CN108865927A - 低温酵解玉米秸秆的细菌菌株及其发酵培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了低温酵解玉米秸秆的细菌菌株及其发酵培养方法和应用。本发明首先公开了一株分离的短小芽胞杆菌菌株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.15177。本发明对所分离的短小芽胞杆菌菌株的发酵制备方法的有关参数进行了优化。本发明所分离的短小芽胞杆菌在不同温度下都可生长，在4℃低温条件下，仍然具有旺盛的生长力。本发明所分离的菌株能够在低温条件下高效酵解秸秆，可以单独或与EM菌联合应用于酵解秸秆。将本发明菌株的发酵液同EM菌液混合后在低温下酵解玉米秸秆，秸秆酵解效果呈显著提升，酵解率提高了47.4％。本发明所分离的短小芽胞杆菌菌株在制备秸秆腐熟剂，尤其是玉米秸秆腐熟剂中应用前景广泛。

Description

低温酵解玉米秸秆的细菌菌株及其发酵培养方法和应用

技术领域

本发明涉及一株分离的寒地玉米秸秆腐熟细菌菌株，还涉及所述寒地 秸秆腐熟细菌菌株在低温下高效酵解玉米秸秆中的应用，属于寒地秸秆腐 熟细菌的分离及应用领域。

背景技术

农作物秸秆含有丰富的纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质和矿物质 元素等营养物质，是一种可再生的生物资源。但中国秸秆利用率不足33％， 主要是由于秸秆在田中难于收集，运输不便，大多数被焚烧或废弃处理。 黑龙江省是中国农业大省，每年产秸秆数量巨大，这些秸秆由于环境温度 低、还田条件和推广程度不高，许多秸秆被焚烧或废弃，不仅浪费宝贵的 农作物资源，还对环境造成了巨大污染。秸秆主要富含纤维素、半纤维素 和木质素，许多真菌、细菌和放线菌等能分泌纤维素酶、半纤维素酶和木 质素酶而分解秸秆。由于秸秆中纤维素含量最高，因此，筛选具有高纤维 素酶产酶特性的微生物成为研究秸秆腐熟剂的重要方向之一。

EM菌是由光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、发酵丝状菌和放线菌 等多种微生物组成的一个有益菌群，在应用时具有成本低、使用方法简便 等优点，已经在农业领域、畜牧业领域、水产领域和水污染领域等方面被 广泛应用。许多试验结果已经证明EM菌中具有高效分解秸秆纤维素的微 生物，并且这些微生物在低温条件下也能够正常发挥作用，因此，利用 EM菌筛选寒地腐熟秸秆菌筛选出能够在低温条件下腐熟秸秆的高效菌 株，将为增加寒地秸秆腐熟菌剂的菌种组成及秸秆腐熟剂的应用提供实践 基础和理论依据。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株分离的低温高效酵解 玉米秸秆的细菌菌株；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述寒地秸秆腐熟细菌菌 株在低温下高效酵解玉米秸秆中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明通过对寒地秸秆腐熟物中的微生物进行6次分离和纯化，共 获得了23个菌株；在不同温度培养条件下，对分离的26个菌株进行培养， 观察其生长情况，进行低温秸秆腐熟菌的初筛，筛选出能够在15℃低温 条件下正常生长细菌为7株，分别为A3、B7、C1、C4、D7、E5和E14。 本发明进一步对初筛到的能在低温条件下正常生长的7株细菌菌进行复 筛，观察筛选获得细菌的CMC-刚果红固体培养基中透明圈直径与菌落直 径之比(D/d)大小，结果发现，B7株具有较大的透明圈直径与菌落直径 之比(D/d)，为2.68；鉴于透明圈大小在一定程度上可体现菌株产生纤 维素酶的能力，说明所筛选到的菌株B7具有较强的纤维素酶的能力。

