宿主细胞的载体，使得它们能够表达具有如主要的物种的期望的N-糖形式的期望的多肽。根据Hamilton等,Science, 313:1441-1443 (2006)和Hamilton US 2006/0286637中所述的方法从NRRL11430 (美国典型培养物保藏中心(ATCC), P.O. Box 1549,Manassas, VA 20108, USA)工程化GFI 5.0和GFI6.0菌株。工程化的巴斯德毕赤酵母菌株GFI5.0能够产生具有双向触角的具有末端半乳糖的N-聚糖结构的蛋白。本文所用的GFI5.0菌株RDP697的基因型如下：
GFI 6.0菌株能够产生具有双向触角的N-聚糖结构的蛋白，在所述结构上末端的α2,6-连接的唾液酸连接半乳糖。
用来描述基因型的缩写是本领域技术人员通常所知并理解的，包括以下缩写：
ScSUC2 酿酒酵母转化酶(Invertase)
OCH1 α-1,6-甘露糖基转移酶
KlMNN2-2 乳酸克鲁维酵母UDP-GlcNAc转运蛋白
BMT1 β-甘露糖转移(β-甘露糖去除)
BMT2 β-甘露糖转移(β-甘露糖去除)
BMT3 β-甘露糖转移(β-甘露糖去除)
BMT4 β-甘露糖转移(β-甘露糖去除)
MNN4L1 MNN4-样1 (电荷去除)
MmSLC35A3 UDP-GlcNAc转运蛋白的小鼠同源物
PNO1 N-聚糖的磷酸甘露糖基化(电荷去除)
MNN4 甘露糖基转移酶(电荷去除)
ScGAL10 UDP-葡萄糖4-差向异构酶
XB33 融合于ScKRE2前导序列的截短的HsGalT1
DmUGT UDP-半乳糖转运蛋白
KD53 融合于ScMNN2前导序列的截短的DmMNSII
TC54 融合于ScMNN2前导序列的截短的RnGNTII
NA10 融合于PpSEC12前导序列的截短的HsGNTI
FB8 融合于ScSEC12前导序列的截短的MmMNS1A
TrMDS1 分泌的里氏木霉MNS1
ADE1 N-琥珀酰-5 - 氨基咪唑-4 - 甲酰胺核糖核苷酸(SAICAR)合成酶
MmCST 小鼠CMP-唾液酸转运蛋白
HsGNE 人UDP-GlcNAc 2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶
HsCSS 人CMP-唾液酸合成酶
HsSPS 人N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合成酶
MmST6-33 融合于ScKRE2前导序列的截短的小鼠α-2,6-唾液酸转移酶
LmSTT3d 来自硕大利什曼原虫的寡糖转移酶的催化亚基。
实施例4
酵母转化和筛选
糖工程化的GFI5.0和GS6.0菌株生长在YPD丰富培养基(酵母提取物1％，蛋白胨2％，2％葡萄糖)中，通过离心在对数期收获，并用冰冷的1M山梨醇洗涤三次。将1-5μg Spe1消化的质粒与感受态酵母细胞混合，用预设巴斯德毕赤酵母电穿孔程序的Bio-Rad GenePulser XcellTM (Bio-Rad, 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)电穿孔。24℃在恢复丰富培养基中1小时后，将细胞铺于包含300 μg/ml博来霉素的最小葡萄糖培养基(1.34％YNB，0.0004％生物素，2％葡萄糖，1.5％琼脂)板上，在24℃孵育直至转化体出现。
为了筛选高滴度菌株，将96个转化体接种于缓冲的甘油复杂培养基(BMGY)，生长72小时，随后在缓冲的甲醇复杂培养基(BMMY)中诱导24小时。如下通过蛋白A珠粒测定评价抗体的分泌。在未结合的96孔测定板中用50 mM Tris pH 8.5 1:1稀释来自96孔板培养物的50微升上清液。对于每个96孔板，2 ml磁性的BioMag蛋白A悬浮珠粒(Qiagen, Valencia,CA)置于保持在磁性架中的管中。当珠粒收集至管的侧壁2-3分钟后，滗去缓冲液。用等于原始体积的体积的洗涤缓冲液(100 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.0)洗涤珠粒三次，并重悬浮于相同的洗涤缓冲液中。将20μl珠粒加入包含稀释的样品的测定板的每个孔中。覆盖板，轻轻涡旋，然后在室温孵育1小时，同时每隔15分钟涡旋。孵育后，样品板置于磁性板上，诱导珠粒收集至每个孔的一侧。在Biomek NX液体处理器(Beckman Coulter, Fullerton,CA)上，上清液从板移至废物容器。然后将样品板从磁体离开，用100 μl洗涤缓冲液洗涤珠粒。将板再次置于磁体上，然后通过抽吸除去洗涤缓冲液。将20μl上样缓冲液(包含25 mMNEM (Pierce, Rockford, IL)的Invitrogen E-PAGE凝胶上样缓冲液)加入每个孔中，并将板短暂涡旋。在Beckman Allegra 6离心机上500 rpm离心后，在99℃孵育样品5分钟，然后在E-PAGE高通量的预制凝胶(Invitrogen, Carlsbad, CA)上迁移。用凝胶染色溶液(0.5 g考马斯G250亮蓝, 40% MeOH, 7.5%乙酸)覆盖凝胶，在微波中加热35秒，然后在室温孵育30分钟。凝胶在蒸馏水中脱色(de-stained)过夜。选择高滴度的集落用于实施例5中详细描述的进一步的Sixfors发酵筛选。产生IgG1野生型(母体的)和Fc突变蛋白的菌株的概述如下面的表2中给出。
表 2
实施例5
生物反应器(Sixfors)筛选
如下所述进行生物反应器发酵筛选：在0.5升生物反应器(Sixfors多发酵***，ATR Biotech, Laurel, MD)中进行糖工程化的巴斯德毕赤酵母的分批投料发酵(Fed-batch fermentations)，条件如下：pH 6.5, 24℃, 300 ml气流/min，初始搅拌速度为550rpm，初始工作体积为350 ml (330 ml BMGY培养基[100 mM磷酸钾, 10 g/l酵母提取物,20 g/l蛋白胨(BD, Franklin Lakes, NJ), 40 g/l甘油, 18.2 g/l山梨醇, 13.4 g/lYNB (BD, Franklin Lakes, NJ), 4 mg/l生物素]和20 ml接种物)。使用IRIS多发酵罐软件(ATR Biotech, Laurel, MD)来在发酵的1-10小时之间线性地将搅拌速度从550 rpm提高至1200 rpm。因此，允许溶解氧的浓度在发酵期间波动。以批处理模式进行发酵，直到消耗掉初始的甘油负荷(40 g/l)(通常为18-24小时)。通过将17 ml甘油投料溶液加入生物反应器(50% [w/w]甘油, 5 mg/l生物素和12.5 ml/l PTM1盐(65 g/l FeSO4.7H2O, 20 g/lZnCl2, 9 g/l H2SO4, 6 g/l CuSO4.5H2O, 5 g/l H2SO4, 3 g/l MnSO4.7H2O, 500 mg/lCoCl2.6H2O, 200 mg/l NaMoO4.2H2O, 200 mg/l生物素, 80 mg/l NaI, 20 mg/l H3BO4)而开始第二批阶段。以批处理模式再次操作发酵，直到消耗掉加入的甘油(通常为6-8小时)。通过通常在收获前36小时以0.6 g/hr加入甲醇溶液(100% [w/w]甲醇, 5 mg/l生物素和12.5 ml/l PTM1盐)而开始诱导阶段。从反应器中取出整个体积，在配备SLC-6000转子的Sorvall Evolution RC离心机(Thermo Scientific, Milford, MA)中以8,500 rpm离心30分钟。弃去细胞量，并保留上清液用于纯化和分析。根据Li等., Nat. Biotech. 24(2):210-215 (2006)通过MALDI-飞行时间(Time-of-flight, TOF)光谱法和 2-氨基联苯胺(2-AB)评价聚糖质量。通过用PNGase-F处理而从抗体释放聚糖并通过MALDI-TOF分析以验证聚糖结构。为了定量存在的中性和带电的聚糖的相对量，用2-AB标记N-糖苷酶F释放的聚糖并通过HPLC分析。
实施例6
生物反应器培养
在3L (Applikon, Foster City, CA)和15L (Applikon, Foster City, CA )玻璃生物反应器和40L (Applikon, Foster City, CA)不锈钢的在线蒸汽消毒的(steam inplace)生物反应器中进行发酵。通过以1％的体积比用冷冻的储存小瓶直接接种BMGY培养基而制备菌种培养物。在24℃孵育菌种瓶48小时以获得20±5的光密度(OD600)，从而确保细胞在转移后以指数生长。培养基每升包含40 g甘油, 18.2 g山梨醇, 2.3 g K2HPO4, 11.9g KH2PO4, 10 g酵母提取物(BD, Franklin Lakes, NJ), 20 g蛋白胨(BD, FranklinLakes, NJ), 4 x 10-3 g生物素和13.4 g酵母基础氮源(BD, Franklin Lakes, NJ)。以10％的菌种比初始培养基的体积比接种生物反应器。以分批投料模式进行培养，条件如下：设定为24±0.5℃的温度，用NH4OH控制在6.5±0.1的pH，通过以级联搅拌速率增加O2而使溶解氧保持在1.7±0.1 mg/L。气流速率保持在0.7 vvm。在初始的负载甘油(40 g/L)消耗之后，以50％的最大生长速率指数地加入包含12.5 mL/L PTM1盐的50％甘油溶液，持续8小时，直到达到250 g/L的湿细胞重量。当指数地加入甲醇以维持0.01 h-1的特定生长速率时，在30分钟的饥饿阶段后开始诱导。当达到150 mM/L/h的氧摄取速率时，甲醇进料速率保持恒定以避免氧气限制。
