JP2010091308A - レクチン吸収法による前立腺がんの診断方法及び判定キット - Google Patents
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Abstract
【課題】高い特異性、高い感度及び簡便性を兼ね備えた、前立腺がんの早期発見・早期治療に貢献しうる前立腺がんの判定方法や判定キットを提供すること。
【解決手段】（ａ）血清試料に糖非還元末端にα２，３結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程；（ｂ）工程（ａ）におけるインキュベーション後のレクチン固相化ビーズを分離した残存試料中のＰＳＡ値［α2,3-Non-bound ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程；（ｃ）血清試料中のＰＳＡ値［Total ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程）;（ｄ）［Total ＰＳＡ］−［α2,3-Non-bound ＰＳＡ］により［α2,3-Bound ＰＳＡ］を求め、［α2,3-Bound ＰＳＡ］／［Total ＰＳＡ］で求められる吸収率（％）を算出する工程；（ｆ）吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、前立腺がんと判定する工程；の各工程からなる前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を標的とした前立腺がんの判定方法。
【選択図】なし
【解決手段】（ａ）血清試料に糖非還元末端にα２，３結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程；（ｂ）工程（ａ）におけるインキュベーション後のレクチン固相化ビーズを分離した残存試料中のＰＳＡ値［α2,3-Non-bound ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程；（ｃ）血清試料中のＰＳＡ値［Total ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程）;（ｄ）［Total ＰＳＡ］−［α2,3-Non-bound ＰＳＡ］により［α2,3-Bound ＰＳＡ］を求め、［α2,3-Bound ＰＳＡ］／［Total ＰＳＡ］で求められる吸収率（％）を算出する工程；（ｆ）吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、前立腺がんと判定する工程；の各工程からなる前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を標的とした前立腺がんの判定方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、前立腺特異抗原（prostate specific antigen：以下「ＰＳＡ」と略す）を標的としたレクチン吸収法による前立腺がんの判定方法や判定キットに関する。
前立腺がん（prostate carcinoma）は男性の主要な死亡原因である。前立腺上皮細胞から分泌され前立腺がん細胞によっても産生されるＰＳＡは、セリンプロテアーゼの一種で、前立腺がんに対する最も重要な腫瘍マーカーとして認識されている（例えば、非特許文献１参照）。ＰＳＡは分子量約３４ｋＤａの糖タンパク質であり、４５番目のアスパラギン残基に１本の糖鎖を有し、糖鎖の中で主たるものは、非還元末端にシアル酸がα２，６結合したものである。ＰＳＡは、血中では、プロテアーゼインヒビターとの結合型と、非結合の遊離型前立腺特異抗原として存在する。ＰＳＡは、健康なときも血液中に存在するが、前立腺がんが発症すると大量のＰＳＡが血液中に放出されることから、前立腺がんの腫瘍マーカーとして広く用いられており、前立腺がんの初期診断に対する血清ＰＳＡ試験の簡便性・有用性は既に多く報告されている。
図１のグラフ（財団法人 前立腺研究財団：前立腺がん検診テキスト）は、ＰＳＡ値と前立腺がんの発見率を示したもので、ＰＳＡ値が高くなるにつれて、前立腺がんの確率も高くなることが示されているものの、ＰＳＡ値が低いと前立腺がんの発見率が３０％以下となることが示されている。日本人男性のＰＳＡ基準値としては、６４歳以下の男性では３．０ｎｇ／ｍＬ、６５〜６９歳の男性では３．５ｎｇ／ｍＬ、７０歳以上の男性では４．０ｎｇ／ｍＬが目安といわれ、この基準値以上であれば、前立腺がんである可能性があり、医療機関でさらに詳しい検査を受けることが推奨されている（例えば、非特許文献２及び３参照）。
図２（栗山 学他：泌尿器科紀要, 41(1)：39, 1995より改変）には、前立腺がん、前立腺肥大症、及び、健常男子における血清ＰＳＡ値が示されている。健常男子に比べて、前立腺肥大症、前立腺がんでは数値が高く、病期が進行しているほど数値も高くなり、ＰＳＡ検査は、がんの進行を示す病期の予測にも有用であるといわれている。しかし、病期がかなり進行していても、ＰＳＡ値が正常範囲の例もあることや、前立腺肥大や前立腺炎でもＰＳＡ値が高値となることに起因するグレイゾーンの取り扱いの問題などから、ＰＳＡ値だけで診断することはできず、疑わしい場合は、さらに他の検査を併用して、診断精度を高める必要がある。
最近、前立腺がんにおけるＰＳＡの糖鎖変化、すなわち、前立腺がん患者では、血清ＰＳＡの糖鎖の非還元末端がα２，６結合型シアル酸からα２，３結合型シアル酸を有するものに有意に変化しており、前立腺がん特異的なＰＳＡの糖鎖構造を糖鎖に結合活性を示すタンパク質であるレクチンが識別しうるという報告がなされ（例えば、非特許文献４〜６参照）、ＰＳＡを含む試料をＰＳＡ糖鎖構造の末端シアル酸残基のα２，３結合型を特異的に認識するイヌエンジュレクチン（ＭＡＡ）や、末端シアル酸残基のα２，６結合型を特異的に認識するニワトコレクチン（ＳＮＡ）に接触させ、該レクチンとＰＳＡの糖鎖構造の親和性により分別されたＰＳＡを測定することにより、前立腺がんと前立腺肥大を識別する方法も提案され（例えば、特許文献１参照）、レクチンを検出プローブとして用いることで、より特異的かつ高感度に前立腺がんを鑑別することが可能になると考えられてきた。
