CN104031860B - 一种高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌及其应用，分类命名为球状赖氨酸芽孢杆菌？(Lysinibacillus？sphaericus)？Xyn-1，已于2014年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC？M？2014183。采用Plackett-Burman设计与响应面分析法确定了筛选菌株摇瓶最佳发酵产酶条件，该条件下的发酵水平可达5678.5？IU/mL。利用该菌株发酵所产酶应用于植物半纤维素的降解，经过酶解半纤维素的木二糖收率可达60%以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌及其应用，属于应用微生物技术领域。
背景技术
木聚糖酶(XylanaseE.C3.2.1.8)是一种主要的木聚糖降解酶类，其通过内切方式降解木聚糖中的β-1,4木糖苷键，水解产物大多为低聚木糖，并伴有少量的木糖和***糖。木聚糖酶具有广泛的应用前景，在造纸工业方面：木聚糖酶可作为生物漂白剂替代传统的化学漂白，从而大量降低氯的用量，减轻造纸对环境的污染，木聚糖酶作为“制浆酶”已广泛应用于西方发达国家，带来了良好的经济和社会效益；木聚糖酶在食品行业被广泛用于面制品、果汁等食品制作以及木寡糖的制备生产；发酵产业中，木聚糖酶被广泛用于小麦等发酵原料的糖化处理上；饲料行业作为一类饲料添加酶，可有效提高饲料营养。木聚糖酶已经成为酶制剂生产行业中的一个重要产品，市场对于其需求量也呈现与日俱增的趋势。
此外，通过对目前市场上应用木聚糖酶的整体环境分析可以发现，木聚糖酶剂的应用环境大多处于高温条件，例如造纸过程，需要高温操作以除去木质素等；食品生产过程一般需要高温灭菌等操作。研究发现，木聚糖酶的最适反应温度一般低于45℃，因此木聚糖酶在上述过程中投入使用前需要提前降温以提高酶的催化活性，这些操作不仅耗能也极大地阻碍木聚糖酶的应用发展。因此，获得高产耐热木聚糖酶菌株并将其投入于实际发酵生产具有广阔的研究和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌及其在发酵产耐高温木聚糖酶中的应用，具有很大的推广价值。
高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌，分类命名为球状赖氨酸芽孢杆菌Xyn-1(LysinibacillussphaericusXyn-1)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCCM2014183，保藏日期为2014年5月5日，地址：中国武汉武汉大学。
本发明菌株的筛选方法如下：
筛选培养基配方：蛋白胨10g，酵母膏3g，NaCl5g，木聚糖4g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，pH8.0，灭菌121℃，20min。
采集位于南京工业大学生物甲烷生产车间周围的农用秸杆堆肥不同位置若干份样品接种到上述筛选培养基中，55℃培养24～48h，用0.1％刚果红溶液处理30min，再用1mol/LNaCl溶液脱色，然后选取培养基上透明圈较大且水解圈明显的菌株作为初筛菌株；随后，对初筛菌株的发酵产酶能力进行验证，以木聚糖为底物，基于DNS法测定酶活，选取产量最高的一株菌株Xyn-1，其初始发酵水平为3245.5IU/mL。
生理生化特征：菌株Xyn-1的生长以OD600的吸光度值表示，通过细菌对数时期单位内数量的增长计算生长代时为3.0h。菌株的分子生物学鉴定表明，菌株Xyn-1的16SrRNA基因序列在GenBank的注册号为KJ755851，与其最相近种属Lysinibacillussphaericus的相似性为91％，为一新种属细菌，命名为球状赖氨酸芽孢杆菌Xyn-1(LysinibacillussphaericusXyn-1)。该菌株已于2013年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为：CCTCCM2014183。
所述的高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌在发酵产木聚糖酶的应用。
所述的高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌在降解秸秆半纤维素中的应用。
应用的具体步骤如下：
1)将菌株进行斜面培养，置于37℃下，培养48～72h，采用牛肉膏蛋白胨培养基，具体配方：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂20g，溶解在1000mL蒸馏水中，pH7.4-7.6。将上述斜面培养的菌株划线接种灭菌的LB培养基中(蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶解在1000mL蒸馏水中，pH7.0～7.2)，37℃条件下200～250r/min培养12h，利用细胞计数板测定菌液浓度，并将其稀释至菌悬液浓度5×106个/mL。
2)将步骤1)得到的菌液接种至发酵培养基中，接种量为4％(v/v)，培养基用量为25mL/250mL锥形瓶，培养温度45℃，摇瓶转速200r/min，发酵时间为72h。所述发酵培养基为：木聚糖10.7g，酵母粉5.6g，蛋白胨2g，NH4NO34g，(NH4)2SO46g，KH2PO40.9g，MgSO4·7H2O1g，NaCl5g，蒸馏水1000mL。
3)发酵制备木聚糖酶用于小麦秸秆半纤维素的酶解：将步骤2)获得的发酵液在5500r/min，4℃条件下离心5min。收集上清液即得到发酵所产耐高温木聚糖酶液，并将其应用于玉米秸秆半纤维素的酶解。酶解过程以100～150IU/g半纤维素的比例加入木聚糖酶液，在55℃条件下反应72h。反应结束后，过滤收集酶解液，利用HPLC法测定酶解液中各还原糖含量，并以此计算该过程的酶解效率。