实施例7
抗体纯化
本领域普通技术人员可以使用可用的公开的方法进行分泌抗体的纯化，例如Li等, Nat. Biotech. 24(2):210-215 (2006)，其中通过蛋白A亲和色谱从发酵上清液捕获抗体，并使用与苯基琼脂糖快速流动树脂的疏水性相互作用色谱进一步纯化。
实施例8
聚糖的MALDI-TOF分析
如Choi等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5022-5027 (2003)和Hamilton等,Science301:1244-1246 (2003)中所述分析N-聚糖。糖蛋白还原并羧甲基化后，通过用肽-N-糖苷酶F处理而释放N-聚糖。用乙醇沉淀蛋白后，回收释放的寡糖。根据制造商的说明书，通过具有延迟的提取的Voyager PRO linear MALDI-TOF (Applied Biosystems)质谱仪测定分子量。根据上述实施例产生的抗Her2抗体的N-聚糖分析的结果如图4-8中所示。
实施例9
通过HPLC的N-连接的聚糖分析
为了定量每种糖形式的相对量，如Choi等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5022-5027 (2003)和Hamilton等,Science313:1441-1443 (2006)中所述用2-氨基联苯胺(2-AB)标记N-糖苷酶F释放的聚糖并通过HPLC分析。对于3L生物反应器中产生的单和双突变蛋白和小规模的0.5L生物反应器中产生的野生型和双突变蛋白的GFI 6.0菌株中产生的唾液酸化的抗Her2抗体的量如表3中所示。
表 3
实施例10
抗原亲和力测定
通过胰蛋白酶化收获表达抗原的哺乳动物细胞，过滤通过40 μm细胞过滤器，并在96深孔板中悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1％胎牛血清(FBS)中。以10-0.01μg ml-1的终浓度将纯化的抗体的系列稀释物加入细胞。抗体细胞混合物在冰上孵育45分钟。用冷PBS洗涤细胞，并用1% FBS/PBS中的2 μg ml-1抗人IgG-AlexaFluor488(Invitrogen,Carlsbad, CA)在冰上避光染色45 min。在冷PBS中再次洗涤细胞，重悬于1％FBS/PBS中，并转移至U型底的96 孔板(USA Scientific, Ocala, FL)中。用488 nm的激发波长和525 nm的发射波长在Guava ExpressPlus (Millipore, Billerica, MA)上检测平均荧光强度(MFI)。结果如图3中所示。
实施例11
FcγR结合测定
对Shields等.,J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)所述的稍作修改进行Fcγ受体结合测定。以每孔100 μl下列浓度的Fcγ受体溶液/PBS包被高蛋白结合96孔板(Corning Costar, Lowell, MA)：对于FcγRI (R & D Systems)和FcγRIIa (巴斯德毕赤酵母产生的)为1 μg/mL，对于FcγRIIb/c (巴斯德毕赤酵母产生的)为2 μg/mL，对于FcγRIIIa-V158为0.4 μg/mL，以及对于FcγRIIIa-F158 为0.8 μg/mL(都是巴斯德毕赤酵母产生的)。如Li等.,Nat. Biotech. 24:210-215(2006)中所述使用巴斯德毕赤酵母表达FcγRIIIa-V158和FcγRIIIa-F158受体。
也如Li等中所述使用类似方法在糖工程化的毕赤酵母中表达FcγRIIa。从人cDNAPCR扩增FcγRIIa胞外结构域并克隆进pCR2.1 topo载体。将Fcγ受体克隆进使用酿酒酵母α接合因子前结构域(alpha Mating Factor prepro domain)的毕赤酵母表达载体中，其在AOX1启动子控制之下。通过将pGLY3249转化进yGLY638 (GFI2.0宿主)而产生最终的菌株yGLY4665。
使用糖工程化的毕赤酵母YGLY638(GFI2.0宿主)表达并产生FcγRIIb/c。C-末端携带9His-标签的人Fcγ受体IIb/c (NP_003992)的胞外结构域的DNA序列进行毕赤酵母密码子优化，命名为pAS197 (GeneArt, Germany)。FcγRIIb/c的组氨酸-标签的胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:17中所示。对于pGLY3246的质粒构建，将密码子优化的hFcRIIb/c (AfeI/KpnI)和酿酒酵母αMFprepro (EcoRI/平端的)克隆进pGLY2219的EcoRI和KpnI之间。将产生的质粒pGLY3246转化进yGLY638以生成yGLY4653。根据Li等发酵并纯化YGLY4653。
对于FcγRI，在测定稀释液(1%BSA, PBS, 0.05% Tween20)中包被单体形式的抗体。对于所有其它受体，在用碱性磷酸酶缀合的抗人IgG F(ab')2 (JacksonImmunoResearch, West Grove, PA)二聚化后在室温包被抗体1小时。也使用F(ab')2检测FcγRI结合的抗体，在与SuperPhos (Virolabs, Chantilly, VA)孵育18小时后通过测定340nm处的激发和465nm处的发射而定量所有板。
结果如图9中所示。如图9A中所示，Fc单突变蛋白(▲和▼)具有与Her2抗体(■)(图9A)和巴斯德毕赤酵母Her2(数据未显示)相似的FcγRI(Fc受体γ链I，CD64)结合，而Fc双突变蛋白(♦)具有与FcγRI的亲和力的约14倍的降低(图9A)。
对于FcγRIIb/c，Fc单突变蛋白(▲和▼)表现出与Her2抗体(■)相比受体结合特性的10倍的降低(图9B)，而双Fc突变蛋白似乎不结合FcγRIIb/c。
FcγRIIIa-F158和FcγRIIIa-V158，两种单Fc突变蛋白(▲和▼)对于FcγRIIIa-F158的结合都比商售的Herceptin抗体(■)好20倍(图9C)，但是结合FcγRIIIa-V158仅稍好于商售的Herceptin抗体(图9D)。Fc双突变蛋白(♦)对于FcγRIIIa-F158有很小的亲和力(50倍降低)(图9C)，同时仍然保留了对于FcγRIIIa-V158的一些亲和力，尽管比商售的Herceptin抗体(■)和来自GS5.0的巴斯德毕赤酵母Her2抗体(数据未显示)要弱30倍(图9D)。
此外，在由神经氨酸酶释放唾液酸之后，双Fc突变蛋白对于FcγRIIIa的两种多态性的亲和力似乎没有改变(数据未显示)。因此，不希望受任何理论的束缚，申请人将对于FcγRIIIa的两种多态性的亲和力的降低归因于由双突变蛋白，即双Fc突变蛋白导致的结构或构象的变化，而不是由于α2,6-连接的唾液酸化的N-聚糖的水平的增加。
实施例12
对于抗Her2抗体及其Fc突变蛋白的C1q结合测定
使用Idusogie等,J. Immunology, 164:4178-4184 (2000)所述的方法进行C1q结合测定。将每孔100 μl的50mM Na2HCO3 pH9.0中的系列稀释的抗体包被至干净的高结合板。将2 μg/mL测定稀释液(0.1％牛明胶，PBS，0.05％ Tween20)中的人C1q补体(USBiological, Swampscott, MA)包被2小时。用HRP缀合的羊多克隆抗人C1q抗体(AbDSerotec)检测C1q，并通过测量OD450而定量。
结果如图10中所示。如图10中所示，相对于哺乳动物细胞培养物或非唾液酸化的巴斯德毕赤酵母株中产生的那些，本文所述的材料和方法产生的单和双Fc突变蛋白抗体具有降低的C1q结合。相对于Her2抗体，从单Fc突变蛋白产生的抗体的C1q结合(▲或▼)降低5-10倍，而双Fc突变蛋白的C1q结合(♦)几乎被消除。
GFI5.0菌株中产生的巴斯德毕赤酵母Her2(数据未显示)和Her2抗体都显示出相似的与C1q的亲和力。
实施例13
对于抗Her2及其Fc突变蛋白的抗体依赖性细胞毒性
