JP4861830B2 - 糖タンパク質の産生において、グリカンのマンノシルリン酸化を除去する方法 - Google Patents
糖タンパク質の産生において、グリカンのマンノシルリン酸化を除去する方法 Download PDFInfo
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- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
Description
本願は、2003年12月24日に出願された、米国仮特許出願第60/532,461号の優先権を主張するものであり、本明細書中にてその全体が参考として援用される。
本発明は、商務省からの助成金、NIST−ATP協同協定番号(Cooperative Agreement Number)70NANB2H3046の下で、少なくとも一部分の資金を供給された。従って、米国政府は本発明に特定の権利を有し得る。
本発明は、糖タンパク質のグリカン上へのマンノシルリン酸転移の除去に関し、そしてさらに、酵母細胞および糸状菌細胞における、グリカン上へのマンノシルリン酸残基の付加を引き起こす遺伝子の除去に関する。特に、本発明は、マンノシルリン酸残基を有さないグリカンを産生する、酵母宿主細胞および糸状菌宿主細胞の操作に関する。
組換えヒトタンパク質を産生する能力によって、ヒトの健康管理において重要な進歩がもたらされ、そして、薬物の発見は活発な分野であり続ける。多くの治療的タンパク質は、ヒト血清における適切な構造機能活性、およびそれに伴う安定性を確実にするために、そのタンパク質の特定のアスパラギン残基への、共翻訳のグリカンの付加(N−グリコシル化)を必要とする。ヒトにおける治療的使用のために、糖タンパク質は、ヒト様N−グリコシル化を必要とする。ヒト様糖タンパク質プロセシングを模倣し得る哺乳動物細胞株(チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、およびヒト網膜細胞)は、低いタンパク質力価、長い発酵時間、不均一な産物、および進行中のウイルス封じ込めの問題を含む、いくつかの欠点を有する。従って、処理がより経済的で、安全性の妨げがより少なく、そしてより強い異種のタンパク質の産生を引き起こす、酵母発現系および糸状菌発現系の使用が、ヒトの治療のための宿主細胞として重点的に研究されている。
本発明は、酵母宿主または糸状菌宿主(例えば、P.pastoris)における、糖タンパク質のグリカン上のマンノシルリン酸残基を除去する方法を提供する。本発明はまた、マンノシルリン酸化された糖タンパク質、またはそのフラグメントを正常に産生する真菌宿主を提供し、ここで、この真菌宿主は、マンノシルリン酸残基を実質的に含まない糖タンパク質を産生するように、改変される。1つの実施形態において、本発明は、MNN4と相同的な1つ以上の遺伝子を欠く、ヌル変異体を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、mnn4Bおよびpno1の破壊、欠失、または変異を含む、Pichia属の宿主を提供する。得られる宿主株は、糖タンパク質のグリカン上のマンノシルリン酸化を、実質的に含まない。
本明細書中で他に定義しない限り、本発明と関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者に広く理解される意味を有する。さらに、文脈から他に要求されない限り、単数形の語は複数形を含み、そして複数形の語は単数形を含む。通常、本明細書中で記載される、生化学、酵素学、分子生物学、および細胞生物学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法、およびこれらの技術は、当該分野で周知のものであり、そして当該分野で広く用いられる。本発明の方法および技術は、当該分野で周知である従来の方法に従い、そして、他に示されない限り、本明細書の全体にわたって引用され、考察される種々の一般的な参考文献、およびより詳細な参考文献において記載されるように、一般に実施される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989);Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates(1992、および2002に補遺);HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1990);TaylorおよびDrickamer、Introduction to Glycobiology、Oxford Univ.Press(2003);Worthington Enzyme Manual、Worthington Biochemical Corp.、Freehold、NJ;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins、第I巻、CRC Press(1976);Handbook of Biochemistry:Section A Proteins、第II巻、CRC Press(1976);Essentials of Glycobiology、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)を参照のこと。