本发明将筛选出来的秸秆腐熟细菌B7进行菌落及菌体形态观察。结 果发现，该细菌能在固体培养基上形成了单一的菌落。菌株B7的菌落为 具有黄色，半透明，光滑湿润，边缘不整齐，稍***的圆形菌落，菌体为 细杆状，圆末端，单个或呈短链排列，呈现为革兰氏阳性，通过以上观察， 初步推断筛选的秸秆腐熟细菌菌株B7为芽孢杆菌。根据***发育树的结 果，确定B7为短小芽胞杆菌(bacillus pumilus)，将该菌株定名为bacilluspumilus-B7。

本发明将筛选获得的Bacillus pumilus-B7菌株进行耐冷性鉴定，结果 发现该菌株在不同温度下都可以生长，在4℃条件下，仍然具有旺盛的生 长力，表明该腐熟菌株具有较强的耐冷性。Morita指出耐冷微生物具有的 特征为在0-5℃能够生长繁殖，最适生长温度在15℃以上，最高生长温 度高于20℃。因此，本发明筛选获得的Bacillus pumilus-B7菌株为耐冷微 生物，可以在北方低温地区正常生长。

本发明将分离获得的Bacillus pumilus-B7菌株提交专利认可的机构 进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.15177；分类命名为：短小 芽孢杆菌Bacillus pumilus。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心；保藏时间是2018年1月11日；保藏地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号。

本发明所述Bacillus pumilus-B7菌株的发酵液的制备包括：将所述 的Bacilluspumilus-B7菌株接种于液体培养基中进行培养，收集菌液，即 得。

其中，所述液体培养基可以为赫奇逊氏无机盐培养基作为基础培养 基，所述的氮源可以为蛋白胨、酵母膏、硫酸铵或尿素，添加量为0.2wt％； 优选的，所述的氮源为蛋白胨；按体积百分比计，所述菌株的接种量可以 是1-9％，优选的，菌株的接种量为5％；所述培养温度可以是10-40℃， 优选为25℃；液体培养基的初始pH值可以为4-10，优选为7；所述的发 酵培养的时间可以为1-7d，优选为3d。

发酵培养基的的最佳氮源筛选实验发现，在以蛋白胨和酵母膏为氮源 培养基上产纤维素酶的活性较高，而在添加硫酸铵和尿素作物氮源培养基 上产生纤维素酶的活性较低，并且差异很显著。综合比较结果，适合于寒 地秸秆腐熟细菌Bacillus pumilus-B7菌株产纤维素酶的培养最佳氮源为蛋 白胨。

发酵的最佳接种量筛选结果发现，接种量的不同会影响菌株液体发酵 产纤维素酶的活性，随着接种量的增加，秸秆腐熟细菌产纤维素酶的活性 呈现先上升，后下降的趋势，该细菌都具有较高纤维素酶活性。接种量为 1％和3％时，产酶和酶活力逐渐增高。接种量超过5％后，酶活力开始下 降，可能是由于菌含量过多，环境中营养物质有限，菌体生长大量消耗营 养物质而产酶能力下降。综合比较结果，最佳接种量为5％。

发酵温度筛选实验结果发现，菌株Bacillus pumilus-B7是在温度 10-30℃时酶活力逐渐增加，到30℃时酶活力最高，但产酶的活力同25℃ 比，差异不显著。随着温度升高，产酶活力开始下降，在40℃时，菌株 的产酶活力都下降到最低。由这些结果可以看出，本试验筛选的菌株具有 一个很宽的产酶活性区间，低温更有利于其产酶。综合比较结果，确定该 菌株发酵的最佳温度为25℃。

培养基最佳初始pH值的筛选实验结果发现，在过酸、过碱的环境中 秸秆腐熟细菌的CMC酶活力很低，甚至不产酶。在pH为5至8时，腐 熟细菌具有产酶活性，在培养基初始pH为7时，具有最高的CMC酶活 力，当pH升高到8时，产酶的活性都出现了显著性下降。这些结果表明， 本试验筛选的低温秸秆腐熟菌株更适于在酸性和中性条件下产酶，确定最 佳培养基初始pH值为7。