使用铕掺入法测定抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在补充10％胎牛血清(FBS)的McCoy's 5A培养基中培养人卵巢腺癌系SKOV3。从leucopaks获得外周血单核细胞(PBMC)。PBMC进行Ficoll-Hypaque密度离心，在补充2% FBS的PBS中洗涤并重悬浮于具有10% FBS的McCoy's 5A培养基中。对于每位个体供体测定FcγRIIIA F158V基因型。用EuDTPA标记SKOV3细胞。以5000/孔将细胞加入96孔组织培养板并且以300,000/孔(E:T 60:1)加入效应细胞(PBMC)。以不同的浓度加入抗体并横跨板进行稀释。对照包括背景、目标和效应基线计数，和100％裂解细胞。将有和没有抗体的PBMC混合物在37℃孵育4小时。通过用DELPHIAEnhancement Solution (Perkin Elmer, cat# 1244-105)混合20 μl上清液以形成高度荧光的螯合物(其使用时间分辨的荧光来测定)而测定从裂解的PBMC的EuDTPA的释放。对于每个抗体稀释液设定一式三份孔，根据下式计算裂解的百分比：((实验释放 - 背景)/(最大释放 - 背景)) - ((自然细胞毒性 - 背景)/(最大释放 - 背景))。如下定义术语：实验释放代表在效应细胞和抗体存在的情况下靶细胞的平均计数，背景代表在标记靶细胞之后来自最后洗涤的上清液的平均值，最大释放代表与DELPHIA裂解缓冲液(Perkin Elmer, cat#4005-0010)孵育的靶细胞的平均值，自然细胞毒性代表在效应细胞存在的情况下靶细胞的平均计数。使用Prism 5.0软件将数据点拟合至四参数逻辑回归模型。迫使所有曲线共享相同的最大值，最小值，和斜率。
本领域技术人员可以认识并理解，可以容易地调整实施例10-12中的测定而用于适合任何免疫球蛋白分子的要求。此外，对于任何特定IgG，可以使用Borchmann等,Blood,102:3737-3742 (2003); Niwa等,Cancer Research, 64:2127-2133 (2004)的方法调整动物模型中的体内ADCC测定。
结果如图11中所示。单Fc突变蛋白显示了与Her2抗体相似的ADCC活性曲线并且比GFI 5.0宿主中产生的巴斯德毕赤酵母Her2抗体的低约5倍。如图11中所示，正如从FcγRIIIa结合数据所预测的，对于从双Fc突变蛋白产生的抗体，ADCC活性几乎不存在。
实施例14
对于抗Her2及其Fc突变蛋白的皮下PK研究
在C57B6小鼠中进行皮下PK研究。以1 mg/kg (n=3)的剂量皮下施用抗体样品。在1, 6, 24, 53, 77, 120, 192, 240, 288和360的收集时间点用毛细管收集10μl血液并转移至包含90 μl无钙和镁的PBS和1.8mg/ml K2EDTA的微量离心管中。使用夹心免疫测定在Gyros® Bioaffy (Uppsala, Sweden)工作站上测定人IgG水平。使用100 μg/ml生物素化的小鼠单克隆的抗人κ链(BD Pharmingen, San Diego, CA)作为捕获抗体，使用12.5nMALEXA-647标记的小鼠单克隆的抗人Fc, Pan IgG(Southern Biotech, Birmingham, AL)作为检测抗体。将从捕获抗体固定和分析物添加至检测抗体添加和洗涤步骤的整个免疫测定自动化。在5％小鼠对照血浆(EDTA)中制备标准品和QC作为20x储存物，在分析之前以1:20稀释进5%小鼠血浆/测定缓冲液(PBS, 0.01% Tween)中。用加入标准的(spiked)QC建立准确的IgG浓度测定的线性范围，发现为5-5000 ng/ml。准确度和精确度可接受范围为+/-20%，定量下限(LLOQ)为+/- 25%。在没有显著的信号损失的情况下将标准品和QC冷冻并融解三次。标准品、QC和研究样品保存在-70℃。融解研究样品并1:20稀释在5%小鼠血浆/测定缓冲液中，如果水平在线性测定范围之外，进一步1:10稀释。所有标准品、QC和研究样品以一式两份检测并报告平均结果。使用第5参数逻辑曲线拟合测定浓度。对于每只动物，使用血清mAb浓度 - 时间数据的非房室分析的WinNonlin(WinNonlin Enterprise Version5.01, Pharsight Corp, Mountain View, CA)计算药代动力学参数。
如在图12中所示，用具有GFI5.0糖基化的巴斯德毕赤酵母Her2和Her2处理的小鼠具有相似的t 1/2和血清浓度，而与CHO细胞中产生的Her2处理的小鼠相比，用具有GFI6.0糖基化产生的Fc双突变蛋白Her2处理的小鼠表现出更高的Cmax(最大浓度)和约30％的血清浓度的增加。因此，在皮下注射的三份样品中，Fc双突变蛋白抗体表现出基于更高的Cmax和血清浓度的更好的生物利用度(吸收或暴露)。
实施例15
如实施例11中所述进行本发明的抗Her2抗体及其Fc突变蛋白的另一组Fcγ受体结合测定，结果如图13；和表4和5中所示。
表 4
与Her 2抗体的FcγR结合亲和力的比较
比值计算：STD EC50/抗-抗原mAb
比值> 1.0 比Her2 Ab更高的亲和力
比值< 1.0 比Her2 Ab更低的亲和力。
表 5
与毕赤酵母Her 2抗体的FcγR结合亲和力的比较
比值计算：STD EC50/抗-抗原mAb
比值> 1.0 比毕赤酵母Her2 Ab更高的亲和力
比值< 1.0 比毕赤酵母Her2 Ab更低的亲和力。
实施例16
抗HER2抗体和Fc突变蛋白的ADCC评价
用SKOV3靶细胞(ATCC, Cat # HTB-77)进行ADCC分析。在测定前一天，以1000 rpm离心15分钟沉淀原代NK效应细胞(Biological Specialty, Cat # 215-11-10)，在补充10%FBS (Cellgro, Cat # 35-016-CV)的RPMI减去酚红的培养基(Invitrogen, catalog #11835-030)中重悬浮至1 x 106细胞/ml。重悬浮的NK细胞在37℃ 5％CO2下培养过夜。
在测定的当天，用PBS洗涤一瓶粘附的SKOV3靶细胞，用3ml胰蛋白酶(Cellgro,Cat # 25-053-CI)并在37ºC孵育2 - 5分钟而分离细胞。用包含10％FBS的23 ml RPMI减去酚红的培养基收集细胞并上下吸吹(pipetted)以分开团块。1800 rpm 5分钟离心收获的细胞，用包含10％FBS的RPMI减去酚红的培养基重悬浮至1 x 107细胞/ml的浓度。用100 μCi铬-51 (在正常盐水中5 mCi铬酸钠，Perkin Elmer, Cat # NEZ03005MC)标记靶细胞(1 x107细胞)。靶细胞在37℃孵育一小时，每隔15分钟振荡。1800 rpm 2分钟离心细胞，重悬浮于1ml 包含10％FBS的RPMI减去酚红的培养基中。用1ml 包含10％FBS的RPMI减去酚红的培养基将细胞额外地洗涤两次，每次洗涤之间以1800 rpm离心2分钟。最后洗涤之后，标记的靶细胞重悬浮于包含10％FBS的RPMI减去酚红的培养基中至2.5 x 105细胞/ml的终浓度。
在这些测定中使用的测试抗体是GFI 5.0中产生的抗HER2 mAb，GFI 6.0中产生的抗HER2 mAb F243A(GS6.0/F243A)，GFI 6.0中产生的抗HER2 mAb V264A(GS6.0/V264A)和GFI 6.0中产生的抗HER2 mAb F243A/V264A(GS6.0/F243A/V264A)。SKOV3靶细胞被标记的同时，在聚苯乙烯96孔板(Costar, Cat # 353077)中使用3倍系列滴定(在1 μg/ml开始)将测试抗体稀释于包含10％FBS的RPMI减去酚红的培养基中。将100 μl Cr-51标记的SKOV3靶细胞(= 25,000细胞)转移至单独的96孔测定板的孔中。制备抗体稀释板后，将10 μl每种稀释物转移至包含标记的靶细胞的96孔测定板。对于对照，将10 μl Triton-X100 (10%储存物, Fluka Analytical, Cat # 93443)或10 μl培养基分别加入“最大裂解”或“自发释放”对照孔。每个抗体稀释液进行一式两份测试，同时测试每个对照的6个重复。
1200 rpm 5分钟离心原代的NK细胞并轻轻重悬浮于包含10％FBS的RPMI减去酚红的培养基中至2.5 x 106细胞/ml。将100 μl NK细胞(= 250,000细胞)加入所有样品孔和“没有抗体”对照孔(即，排除“自发释放”和“最大裂解”对照)至效应物：靶标比为10:1。测定板在37℃ 5% CO2下孵育4小时。孵育后，以300 rpm将测定板离心5分钟。将30μl上清液加入96孔Picoplate (Perkin Elmer, Cat # 6005185)中的250 μl Microscint 20 (PerkinElmer, Cat # 6013621)。在Packard Top Count闪烁计数器中测定Cr-51释放。
如下计算百分比裂解：((ADCC实验释放 – 自发释放) / (最大释放 – 自发释放)) * 100
这些测定的结果如图14中所示。如图14中所示，当与母体的(野生型)抗体相比，F243A单突变蛋白抗体和V264A单突变蛋白抗体的ADCC活性有5-10倍降低；而当与母体的(野生型)抗体相比，F243A/V264A双突变蛋白抗体的ADCC活性有100倍降低。
实施例17
抗HER2抗体及其Fc突变蛋白的ADCC数据的统计分析
