CN102864091A

CN102864091A - 一种一菌多酶菌株及其筛选方法和应用

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Publication number: CN102864091A
Application number: CN2012100108905A
Authority: CN
Inventors: 刘一尘; 张谦; 李宏伟; 张春杰; 汪洋; 关随霞; 龚婷; 丁轲; 李小康; 吴庭才; 李银聚; 王臣
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2012-01-15
Filing date: 2012-01-15
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2032-01-15
Also published as: CN102864091B

Abstract

本发明涉及一种一菌多酶菌株及其制备方法和应用，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1.1111，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M 2011286。本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1.1111可产木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等9种酶的菌株，其中蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶产量特别高。同时通过模拟体内胆酸盐环境、人工胃液、人工肠液和动物试验证明该菌株对胆盐、人工胃液、人工肠液有很强的耐受能力，对试验动物表现出安全性和促增长能力，这为有效提高该菌株的产酶能力，在发酵过程中能够同时产生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等，实现一菌多酶发酵奠定了基础。该菌株产生的多种酶之间相互协同作用效果强，可作为饲料添加剂应用于畜、禽、水产动物等农业生产。

Description

一种一菌多酶菌株及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及一种一菌酶菌株，同时还涉及该菌株的筛选方法及应用，属于微生物技术领域。

背景技术

酶是一种生物催化剂，饲用酶制剂作为一类高效、无毒副作用的环保型“绿色”饲料添加剂广泛应用于在动物生产中，应用饲用酶制剂既能提高饲料的消化率和利用率，提高畜禽及水产动物的生产性能，又能减少***物中氮、磷含量，保护水体和土壤免受污染，将有着十分广阔的应用前景。

早期的酶制剂以动植物作为原料直接提取，但由于动植物生长周期长，又受地理、气候和季节等多种因素的影响，不适于大规模的工业生产。目前人们已将目光转向以微生物作为酶制剂的主要来源，如淀粉酶和蛋白酶的微生物制备使用于工业化生产。早期的复合酶制剂是通过单酶复配后再使用，此种方式易造成生产成本过高，质量不稳定，使用不方便。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一菌多酶菌株。

同时，本发明的目的还在于提供一种该一菌多酶菌株的筛选方法。

进一步地，本发明的目的还在于提供一种该菌多酶菌株的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种一菌多酶菌株，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1.1111，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M 2011286。

应用经典的细菌鉴定方法及分子生物学方法16S rDNA对其进行鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1.1111,于2011年8月11日保藏在中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M 2011286。

该枯草芽孢杆菌对对胆酸盐、人工胃液、人工肠液等环境表现出很强的耐受能力，对实验动物安全无毒无副作用，并能产生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶多种酶，这有利于该菌株作为益生菌在饲料添加剂中的进一步开发利用，为进一步研究各酶的性质、各酶之间的相互关系、实现一菌多酶发酵奠定了良好的基础。

所述的一菌多酶菌株可产木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶。

本发明的技术方案还采用了一种一菌多酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：以产木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶为筛选目标，分别用各酶选择性培养基，根据菌落周围有无透明圈或水解圈，以及透明圈或水解圈的直径(D)与菌落直径(d)的比值，来初步判断是否为产酶菌株及高产酶活，最终从实验室分离、筛选保存的菌种资源库中筛选到一菌产多酶的菌株。

本发明的技术方案还涉及一种该一菌多酶菌株在制备益生菌剂方面的应用。

斜面和种子培养基以g/L计：蛋白胨10.0，牛肉膏5，NaCl 5，斜面再加15-20，pH7.2；发酵培养基以g/L计：玉米粉36-44，豆饼粉36-44，Na₂HPO₄ 8，(NH₄)2SO₄ 4，NH₄Cl 0.75，CaCl₂ 1.0，pH7.0；培养条件：10L发酵罐中发酵体积为7L，接种量为总体积10％，温度为35-40℃，通气量为3L/L.min，搅拌速度为200-300r/min，发酵时间30-50h，发酵液中有大量的枯草芽孢杆菌活菌、以蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶为主，同时含有木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶等水解酶，将发酵液浓缩加入30％-60％淀粉干燥即制成益生菌和复合酶制剂。

同时，本发明的技术方案还涉及一种一菌多酶菌株在制备饲料方面的应用。

复合酶制剂在饲料中的添加量为每吨饲料加100-200g。

所述的复合酶制剂组成为蛋白酶5000-10000U/g、甘露葡聚糖酶1000-3000U/g、糖化酶700-3000U/g，木聚糖酶7500-15000U/g、淀粉酶500-3000U/g、纤维素酶200-700U/g、植酸酶50-80U/g、果胶酶100-200U/g、脂肪酶200-500U/g。