有益效果
本发明提供了一株高产耐高温木聚糖酶菌株Xyn-1，其培养条件相对温和，筛选菌株通过鉴定属于球状赖氨酸芽孢杆菌，此前对于该菌株的木聚糖酶研究尚未进行过报道，本发明进一步丰富了该种属菌系的相关研究内容。
筛选得到的菌株Xyn-1产耐高温木聚糖酶的发酵水平达到5678.5IU/mL，比较发现该菌株的木聚糖酶生产能力较高，同时发酵获得的耐高温木聚糖酶具有很好的热稳定性，可以广泛应用于造纸、食品等行业。
采用统计学方法对菌株Xyn-1的生产发酵过程进行优化研究，获得了最佳的培养方案，菌株的木聚糖酶发酵水平有了显著的提高，由初始发酵3245.5IU/mL提高到5678.5IU/mL。
附图说明
图1球状赖氨酸芽孢杆菌Xyn-1平板菌落形态图。
具体实施方式
实施例1高产耐高温木聚糖酶菌株的筛选及培养
富集培养基：NaNO30.5g、K2HPO4lg、MgSO4·7H2O0.5g、KCl0.5g、FeSO4·7H2O0.005g、蒸馏水1000mL，pH自然，灭菌121℃，20min。
筛选培养基：蛋白胨10g，酵母膏3g，NaCl5g，木聚糖4g，琼脂粉15g，
蒸馏水1000mL，pH8.0，灭菌121℃，20min。
发酵培养基：蛋白胨10g，酵母膏3g，NaCl5g，木聚糖4g，蒸馏水1000mL，pH自然，灭菌121℃，20min。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂20g，溶解在1000mL蒸馏水中，pH7.0～7.2，灭菌121℃，20min。
采集位于南京工业大学生物甲烷生产车间周围的秸杆堆肥不同位置若干份样品5g，将其分别置于250mL锥形瓶中，加入50mL无菌水，37℃、180r/min培养1h制备悬液，取5mL悬液加入到盛有50mL富集培养基的三角瓶中，振荡培养5～7d后，取培养液分别稀释10-1～10-6，并分别将其均匀涂布到筛选培养基上，55℃培养24～48h，用0.1％刚果红溶液处理30min，再用1mol/LNaCl溶液脱色。观察菌落周围的透明圈情况，根据透明圈与菌落尺寸的大小可以比较出菌株产木聚糖酶活力的高低，并以此作为指标进行菌株的初筛。初筛完成后，对若干初筛菌株的菌液稀释10-1～10-6，分别接种到新鲜的发酵培养基中35℃培养72h，以发酵液中木聚糖酶产量作为直接标准进行菌株复筛。如此继代培养，淘汰发酵水平较弱的培养物，最终得到一株保持较高木聚糖酶产酶能力且稳定的菌株，利用LB培养基对其进行菌株纯化保藏，同时利用甘油培养方式对纯化菌株进行冻藏处理。
实施例2筛选菌株的生物学鉴定
1.菌株的形态学鉴定
将分离纯化菌株接种到固体LB培养基上，在37℃条件下培养24h观察菌种的平板菌落形态。如图1，菌株Xyn-1，在固体LB培养基生长后，菌落直径0.6cm，形状呈规则的突起物，可形成内生芽孢，呈圆形，培养基上呈白色不透明菌落，表面光滑，菌落边缘规则。
2.菌株的分子学鉴定
对筛选细菌进行菌种鉴定，菌种鉴定基于NCBI数据库的细菌16SrDNA序列库。利用细菌基因组提取试剂盒提取菌株的DNA，并利用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，引物序列为：27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)、1492R(5’-GGYTACCTTGTTACGACT-3’)。PCR反应体系为(25μL)：模板DNA10ng，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/LMgCl21.5μL，dNTPmix2.5μL，引物各0.25μL，5U/μLrTaq聚合酶0.125μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min，随后35个循环(94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸2min)，最后72℃反应10min。将纯化后的PCR扩增片段送检测序，并将测序结果通过NCBI中Genbank的BLAST程序进行相似性比对。
分子学鉴定结果：筛选菌株Xyn-1的16SrDNA区序列如SEQIDNO:1所示，该序列已提交至Genbank，注册号为KJ755851，与其最相近种属Lysinibacillussphaericus的相似性为91％，为一新种属细菌，命名为球状赖氨酸芽孢杆菌Xyn-1。
实施例3发酵培养条件的优化
采用单因素分析法对菌株Xyn-1培养条件进行优化，确定最佳的培养条件：培养基用量25mL/250mL锥形瓶，培养温度45℃，摇瓶转速200r/min，菌悬液浓度为5×106个/mL，每瓶接种量为1.0mL，初始pH7.0，发酵时间为72小时。培养基组成的优化：
通过单因素分析法确定与Xyn-1产酶的培养基相关9因素。采用Plackett-Burman设计筛选产酶重要影响因子，选用试验次数N＝12的设计，对培养基中的乳糖、麦芽糖、木聚糖、酵母粉、蛋白胨、氯化钠、硫酸镁、硫酸铵和磷酸二氢钾(％)等9个因素进行考察，结果见表1～2，对产酶影响的顺序为：木聚糖>酵母粉>磷酸二氢钾>蛋白胨。
表1菌株Xyn-1培养因素Plackett-Burman设计试验
| 实验组 | A | B | (C) | D | E | F | G | H | I | J | (K) | 酶活(IU/mL) |
| 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | 1 | 3279.24 |
| 2 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | -1 | -1 | 3391.19 |
| 3 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | 1 | 1 | 3267.78 |