最佳培养时间的筛选实验结果发现，菌株的产酶活性随着培养时间的延 长，呈现先上升，后下降的趋势。在培养3d的时候，都具有最好的产酶活 性，3d后CMC酶活力逐渐降低，但仍具有较强的酶活性。确定寒地秸秆腐 熟细菌发酵的最佳培养时间为3d。

为了验证所筛选的低温高效酵解秸秆细菌菌株Bacillus pumilus-B7 的酵解效果，本发明采用腐熟细菌进行滤纸酵解试验。根据滤纸酵解试验 结果可见，本发明所筛选的秸秆腐熟细菌菌株Bacillus pumilus-B7具有较 强的滤纸酵解效果。

本发明进一步将低温高效酵解秸秆细菌Bacillus pumilus-B7与EM菌 配合进行酵解秸秆试验，在30d的时候，两种处理中，秸秆出现了失重和 变黑现象，但是在添加了低温高效酵解秸秆细菌Bacillus pumilus-B7组合 中，秸秆失重和变黑的程度更大，测定玉米秸秆的失重率，添加了低温高 效酵解秸秆细菌Bacillus pumilus-B7组合的失重率为56％，而只用EM菌 发酵液的处理，秸秆的失重率为38％，酵解率提高了47.4％，并且在秸秆腐熟过程中添加了低温高效酵解秸秆细菌Bacillus pumilus-B7，发酵30d 时，秸秆腐烂的程度较好，易于破碎。由此，本发明所分离的Bacillus pumilus-B7菌株能够在低温下高效酵解秸秆，可以将其应用于酵解作物秸 秆，尤其是玉米秸秆。

本发明进一步公开了所述的Bacillus pumilus-B7菌株在制备秸秆腐熟 剂中的应用。

本发明还公开了一种水稻秸秆腐熟剂，包括：本发明所述的Bacillus pumilus-B7菌株的发酵液。

本发明所分离的Bacillus pumilus-B7菌株的发酵液可以单独应用于酵 解秸秆，也可将其与EM菌菌液相配合应用于酵解，秸秆酵解率将得到显 著提高。

本发明还公开了一种玉米秸秆腐熟剂，包括：本发明所述的Bacillus pumilus-B7菌株的发酵液和EM菌菌液。优选的，将Bacillus pumilus-B7 菌株的发酵液与EM菌菌液按照1:1的体积比组成。

本发明对所述EM菌菌液没有特殊限制，市售的EM菌菌液均适用于 本发明。

本发明所分离的Bacillus pumilus-B7菌株在不同温度下都可以生长， 在4℃条件下，仍然具有旺盛的生长力具有较强的耐冷性，能够在低温条 件下高效酵解秸秆；可以单独或与EM菌联合应用于酵解秸秆；将Bacillus pumilus-B7菌株的发酵液同EM菌发酵液混合后在低温下酵解玉米秸秆， 秸秆酵解效果显著提高，酵解率提高了47.4％。

附图说明

图1为CMC-刚果红培养基上腐熟细菌的透明圈；

图2为腐熟细菌的菌落形态(A)及显微形态(B)；

图3为菌株B7基于16SrDNA序列同源性构建的***发育树；

图4为不同氮源对菌株产酶的影响；

图5为不同接种量对菌株发酵的影响；

图6为不同温度对菌株发酵的影响；

图7为不同培养基初始pH对3菌株产酶的影响；

图8为不同培养时间发酵的影响；

图9为菌株对滤纸的分解率。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明 的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的 精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这 些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1寒地秸秆腐熟菌的分离和鉴定