本研究的目的是，确定双突变型变体的百分比裂解就两种单一突变型变体而言是否是协同的。通过比较双突变型变体(第4组)和假设累加的参照曲线之间的ED50(对应于50％裂解的抗体水平)而进行测定(图15和表6中显示)。由于双突变体曲线的ED50的下限高于测定的最高抗体水平，并且远高于累加的参照曲线的ED50的上限，我们得出结论：双突变的效果远远超过累加的。
统计方法和结果：
目的是确定Herceptin抗体(GS6.0/F243A/V264A)的双突变变体是否显示相比于两种单突变变体(GS6.0/F243A和GS6.0/V264A)的协同效应。因此，我们使用4个抗体组：第1组(GS5.0)，第2组(GS6.0/F243A)，第3组(GS6.0/V264A)和第4组(GS6.0/F243A/V264A)。
在单独的96孔板上进行来自三位供体的数据。通过如下将值转换为裂解百分比而使来自每块板的观察结果归一化：
其中：Orc是在每块板的第r行和第c列中观察的响应。
ON是对于每块板的阴性对照的平均响应。
OP是对于每块板的阳性对照的平均响应。
然后将每个抗体水平和每个组的重复的％裂解值取平均值。
将来自所有四组和所有三位供体的数据共同地构建模型。我们假设“抗体水平-响应”关系遵循S形Hill方程(方程1)。我们使用(100％减去％裂解)作为我们的响应变量(Y)，对数抗体-水平作为解释变量(X)。为了比较各种突变的效力并拟合模型，对于每个组进行关于模型参数的一些假设。
使用的模型的形式假设：
1. 对于所有4个处理组，跨度(span)(a)和稳定水平(plateau)(d)是相同的。
2. 除了GS5.0组(允许其具有不同的斜率)，所有的处理组的斜率是相同的。
3. 对于不同的组的EC50参数(γ)是不同的。
Hill方程：
(方程1)
约束条件为:γ1=0,β1=0和β2 = β3 = β4= β
在这里：
Yij 是对于第j处理的第i响应(100-%裂解)
Xij是对应于Yij的抗体水平(对数标尺)
对于GS5.0，j =1 对于GS6.0/F243A，j = 2
对于GS6.0/V264A，j = 3 对于GS6.0/F243A/V264A，j = 4。
进一步假设，如果两种单突变体(GS6.0/F243A和GS6.0/V264A)是累加的，那么组合效应的方程将是：
(方程2)
其中参数a, d, γ, γ2, γ3, β和β0与方程1中相同。
使用SAS v9.2中的PROC NLIN拟合模型(方程1和方程2)。4个组的观察的数据值和拟合的曲线，以及组合的两个单突变组的假设的累加的参照曲线如图15中所示。ED50连同它们的置信区间(在原始标尺上)如表6中所示。
表 6
*估计值大于实验中的最高抗体水平。
为了评价GS6.0/F243A/V264A相比于两种单突变GS6.0/F243A和GS6.0/V264A的效果；将第4组的ED50与累加的参照曲线的ED50相比较。如果置信区间不重叠，那么可以得出结论：两个量是统计学差异的。
对于累加的参照曲线的ED50的95％置信区间为(0.3031，0.5455)，而第4组的ED50的估计值和置信区间均高于1(估计值在抗体水平的观察的范围之外) 。双突变的ED50的95％置信下限> 1，这远远高于参照的累加曲线(组合的第2&3组)的ED50的95％置信上限。因此，可以得出结论：两个量是显著差异的。
上述ED50的置信区间的比较等于比较γ4与总和(γ2 + γ3)，即，测试假设Ho:γ4= (γ2 + γ3)比替代假设Ha:γ4 > (γ2 + γ3)。
允许SSE简化和SSE完全分别是来自简化模型(the reduced model)和完全模型的残差平方和(the residual sum of squares)。通过将方程1拟合至数据而获得完全模型，而通过用(γ2 + γ3)取代方程1中的γ4而获得简化模型。
假设：
检验统计：
p-值：
由于p-值<0.0001，我们可以排除H0并得出结论γ4 > (γ2 + γ3)。
基于数据和模型的比较表明，与两种单突变的假设的组合效果相比，双突变GS6.0/F243A/V264A具有显著更低的％裂解。双突变的效果远远超过单突变的累加效果。
涉及本实施例的参考文献：
[1] SAS (r) Proprietary Software 9.2 (TS2M2), SAS Institute Inc.,Cary, NC, USA.
[2] ‘Application of the Four-Parameter Logistic Model to Bioassay:Comparison with Slope Ratio and Parallel Line Models’; Aage Vølund,Biometrics,Vol. 34, No.3 (Sep. 1978), pp. 357-365。
实施例18
抗TNFα Fc突变蛋白的构建和ADCC评价
使用下面列出的序列和方案进行巴斯德毕赤酵母中抗TNF单克隆抗体的双Fc突变蛋白(F243A/V264A)的制备。母体的(野生型)抗TNFα抗体的重链和轻链的序列如SEQ IDNO：10和11中所述。双突变蛋白抗TNFα抗体的重链的序列如SEQ ID NO：12中所述。野生型和双突变蛋白抗TNFα抗体的轻链序列是相同的。
通过PCR融合将α-接合因子前结构域的信号序列(SEQ ID NO:8)同框融合至轻链或重链的末端。该序列进行密码子优化并由Genscript (GenScript USA Inc., 860Centennial Ave. Piscataway, NJ 08854, USA)合成。以构建抗HER2 IgG1及其Fc突变蛋白类似的方式将重链和轻链都克隆进抗体表达载体中。
将具有融合的IgG1的信号序列的重链和轻链及其突变蛋白分别克隆进巴斯德毕赤酵母AOX1启动子之后以及酿酒酵母Cyc终止子之前。将完成的重链和轻链的表达盒一起放入最终的表达载体中。通过用Spe1线性化载体并靶向整合进Trp2位点而实现基因组***巴斯德毕赤酵母。质粒pGLY6964编码野生型抗TNFα IgG1抗体。质粒pGLY7715编码抗TNFαIgG1 F243A/V264A双突变蛋白。
用于产生抗TNFα及其Fc突变蛋白的糖工程化的毕赤GFI5.0 YGLY8316和GFI6.0YGLY 22834宿主。
用于表达抗TNFα抗体及其Fc突变蛋白的GFI5.0菌株YGLY16786的基因型如下：
。
用于表达抗TNFα Fc DM突变蛋白的工程化的巴斯德毕赤酵母GFI6.0菌株YGLY23423的基因型如下：
。
细胞如实施例4-7中所示转化，筛选并纯化。
抗TNFα Fc突变蛋白的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)评价
使用稳定表达TNFα的不可裂解的变体(其前12个氨基酸被去除)的Jurkat FlpIn靶细胞 - Jurkat FlpIn TNFα(∆1-12)靶细胞进行ADCC分析。通过用TNFα的不可分泌的细胞表面突变体(∆1-12 TNFα)转染Jurkat FlpIn人T-细胞白血病细胞(Invitrogen)而制备这些细胞。Perez等,Cell 63;251-258 (1990)。将∆1-12 TNFα DNA克隆进pcDNA5载体(Invitrogen)而用于转染。通过流式细胞仪验证细胞表面TNFα的表达。
在测定前一天，以1200 rpm离心12分钟沉淀原代NK效应细胞(BiologicalSpecialty, Cat # 215-11-10)，在补充10%热灭活的FBS (Sigma, Cat # F4135), 10 mMHepes (Gibco, Cat # 15630), 2 mM L-谷氨酰胺(Cellgro, Cat # 25-005-CI),和1X 青霉素/链霉素(Cellgro, Cat # 30-002-CI)的RPMI减去酚红的培养基(Invitrogen,catalog # 11835-030)中轻轻重悬浮至1 – 1.5 x 106细胞/ml。重悬浮的NK细胞在37℃5％CO2下培养过夜。
在测定当天，1200 rpm 5分钟离心Jurkat FlpIn TNFα (∆1-12)靶细胞，将细胞沉淀用补充5%热灭活的FBS的RPMI减去酚红的培养基轻轻重悬浮至2 x 106细胞/ml的浓度。用25 μl DELFIA BATDA标记试剂(来自DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒, Perkin Elmer,Cat # AD0116)标记细胞。轻轻混合细胞并在37℃孵育20分钟，每隔10分钟轻轻混合。用包含1.5 mM对一苯甲酸(probenicid, Invitrogen, Cat # P36400)的DPBS将细胞体积调整至30 ml，在1200 rpm离心5分钟。用30 ml包含1.5 mM对一苯甲酸的DPBS将细胞洗涤三次，每次洗涤之间以1200 rpm离心5分钟。最后洗涤之后，标记的靶细胞重悬浮于补充5%热灭活的FBS和1.5 mM对一苯甲酸的RPMI减去酚红的培养基中至2.5 x 105细胞/ml的终浓度。