本発明の課題は、高い特異性（前立腺がん患者だけを的確に識別）、高い感度（早期がんを発見できる）及び簡便性（一般の検査施設で簡便に検査できる）を兼ね備えた、前立腺がんの早期発見・早期治療に貢献しうる前立腺がんの判定方法や判定キットを提供することにある。
血清ＰＳＡ濃度は前立腺がんのスクリーニングに用いられているが、ＰＳＡ濃度が１０ｎｇ／ｍＬ未満（グレーゾーン）の場合、ＰＳＡ濃度により前立腺がん患者を前立腺肥大等の良性患者と区別することはできない。レクチンの中には、ＰＳＡの糖鎖の非還元末端がα２，６結合型シアル酸からα２，３結合型シアル酸に変化した前立腺がん特異的糖鎖を有するＰＳＡに選択的・優先的に結合するものがあるとの知見をもとに、本発明者らは低ＰＳＡ濃度での前立腺がんの血清診断方法を新たに確立するべく鋭意研究し、糖鎖の非還元末端がα２，３結合型シアル酸を有するＰＳＡに結合することができる数種のレクチンをレクチンブロッティング解析によりスクリーニングした。次いで、前立腺がん患者と良性患者の血清試料を用い、レクチン抗体サンドウィッチ法とレクチン吸収アッセイ法が前立腺がんの血清診断に有効かどうかを検討した。
本発明者らがスクリーニングしたレクチンの中で、ＭＡＬレクチン（Maackia amurensis lectin）が、α２，３結合型シアル酸を糖鎖の非還元末端に有する前立腺がん特異的ＰＳＡにより選択的・優先的に結合することを確認した（図３参照）。３０の血清試料を用いて、図４に示すレクチン抗体サンドウィッチエライザ法と図５に示すレクチン吸収アッセイ法により試験した。ＭＡＬレクチン結合（吸収）分画のＰＳＡを直接測定するレクチン抗体サンドウィッチエライザ法による試験ではレクチンの親和性が低く、前立腺がん患者を区別することはできなかったが、ＭＡＬレクチン非結合（非吸収）分画のＰＳＡを測定するレクチン吸収アッセイ法による試験では８８％の特異性と８１％の感受性で、２０ｎｇ／ｍＬ以下のＰＳＡ低濃度の前立腺がん患者が良性の患者と区別しうることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、（１）以下の工程を備えた前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を標的とした前立腺がんの判定方法；（ａ１）血清試料に、糖非還元末端にα２，３結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程；（ｂ１）工程（ａ１）におけるインキュベーション後のレクチン固相化ビーズを分離した残存試料中のＰＳＡ値［α2,3-Non-bound ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程；（ｃ）血清試料中のＰＳＡ値［Total ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程；や、（２）さらに、以下の工程を備えたことを特徴とする前記（１）記載の判定方法；（ｄ１）［Total ＰＳＡ］−［α2,3-Non-bound ＰＳＡ］により［α2,3-Bound ＰＳＡ］を求め、［α2,3-Bound ＰＳＡ］／［Total ＰＳＡ］で求められる吸収率（％）を算出する工程；（ｆ）吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、前立腺がんと判定する工程；や、（３）以下の工程を備えた前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を標的とした前立腺がんの判定方法；（ａ２）血清試料に糖非還元末端にα２，６結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程；（ｂ２）工程（ａ２）におけるインキュベーション後のレクチン固相化ビーズを分離した残存試料中のＰＳＡ値［α2,6-Non-bound ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程；（ｃ）血清試料中のＰＳＡ値［Total ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程；や、（４）さらに、以下の工程を備えたことを特徴とする前記（３）記載の判定方法；（ｄ２）［α2,6-Non-bound ＰＳＡ］を［α2,3-Bound ＰＳＡ］とし、［α2,3-Bound ＰＳＡ］／［Total ＰＳＡ］で求められる吸収率（％）を算出する工程；（ｆ）吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、前立腺がんと判定する工程；や、（５）吸収率が１０％以上の場合、前立腺がんと判定することを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載の判定方法や、（６）工程（ｃ）が、以下の工程を備えたことを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか記載の判定方法；（ｃｉ）血清試料に非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズを接触させ、インキュベーションする工程；（ｃii）工程（ｃｉ）におけるインキュベーション後の対照タンパク質固相化ビーズを分離した残存試料中のＰＳＡ値［Total ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程；や、（７）非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズが、ＢＳＡ固相化ビーズであることを特徴とする前記（６）記載の判定方法や、（８）固相化ビーズが固相化磁性ビーズであることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれか記載の判定方法や、（９）免疫学的方法が、サンドイッチエライザであることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載の判定方法に関する。