本发明的复合酶有不同的作用机制，在饲料中的添加可减少其抗营养作用，提高饲料利用率，提高动物生产效率，充分发挥动物的生产性能。本发明通过模拟体内胆酸盐环境、人工胃液、人工肠液和动物试验证明该菌株对胆盐、人工胃液、人工肠液有很强的耐受能力，对试验动物表现出安全性和促增长能力，这为有效提高该菌株的产酶能力，在发酵过程中能够同时产生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等，实现一菌多酶发酵奠定了基础。该菌株产生的多种酶之间相互协同作用效果强，可作为饲料添加剂应用于畜、禽、水产动物等农业生产。

产酶菌株的筛选

1.产木聚糖酶菌株的筛选

将已活化的菌株刺种在木聚糖酶筛选培养基上，在37℃恒温培养24h，根据菌落周围是否有透明圈产生，判断其是否产生木聚糖酶。分别测量透明圈直径和菌落直径，根据两者比值大小确定其分泌木聚糖酶活性的高低，并以比值大于等于2时判其为产木聚糖酶活性高的菌株。

2.产蛋白酶菌株的筛选

将已活化的菌株刺种在酪蛋白琼脂培养基上，在37℃温箱中培养24h，根据菌落周围是否有酪素水解圈产生，判断其是否产生蛋白酶。用直尺分别测量水解圈与菌落的直径，根据两者比值大小确定其分泌蛋白酶活性的高低，并以比值大于等于2时判其为产蛋白酶活性高的菌株。

3.产植酸酶菌株的筛选

将已活化的菌株刺种在植酸酶初筛培养基上，在30℃温箱中培养48h，根据菌落周围是否产生透明圈来判断其是否产生植酸酶。用直尺分别测量透明圈的直径(D)和菌落直径(d)，根据两者的比值大小来初步确定其产生植酸酶活性的高低，并以比值大于等于2时判其为产植酸酶活性高的菌株。

4.产果胶酶菌株的筛选

将已活化的菌株刺种在果胶酶初筛培养基上，在37℃温箱中培养36h，取出后，在菌落周围滴加几滴CTAB溶液，静置10min后观察透明圈。根据菌落周围是否产生透明圈来判断其是否产生果胶酶。用直尺分别测量透明圈的直径(D)和菌落直径(d)，根据两者的比值大小来初步确定其产生果胶酶活性的高低，并以比值大于等于2时判其为产果胶酶活性高的菌株。

5.产脂肪酶菌株的筛选

将已活化的菌株刺种在脂肪酶初筛培养基上，在37℃温箱中培养24h，根据菌落周围是否产生水解圈来判断其是否产生脂肪酶。分别测量水解圈的直径(D)和菌落直径(d)，根据两者的比值大小来初步确定其产生脂肪酶活性的高低，并以比值大于等于2时判其为产脂肪酶活性高的菌株。

6.产甘露聚糖酶菌株的筛选

将已活化的菌株刺种在甘露聚糖酶筛选培养基上，37℃培养24h后，用刚果红水溶液检测菌落周围是否产生透明圈及其大小，作为产甘露聚糖酶筛选的依据。，并以比值大于等于2时判其为产甘露聚糖酶活性高的菌株。

7.产糖化酶菌株的筛选

将活化后的菌株刺种糖苷酶筛选培养基上，37℃培养36h，采用革兰氏碘液染色，在菌落周围有透明圈产生证明其产糖化酶。分别测量透明圈直径和菌落直径，并以比值大于等于2时判其为产糖化酶活性高的菌株。

8.高产淀粉酶菌株的筛选

将活化后的菌株刺种可溶性淀粉培养基平皿上，在37℃温箱中培养24h，采用革兰氏碘液染色，根据菌落周围是否有透明圈产生判断其是否产生淀粉酶。分别测量透明圈直径和菌落直径，并以比值大于等于2时判其为高产淀粉酶的菌株。9.高产纤维素酶菌株的筛选

9.高产纤维素酶菌株的筛选

将活化后的菌株刺种纤维素酶筛选培养基上，在37℃温箱中培养24h，采用1mg/ml刚果红染色1h，然后依次用，1mol/LNaCl溶液彻底洗去染液1h，再用1mol/mlHCl定色，根据菌落周围是否形成染色圈，判断芽孢杆菌是否产生纤维素酶。分别测量染色圈直径和菌落直径，以比值大于等于2的判其为活性比较高的纤维素酶产酶菌株。