在测定中使用的测试抗体为：GFI 5.0中产生的抗TNF IgG1野生型抗体(命名为“GFI774”)，GFI 5.0中产生的非唾液酸化的抗TNF IgG1抗体(GFI774) F243A/V264A和GFI6.0中产生的唾液酸化的抗TNF IgG1抗体(GFI774) F243A/V264A。GFI 5.0中产生的非唾液酸化的抗TNF IgG1抗体- F243A/V264A包含如下糖形式：84% G2, 2% G1和14%杂合的N-聚糖。GFI 6.0中产生的唾液酸化的抗TNF IgG1抗体- F243A/V264A包含如下糖形式：27% A1,50.6% A2, 和5.7 % A1杂合的(总共多于83%的N-聚糖被唾液酸化。
Jurkat FlpIn TNFα (∆1-12)靶细胞被标记的同时，在96孔聚丙烯圆底板(Costar, Cat # 5699; lids - Costar Cat # 3931)中使用3倍系列滴定(在40 μg/ml开始)将2X浓度的抗体稀释于补充5%热灭活的FBS和1.5 mM对一苯甲酸的RPMI减去酚红的培养基中。制备稀释板后，将100 μl每种2X稀释物转移至新的96孔圆底聚丙烯板(对于“没有抗体”对照，仅转移100 μl培养基)。对于“自发释放”和“最大裂解”对照(150 μl/孔)以及“背景”对照(200 μl/孔)，也将补充5%热灭活的FBS和1.5 mM对一苯甲酸的RPMI减去酚红的培养基转移至96孔板。每个抗体稀释液进行一式两份测试，同时一式四份测试每个对照。
将50 μl铕标记的Jurkat FlpIn TNFα (∆1-12)细胞(= 12,500细胞)加入除“背景”对照以外的所有孔并轻轻混合。1200 rpm 12分钟离心原代的NK细胞并轻轻重悬浮于补充5%热灭活的FBS和1.5 mM对一苯甲酸的RPMI减去酚红的培养基中至2.5 x 106细胞/ml。将50 μl NK细胞(= 125,000细胞)加入所有样品孔(即，排除“自发释放”，“最大裂解”和“背景”对照)至效应物：靶标比为10:1。轻轻混合样品，测定板在37℃孵育两小时。1小时15分钟后，将10 μl 20% Triton-X100 (Pierce Surfact-Amps X-100, Cat # 28314)或10 μl培养基分别加入“最大裂解”或“自发释放”对照孔。将板在37℃孵育额外的45分钟(总孵育时间为2小时)。板孵育的同时，在室温平衡DELFIA铕溶液(来自DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒)。两小时孵育后，以1500 rpm将测定板离心5分钟。将20μl上清液转移至白色的平底透明板(来自DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒或Costar, Cat # 3632)，注意不要引入气泡。将200μl DELFIA铕溶液加入每个孔，用铝箔密封覆盖板。测定板在室温下孵育15分钟，轻轻振荡。使用设置为阅读铕的Perkin Elmer Envision仪器测定荧光。
如下计算百分比裂解：
1) 从所有的原始值减去背景对照的平均值，
2) 如下计算ADCC活性的%：((ADCC实验值 – 自发释放) / (最大裂解 – 自发释放)) * 100
以及
3) 根据步骤2的% ADCC活性减去“没有抗体”对照计算最后的％裂解值。
这些测定的结果如图16中所示。如图16中所示，与GS5.0中产生的母体的(野生型)多肽相比，非唾液酸化的和唾液酸化的抗TNFα IgG1 - F243A/V264A双突变蛋白的ADCC具有多于1000倍的降低。
实施例19
抗TNFα双Fc突变蛋白的补体依赖性细胞毒性(CDC)评价
使用稳定表达TNFα的不可裂解的变体(其前12个氨基酸被去除)的HEK293 FlpIn细胞进行CDC分析。HEK293 FlpIn TNFα (∆1-12)细胞在组织培养瓶中补充10%热灭活的FBS (Sigma, Cat # F4135), 100 ug/ml潮霉素B (Cellgro, Cat # 30-240-CR),和L-谷氨酰胺(Cellgro, Cat # 25-005-CI)的减去酚红的Dulbecco's Minimal EssentialMedia (DMEM)(Gibco, Cat # 21063)中生长至70％汇合。细胞用2ml胰蛋白酶(Cellgro,Cat # MT25-053-CI)处理，用8 ml包含10％热灭活的FBS的减去酚红的DMEM培养基收获，并以1200rpm离心10分钟。除去上清液，细胞沉淀重悬浮于包含10％热灭活的减去酚红的DMEM培养基中至4 x 105细胞/ml的浓度。将细胞置于具有透明底的96孔黑色板(Costar, Cat #3603)中的100 μl (40,000细胞)/孔中，并在37℃ 5% CO2下孵育过夜。
在测定中使用的测试抗体为：GFI 5.0中产生的抗TNF IgG1抗体(命名为“GFI774”)，GFI 5.0中产生的抗TNF IgG1抗体(GFI774) F243A/V264A，和GFI 6.0中产生的抗TNF IgG1抗体(GFI774) F243A/V264A。(这些抗体如实施例18中所述。)在测定的当天，用多通道移液器从96孔板吸出培养基并用50 μl 包含1X青霉素/链霉素的DMEM减去酚红的培养基替换。在包含1X 青霉素/链霉素, 10 μg/ml抗人CD55小鼠IgG1单克隆抗体(IBGRLResearch Products, Clone BRIC216, Cat # 9404P)和10 μg/ml抗人CD59小鼠IgG2b单克隆抗体(IBGRL Research Products, Clone BRIC 229, Cat # 9409P)的DMEM减去酚红的培养基中制备试验抗体的2倍系列滴定液(在30 μg/ml开始)。将50 μl稀释的抗体加入适当的测定板孔。测定阴性对照是单独的测定培养基和测定的DMEM减去酚红的培养基中稀释的人IgG(Jackson ImmunoResearch, Cat # 009-000-003)(包含CD55和CD59抗体)。测定裂解对照是测定的DMEM减去酚红的培养基(包含CD55和CD59抗体)中稀释的0.25% Triton X100(10%储存物, Fluka, Cat # 93443)。每个测试抗体浓度进行一式两份测试，同时测定对照进行一式三份测试。通过轻轻敲击混合包含试验样品的测定板，并将该板在37℃孵育约10分钟，同时制备人补体血清。用3 ml包含1X青霉素/链霉素的DMEM减去酚红培养基1:2稀释3ml人补体(QUIDEL, Cat # A113)，将50 μl稀释的补体加入测定板孔。通过轻轻敲击混合测定板，将板在37℃ 5% CO2下孵育4小时。通过用包含1X青霉素/链霉素的DMEM减去酚红培养基稀释100%储存物而制备40%阿尔玛蓝溶液(Biosource, Cat # DAL1100)，将50 μl稀释的阿尔玛蓝溶液加入测定板孔(=最终的10%)。通过轻轻敲击混合测定板，将板在37℃ 5% CO2下孵育过夜(15-20小时)。第二天，在室温下在振荡器上孵育测定板10分钟，在544 nm激发和590 nm发射时阅读荧光。如下计算百分比CDC：(1 - (样品原始荧光单位(RFU) - TritonRFU)/(培养基RFU - Triton RFU))* 100
这些测定的结果如图17中所示。如图17中所示，与母体的(野生型)抗体相比，非唾液酸化的和唾液酸化的抗TNFα IgG1 - F243A/V264A双突变蛋白的CDC活性具有约10倍的降低。
实施例20
抗TNFα抗体及其Fc突变蛋白在胶原-抗体诱导的关节炎(AIA)模型中的影响
模型诱导：用由识别各种物种的II型胶原上的保守表位的5种单克隆抗体克隆A2-10 (IgG2a), F10-21 (IgG2a), D8-6 (IgG2a), D1-2G(IgG2b), 和D2-112 (IgG2b)的鸡尾酒组成的商售的Arthrogen-CIA®致关节炎的单克隆抗体(购自Chondrex)诱导AIA(抗体诱导的关节炎)。
动物：使用10周龄B10.RIII雄性小鼠，其在没有额外的共刺激因子的情况下易于诱导关节炎。这些动物购自Jackson Laboratory。
临床评分：诱导关节炎后每天测量足肿胀。如下以0-3等级对每个足部进行疾病严重性的分级：0，正常; 1，一个足趾的肿胀; 2，两个或更多个足趾的肿胀；3，整个足部的肿胀。每只小鼠的最大临床评分为12。
研究设计：在第0天，通过被动转移3 mg抗CII mAb病原体鸡尾酒IV而诱导关节炎。
使用下列试剂皮下地处理小鼠组：
组/试剂 Lot 剂量
A. 未处理的 *** ***
B. 同种型IgG1 78ABY 33mpk
C. 未唾液酸化的抗-TNF 36ADV 33mpk
D. α2,6唾液酸化的抗-TNF 37ADV 33mpk
E. mTNFR-Ig 82ABW 33mpk
F. GAMMAGARD 84ADU 33mpk
G. GAMMAGARD 84ADU 1000mpk
H. HUMIRA 85ADU 33mpk
除了组A和H n=3以外，对于所有组n=5。
使用同种型IgG1抗体作为对照。结合于小鼠抗六聚体的抗体具有命名“27F11”。