また本発明は、（１０）糖非還元末端にα２，３結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズ、抗ＰＳＡ抗体を含むＰＳＡ測定試薬、緩衝液、及び反応終了液を備えた前立腺がんの判定キットや、（１１）糖非還元末端にα２，６結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズ、抗ＰＳＡ抗体を含むＰＳＡ測定試薬、緩衝液、及び反応終了液を備えた前立腺がんの判定キットや、（１２）さらに、非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズを含むことを特徴とする前記（１０）又は（１１）記載の判定キットや、（１３）非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズが、ＢＳＡ固相化ビーズであることを特徴とする前記（１２）記載の判定キットや、（１４）固相化ビーズが固相化磁性ビーズであることを特徴とする前記（１０）〜（１３）のいずれか記載の判定キットや、（１５）抗ＰＳＡ抗体を含むＰＳＡ測定試薬が、抗ＰＳＡ抗体固相化エライザ用アッセイプレート、標識化抗ＰＳＡ抗体、検出基質を含むことを特徴とする前記（１０）〜（１４）のいずれか記載の判定キットや、（１６）標識化抗ＰＳＡ抗体が、ビオチン標識抗ＰＳＡモノクローナル抗体とＨＲＰ標識ストレプトアビジンとの組合せであることを特徴とする前記（１５）記載の判定キットに関する。
レクチン吸収アッセイ法を利用する本発明によると、従来の血清ＰＳＡ濃度測定法では、良性疾患と前立腺がんとの鑑別は不可能であった低濃度ＰＳＡ値の場合であっても、良悪の鑑別が可能となり、前立腺がんであるか否かを一般の検査施設で簡単に検査することができる。
本発明のＰＳＡを標的とした前立腺がんの判定方法としては、（ａ１）血清試料に、糖非還元末端にα２，３結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程、すなわち、糖非還元末端にα２，３結合型シアル酸を有するＰＳＡと前記レクチン固相化ビーズとの複合体を形成させる工程；（ｂ１）工程（ａ１）におけるインキュベーション後のビーズを分離した残存試料中のＰＳＡ値［α2,3-Non-bound ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程、すなわち、工程（ａ１）で形成された複合体を分離した残存試料中のＰＳＡ値を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程；（ｃ）血清試料中のＰＳＡ値［Total ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程；の（ａ１）、（ｂ１）、（ｃ）の各工程を備える方法［以下、「判定方法Ｉ」ということがある］や、（ａ２）血清試料に糖非還元末端にα２，６結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程、すなわち、糖非還元末端にα２，６結合型シアル酸を有するＰＳＡと前記レクチン固相化ビーズとの複合体を形成させる工程；（ｂ２）工程（ａ２）におけるインキュベーション後のレクチン固相化ビーズを分離した残存試料中のＰＳＡ値［α2,6-Non-bound ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程、すなわち、工程（ａ２）で形成された複合体を分離した残存試料中のＰＳＡ値を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程；（ｃ）血清試料中のＰＳＡ値［Total ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程；の（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ）の各工程を備える方法［以下、「判定方法II」ということがある］であれば特に制限されず、本発明の判定方法においては、特定のレクチンと、レクチン吸収アッセイ法（レクチン結合（吸収）分画のＰＳＡを直接測定することなく、レクチン非結合（非吸収）分画のＰＳＡを測定する方法）とを用いることを特徴としている。
上記判定方法Ｉにおいては、さらに、（ｄ１）［Total ＰＳＡ］−［α2,3-Non-bound ＰＳＡ］により［α2,3-Bound ＰＳＡ］を求め、［α2,3-Bound ＰＳＡ］／［Total ＰＳＡ］で求められる吸収率（％）を算出する工程；（ｆ）吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、例えば吸収率が１０％以上のとき、前立腺がんと判定する工程；の両工程を備えることが好ましく、上記判定方法IIにおいては、さらに、（ｄ２）［α2,6-Non-bound ＰＳＡ］を実質的に［α2,3-Bound ＰＳＡ］と考え、［α2,3-Bound ＰＳＡ］／［Total ＰＳＡ］で求められる吸収率（％）を算出する工程；（ｆ）吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、例えば吸収率が１０％以上のとき、前立腺がんと判定する工程；の両工程を備えることが好ましい。