1.试验方法

1.1试验材料

1.1.1菌种及秸秆

本试验中所使用EM菌菌液由黑龙江省农科院提供。玉米秸秆采自东 北农业大学试验田。

1.2试验方法

1.2.1寒地秸秆EM菌腐熟

2016年12月份，在黑龙江省哈尔滨东北农业大学试验田，室外温 度在零下12℃至25℃之间，将粉碎秸秆与EM菌液混合物埋于深沟中， 采用未处理的秸秆及塑料布覆盖，腐熟分解60d。取出的秸秆腐熟物呈腐 烂状态，偶见条状或小碎片状未完全腐熟的秸秆碎块。

1.2.2寒地秸秆腐熟菌的分离

1.2.2.1秸秆腐熟物中细菌菌株的分离、初筛和保存

(1)腐熟物中细菌菌株的分离：称取5g秸秆腐熟物于锥形瓶中加入 50mL无菌水，37℃在摇床上培养24h。用接菌环蘸取腐熟物悬浮上清 液在菌株分离培养基上划线，分离出单菌落后，将细菌接在LB琼脂培养 基上，保存。

(2)低温条件下腐熟物中细菌菌株的初筛：利用寒地秸秆腐熟菌能够 在低温条件下生长，利用不同温度对富集分离的菌株进行初筛。采用4℃、 10℃、15℃、25℃和37℃等温度条件，培养所分离的菌株，观察菌株生 长情况，筛选出能在低温条件下正常生长的菌株。

(3)菌株的保存：将分离出的单菌落分类，细菌接在LB液体培养基 中37℃培养24h，取细菌菌液置于已高压灭菌后的50％甘油中，-80℃ 保存。

1.2.2.2寒地秸秆腐熟菌的复筛

以低温筛选获得微生物是否具有分解纤维素的能力作为依据，对寒地 秸秆腐熟菌进行复筛。将初筛获得的可以在低温条件下生长的细菌，接种 在CMC-刚果红培养基上，培养至菌株生长。观察培养基上透明圈大小， 计算透明圈与菌株直径之比(D/d)。菌株在CMC-刚果红固体培养基上 透明圈大小在一定程度上能够反映菌株分解纤维素能力的大小，透明圈越 大，菌株分解纤维素的能力越强。

1.2.3寒地秸秆腐熟细菌的鉴定

1.2.3.1寒地秸秆腐熟细菌的形态学鉴定

将复筛到的细菌菌株分别接种于LB固体和液体培养基中，24h后 观察菌落外观和菌体形态，采用革兰氏染色法对细菌进行分类鉴定。

1.2.3.2寒地秸秆腐熟细菌的分子鉴定

从LB平板培养基上接种已经纯化好的单菌落到30mL的LB培养 基中，37℃培养24h，采用SDS细菌的DNA，利用细菌鉴定的16SrDNA 序列通用引物27F/541R作为寒地秸秆腐熟细菌的分子鉴定引物进行PCR 扩增，将PCR产物至哈尔滨博仕生物技术有限公司进行测序。将测序获 得的序列输入GenBank中，利用BLAST比对，进行序列同源性分析，并 采用MEGA5.0软件构建***发育树，对细菌的种属进行分子鉴定。

1.2.4寒地秸秆腐熟菌的耐冷性鉴定

将前期筛选和鉴定获得秸秆腐熟细菌分别接种于LB液体培养基和 LB固体培养基上，记录菌株在4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、 35℃的培养条件下的生长状况，确定筛选的秸秆腐熟菌的耐冷性。

2.试验结果

2.1.寒地秸秆腐熟细菌的初筛

通过对寒地秸秆腐熟物中的微生物进行6次分离和纯化，共获得了23 个菌株。在不同温度培养条件下，对分离的菌株进行培养，观察其生长情 况，进行低温秸秆腐熟菌的初筛。结果表明，筛选出的能够在15℃低温 条件下正常生长细菌为7株，分别为A3、B7、C1、C4、D7、E5和E14。