鉴别为“未唾液酸化的抗TNF”的样品对应于如实施例18中所述的GFI 5.0中产生的包含F243A/ V264A突变的抗TNF抗体。鉴别为“α2,6唾液酸化的抗TNF”的样品对应于实施例18中所述的GFI 6.0中产生的包含F243A/ V264A突变的抗TNF抗体。GFI 5.0中产生的非唾液酸化的抗TNF IgG1抗体- F243A/V264A包含如下糖形式：84% G2, 2% G1和14%杂合的N-聚糖。GFI 6.0中产生的唾液酸化的抗TNF IgG1抗体- F243A/V264A包含如下糖形式：27%A1, 50.6% A2, 和5.7 % A1杂合的(总共多于83%的N-聚糖被唾液酸化。
mTNFR-Ig是CHO细胞中产生的包含连接至在铰链处开始并横跨CH2和CH3区的mIgG1 Fc 的mTNFR2的胞外结构域并包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的免疫黏附素(抗TNF受体Ig融合蛋白)。
GAMMAGARD液体购自Baxter Corp。
HUMIRA购自Abbott Labs。HUMIRA包含具有非常少的末端半乳糖的非唾液酸化的N-聚糖。
在第-1天和第7天对所有组小鼠给药，除了mTNFR-Ig在第-1，+3和+7天接受总共三次剂量。监测临床评分，持续14天。
这些实验的结果如图18A和18B中所示。在本研究中，GAMMAGARD并没有表现出临床效力。Mu-TNF-Ig在5只小鼠中的4只中表现出良好的保护免于疾病。HUMIRA具有与对照IgG1非常相似的疾病动力学。未唾液酸化的抗-TNF表现出疾病的一些回复(dampening)。α2,6唾液酸化的抗-TNF在5只小鼠中的5只中表现出良好的疾病保护，评分与抗-TNF治疗相当。
基因表达分析：通过来自同种型、a2,6唾液酸化的mAb或mTNFR-Ig处理的小鼠(每组n = 4)的后足的RT/PCR分析测定炎症和骨重塑基因的表达。为了进行定量PCR，用RNASTAT-60 (Tel-Test, Friendswood, TX, USA)从后足分离总RNA。总RNA(5 µg)进行DNase(Roche)处理。用Superscript II (Gibco/BRL)将DNase处理的总RNA反转录。引物用PrimerExpress(PE Biosystems)设计，或从Applied Biosystems商业上获得。
使用两种方法之一进行来自每份样品的10 ng cDNA的实时定量PCR。在第一种方法中，采用ABI 5700仪器，在Perkin Elmer SYBR绿色实时定量PCR测定中以400 nM使用两种基因特异性的未标记的引物。在第二种方法中，在ABI 7700序列检测***上，在TAQMAN™实时定量PCR中使用每种900 nM的两种未标记的引物和250 nM FAM标记的探针(AppliedBiosystems)。使用识别CD4启动子的基因组区域的引物验证不存在基因组DNA污染 – 将具有实时PCR可检测的DNA污染的样品从研究中排除。对于每份样品使用泛素和感兴趣的基因的平均循环阈(Ct)值，泛素水平在单独的反应中测定并用于通过Δ − Δ Ct方法使数据归一化；使用方程1.8 e (Ct泛素 - Ct感兴趣的基因) x 104以获得归一化的值。结果如表7中所示。显示的数据是炎症/骨重塑基因表达相对于未处理的对照小鼠的后足中基因表达的增加倍数。
表 7
相对于未处理的小鼠的诱导倍数
实施例21
抗TNFα抗体或其Fc突变蛋白在胶原抗体诱导的关节炎(AIA)模型中的影响
在本实施例中重复实施例20中所述的实验，除了静脉内施用GAMMAGARD (而皮下施用所有其它试剂)。
研究设计：如实施例20中所述诱导关节炎。
在第-1天对所有组小鼠给药，除了mTNFR-Ig在第-1和+3天接受总共两次剂量。监测临床评分，持续7天。
使用下列试剂治疗小鼠组：
组/试剂 Lot 剂量
未处理的 *** ***
同种型IgG1 78ABY 33mpk
未唾液酸化的抗-TNF 36ADV 33mpk
α2,6唾液酸化的抗-TNF 37ADV 33mpk或6.6mpk
α2,3唾液酸化的抗-TNF 19ADX 33mpk
mTNFR-Ig 82ABW 33mpk
GAMMAGARD 84ADU 1000mpk
HUMIRA 85ADU 33mpk
18 ADX PNG Humira 18ADX 33mpk
20 ADX No Glyco 20ADX 33mpk
对于所有组，每组n=5。
试剂：“同种型IgG1”，“未唾液酸化的抗TNF”，“ α2,6唾液酸化的抗-TNF, mTNFR-Ig , GAMMAGARD和HUMIRA如实施例20中所述。
鉴别为“α2,3唾液酸化的抗TNF”的试剂对应于实施例18中所述的GFI 6.0中产生的包含F243A/ V264A的抗TNF抗体，其用神经氨酸酶体外处理以去除α2,6连接的唾液酸，并用α2,3唾液酸转移酶进一步体外处理。简而言之，纯化的抗体(4-5 mg/ml)在试剂缓冲液中，其每1ml包含6.16 mg氯化钠，0.96 mg脱水磷酸二氢钠，1.53 mg磷酸氢二钠二水合物，0.30 mg柠檬酸钠，1.30 mg柠檬酸一水合物，12 mg甘露醇，1.0 mg聚山梨酯80，并调整pH至5.2。将神经氨酸酶(10mU/ml)加入抗体混合物，并在37℃孵育至少5小时，或直到完成去唾液酸化。将去唾液酸化的材料应用于CaptoMMC(GE Healthcare)柱纯化，以除去神经氨酸酶并以4mg/ml配制在唾液酸转移酶缓冲液(50 mM Hepes pH 7.2 150 mM NaCl, 2.5 mMCaCl2, 2.5mM MgCl2, 2.5mM MnCl2)中。使用毕赤酵母中表达并通过his-标签纯化的小鼠α2,3唾液酸转移酶重组酶用于α2,3唾液酸延伸。在1.2mg/ml Protease InhibitorCocktail (Roche™ , cat # 11873580001)存在的情况下将酶混合物配制在PBS中。在唾液酸化反应之前，将胃酶抑素(50 ug/ml)，胰凝乳蛋白酶抑制剂(2mg/ml)和10mM CMP-唾液酸加入酶混合物中，随后通过0.2μm过滤器灭菌。将1ml酶混合物加入10ml去唾液酸化的材料。反应在37℃进行8小时。通过ESI-Q-TOF以质量测定验证唾液酸化产量。使用MabSelect(GE Healthcare)纯化最终的材料，并配制在上述缓冲液中并无菌过滤(0.2μm膜)。
鉴别为“18 ADX PNG Humira”的试剂对应于实施例18中所述的GFI 6.0中产生的包含F243A/ V264A的抗TNF抗体，其用PNG'ase F体外处理以去除所有N-聚糖。PNGase F酶得自Prozyme, Inc.，在pH 7.4以2μl商售酶比4 mg IgG1的化学计量使用。使用Mabselect(GE Healthcare)纯化消化的材料。配制最终的材料并无菌过滤(0.2μm膜)。
鉴别为“20 ADX No Glyco”的试剂对应于实施例18中所述的在GFI5.0 YGLY8316中产生的野生型的抗-TNF抗体，其在297位包含单一的突变(这导致没有糖基化)。通过在Sorvall Evolution RC (kendo, Asheville, NC)中13,000 g离心15 min而使产生这种抗体的菌株澄清。使用MabSelect(GE Healthcare)以及随后用Capto MMC (GE Healthcare)的表面处理步骤(polishing step)而进行捕获步骤。配制最终的材料并无菌过滤(0.2μm膜)。
这些实验的结果如图19A和19B中所示。
基因表达分析：通过RT/PCR分析测定炎症和骨重塑基因的表达。为了进行定量PCR，用RNA STAT-60 (Tel-Test, Friendswood, TX, USA)从后足分离总RNA。总RNA(5 µg)进行DNase (Roche)处理。用Superscript II (Gibco/BRL)将DNase处理的总RNA反转录。引物用Primer Express(PE Biosystems)设计，或从Applied Biosystems商业上获得。
使用两种方法之一进行来自每份样品的10 ng cDNA的实时定量PCR。在第一种方法中，采用ABI 5700仪器，在Perkin Elmer SYBR绿色实时定量PCR测定中以400 nM使用两种基因特异性的未标记的引物。在第二种方法中，在ABI 7700序列检测***上，在TAQMAN™实时定量PCR中使用每种900 nM的两种未标记的引物和250 nM FAM标记的探针(AppliedBiosystems)。使用识别CD4启动子的基因组区域的引物验证不存在基因组DNA污染 – 将具有实时PCR可检测的DNA污染的样品从研究中排除。对于每份样品使用泛素和感兴趣的基因的平均循环阈(Ct)值，泛素水平在单独的反应中测定并用于通过Δ − Δ Ct方法使数据归一化；使用方程1.8 e (Ct泛素 - Ct感兴趣的基因) x 104以获得归一化的值。结果如表8中所示。显示的数据是炎症/骨重塑基因表达相对于未处理的对照小鼠的后足中基因表达的增加倍数。
表 8
相对于未处理的小鼠的诱导倍数