上記（ａ１）工程で用いられる、糖非還元末端にα２，３結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンとしては、糖非還元末端にα２，６結合型シアル酸を有する糖鎖を認識することなく、糖非還元末端にα２，３結合型シアル酸を有する糖鎖を認識するレクチンであれば特に制限されないが、ＭＡＬレクチン（Maackia amurensis leukoagglutinin lectin、Maackia amurensis Lectin I、ＭＡＭレクチンともよばれる）や、ＭＡＡレクチン（Maackia amurensis agglutinin lectin、Maackia amurensis Lectin IIともよばれる）やＡＣＧレクチン（Agrocybe cylindracea galectin lectin）等を好適に例示することができる。この（ａ１）工程で用いられるＭＡＬ固相化ビーズ、ＡＣＧ固相化ビーズ等は、常法により作製することもできるが、市販品を利用することもできる。
上記（ａ２）工程で用いられる、糖非還元末端にα２，６結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンとしては、糖非還元末端にα２，３結合型シアル酸を有する糖鎖を認識することなく、糖非還元末端にα２，６結合型シアル酸を有する糖鎖を認識するレクチンであれば特に制限されないが、ＳＮＡレクチン（Elderberry bark lectin）やＳＳＡレクチン（Sambucus sieboldiana lectin）等を好適に例示することができる。この（ａ２）工程で用いられるＳＮＡ固相化ビーズ、ＳＳＡ固相化ビーズ等は、常法により作製することもできるが、市販品を利用することもできる。
上記（ｃ）工程は、血清試料中の全ＰＳＡを、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程であるが、血清試料にＢＳＡ固相化ビーズ等の非特異的吸着補正用の対照タンパク質吸着用ビーズを接触させ、インキュベーションする工程（ｃｉ）と、該工程（ｃｉ）におけるインキュベーション後の対照タンパク質固相化ビーズを分離した残存試料中の全ＰＳＡを、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程（ｃii）とを備えた工程とすることが、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により血清試料中の全ＰＳＡを正確に測定する上で好ましい。上記ＢＳＡ固相化ビーズ等は、常法により作製することもできるが、市販品を利用することもできる。
上記工程（ａ１，ａ２）工程や（ｂ１，ｂ２）工程や（ｃｉ）工程におけるインキュベーションとしては、例えば、２０〜３０℃で３０〜１５０分間撹拌するインキュベーションを好適に例示することができる。また、固相化ビーズとしては、磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ガラスビーズ等を例示することができ、上記工程（ｂ１，ｂ２）や（ｃii）工程におけるビーズを分離した残存試料には、反応液中からビーズを遠心分離又は濾過除去した残存液や、反応液中の磁性ビーズを磁石により固定し、マイクロピペット等で回収した上清が含まれる。
上記（ｂ１，ｂ２）工程や（ｃ）工程における抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法としては、ＰＳＡを定量できる免疫学的方法であれば特に制限されず、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッテイング、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、エンザイムイムノアッセイが好ましく、特にエライザが好ましく、中でもサンドイッチエライザが好ましい。エライザなどの免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことができる。上記抗ＰＳＡ抗体としては抗ＰＳＡモノクローナル抗体が好ましく、また、かかるモノクローナル抗体に代えて、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆａｂなどのモノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントも使用することができ、これら抗体フラグメントは、抗ＰＳＡモノクローナル抗体に便宜上含まれる。また、これらモノクローナル抗体や抗体フラグメントを標識化抗体として用いる場合、標識物質としては、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ等の酵素を例示することができ、これら酵素は「酵素標識法(生物化学実験法２７) 」 (第１版、石川栄治著、学会出版センター、１９９１年) などに記載されている方法で標識することができる。またこれら酵素に代えて、例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ等のラジオアイソトープや、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、テトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることもできる。
上記の抗ＰＳＡ抗体を用いたサンドイッチエライザによる残存試料中のＰＳＡ値の測定は、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、第１抗ＰＳＡ抗体と標識化第２抗ＰＳＡ抗体を用い、シリコン、ナイロン、プラスチック、ガラスからなるビーズ、マイクロプレート、試験管、フィルター、メンブレン等の固相、好ましくは抗体固相化エライザ用アッセイプレートのウェルに第１抗ＰＳＡ抗体を固定化し、前記ウェル内に試料を加え、試料中のＰＳＡと第１抗ＰＳＡ抗体との間で抗原抗体反応を行わせ、ＰＳＡを捕捉する。その後、試料を除いて洗浄した後、ウェル内に標識化第２抗ＰＳＡ抗体を加え、この標識化第２抗ＰＳＡ抗体と前記ウェルに捕捉されたＰＳＡとの間で抗原抗体反応を行わせ、第１抗ＰＳＡ抗体とＰＳＡとを介して標識化第２抗ＰＳＡ抗体をウェルに結合させ、ウェルに結合した標識化第２抗ＰＳＡ抗体の標識を利用してＰＳＡを定量する。上記第１抗ＰＳＡ抗体としては抗ＰＳＡモノクローナル抗体が好ましく、第２抗ＰＳＡ抗体としては、第１抗ＰＳＡ抗体と認識部位を異にし、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素、ビオチン等で標識化された抗ＰＳＡモノクローナル抗体が好ましい。また、標識化第２抗ＰＳＡ抗体に代えて、第２抗ＰＳＡ抗体と標識化抗ＩｇＧ抗体を用いることもできる。