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、長さが少なくとも10塩基のヌクレオチドのポリマー形態をいう。この用語は、DNA分子(例えば、cDNA、あるいはゲノムDNAまたは合成DNA)、およびRNA分子(例えば、mRNAまたは合成RNA)、ならびに非天然のヌクレオチドアナログ、非天然のヌクレオシド間結合、またはその双方を含む、DNAアナログもしくはRNAアナログを含む。核酸は、任意の形態の構造であり得る。例えば、核酸は、単鎖であっても、二本鎖であっても、三本鎖であっても、四重であっても、部分的に二本鎖であっても、分枝していても、ヘアピンであっても、環状であってもよいか、またはパドロック(padlock)された高次構造であってもよい。
期待値:10(デフォルト);フィルター:seg(デフォルト);ギャップを開けるためのコスト:11(デフォルト);ギャップを広げるためのコスト:1(デフォルト);最大アラインメント:100(デフォルト);ワードサイズ:11(デフォルト);記載数:100(デフォルト);ペナルティーマトリックス:BLOWSUM62。
本発明は、マンノシルリン酸化を有する糖タンパク質を正常に産生する、酵母宿主細胞または糸状菌宿主細胞において、糖タンパク質のグリカンへのマンノシルリン酸の転移を除去する方法を提供する。1つの実施形態において、マンノシルリン酸化を有する糖タンパク質を正常に産生する、酵母宿主細胞または糸状菌宿主細胞が、糖タンパク質上のグリカンにおけるマンノシルリン酸化が実質的に無くなるように、操作(engineer)される。別の実施形態において、この真菌宿主は一般的に、マンノシルリン酸トランスフェラーゼに関与するタンパク質をコードする、少なくとも1つの遺伝子を破壊、減弱化、または突然変異するように、改変される。好ましくは、この方法は、MNN4A、MNN4B、MNN4C、およびPNO1から選択される1つ以上の遺伝子の破壊、減弱化、または突然変異に関与する。
1つの局面において、本発明は、配列番号1と少なくとも50%の同一性を有する、P.pastorisのMNN4A遺伝子の改変体である配列を含む、またはこの配列からなる核酸分子を提供する。この核酸配列は、好ましくは、野生型遺伝子と少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、または少なくとも80%の同一性を有し得る。なおより好ましくは、この核酸配列は、配列番号1と、85%の同一性、90%の同一性、95%の同一性、98%の同一性、99%の同一性、99.9%の同一性、またはなおより高い同一性を有し得る。本発明はまた、配列番号2と少なくとも50%の同一性を有する、P.pastorisのMNN4A遺伝子の改変体である配列を含む、またはこの配列からなるポリペプチドを提供する。このアミノ酸配列は、好ましくは、野生型遺伝子と少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、または少なくとも80%の同一性を有し得る。なおより好ましくは、このアミノ酸配列は、配列番号2と、85%の同一性、90%の同一性、95%の同一性、98%の同一性、99%の同一性、99.9%の同一性、またはなおより高い同一性を有し得る。
3つの新たに同定されたP.Pastorisの遺伝子、MNN4A、MNN4B、MNN4Cのそれぞれが、マンノシルリン酸化における効果を決定するために、図4に示されるPCR重複戦略を用いて、破壊される。個々のΔmnn4A突然変異体、Δmnn4B突然変異体、およびΔmnn4C突然変異体は、ヒトプラスミノーゲンのクリングル3ドメイン(K3)タンパク質のグリカンへの、マンノシルリン酸化転移活性において、有意な減少を示さなかったが、一方で、Δpno1突然変異体(YSH−49)が、マンノシルリン酸化転移における減弱のみを示したものの(6%までの減少(図5C))、Miuraら(国際公開第01/88143号)において過去に記載されたレベルまでではなかった。異なる糖タンパク質は、同じ宿主細胞内において、異なる度合いおよび型のグリコシル化を示すと、仮定されている(Montesinoら、1998、Prot.Expr.Purif.14:197−207)。