实施例22
抗-TNF抗体和突变蛋白的FcγR结合测定
使用实施例18中所述的抗-TNF抗体，如实施例1中所述进行Fcγ受体结合测定。结果如图20以及表9-10中所示。
表 9
与GS 5.0中产生的野生型(母体)抗体相比的与Fcγ受体结合的降低
↓表示降低的亲和力倍数
↑表示增加的亲和力倍数。
表 10
与商售的HUMIRA相比的与Fcγ受体结合的降低
↓表示降低的亲和力倍数
↑表示增加的亲和力倍数。
实施例23
额外的抗Her2 Fc双突变蛋白(在243/264位)和它们的N-聚糖组合物的构建
使用Stratagene QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit Catalog #200518 (30个反应)并根据该试剂盒提供的用于以简并引物处理饱和诱变的方案构建实施例2中所述的Her2 IgG1抗体的额外的Fc双突变蛋白。将α-接合因子前结构域的信号序列同框融合至轻链和重链的5'末端。将产生的具有融合的IgG1的信号序列的重链和轻链及其突变蛋白分别克隆进巴斯德毕赤酵母AOX1启动子之后以及酿酒酵母Cyc终止子之前。将完成的重链和轻链的表达盒一起放入最终的表达载体中。
在糖工程化的毕赤酵母GFI6.0宿主细胞YGLY3582和YGLY22812中表达载体。
表 11
菌株 描述
YGLY4563 制备抗Her2 F243A/V264A双突变蛋白的GFI6.0宿主YGLY3582菌株
YGLY23294 制备抗Her2 F243Y/V264G双突变蛋白的GFI6.0宿主YGLY22812菌株
YGLY23280 制备抗Her2 F243T/V264G双突变蛋白的GFI6.0宿主YGLY22812菌株
YGLY23301 制备抗Her2 F243L/V264A双突变蛋白的GFI6.0宿主YGLY22812菌株
YGLY25259 制备抗Her2 F243L/V264N双突变蛋白的GFI6.0宿主YGLY22812菌株
YGLY23305 制备抗Her2 F243V/V264G双突变蛋白的GFI6.0宿主YGLY22812菌株
GFI6.0 YGLY3582菌株的基因型如实施例4中所述(与YGLY4563相同)。
用于表达抗TNFα Fc DM突变蛋白的工程化的巴斯德毕赤酵母GFI 6.0 YGLY22812菌株的基因型如下：
YGLY23305具有相同的基因型，除非它们表达表11中列出的不同的突变蛋白。
该菌株用300ml 2% BMGY培养基在500ml摇瓶中培养并在24℃振摇3天。
用于诱导摇瓶的方案：将每个培养物的总体积(300ml)收集进falcon管并在2500rpm离心5分钟。倒掉上清液并将细胞沉淀重悬浮于150ml 2% BMMY和360ul PMTi4(储存物浓度0.65mg/ml)的终体积中。转移至新的500ml摇瓶并在24℃振摇2天。向下离心诱导的培养物并将上清液收集至新的falcon管中。
使用GE Healthcare, STREAMLINE rProtein A (catalog No.17-1281-01)和BioRad多制备色谱柱(10ml) (catalog No.731-1550)通过蛋白A柱纯化分泌的抗体。使用下列缓冲液：
· 洗涤缓冲液 #1: 20mM Tris pH 7.0, 1M NaCl
· 洗涤缓冲液 #2: 20mM Tris pH 7.0
· 中和缓冲液: 1M Tris pH 8.0- pH 9.0
· 洗脱缓冲液: 100 mM或50 mM柠檬酸钠pH 3.0
· 清洗溶液: 水中的6M尿素。
纯化方案如下：
· 将500ul of STREAMLINE rProtein A珠粒加入每个BioRad柱。珠粒应当在20％乙醇中。珠粒浆的组成应当是50％珠粒，50％液体。
· 一旦蛋白A珠粒在柱中，它们应当用5ml洗涤缓冲液#2洗涤 (丢弃流出物)
· 将10ml上清液加入BioRad柱。在此步骤期间，抗体将结合蛋白A珠粒。(丢弃流出物)
· 通过将5ml洗涤缓冲液#1加入柱而洗掉不需要的过量蛋白。(丢弃流出物)
· 通过加入5ml洗涤缓冲液#2而再次洗柱(丢弃流出物)
· 将1ml中和缓冲液加入15ml蛋白收集管。
· 将BioRad置于15ml收集管中。
· 将3ml洗脱缓冲液加入BioRad柱。这将从蛋白A珠粒去除不需要的抗体。
· 在15ml蛋白收集管中收集洗脱的蛋白。
· 通过Bradford分析测定洗脱的蛋白的浓度(使用10ul蛋白用于Bradford测定)。
为了定量每种糖形式的相对量，用2-氨基联苯胺(2-AB)标记N-糖苷酶F释放的聚糖并如Choi等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5022-5027 (2003)和Hamilton等,Science313:1441-1443 (2006)中所述通过HPLC分析。表12显示了产生的抗体的聚糖模式(NQP =不可能定量)。
表 12
使用实施例11中所述的方法来测定上述突变体与各种Fcγ受体的结合。结果如图21以及表13和14中所示。
表 13
与F243A/V264A双突变蛋白相比的结合亲合力
表 14
与商业上可获得的Herceptin相比的结合亲合力
实施例23
抗PCKS9母体的抗体及Fc突变蛋白
还构建了具有SEQ ID NO:13的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:14的轻链氨基酸序列的抗PCKS9抗体，如实施例2中所述引入重链的突变F243A和V264A。抗PCSK9双突变蛋白的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:15中所示。抗体的野生型和双突变蛋白形式在糖工程化的酵母毕赤GFI5.0和GFI6.0中表达，并根据实施例3-7中所述的操作进行纯化，并使用实施例11中所述的操作测定它们结合各种Fcγ受体的能力。当与母体抗体(GFI5.0中产生)相比时，抗PCSK9双突变蛋白抗体(GFI6.0中产生的，包含SEQ ID NO:15的重链氨基酸序列和SEQ IDNO:14的轻链氨基酸序列)在结合FcγRI中具有约4倍的降低，在结合FcγRIIIa LF中具有8-60倍的降低，在结合FcγRIIIa LV中具有2-6倍的降低以及与FcγRIIa或FcγRIIb/c没有可检测的结合。
实施例24
抗Her2抗体及其Fc突变蛋白在胶原-抗体诱导的关节炎(AIA)模型中的影响
模型诱导：用由识别II型胶原的各个物种上的保守表位的5种单克隆抗体克隆A2-10 (IgG2a), F10-21 (IgG2a), D8-6 (IgG2a), D1-2G(IgG2b), 和D2-112 (IgG2b)的鸡尾酒组成的商售的Arthrogen-CIA®致关节炎的单克隆抗体(购自Chondrex)诱导AIA(抗体诱导的关节炎)。
动物：使用10周龄B10.RIII雄性小鼠，其在没有额外的共刺激因子的情况下易于诱导关节炎。这些动物购自Jackson Laboratory。
临床评分：诱导关节炎后每天测量足肿胀。如下以0-3等级对每个足部进行疾病严重性的分级：0，正常; 1，一个足趾的肿胀; 2，两个或更多个足趾的肿胀；3，整个足部的肿胀。每只小鼠的最大临床评分为12。
研究设计：在第0天，通过被动转移3 mg抗CII mAb病原体鸡尾酒IV而诱导关节炎。
在第-1天对所有组的小鼠给药。监测临床评分，持续7天。
使用下列试剂皮下地处理小鼠组：
组/试剂 Lot 剂量
A. 未处理的 *** ***
B. 同种型IgG1 78ABY 33mpk
C. 未唾液酸化的抗-Her2 38ADV 33mpk
D. α2,6唾液酸化的抗- Her2 37ADV 33mpk
E. muTNFR-Ig 82ABW 33mpk
除了组E n=4以外，所有组n=5。
使用同种型IgG1抗体作为对照。结合于小鼠抗六聚体的抗体具有命名“27F11”。
鉴别为“未唾液酸化的抗Her2”的样品对应于GFI 5.0菌株YGLY19709中产生的包含F243A/ V264A突变的抗Her2抗体。YGLY19709菌株源自表达抗Her2抗体的菌株YGLY13979，所述菌株YGLY13979由用于表达LsSTT3d的质粒pGLY630转化。菌株YGLY13979和质粒pGLY6301如专利申请：WO 2010/099186中所述。
鉴别为“α2,6唾液酸化的抗Her2”的样品对应于GFI 6.0菌株YGLY4563中产生的包含F243A/ V264A突变的抗Her2抗体(见实施例4)。
mTNFR-Ig是CHO细胞中产生的包含连接至在铰链处开始并横跨CH2和CH3区的mIgG1 Fc 的mTNFR2的胞外结构域并包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的免疫黏附素(抗TNF受体Ig融合蛋白)。
这些实验的结果如图22中所示。
序列表
尽管本文描述了本发明的说明性实施方案，但是应当理解的是，本发明不限于此。具有本领域普通技术以及接受本文教导的人员将认识到在其范围内的额外的改进和实施方案。
序列表
<110> Stadheim, Terrance A.