2.2寒地秸秆腐熟细菌的复筛

对初筛到的能在低温条件下正常生长的7株细菌菌进行复筛，主要 是通过CMC-刚果红固体培养基上的透明圈直径大小进行复筛。观察筛选 获得细菌的CMC-刚果红固体培养基中透明圈直径与菌落直径之比(D/d) 大小，其中B7具有较大的透明圈直径与菌落直径之比(D/d)，为2.68， 透明圈大小在一定程度上说明菌株产生纤维素酶的能力，说明菌株B7具 有较强的纤维素酶的能力(见图1)。

2.3寒地秸秆腐熟菌的形态学观察

2.3.1腐熟细菌的形态学观察

将筛选出来的秸秆腐熟细菌B7在LB固体和液体培养基上进行培养， 观察菌落及菌体形态。结果表明，该细菌都能在固体培养基上形成了单一 的菌落。菌株B7的菌落为具有黄色，半透明，光滑湿润，边缘不整齐， 稍***的圆形菌落，菌体为细杆状，圆末端，单个或呈短链排列(见图 2-A)。呈现为革兰氏阳性(见图2-B)，通过以上观察，初步推断筛选 的秸秆腐熟细菌菌株都为芽孢杆菌。

2.4寒地秸秆腐熟菌的分子鉴定

通过细菌16SrDNA序列分析，对筛选获得的腐熟菌B7进行分子生物 学鉴定，其中，扩增的获得16SrDNA序列片段长度为1449bp。

对获得的序列进行BLAST比对及***发育树构建，结果如图3所示。 根据***发育树的结果，确定B7为短小芽胞杆菌(bacillus pumilus)， 这个结果同前面的形态学鉴定具有一致性，将该菌株定名为bacillus pumilus-B7。

2.5寒地秸秆腐熟菌的耐冷性鉴定

对筛选获得的Bacillus pumilus-B7菌株进行耐冷性鉴定。将筛选的腐 熟细菌接种在LB的培养基中，在不同培养温度下进行培养，结果表明该 菌株在不同温度下都可以生长，在4℃条件下，仍然具有旺盛的生长力， 表明这些腐熟菌具有较强的耐冷性。Morita指出耐冷微生物具有的特征为 在0-5℃能够生长繁殖，最适生长温度在15℃以上，最高生长温度高于 20℃。因此，本试验筛选获得的腐熟菌株为耐冷微生物，可以在北方低温 地区正常生长。

试验例1寒地秸秆腐熟菌发酵条件优化试验

1.试验方法

1.1培养基不同的氮源对腐熟细菌发酵性能的影响

为了确定培养基不同氮源的对腐熟菌发酵的影响，本试验采用无氮源 的赫奇逊氏无机盐培养基作为基础培养基，在此基础上添加不同的氮源， 添加的氮源是蛋白胨、酵母膏、硫酸铵和尿素，添加量为0.2％，每个处 理4瓶，设3个重复。25℃条件下发酵3d，取菌液0.2mL，用于纤维素 酶活性测定，采用DNS测定方法。

1.2菌种接种量对腐熟细菌发酵的影响

为了观察不同菌种接种量对腐熟菌发酵的影响，本试验设计不同的菌 种接种量。设置1％、3％、5％、7％、9％五个接种量处理。在以蛋白胨为 氮源的液体发酵培养基中接种，培养基初始pH值为7.0，25℃培养，每 个处理5瓶，设3个重复。在25℃条件下培养3d时，取菌液0.2mL， 用于纤维素酶活性测定。

1.3培养温度对腐熟细菌发酵的影响

为了观察不同培养温度对腐熟菌发酵的影响，本试验设计不同的菌株 培养温度。设置了10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃共7个 培养温度处理。在以蛋白胨为氮源的液体发酵培养基中分别以5％的接种 量接种，培养基初始pH值为7.0，每个处理7瓶，设3个重复。在培养3 d时，取菌液0.2mL，用于纤维素酶活性测定。