本発明の前立腺がんの判定キットとしては、糖非還元末端にα２，３結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズ、抗ＰＳＡ抗体を含むＰＳＡ測定試薬、緩衝液、及び反応終了液を備えた、前記判定方法Ｉに用いることができるキットや、糖非還元末端にα２，６結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズ、抗ＰＳＡ抗体を含むＰＳＡ測定試薬、緩衝液、及び反応終了液を備えた、前記判定方法IIに用いることができるキットであれば特に制限されず、これらキットには、ＢＳＡ固相化ビーズ等の非特異的吸着補正用の対照タンパク質固相化ビーズを含むことが好ましく、上記固相化ビーズとしては、磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ガラスビーズ等を例示することができるが、磁性ビーズが好ましい。また、上記抗ＰＳＡ抗体を含むＰＳＡ測定試薬としては、ＰＳＡを定量しうる試薬であれば特に制限されないが、抗ＰＳＡ抗体固相化エライザ用アッセイプレート、標識化抗ＰＳＡ抗体、検出基質を含むサンドイッチエライザ用試薬が好ましく、上記標識化抗ＰＳＡ抗体としては、酵素標識抗ＰＳＡモノクローナル抗体の他、ビオチン標識抗ＰＳＡモノクローナル抗体とＨＲＰ標識ストレプトアビジンとの組合せを特に好適に例示することができる。
以下、実施例により本発明のレクチン吸収アッセイ法をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［測定試薬］
１．天然レクチン固相化磁性ビーズ
１）ＢＳＡ固相化磁性ビーズ（total ＰＳＡ濃度測定用、Polyscience社製Streptavidin Particles, BioMag PlusにＢＳＡを固相化した磁性ビーズ）５ｍＬ
２）ＭＡＬ固相化磁性ビーズ（α2,3-Non-bound ＰＳＡ濃度測定用、Polyscience社製Streptavidin Particles, BioMag PlusにＭＡＬを固相化した磁性ビーズ）５ｍＬ
１．天然レクチン固相化磁性ビーズ
１）ＢＳＡ固相化磁性ビーズ（total ＰＳＡ濃度測定用、Polyscience社製Streptavidin Particles, BioMag PlusにＢＳＡを固相化した磁性ビーズ）５ｍＬ
２）ＭＡＬ固相化磁性ビーズ（α2,3-Non-bound ＰＳＡ濃度測定用、Polyscience社製Streptavidin Particles, BioMag PlusにＭＡＬを固相化した磁性ビーズ）５ｍＬ
２．抗体固相化エライザ用アッセイプレート
（日本医学臨床検査研究所社製エライザキャプチャー用マウスモノクローナル抗ＰＳＡ抗体clone 2E2を固相化）２枚
３．検出用抗体試薬（１００倍検出用抗体試薬（日本医学臨床検査研究所社製エライザ検出用ビオチン標識抗ＰＳＡ抗体clone 79））０．３ｍＬ
４．検出試薬（１００倍ＨＲＰ標識検出試薬（Zymed社製ＨＲＰ標識ストレプトアビジン）０．３ｍＬ
５．緩衝液
１）検出用抗体試薬用緩衝液（ＴＢＳ−０．０５％Tween２０，１％ＢＳＡ）２３ｍＬ
２）ＨＲＰ標識検出試薬用緩衝液（ＴＢＳ−０．０５％Tween２０，１％ＢＳＡ）２３ｍＬ
６．検出基質／反応終了液
１）検出基質（ＴＭＢ）２３ｍＬ
２）反応終了液（０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４）２３ｍＬ
（日本医学臨床検査研究所社製エライザキャプチャー用マウスモノクローナル抗ＰＳＡ抗体clone 2E2を固相化）２枚
３．検出用抗体試薬（１００倍検出用抗体試薬（日本医学臨床検査研究所社製エライザ検出用ビオチン標識抗ＰＳＡ抗体clone 79））０．３ｍＬ
４．検出試薬（１００倍ＨＲＰ標識検出試薬（Zymed社製ＨＲＰ標識ストレプトアビジン）０．３ｍＬ
５．緩衝液
１）検出用抗体試薬用緩衝液（ＴＢＳ−０．０５％Tween２０，１％ＢＳＡ）２３ｍＬ
２）ＨＲＰ標識検出試薬用緩衝液（ＴＢＳ−０．０５％Tween２０，１％ＢＳＡ）２３ｍＬ
６．検出基質／反応終了液
１）検出基質（ＴＭＢ）２３ｍＬ
２）反応終了液（０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４）２３ｍＬ
７．標準物質（ＣＨＯ細胞発現リコンビナントＰＳＡ）
標準溶液１ ０ｐｇ／ｍＬ
標準溶液２ ５ｐｇ／ｍＬ
標準溶液３ ２０ｐｇ／ｍＬ
標準溶液４ ５０ｐｇ／ｍＬ
標準溶液５ １５０ｐｇ／ｍＬ
８．磁性ビーズ反応プレート ２枚
９．血清希釈液（ＴＢＳ−０．０５％Tween20，１ｍＭ ＭｎＣｌ２，１ｍＭ ＣａＣｌ２）５０ｍＬ
標準溶液１ ０ｐｇ／ｍＬ
標準溶液２ ５ｐｇ／ｍＬ
標準溶液３ ２０ｐｇ／ｍＬ
標準溶液４ ５０ｐｇ／ｍＬ
標準溶液５ １５０ｐｇ／ｍＬ
８．磁性ビーズ反応プレート ２枚
９．血清希釈液（ＴＢＳ−０．０５％Tween20，１ｍＭ ＭｎＣｌ２，１ｍＭ ＣａＣｌ２）５０ｍＬ
［操作法］
１．試薬の調製
１）エライザ洗浄液
０．１％Tween20を含むＰＢＳ溶液を調製する。
２）検出用抗体試薬
１００倍検出用抗体試薬０．２３ｍＬを検出用抗体用緩衝液２３ｍＬと混合させる。混合後は４℃保存し、なるべく早く使用する。
３）ＨＲＰ標識検出試薬 ，