Zha, Dongxing
Liu, Liming
<120> 制备具有改进特性的抗体的方法
<130> GFI-MIS-0003
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
ggtccttccg tttttttggc cccaccaaag ccaaaggaca ctttg 45
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
gtgtcctttg gctttggtgg ggccaaaaaa acggaaggac cacc 44
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
gttacatgtg ttgttgctga cgtttctcac gag 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
ggtcctcgtg agaaacgtca gcaacaacac atg 33
<210> 7
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 7
gaattcgaaa cgatgagatt tccttcaatt tttactgctg ttttattcgc agcatcctcc 60
gcattagct 69
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 8
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala
<210> 9
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Ala Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ala Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 10
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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275 280 285
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Pro Gly
450
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 12
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
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Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Ala Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ala Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
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435 440 445
Pro Gly
450
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<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Ala Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Gly Ile Ile Thr Glu Ile Ala Glu Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 14
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
His Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 15
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Ala Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Gly Ile Ile Thr Glu Ile Ala Glu Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Ala Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ala Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 16
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc融合蛋白
<400> 16
Val Val Leu Thr Pro Tyr Lys Pro Glu Pro Gly Tyr Glu Cys Gln Ile
1 5 10 15
Ser Gln Glu Tyr Tyr Asp Arg Lys Ala Gln Met Cys Cys Ala Lys Cys
20 25 30
Pro Pro Gly Gln Tyr Val Lys His Phe Cys Asn Lys Thr Ser Asp Thr
35 40 45
Val Cys Ala Asp Cys Glu Ala Ser Met Tyr Thr Gln Val Trp Asn Gln
50 55 60
Phe Arg Thr Cys Leu Ser Cys Ser Ser Ser Cys Thr Thr Asp Gln Val
65 70 75 80
Glu Ile Arg Ala Cys Thr Lys Gln Gln Asn Arg Val Cys Ala Cys Glu
85 90 95
Ala Gly Arg Tyr Cys Ala Leu Lys Thr His Ser Gly Ser Cys Arg Gln
100 105 110
Cys Met Arg Leu Ser Lys Cys Gly Pro Gly Phe Gly Val Ala Ser Ser
115 120 125
Arg Ala Pro Asn Gly Asn Val Leu Cys Lys Ala Cys Ala Pro Gly Thr
130 135 140
Phe Ser Asp Thr Thr Ser Ser Thr Asp Val Cys Arg Pro His Arg Ile
145 150 155 160
Cys Ser Ile Leu Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Thr Asp Ala Val Cys
165 170 175
Ala Pro Glu Ser Pro Thr Leu Ser Ala Ile Pro Arg Thr Leu Tyr Val
180 185 190
Ser Gln Pro Glu Pro Thr Arg Ser Gln Pro Leu Asp Gln Glu Pro Gly
195 200 205
Pro Ser Gln Thr Pro Ser Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Thr Pro Ile
210 215 220
Ile Glu Gln Ser Thr Lys Gly Gly Gly Ser Val Pro Arg Asp Cys Gly
225 230 235 240
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
275 280 285
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
305 310 315 320
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
325 330 335
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340 345 350
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
355 360 365
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
370 375 380
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
405 410 415
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
420 425 430
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
435 440 445
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 17
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 组氨酸标签的蛋白
<400> 17
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro
85 90 95
Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg
100 105 110
Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly
115 120 125
Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn
130 135 140
Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu
145 150 155 160
Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln
165 170 175
Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys
180 185 190
His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn
195 200 205
Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro
210 215 220
Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile
225 230 235 240
Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala
245 250 255
Pro Gly Gly Gly His His His His His His His His His
260 265
<210> 18
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc区
<400> 18
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 19
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc区
<400> 19
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230

Claims (18)

1.包含Fc的多肽，其包含SEQ ID NO:18，其中所述包含Fc的多肽包含Fc区的243和264位氨基酸的突变，其中所述包含Fc的多肽是包含唾液酸化的N-聚糖的抗体或抗体片段，并且其中所述突变为F243A和V264A，其中根据如Kabat中的EU索引编号。
2.权利要求1的包含Fc的多肽，其中所述唾液酸化的N-聚糖中的唾液酸残基通过α-2,6连接而连接。
3.权利要求1-2中任一项的包含Fc的多肽，其中所述包含Fc的多肽中至少70摩尔％的N-聚糖具有选自SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc((2-4)Man3GlcNAc2的结构。
4.权利要求1-2中任一项的包含Fc的多肽，其中所述包含Fc的多肽中至少90摩尔％的N-聚糖具有选自SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc((2-4)Man3GlcNAc2的结构。
5.权利要求1-2中任一项的包含Fc的多肽，其中所述包含Fc的多肽中至少66摩尔％的N-聚糖具有NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构。
6.权利要求1-5中任一项的包含Fc的多肽，其中当与母体的包含Fc的多肽相比时，所述包含Fc的多肽具有下列特性中的一种或多种：
a) 降低的效应功能，
b) 增加的抗炎特性，
c) 增加的唾液酸化，
d) 当肠胃外施用时增加的生物利用度，以及
e) 与FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa结合的降低。
7.在宿主细胞中产生包含Fc的多肽的方法，包括：
a) 提供已经被基因工程化以生产包含Fc的多肽的基因修饰的细胞，其中所述包含Fc的多肽是包含唾液酸化的N-聚糖的抗体或抗体片段，其中所述宿主细胞包含编码所述包含Fc的多肽的Fc区的243和264位氨基酸的突变的核酸，其中所述突变为F243A和V264A，其中根据如Kabat中的EU索引编号；
b) 在引起所述包含Fc的多肽的表达的条件下培养所述宿主细胞；以及
c) 从所述宿主细胞分离所述包含Fc的多肽。
8.权利要求7的方法，其中所述唾液酸化的N-聚糖中的唾液酸残基通过α-2,6连接而连接。
9.权利要求7-8中任一项的方法，其中所述包含Fc的多肽具有N-聚糖组成，其中相对于母体的包含Fc的多肽，总的唾液酸化的N-聚糖的量和百分比增加。
10.权利要求7-8中任一项的方法，其中所述包含Fc的多肽中至少70摩尔％的N-聚糖具有选自SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc((2-4)Man3GlcNAc2的结构。
11.权利要求7-8中任一项的方法，其中所述包含Fc的多肽中至少90摩尔％的N-聚糖具有选自SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc((2-4)Man3GlcNAc2的结构。
12.权利要求7-8中任一项的方法，其中所述包含Fc的多肽中至少66摩尔％的N-聚糖具有NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构。
13.权利要求7-12中任一项的方法，其中当与母体的包含Fc的多肽相比时，所述包含Fc的多肽具有下列特性中的一种或多种：
a) 降低的效应功能，
b) 增加的抗炎特性，
c) 增加的唾液酸化，
d) 当肠胃外施用时增加的生物利用度，以及
e) 与FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa结合的降低。
14.增加包含Fc的多肽的抗炎特性或降低其细胞毒性的方法，包括在Fc区的243和264位引入突变，其中所述突变为F243A和V264A，其中根据如Kabat中的EU索引编号；且
其中当与母体的包含Fc的多肽相比时，所述包含Fc的多肽具有增加的抗炎特性或降低的细胞毒性。
15.权利要求14的包含Fc的多肽在制备药物中的用途，所述药物用于在需要治疗的受试者中治疗炎症状况。
16.包含Fc的多肽，其包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
17.包含Fc的多肽，其包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
18.包含Fc的多肽，其包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
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