1.4培养基初始pH值对腐熟细菌发酵的影响

为了观察不同培养基初始pH值对腐熟菌发酵的影响，本试验设计不 同的培养基初始pH值。设置了4、5、6、7、8、9、10共7个不同培养 基初始pH值处理。以蛋白胨为氮源的液体发酵培养基为基础培养基，调 节培养基初始pH，以5％的接种量接种，25℃培养，每个处理7瓶，设3 个重复。在培养3d时，取菌液0.2mL，用于纤维素酶活性测定。

1.5培养时间对腐熟菌纤维素酶活性的影响

为了观察不同培养时间对腐熟菌发酵的影响，本试验设计不同的培 养时间。其中细菌设置1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d共7个不同培 养时间处理，以蛋白胨为氮源的液体发酵培养基，培养基初始pH值为7， 以5％的接种量接种，25℃培养，细菌试验每个处理7瓶，按实验设计的 培养时间培养后，分别取菌液0.2mL，用于纤维素酶活性测定。

2.实验结果

2.1最佳氮源筛选结果

对筛选的寒地秸秆腐熟细菌发酵的最佳氮源进行筛选。结果如图4所 示，由结果可以看出，在以蛋白胨和酵母膏为氮源培养基上产纤维素酶的 活性较高，而在添加硫酸铵和尿素作物氮源培养基上产生纤维素酶的活性 较低，并且差异很显著。综合比较结果，适合于寒地秸秆腐熟细菌产纤维 素酶的培养最佳氮源为蛋白胨。

2.2接种量对发酵的影响

对筛选的寒地秸秆腐熟细菌发酵的最佳接种量进行筛选，结果如图5 所示。由结果可以看出，接种量的不同会影响菌株液体发酵产纤维素酶的 活性，随着接种量的增加，秸秆腐熟细菌产纤维素酶的活性呈现先上升， 后下降的趋势，该细菌都具有较高纤维素酶活性。接种量为1％和3％时， 产酶和酶活力逐渐增高。接种量超过5％后，酶活力开始下降，可能是由 于菌含量过多，环境中营养物质有限，菌体生长大量消耗营养物质而产酶 能力下降。综合比较结果，最佳接种量为5％。

2.3温度对发酵的影响

由图6可看出，菌株Bacillus pumilus-B7是在温度10-30℃时酶活力 逐渐增加，到30℃时酶活力最高，但产酶的活力同25℃比，差异不显著。 随着温度升高，产酶活力开始下降，在40℃时，菌株的产酶活力都下降 到最低。由这些结果可以看出，本试验筛选的菌株具有一个很宽的产酶活 性区间，低温更有利于其产酶。综合比较结果，确定该菌株发酵的最佳温 度为25℃。

2.4培养基初始pH对发酵的影响

由图7可看出，在过酸、过碱的环境中秸秆腐熟细菌的CMC酶活力 很低，甚至不产酶。在pH为5至8时，腐熟细菌具有产酶活性，在培养 基初始pH为7时，具有最高的CMC酶活力，当pH升高到8时，产酶的 活性都出现了显著性下降。这些结果表明，本试验筛选的低温秸秆腐熟菌 株更适于在酸性和中性条件下产酶，确定最佳培养基初始pH值为7。

2.5培养时间对产酶的影响

由图8可以看出，菌株的产酶活性随着培养时间的延长，呈现先上升， 后下降的趋势。在培养3d的时候，都具有最好的产酶活性，3d后CMC 酶活力逐渐降低，但仍具有较强的酶活性。确定寒地秸秆腐熟细菌发酵的 最佳培养时间为3d。