本発明の1つの実施形態において、ヌル突然変異の組み合わせが構築され、その1つである、P.pastorisにおけるΔpno Δmnn4bの二重突然変異体(double mutant)は、結果として、K3レポータータンパク質のグリカン上における、検出不可能なレベルのマンノシルリン酸化を生じた(図5D)。同様に、P.pastorisにおけるΔpno1 Δmnn4bの二重突然変異体によって産生される他の糖タンパク質(例えば、CD40およびインベルターゼ)もまた、結果として、マンノシルリン酸化の欠失を生じた。それゆえ、この二重突然変異体は、グリカン上にマンノシルリン酸化を有しない、種々の目的の糖タンパク質を産生する。従って、宿主(例えば、Pichia種)における糖タンパク質のグリカン上の、マンノシルリン酸残基の転移に関与する遺伝子の組み合わせを破壊する方法が提供される。好ましくは、この組み合わせは、MNN4BおよびPNO1の破壊を含む。
酵母および糸状菌において、異種糖タンパク質を発現するための、確立された技術を用いて、治療的糖タンパク質をコードする遺伝子が発現される。真菌組換えタンパク質発現系は、代表的には、プロモーター(例えば、AOXI、AOX2、または他の誘導性プロモーター)、転写終結因子(例えば、CYC)、選択可能なマーカー(例えば、URA3、URA5、G418、ADE1、ARG4、HIS4、Zeocin)、および分泌シグナル(例えば、S.cerevisiae aMF)を含み得る。1つの実施形態において、この発現系は、少なくともmnn4B突然変異体であるように、改変される。好ましくは、糖タンパク質は、少なくともΔmnn4Bを有するP.pastorisにおいて産生される。
本発明の別の局面において、本発明は、糖タンパク質上のグリカンへのマンノシルリン酸転移の除去工程を包含する、真菌および酵母(例えば、P.pastoris)における、複合N−連結グリカンの産生の方法が提供される。このような方法は、糖タンパク質上に、実質的にマンノシルリン酸残基を含まない、糖タンパク質組成物を提供する。1つの実施形態において、本発明は、全N−グリカンの1%未満が、マンノシルリン酸化された、糖タンパク質を提供する。さらに好ましい実施形態において、全N−グリカンの0.5%未満が、マンノシルリン酸化された、糖タンパク質を提供する。
異なる糖タンパク質は、同じ宿主細胞中で、異なる度合いおよび型のグリコシル化を示し得る(Montesinoら、1998)。本発明は、マンノシルリン酸化を実質的に欠失する、組換え酵母系統における、種々の糖タンパク質の酸性方法を提供する。好ましくは、この方法は、P.pastoris Δpno1 Δmnn4Bにおける、異種糖タンパク質の発現の操作に関与する。このように、本発明は、種々の治療的糖タンパク質上のグリカンからの、マンノシルリン酸化の除去を示す(図7A〜図7E、図8)。
本発明の別の局面において、任意の酵母(好ましくは、Pichia種)、または糸状菌における、MNN4遺伝子のホモログの同定方法が提供される。当業者は、MNN4A、MNN4B、MNN4C、またはPNO1(Genbank登録番号BD105434)のアミノ酸配列を用いて、任意の酵母(好ましくは、Pichia)のゲノムに対して、BLASTデータベース検索を行い、そしてこれらの遺伝子の任意のものの、ホモログを得ることが出来る。Pichia酵母における、MNN4/PNO1ホモログの同定によって、当業者は続いて、これらの相同な遺伝子の任意の組み合わせを、破壊または突然変異し得る。P.pastoris、S.cerevisiae、Neurospora crassa、Aspergillus nidulans、Candida albicans、およびPichia angusta(Hansenula polymorpha)における、MNN4/PNO1のホモログのアラインメントが、図9に示される。Pichia宿主から発現されるタンパク質上の、マンノシルリン酸化グリカンの存在についてのスクリーニング(実施例7)に際して、破壊すると、Pichia宿主から、マンノシルリン酸化を実質的に含まない糖タンパク質を発現させる、遺伝子または遺伝子の組み合わせを、当業者は決定し得る。
(P.pastorisにおける、MNN4A、MNN4B、MNN4Cの同定および配列決定(図1〜図3))
Saccharomyces cerevisiae MNN4タンパク質配列(Genbank登録番号P36044)を、Pichia pastorisのゲノム配列(Integrated Genomics、Chicago、IL)に対して、相同性を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームについて、ブラスト検索した。この検索から、MNN4pと相同な領域を有する、3つのORFを同定した。これらのORFを、MNN4A、MNN4B、およびMNN4Cと名付けた。続いて、これら3つの遺伝子のそれぞれを、配列決定した。MNN4A遺伝子は、860アミノ酸をコードする、2580ヌクレオチド塩基を含む、オープンリーディングフレームを含むように見受けられた(図1)。MNN4B遺伝子は、652アミノ酸をコードする、1956ヌクレオチド塩基を含む、オープンリーディングフレームを含むように見受けられ(図2)、そして、MNN4C遺伝子は、763アミノ酸をコードする、2289ヌクレオチド塩基を含む、オープンリーディングフレームを含むように見受けられた(図3)。