１００倍ＨＲＰ標識検出試薬０．２３ｍＬをＨＲＰ標識検出試薬用緩衝液２３ｍＬと混合させる。混合後は４℃保存し、なるべく早く使用する。
１．試薬の調製
１）エライザ洗浄液
０．１％Tween20を含むＰＢＳ溶液を調製する。
２）検出用抗体試薬
１００倍検出用抗体試薬０．２３ｍＬを検出用抗体用緩衝液２３ｍＬと混合させる。混合後は４℃保存し、なるべく早く使用する。
３）ＨＲＰ標識検出試薬 ，
１００倍ＨＲＰ標識検出試薬０．２３ｍＬをＨＲＰ標識検出試薬用緩衝液２３ｍＬと混合させる。混合後は４℃保存し、なるべく早く使用する。
２．必要な器具・器材
１）マイクロピペット
２）撹拌機能付き恒温糟（２５℃で使用可能な装置）
エッペンドルフ社製サーモミキサーコンフォート
３）マイクロプレート用磁石スタンド
４）ボルテックスミキサー
５）マイクロプレート用分光光度計（主波長４５０ｎｍおよび副波長６３０ｎｍ）
１）マイクロピペット
２）撹拌機能付き恒温糟（２５℃で使用可能な装置）
エッペンドルフ社製サーモミキサーコンフォート
３）マイクロプレート用磁石スタンド
４）ボルテックスミキサー
５）マイクロプレート用分光光度計（主波長４５０ｎｍおよび副波長６３０ｎｍ）
３．測定操作
１）磁性ビーズ反応プレートの各ウェルに、各血清検体を血清希釈液で２０倍希釈した溶液を１００μＬ加える。
２）ＢＳＡ固相化磁性ビーズまたはＭＡＬ固相化磁性ビーズを撹拌し、それぞれ各ウェルに５０μＬ加える。
３）撹拌機能付き恒温槽で８００ｒｐｍで攬絆しながら、２５℃、１時間インキュベーションする。
４）磁石スタンド上に磁性ビーズ反応プレートを載せ、室温で１０分間静置する。
５）集積させた磁性ビーズを吸わないように注意しながらマイクロピペットで上清１００μＬを回収し、抗体固相化エライザ用アッセイプレートに加える。
６）各標準溶液１００μＬを抗体固相化エライザ用アッセイプレートの各ウェルに加える。
７）撹拌しながら２５℃で１時間インキュベーションする。
８）試料を除き、エライザ用洗浄液を各ウェルに２００μＬ加える。
９）エライザ用洗浄液を除く。
１０）８）と９）を計５回行い、ウェルを洗浄する。
１１）ペーパータオルでタッピングして余分な水分を除去する。
１２）各ウェルに調製した検出用抗体試薬を１００μＬ加える。
１３）撹拌しながら２５℃で１時間インキュベーションする。
１４）８）と９）を計５回行い、ウェルを洗浄する。
１５）ペーパータオルでタッピングして余分な水分を除去する。
１６）各ウェルに調製したＨＲＰ標識検出試薬を１００μＬ加える。
１７）撹拌しながら２５℃で１時間インキュベーションする。
１８）８）と９）を計５同行い、ウェルを洗浄する。
１９）ペーパータオルでタッピングして余分な水分を除去する。
２０）各ウェルに検出基質を１００μＬ加える。
２１）２５℃で２０分間、静置してインキュベーションする。
２２）各ウェルに反応終了液１００μＬを加える。
２３）マイクロプレート用分光光度計にて主波長４５０ｎｍ、副波長６３０ｎｍの吸光度を測定する。
１）磁性ビーズ反応プレートの各ウェルに、各血清検体を血清希釈液で２０倍希釈した溶液を１００μＬ加える。
２）ＢＳＡ固相化磁性ビーズまたはＭＡＬ固相化磁性ビーズを撹拌し、それぞれ各ウェルに５０μＬ加える。
３）撹拌機能付き恒温槽で８００ｒｐｍで攬絆しながら、２５℃、１時間インキュベーションする。
４）磁石スタンド上に磁性ビーズ反応プレートを載せ、室温で１０分間静置する。
５）集積させた磁性ビーズを吸わないように注意しながらマイクロピペットで上清１００μＬを回収し、抗体固相化エライザ用アッセイプレートに加える。
６）各標準溶液１００μＬを抗体固相化エライザ用アッセイプレートの各ウェルに加える。
７）撹拌しながら２５℃で１時間インキュベーションする。
８）試料を除き、エライザ用洗浄液を各ウェルに２００μＬ加える。
９）エライザ用洗浄液を除く。
１０）８）と９）を計５回行い、ウェルを洗浄する。
１１）ペーパータオルでタッピングして余分な水分を除去する。
１２）各ウェルに調製した検出用抗体試薬を１００μＬ加える。
１３）撹拌しながら２５℃で１時間インキュベーションする。
１４）８）と９）を計５回行い、ウェルを洗浄する。
１５）ペーパータオルでタッピングして余分な水分を除去する。
１６）各ウェルに調製したＨＲＰ標識検出試薬を１００μＬ加える。
１７）撹拌しながら２５℃で１時間インキュベーションする。
１８）８）と９）を計５同行い、ウェルを洗浄する。
１９）ペーパータオルでタッピングして余分な水分を除去する。
２０）各ウェルに検出基質を１００μＬ加える。
２１）２５℃で２０分間、静置してインキュベーションする。
２２）各ウェルに反応終了液１００μＬを加える。
２３）マイクロプレート用分光光度計にて主波長４５０ｎｍ、副波長６３０ｎｍの吸光度を測定する。
４．ＰＳＡ濃度測定
ＰＳＡ濃度０〜１５０ｐｇ／ｍＬの標準溶液により作成した検量線から、使用試料のＰＳＡ濃度を算出する。図６にＰＳＡ濃度測定用検量線の代表例を示す。
ＰＳＡ濃度０〜１５０ｐｇ／ｍＬの標準溶液により作成した検量線から、使用試料のＰＳＡ濃度を算出する。図６にＰＳＡ濃度測定用検量線の代表例を示す。
５．ＭＡＬとのＢｏｕｎｄ率の測定
血清検体希釈液とＢＳＡ固相化磁性ビーズを反応させた溶液の上清のＰＳＡ濃度をTotal ＰＳＡとし、ＭＡＬ固相化磁性ビーズと反応させた溶液の上清のＰＳＡ濃度をα2,3-Non-bound ＰＳＡとする。
以下の式より、ＭＡＬ固相化磁性ビーズに吸着したＰＳＡ濃度［Bound ＰＳＡ］を求め、最終的に吸収（Bound）率を求める。
［Total ＰＳＡ］−［α2,3-Non-bound ＰＳＡ］＝［Bound ＰＳＡ］
１００×［Bound ＰＳＡ］／［Total ＰＳＡ］＝ＭＡＬ Bound（％）
（算出例）
［Total ＰＳＡ］＝５０ｐｇ／ｍＬ、［α2,3-Non-bound ＰＳＡ］＝３０ｐｇ／ｍＬの場合、
[Bound ＰＳＡ］＝５０−３０＝２０
ＭＡＬ Bound（％）＝１００×２０／５０＝４０（％）