| 4 | -1 | -1 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 3011.58 |
| 5 | -1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | 3311.02 |
| 6 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 3138.08 |
| 7 | 1 | 1 | -1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 | 3395.20 |
| 8 | 1 | -1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 3084.53 |
| 9 | -1 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | -1 | 3154.11 |
| 10 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | 3178.16 |
| 11 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | 3239.72 |
| 12 | 1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 3161.27 |
对三个重要因素，即木聚糖、酵母粉、磷酸二氢钾，进行了基于Box-Behnken的中心组合设计，设计了3因素的3水平的共17组实验点，完成响应面分析优化，如表2所示。
表2菌株Xyn-1发酵条件Box-Behnken组合设计实验
分析过程中建立了二次响应面回归模型，以分析出最优响应因子水平，得到拟合二次回归方程如下：
二次相应面回归模型是显著的(R2＝0.9884)，模型拟合程度很好，说明该模型回归显著，所以该模型可以用于菌株Xyn-1产酶发酵条件优化的理论预测。通过数据分析，模型提出该过程的最佳发酵培养基条件：木聚糖10.7g，酵母粉5.6g，蛋白胨2g，NH4NO34g，(NH4)2SO46g，KH2PO40.9g，MgSO4·7H2O1g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，模型预测的发酵产酶最高水平达5653.11IU/mL，相较于初始发酵水平的3245.5IU/mL，利用该优化方法能显著提高菌株Xyn-1的发酵产酶能力。
实施例4发酵产耐高温木聚糖酶
斜面培养基：采用牛肉膏蛋白胨培养基，具体配方：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂20g，溶解在1000mL蒸馏水中，pH7.4-7.6。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂20g，溶解在1000mL蒸馏水中，pH7.0～7.2，灭菌121℃，20min。
发酵培养基：木聚糖10.7g，酵母粉5.6g，蛋白胨2g，NH4NO34g，(NH4)2SO46g，KH2PO40.9g，MgSO4·7H2O1g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，pH自然；
将菌株Xyn-1首先接种至斜面培养基，置于37℃下，培养48～72h。从斜面上挑单菌落至250mL锥形瓶中，锥形瓶中装有LB培养基，装液量为25mL/250mL锥形瓶，在37℃条件下置于200～250r/min的摇床中，培养12h，获得一级种子。通过对一级种子的计数，控制发酵的接种量为1mL(菌悬液浓度为5×106个/mL)。
产酶发酵培养条件为：发酵培养基用量25mL/250mL锥形瓶，培养温度45℃，摇床转速200r/min，菌悬液浓度为5×106个/mL，每瓶接种量为1mL，初始pH7.0，发酵时间为72h，发酵结束，测定发酵液中耐高温木聚糖酶的酶活。木聚糖酶(Xylanase)测定方法参照文献(BaileyMJ,PeterB,andKaisaP.Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity[J].JournalofBiotechnology,1992,23(3):257-270.)，木聚糖酶活力单位(IU)定义为1min水解木聚糖底物生成1μmol木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。结果发现发酵水平高达5678.5IU/mL，将发酵液在5500r/min的转速下离心处理5min，收集上清液即为发酵酶液。
实施例5菌株Xyn-1产木聚糖酶降解玉米秸秆半纤维素的应用
1.玉米秸秆半纤维素的提取
回收的玉米秸秆进行粉碎处理，过筛得到平均粒度为2mm的秸秆原料。将处理后的秸秆样品洗涤烘干。称取10g烘干秸秆样品，向其中加入1％的NaOH溶液100mL，并在65℃条件下搅拌60min。反应结束后，加入乙醇/水(50/50体积比)溶剂，并通过过滤回收滤液。调节滤液pH至6.0，并置于4℃静置30min，随后将溶液在5000r/min条件下离心5min，移除上清液，回收沉淀并洗涤烘干即得实验用玉米秸秆半纤维素样品。
2.菌株Xyn-1产木聚糖酶降解玉米秸秆半纤维素
基于上述对于菌株Xyn-1的发酵过程的研究，确定该菌株产木聚糖酶的最佳培养条件，并以此进行产酶的应用。根据实施例4所述的过程，对菌株Xyn-1进行产酶培养并获得相应的发酵酶液，测定发酵液中耐高温木聚糖酶的酶活达5678.5IU/mL。称取0.5g制备的玉米秸秆半纤维素样品，并以100～150IU/g半纤维素的酶解比例加入木聚糖酶液，在55℃条件下进行酶解72h。反应结束后，过滤收集酶解液，利用HPLC法测定酶解液中各还原糖含量，并以此计算该过程的酶解效率。实验结果表明，利用菌株Xyn-1发酵制备的酶解液进行玉米秸秆半纤维素的降解，其木二糖收率近60％。