(P.pastoris系統:YSH−44およびYSH−1の構築)
P.pastoris YSH−44およびYSH−1を、BK64−1(単一のN連結グリコシル化部位を有するレポータータンパク質である、K3を分泌する、Δoch1欠失突然変異体)から操作した(Choiら、2003、PNAS、100:5022−5027;Hamiltonら、2003、Science、301:1244−1246)。YSH−1は、GlcNAcMan5GlcNAc2N−グリカンを主に有する糖タンパク質を発現し、そしてYSH−44は、GlcNAc2Man3GlcNAc2N−グリカンを主に有する糖タンパク質を発現する。
PCR重複方法(Davidsonら、1999、Microbiol.148:2607−2615)によって、YSH−44における、pno1欠失対立遺伝子(pno1::HygR)を生成した。プライマーPNK2(
(P.pastoris YSH−49系統における、PNO1/MNN4Bノックアウト戦略(図4))
YSH−49におけるPCR重複によって、YAS−130(Δpno1 Δmnn4b)二重突然変異系統を達成した。TAS54プライマー(TTCAACGAGTGACCAATGTAGA)(配列番号13)、およびTAS51プライマー(
Δoch1 Δmnn4A Δpno1系統であるYAS159を得るために、SfiI消化したpJN503b(Δmnn4A Δpno1::URA3)を、YSH−1にエレクトロポレーションにて形質転換した。この系統において、5−FOAの対抗選択(counterselection)によって、URA3選択可能マーカーを回収した。結果として生じる系統である、YAS164(Δoch1;Δmnn4A Δpno1;ura3;his4;ade1;arg4)に、SfiI消化したpAS19(Δmnn4B:URA3)を形質転換して、Δoch1 Δmnn4A Δpno1 Δmnn4B系統である、YAS170を生じさせた。引き続いて、YAS174系統(Δoch1 Δmnn4A Δpno1 Δmnn4B;ura3;his4;ade1;arg4)を得るために、YAS170系統を5−FOAにて対抗選択した。従って、YAS174は、マンノース外鎖形成を欠失し、そしてN連結グリカン上のマンノシルリン酸を有さない、Pichia pastoris系統を表す。
(PCR増幅)
全てのPCR反応について、Eppendorf Mastercyclerを用いた。PCR反応液は、テンプレートDNA、125mMのdNTP、それぞれ0.2mMのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、Ex Taqポリメラーゼ緩衝液(Takara Bio Inc.)、ならびにEx Taqポリメラーゼを含んだ。予測されるMNN4B ORFの5’側のDNAフラグメント、予測されるMNN4B ORFの3’側のDNAフラグメント、および薬物耐性マーカーを、最初の変性工程が97℃で2分間、および、最後の伸長工程が72℃で7分間である、97℃で15秒間、55℃で15秒間、および72℃で90秒間の30サイクルによって、増幅した。PCRサンプルを、アガロースゲル電気泳動にて分離し、そしてDNAバンドを、Qiagenから入手したGel Extraction Kitを用いて、抽出および精製した。全てのDNA精製物を、pH8.0である、10mMのTrisに溶出したが、最後のPCR(3つのフラグメント全ての重複)は、脱イオン化H2Oに溶出した。
(マンノシルリン酸化解析のための、P.pastorisにおける複合グリカンの産生のための、DNA形質転換、培養条件)