血清検体希釈液とＢＳＡ固相化磁性ビーズを反応させた溶液の上清のＰＳＡ濃度をTotal ＰＳＡとし、ＭＡＬ固相化磁性ビーズと反応させた溶液の上清のＰＳＡ濃度をα2,3-Non-bound ＰＳＡとする。
以下の式より、ＭＡＬ固相化磁性ビーズに吸着したＰＳＡ濃度［Bound ＰＳＡ］を求め、最終的に吸収（Bound）率を求める。
［Total ＰＳＡ］−［α2,3-Non-bound ＰＳＡ］＝［Bound ＰＳＡ］
１００×［Bound ＰＳＡ］／［Total ＰＳＡ］＝ＭＡＬ Bound（％）
（算出例）
［Total ＰＳＡ］＝５０ｐｇ／ｍＬ、［α2,3-Non-bound ＰＳＡ］＝３０ｐｇ／ｍＬの場合、
[Bound ＰＳＡ］＝５０−３０＝２０
ＭＡＬ Bound（％）＝１００×２０／５０＝４０（％）
［本エライザの性能］
１．感度
０ｐｇ／ｍＬの標準溶液１を試料とした場合の吸光度は、０．１以下であり、１５０ｐｇ／ｍＬの標準溶液５を試料とした場合の吸光度は、１．５〜２．８の範囲内である。
２．再現性
標準溶液２〜５を８回同時に測定するとき、変動係数（ＣＶ）は１０％以下である。
３．測定範囲
本エライザによるＰＳＡ濃度測定範囲は０．５ｐｇ／ｍＬ〜１５０ｐｇ／ｍＬである。
１．感度
０ｐｇ／ｍＬの標準溶液１を試料とした場合の吸光度は、０．１以下であり、１５０ｐｇ／ｍＬの標準溶液５を試料とした場合の吸光度は、１．５〜２．８の範囲内である。
２．再現性
標準溶液２〜５を８回同時に測定するとき、変動係数（ＣＶ）は１０％以下である。
３．測定範囲
本エライザによるＰＳＡ濃度測定範囲は０．５ｐｇ／ｍＬ〜１５０ｐｇ／ｍＬである。
［ＭＡＬ固相化磁性ピーズとの反応時の留意点］
１．ＢＳＡまたはＭＡＬ固相化磁性ビーズ５０μＬと混合させることにより、血清検体希釈液１００μＬ中のＰＳＡ濃度は約２／３倍となる。
また、ＭＡＬ固相化磁性ビーズにＰＳＡが吸着することにより、その上清のＰＳＡ濃度[Free ＰＳＡ］はさらに低濃度となる。
各固相化磁性ビーズと反応させる検体希釈液中のＰＳＡ濃度は２０ｐｇ／ｍＬ以上が望ましい。
２．血清中の成分がＰＳＡとＭＡＬ固相化磁性ビーズとの吸着に影響を与える可能性がある。
１．ＢＳＡまたはＭＡＬ固相化磁性ビーズ５０μＬと混合させることにより、血清検体希釈液１００μＬ中のＰＳＡ濃度は約２／３倍となる。
また、ＭＡＬ固相化磁性ビーズにＰＳＡが吸着することにより、その上清のＰＳＡ濃度[Free ＰＳＡ］はさらに低濃度となる。
各固相化磁性ビーズと反応させる検体希釈液中のＰＳＡ濃度は２０ｐｇ／ｍＬ以上が望ましい。
２．血清中の成分がＰＳＡとＭＡＬ固相化磁性ビーズとの吸着に影響を与える可能性がある。
［測定結果］
上記の［操作法］に従い、良性患者と前立腺がん患者におけるＰＳＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）をレクチン吸収アッセイ法により測定し、吸収率（％）を算出した。結果を図７に示す。これらのレクチン吸収アッセイ法による試験結果から、８８％の特異性と８１％の感受性で、より吸収率が低いことから、前立腺がん患者が良性の患者と区別しうることがわかった。
上記の［操作法］に従い、良性患者と前立腺がん患者におけるＰＳＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）をレクチン吸収アッセイ法により測定し、吸収率（％）を算出した。結果を図７に示す。これらのレクチン吸収アッセイ法による試験結果から、８８％の特異性と８１％の感受性で、より吸収率が低いことから、前立腺がん患者が良性の患者と区別しうることがわかった。
Claims (16)
- 以下の工程を備えた前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を標的とした前立腺がんの判定方法。
（ａ１）血清試料に、糖非還元末端にα２，３結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程；
（ｂ１）工程（ａ１）におけるインキュベーション後のレクチン固相化ビーズを分離した残存試料中のＰＳＡ値［α2,3-Non-bound ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程；
（ｃ）血清試料中のＰＳＡ値［Total ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程； - さらに、以下の工程を備えたことを特徴とする請求項１記載の判定方法。
（ｄ１）［Total ＰＳＡ］−［α2,3-Non-bound ＰＳＡ］により［α2,3-Bound ＰＳＡ］を求め、［α2,3-Bound ＰＳＡ］／［Total ＰＳＡ］で求められる吸収率（％）を算出する工程；
（ｆ）吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、前立腺がんと判定する工程； - 以下の工程を備えた前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を標的とした前立腺がんの判定方法。
（ａ２）血清試料に糖非還元末端にα２，６結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズを接触させ、インキュベーションする工程；
（ｂ２）工程（ａ２）におけるインキュベーション後のレクチン固相化ビーズを分離した残存試料中のＰＳＡ値［α2,6-Non-bound ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程；
（ｃ）血清試料中のＰＳＡ値［Total ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程； - さらに、以下の工程を備えたことを特徴とする請求項３記載の判定方法。
（ｄ２）［α2,6-Non-bound ＰＳＡ］を［α2,3-Bound ＰＳＡ］とし、［α2,3-Bound ＰＳＡ］／［Total ＰＳＡ］で求められる吸収率（％）を算出する工程；