一菌多酶发酵法可以大大提高生产效率、节约成本，而且由于各酶种来源于同一菌株，其安全性与复配性能显得更有优势。

产酶菌株的鉴定

应用普通琼脂培养基对产酶菌株的培养特征进行研究，利用革兰氏染色法对其染色特性进行研究；利用糖发酵试验、IMVIC试验、淀粉水解、明胶液化、硫化氢、赖氨酸脱羧酶试验、精氨酸双水解酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验等生化试验对3其生理生化特性进行分析，并利用分子生物学方法16S rDNA对产酶菌株进行鉴定。

产酶菌株的耐受性及动物试验

通过模拟体内胆酸盐环境、人工胃液、人工肠液环境，分别测定产酶菌株在不同的胆盐含量、不同pH值的人工胃液、不同pH值的人工肠液环境中的耐受能力。并选择健康小白鼠为实验动物，将菌株制成菌悬液(菌悬液活菌数为10⁹CFU/mL)，同时设空白对照，连续灌胃5天，观察小白鼠的健康状况。

附图说明

图1为产酶菌株16S rDNA PCR扩增鉴定图谱；泳道M为DL2000Marker；泳道1、2均为产酶菌株16S rDNA PCR扩增产物；泳道3阴性对照。

图2产酶菌株的***发育树；▲为目的菌株。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述

产酶菌株筛选实施例

1、产木聚糖酶菌株的筛选

将活化的产酶菌株刺种在木聚糖酶筛选培养基上，在37℃温箱中培养24h，根据菌落周围是否有透明圈产生，经过观察，发现有该菌株产生透明圈，测量菌株的透明圈直径(D)、菌落直径(d)及透明圈直径与菌落直径之比(D/d)，试验结果见表1。

表1木聚糖酶分解菌酶活筛选结果

2.产蛋白酶菌株的筛选

将活化的产酶菌株刺种在酪蛋白琼脂培养基上，在37℃温箱中培养24h，观察发现有该菌株株产生酪蛋白水解圈。测量菌株的水解圈直径(D)、菌落直径(d)及水解圈直径与菌落直径之比(D/d)，试验结果见表2。

表2蛋白酶分解菌酶活初筛

3.产植酸酶菌株筛选结果

将活化的产酶菌株刺种在植酸酶初筛培养基平皿上，在30℃温箱中培养48h后，观察发现菌株产生有透明圈，其透明圈直径(D)、菌落直径(d)及二者的比值见表3。

表3产值酸酶菌株筛选结果

由表3可知，该菌株的D/d值为2.125，可初步确定这些菌株产植酸酶的活性较高。

4.产果胶酶菌株筛选结果

将活化的产酶菌株刺种在果胶酶初筛培养基平皿上，在37℃温箱中培养36h后，观察发现该菌株产生透明圈，其透明圈直径(D)、菌落直径(d)及二者的比值见表4。

表4产果胶酶菌株筛选结果

5.产脂肪酶菌株筛选结果

将活化的产酶菌株刺种脂肪酶初筛培养基上，在37℃温箱中培养24h后，观察发现该菌株产生水解圈，其透明圈直径(D)、菌落直径(d)及二者的比值见表5。

表5产脂肪酶菌株筛选结果

6.产甘露聚糖酶菌株的筛选

将已活化的菌株刺种在甘露聚糖酶筛选培养基上，37℃培养24h后，在平板上倒一层刚果红水溶液发现菌落周围产生透明圈，其透明圈直径(D)、菌落直径(d)及二者的比值见表6。

表6产甘露聚糖酶菌株筛选结果

7.产糖化酶菌株的筛选

将活化后的菌株刺种糖苷酶筛选培养基上，37℃培养36h，采用革兰氏碘液染色，在菌落周围有透明圈，其透明圈直径(D)、菌落直径(d)及二者的比值见表7。

表7产糖化酶菌株筛选结果

8.产淀粉酶芽孢杆菌筛选结果

将活化后的菌株刺种糖苷酶筛选培养基上，37℃培养36h，采用革兰氏碘液染色，在菌落周围有透明圈，其透明圈直径(D)、菌落直径(d)及二者的比值见表8。

表8产淀粉酶菌株筛选结果

9.高产纤维素酶芽孢杆菌筛选结果

将活化后的菌株刺种在纤维素酶筛选筛选培养基上，37℃培养24h，经染色、脱色及定色，在菌落周围有透明圈，其透明圈直径(D)、菌落直径(d)及二者的比值见表9。

表9纤维素酶分解菌酶活筛选

产酶菌株的鉴定实施例

1.产酶菌株培养特性的观察

将产酶菌株接种于普通琼脂培养基上，在37℃培养18～24h，对其菌落大小、边缘形状、菌落颜色、***度及是否干燥等培养特性进行观察，并利用革兰氏染色法对其染色特性等进行研究。试验结果见表10。