形質転換のためのDNAを、酢酸ナトリウムを最終濃度0.3Mまで添加することで、調製した。次いで、このDNAサンプルに、100%の氷冷エタノールを、最終濃度70%まで添加した。DNAを遠心分離(12000g×10分間)によってペレット化し、そして、70%の氷冷エタノールを用いて2回洗浄した。DNAを乾燥させ、次いでpH8.0である、10mMのTris50mlに再懸濁した。BMGY(緩衝化最小グリセロール:100mM、pH6.0のリン酸カリウム;1.34%の酵母ニトロゲンベース;4×10−5%のビオチン;1%のグリセロール)中で酵母培養物を、2〜6のO.D.まで拡大することで、YSH−49およびYAS−130を調製した。これらの酵母を、1Mのソルビトールで3回洗浄し、そして約1〜2mlの1Mソルビトールに再懸濁することで、エレクトロコンピテント(electrocompetent)にした。DNA(1〜2mg)を、100mlのコンピテント酵母と混合し、そして氷上で10分間インキュベートした。次いで、以下のパラメーター;1.5kV、129Ω、および25mF、を用いるBTX Electrocell Manipulator 600によって、酵母をエレクトロポレートした。このエレクトロポレートされた細胞に、1mlのYPDS(1%の酵母抽出物、2%のペプトン、2%のデキストロース、1Mのソルビトール)を添加した。引き続いて、形質転換された酵母を、選択寒天プレートにプレートした。hph抵抗性遺伝子を含むノックアウト構築物を形質転換された細胞を、0.4mg/mlのハイグロマイシンBを含む、YPD Y+(1%の酵母抽出物、2%のペプトン、2%のデキストロース、1.34%の、アミノ酸を含まない酵母ニトロゲンベース)寒天プレート上に塗付した。pat抵抗性遺伝子を含む構築物を形質転換された細胞を、0.6mg/mlのグルホシネートを含む、定義された培地(アミノ酸およびNH4SO4を欠く、1.34%の酵母ニトロゲンベース、2%のデキストロース、0.1%のL−プロリン、4×10−5%のビオチン)寒天プレート上に塗付した。コロニーを、同じ選択薬剤を含む別のプレート上に、寄せ集めた。この寄せ集めからDNAを単離し、野生型MNN4BORFの薬物耐性マーカーによる置換について、PCRによって解析した。
(Hisでタグを付けられた、EPOタンパク質、CD40タンパク質、およびインベルターゼタンパク質についての系統構築、図7,8)
Hisでタグを付けられたエリスロポエチン(EPO)のために、ヒト腎臓cDNAライブラリー(Clontech)から、EPOの最初の166アミノ酸を増幅して、そしてC−末端6His pPICZA(Invitrogen)プラスミドの、EcoRI部位およびKpnI部位に挿入した。このプラスミド(pBK291)を2つのP.pastoris系統に形質転換し、EPO−6Hisを発現する、以下の系統を生じた:実施例2、実施例4に記載され、そして示される、BK248ノックアウト(ura3、his4、ade1、arg4、Δoch1::URA3)およびBK244ノックアウト[pBK116、およびpno1mnn4b(pno1::HygR)を有するpBK284を形質転換されたYSH44](mnn4b::KanR)。pBK116は、NRRL11430(ATCC)から単離された1551bpのAOX1 3’UTR DNAフラグメントを、Invitrogen pPIC6AプラスミドのAFlIII部位に挿入し、そしてNRRL11430から単離された1952bpのAOX1 5’UTR DNAフラグメントを、573bpのPmeI/BamHI DNAフラグメントを除去した、同じpPIC6AプラスミドのBglII部位およびBamHI部位に挿入することの結果として生じる。次いで、このpBK116をNotIで消化し、そして、レポーターであるK3タンパク質をノックアウトするために、生じたNotIフラグメントをYSH44に形質転換した。pBK284は、NRRL11430(ATCC)から、AOX1プロモーター配列、AOX1 ORF配列、およびAOX1ターミネーター配列を含む3196bpのDNAフラグメントを単離し、そしてInvitrogenのプラスミドpCR2.1−TOPOのマルチクローニング部位にクローニングすることの結果として生じる。次いで、カナマイシン遺伝子を消失するために、このプラスミドをMscIおよびBssHIで消化した。この結果pBK284が生じ、これを、AOXIプロモーター遺伝子座への組み込みのためにpBK116を形質転換された、YSH44系統への形質転換に先立って、PmeIで消化した。BK248およびBK244における、EPO−6HisのHPLCグリカン解析を、図7Bおよび図7Cに示す。Hisタグを付けられたCD40のために、phCD40/GemT(Pullenら、1999、JBC、274:14246−14254)から、pPICZ aAへのクローニングのための5’EcoRIプライマーおよび3’His10−KpnIプライマーを用いて、ヒトCD40 DNAを増幅し、結果としてpJC33を生じた。pJC33を、P.pastoris YJC12系統(ura3、his4、ade1、arg4)、およびYAS252−2(pBK116、pBK284、および、ガラクトシルトランスフェラーゼを含むpRCD465(USSN 60/562424)を形質転換されたYAS−130)内で発現させ、後者は結果としてYAS252を生じた。YJC12およびYAS252内での、CD49−6HisのHPLCグリカン解析を、図7Dおよび図7Eに示す。