（ｆ）吸収率が対象となる良性と比べて高いとき、前立腺がんと判定する工程； - 吸収率が１０％以上の場合、前立腺がんと判定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の判定方法。
- 工程（ｃ）が、以下の工程を備えたことを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の判定方法。
（ｃｉ）血清試料に非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズを接触させ、インキュベーションする工程；
（ｃii）工程（ｃｉ）におけるインキュベーション後の対照タンパク質固相化ビーズを分離した残存試料中のＰＳＡ値［Total ＰＳＡ］を、抗ＰＳＡ抗体を用いた免疫学的方法により測定する工程； - 非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズが、ＢＳＡ固相化ビーズであることを特徴とする請求項６記載の判定方法。
- 固相化ビーズが固相化磁性ビーズであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の判定方法。
- 免疫学的方法が、サンドイッチエライザであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の判定方法。
- 糖非還元末端にα２，３結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズ、抗ＰＳＡ抗体を含むＰＳＡ測定試薬、緩衝液、及び反応終了液を備えた前立腺がんの判定キット。
- 糖非還元末端にα２，６結合型シアル酸を有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを固相化したビーズ、抗ＰＳＡ抗体を含むＰＳＡ測定試薬、緩衝液、及び反応終了液を備えた前立腺がんの判定キット。
- さらに、非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズを含むことを特徴とする請求項１０又は１１記載の判定キット。
- 非特異的吸着補正用対照タンパク質固相化ビーズが、ＢＳＡ固相化ビーズであることを特徴とする請求項１２記載の判定キット。
- 固相化ビーズが固相化磁性ビーズであることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか記載の判定キット。
- 抗ＰＳＡ抗体を含むＰＳＡ測定試薬が、抗ＰＳＡ抗体固相化エライザ用アッセイプレート、標識化抗ＰＳＡ抗体、検出基質を含むことを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか記載の判定キット。
- 標識化抗ＰＳＡ抗体が、ビオチン標識抗ＰＳＡモノクローナル抗体とＨＲＰ標識ストレプトアビジンとの組合せであることを特徴とする請求項１５記載の判定キット。
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|---|---|---|---|
| JP2008259144A JP2010091308A (ja) | 2008-10-04 | 2008-10-04 | レクチン吸収法による前立腺がんの診断方法及び判定キット |
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| Publication Number | Publication Date |
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| JP2010091308A true JP2010091308A (ja) | 2010-04-22 |
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016155838A (ja) * | 2010-05-27 | 2016-09-01 | メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション | 改善された特性を有する抗体の製造方法 |
| JP2017500058A (ja) * | 2013-11-18 | 2017-01-05 | コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジーＫｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ | シアル酸結合に特異的なヤマブシタケ由来のレクチン |
| WO2020013097A1 (ja) | 2018-07-11 | 2020-01-16 | 公益財団法人がん研究会 | 前立腺がんに特異的な糖鎖、及びこれを用いた検査方法 |
| CN112136047A (zh) * | 2018-05-18 | 2020-12-25 | 富士胶片和光纯药株式会社 | 判断***癌的方法 |
| JP2021519443A (ja) * | 2018-03-26 | 2021-08-10 | グリカノスティックス エス・アール・オーＧｌｙｃａｎｏｓｔｉｃｓ Ｓ．Ｒ．Ｏ． | タンパク質糖鎖プロファイリングの手段及び方法 |
-
2008
- 2008-10-04 JP JP2008259144A patent/JP2010091308A/ja active Pending
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| JP2021519443A (ja) * | 2018-03-26 | 2021-08-10 | グリカノスティックス エス・アール・オーＧｌｙｃａｎｏｓｔｉｃｓ Ｓ．Ｒ．Ｏ． | タンパク質糖鎖プロファイリングの手段及び方法 |
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