表10产酶菌株培养特性及染色特性

2.产酶菌株生理生化特性的研究

将产酶菌株分别进行V.P试验、MR试验、糖类发酵试验、、触酶试验、淀粉水解试验，精氨酸双水解酶试验、赖氨酸脱羧酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验、柠檬酸盐利用试验、硫化氢试验、吲哚试验、明胶试验等。其试验结果见表11。

表11产酶菌株生理生化试验结果

注：+表示阳性反应，-表示阴性反应。

3.产酶菌株的初步鉴定

根据产酶菌株的培养特性、形态、染色性状及生理生化试验结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)和《常见细菌***鉴定手册》对其进行属种鉴定，可初步判定该产酶菌株为枯草芽孢杆菌。

4.产酶菌株的分子生物学鉴定

用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取产酶菌株中总DNA后进行16SrDNA PCR扩增，电泳结果如图1所示，PCR产物由上海生工进行序列测定。由测序报告可知，该序列的大小为1.501Kb。将序列与GenBank中序列进行比对，并建立进化树分析，结果如图2所示。

5.产酶菌株的最终鉴定

根据经典细菌鉴定方法，参考《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌***鉴定手册》，结合16SrDNA鉴定***比较，可以确定该产酶菌株为枯草芽孢杆菌。

产酶菌株的耐受性及动物试验实施例

1.产酶菌株的耐胆盐试验

将产酶菌株分别接种在含0.1％、0.2％、0.3％胆酸盐LB固体培养基培养上培养4～5天后，观察菌落生长情况。结果表明该菌株仍能够生长。

2.产酶菌株的耐人工胃液试验

将产酶菌株制成菌悬液，按1％的接种量分别接入到不同pH2、pH3、pH4的人工胃液中，在不同时间测定其活菌数，其结果见表12。

表12产酶菌株经胃液作用后的存活菌数(mL^-1)

注：表中的数据为活菌数的对数值。

3.产酶菌株的耐人工肠液试验

将产酶菌株按1％的接种量分别接入到pH值为7.6的人工肠液，在不同时间测定活菌数，其结果见表13。

表13产酶菌株经肠液作用后的存活菌数(mL^-1)

注：表中的数据为对数值。

4.产酶菌株的动物试验

将产酶菌株制成菌悬液，连续灌喂5天，在第10天后观察的结果如表14。

表14产酶菌株动物试验结果

Claims

1.一种一菌多酶菌株，其特征在于，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1111，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M 2011286。

2.根据权利要求1所述的一菌多酶菌株，其特征在于：可产木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶，其中蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶为高产酶活。

3.一菌多酶菌株的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：以产木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶为筛选目标，分别用各酶选择性培养基，根据菌落周围有无透明圈或水解圈，以及透明圈或水解圈的直径(D)与菌落直径(d)的比值，来初步判断是否为产酶菌株及高产酶活，最终从实验室分离、筛选保存的菌种资源库中筛选到一菌产多酶的菌株。

4.一菌多酶菌株在制备益生菌剂方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：斜面和种子培养基以g/L计：蛋白胨10.0，牛肉膏5，NaCl 5，斜面再加15-20，pH7.2；发酵培养基以g/L计：玉米粉36-44，豆饼粉36-44，Na₂HPO₄ 8，(NH₄)2SO₄ 4，NH₄Cl 0.75，CaCl₂ 1.0，pH7.0；培养条件：10L发酵罐中发酵体积为7L，接种量为总体积10％，温度为35-40℃，通气量为3L/L.min，搅拌速度为200-300r/min，发酵时间30-50h，发酵液中有大量的枯草芽孢杆菌活菌、以蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶为主，同时含有木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶等水解酶，将发酵液浓缩加入30％-60％淀粉干燥即制成益生菌和复合酶制剂。

6.一菌多酶菌株在制备饲料方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：复合酶制剂在饲料中的添加量为每吨饲料加100-200g。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的复合酶制剂组成为蛋白酶5000-10000U/g、甘露葡聚糖酶1000-3000U/g、糖化酶700-3000U/g，木聚糖酶7500-15000U/g、淀粉酶500-3000U/g、纤维素酶200-700U/g、植酸酶50-80U/g、果胶酶100-200U/g、脂肪酶200-500U/g。