Hisでタグを付けられたインベルターゼのために、インベルターゼ配列の全長を、Centraalbureau voor Schimmelculturesから購入した、Kluyveromyces lactisゲノムDNA(CBS683系統)から、PCRによって増幅した。このインベルターゼORFを、PmlI部位におけるpPICZAプラスミド(C末端の6Hisタグを提供する)への挿入のために、平滑末端の5’プライマーおよび3’プライマーを用いて増幅した。このpPB147を、P.pastoris YAS245−2系統(pBK116、pBK284、およびpRCD465(USSN 60/562424)を形質転換されたYAS130)に形質転換し、結果としてYAS253を生じた。YAS253におけるインベルターゼ−6HisのHPLCグリカン解析を、図8に示す。
(P.pastorisにおけるマンノシルリン酸化の決定)
図5〜図8に示す系統における、N連結グリカンへのマンノシルリン酸の転移の量を、メタノール誘導性AOX1プロモーターの制御下において発現される、Hisでタグを付けられたレポータータンパク質(図5および図6において、クリングル3タンパク質;図7において、エリスロポエチンタンパク質およびCD40タンパク質、ならびに、図8においてインベルターゼタンパク質)の分泌によって決定した。手短に言うと、BMGYを含む振盪フラスコに、新鮮な酵母培養物(例えば、YAS−130)を播種し、そして、O.D.が約20になるまで増殖させた。この培養物を遠心分離し、そして細胞ペレットをBMMY(緩衝化最小メタノール:1%グリセロールの代わりに0.5%メタノールを含む点を除いて、BMGYと同じ)で洗浄した。細胞ペレットを、最初のBMGY培養物の1/5の体積までのBMMYに再懸濁し、そして振盪機に24時間置いた。分泌されたタンパク質、遠心分離によってバイオマスをペレット化し、そして培養培地を新たなチューブに移すことで、収集した。次いで、Hisでタグを付けられたK3タンパク質、EPOタンパク質、CD40タンパク質、およびインベルターゼタンパク質を、Ni−親和性カラム上で精製し、そしてPNGase(Choiら、2003)で消化した。グリカンをタンパク質から分離し、次いで2−アミノ−ベンズアミド(2−AB)で標識した。この2−ABで標識されたグリカンを凍結乾燥し、HPLCグレードの水に再懸濁し、そしてGlycoSep Cカラム(Glyco、Novato、CA)を用いたHPLCに供した。この解析は、中性グリカンと酸性グリカンの分離を可能とする。末端のマンノース基を除いてリン酸を露出させる、穏やかな酸による加水分解を用いる実験によるリン酸化のために、これらのグリカンを決定した。引き続くアルカリホスファターゼ処理によって、末端のリン酸基を切断させて、中性のグリカンを残し得る。一連の実験は、全ての系統におけるリン酸化されたN連結グリカン(酸性グリカン)が、20分〜30分の間に移動することを示した。dH2Oをブランクとして用いることで、基線条件を評価した。リン酸化の割合を、酸性ピーク面積を中性ピークおよび酸性ピークの和で割ることで計算した。このHPLC解析を、以下の条件下で行った。
HPLC条件は以下の通りである:溶媒A(アセトニトリル)、溶媒B(500mMの酢酸アンモニウム、500mM、pH4.5)、および溶媒C(水)。流速は、0.4mL/分にて50分間である。10分間、イソクラティク(20% A:80% C)に溶出した後、グリカンを溶出するために、30分間、線形溶媒勾配(20% A:0% B:80% C〜20% A:50% B:30% C)を用いた。実行の間に、カラムを溶媒(20% A:80% C)で20分間平衡化した。
Claims (2)
- MNN4B遺伝子およびPNO1遺伝子についての破壊または欠失を含む真菌宿主であって、ここで該真菌宿主が、Picha pastorisであり、全N−グリカンの1%未満のマンノシルリン酸化された糖タンパク質を生産でき、
破壊または欠失される前記MNN4B遺伝子が、以下:
(a)配列番号:3、
(b)配列番号:3の縮重改変体である核酸配列、
(c)配列番号:3と少なくとも90%同一である核酸配列、
(d)配列番号:4のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列、及び
(e)配列番号:4と少なくとも90%同一であるポリペプチドをコードする核酸配列
から選択される核酸配列を含むか又は(a)〜(e)の核酸配列からなるcDNAに対応するmRNAをコードする、
真菌宿主。 - 請求項1に記載の真菌宿主において糖タンパク質組成物を生産するための方法であって、該真菌宿主を培養する工程、および該糖タンパク質産物を単離する工程を包含する、方法。
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