试验例2寒地秸秆腐熟菌的酵解秸秆的应用效果试验

1.试验方法

1.1秸秆腐熟细菌滤纸酵解试验

取筛选到的秸秆腐熟细菌Bacillus pumilus-B7以5％的接种量接种于 培养基初始pH为7的滤纸液体培养基上，15℃培养。在接种后，每24h 测量滤纸的失重率，连续测量8d。每个处理8瓶，设3个重复。滤纸失 重率的测定方法是取发酵液过滤，将残留物质置于烘箱中80℃烘干至恒 重，进而测定滤纸失重率。

1.2低温高效酵解秸秆细菌与EM菌复配酵解秸秆试验

采用发酵后的低温高效酵解秸秆细菌发酵液与EM菌发酵液1:1混合， 在4℃条件下酵解玉米秸秆。玉米秸秆的处理方法：用2mol/L的NaOH 溶液浸泡玉米秸秆段24h，水洗至pH＝7，干燥箱80℃烘干，烘干后的秸 秆段粉碎100目过筛备用。发酵的组成，根据发酵玉米的量添加5％EM 菌发酵液，5％低温高效酵解秸秆细菌发酵液，1％红糖，湿度控制在 35％-65％之间，发酵30d，以EM菌发酵液为对照。酵解结束后，测定秸 秆的失重率，测定方法同滤纸失重率方法相同。

2.试验结果

2.1细菌对滤纸的酵解效果

为了验证筛选的寒地秸秆腐熟细菌Bacillus pumilus-B7的酵解效果， 采用腐熟细菌进行滤纸酵解试验。细菌处理后，滤纸的分解率如图9所示。 由结果可以看出，在采用Bacillus pumilus-B7处理后1～3d，随着处理时 间的延长，滤纸的失重率显著上升，3d后滤纸的分解率呈现缓慢上升趋 势，在第15d达到了最高，分解率达75％以上，由以上结果可以看出，本 试验筛选的秸秆腐熟细菌Bacillus pumilus-B7具有较强的滤纸酵解效果。

2.2低温高效酵解秸秆细菌与EM菌配合酵解秸秆试验结果

在低温条件下，采用低温高效酵解秸秆细菌Bacillus pumilus-B7与EM 菌配合进行玉米秸秆的酵解试验，在30d的时候，两种处理中，秸秆出现 了失重和变黑现象，但是在添加了低温高效酵解秸秆细菌组合中，秸秆失 重和变黑的程度更大，测定玉米秸秆的失重率，添加了低温高效酵解秸秆 细菌组合的失重率为56％，而只用EM菌发酵液的处理，秸秆的失重率为 38％，酵解率提高了47.4％，并且在秸秆腐熟过程中添加了低温高效酵解 秸秆细菌，发酵30d时，秸秆腐烂的程度较好，易于破碎。

Claims (10)

1.一株分离的短小芽胞杆菌(bacillus pumilus)菌株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.15177。

2.一种制备权利要求1所述短小芽胞杆菌(bacillus pumilus)菌株发酵液的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的菌株接种于发酵培养基中进行发酵培养，收集发酵液，即得。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的氮源为蛋白胨、酵母膏、硫酸铵或尿素，添加量为0.2wt％；优选的，所述的氮源为蛋白胨。

4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：将按体积百分比计，将权利要求1所述菌株按照1-9％的接种量接种到发酵培养基中进行培养，优选的，将权利要求1所述菌株按照5％的接种量接种到发酵培养基中进行培养。

5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的发酵培养温度是10-40℃，优选为25-30℃，最优选为25℃。

6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的初始pH值为4-10，优选为5-8，最优选为7。

7.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的发酵培养的时间为1-7d，优选为3d。

8.一种酵解秸秆的腐熟剂，其特征在于，包括：权利要求1所述的短小芽胞杆菌(bacillus pumilus)菌剂或发酵液和EM菌菌液；优选的，二者的体积比为1:1。

9.权利要求1所述的短小芽胞杆菌(bacillus pumilus)菌株在酵解秸秆中的应用。

10.权利要求8所述的腐熟剂在酵解秸秆中的应用。