序列表
<110>南京工业大学
<120>一种高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌及其应用
<130>
<160>3
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>1455
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
aggttcggggtgctatactgcaagtcgagcgaaagagaaggagcttgctcctttgacgtt60
agcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctaccttatagtttgggataactccggg120
aaaccggggctaataccgaataatctgttccacctcatggtggaacactgaaagacggtt180
tcggctgtcgctataagatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctca240
ccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacac300
ggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgat360
ggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaaactctgttgtaagggaag420
aacaagtacagtagtaactggctgtaccttgacggtaccttattagaaagccacggctaa480
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taaagcgcgcgcaggcggtcctttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggag600
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cgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgca840
ttaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacggggg900
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<400>2
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ggytaccttgttacgact18
Claims (8)
1.一株高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌，其分类命名为球状赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)Xyn-1，已于2014年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCNO：M2014183。
2.权利要求1所述的高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌在发酵产木聚糖酶的应用。
3.权利要求1所述的高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌在降解秸秆半纤维素中的应用。
4.根据权利要求2所述的高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌在发酵产木聚糖酶的应用，其特征在于包括如下步骤：
1）斜面培养：将球状赖氨酸芽孢杆菌Xyn-1接种至斜面培养基上，37℃下，培养48~72h；
2）种子培养：挑取步骤1）斜面上的单菌落于LB培养基中，在37℃条件下置于200~250r/min的摇床中，培养12h，获得种子液；
3）发酵产酶：将步骤2）中的种子液接种至发酵培养基中，接种量为按体积比1~10%接种，45℃下发酵72h制备含耐高温木聚糖酶的发酵液。
5.根据权利要求4所述的高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌在发酵产木聚糖酶的应用，其特征在于：步骤1）所述斜面培养基为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂20g，溶解在1000mL蒸馏水中，pH7.4-7.6。
6.根据权利要求4所述的高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌在发酵产木聚糖酶的应用，其特征在于：步骤2）所述LB培养基为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂20g，溶解在1000mL蒸馏水中，pH7.0~7.2。
7.根据权利要求4所述的高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌在发酵产木聚糖酶的应用，其特征在于：步骤3）所述发酵培养基为：木聚糖10.7g，酵母粉5.6g，蛋白胨2g，NH4NO34g，(NH4)2SO46g，KH2PO40.9g，MgSO4·7H2O1g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，pH自然。
8.根据权利要求3所述的高产耐高温木聚糖酶的球状芽孢杆菌在降解秸秆半纤维素中的应用，其特征在于：将球状赖氨酸芽孢杆菌Xyn-1发酵得到含耐高温木聚糖酶的发酵液，以100~150IU/g半纤维素的酶解比例加入含耐高温木聚糖酶的发酵液，在55℃条件下酶解72h。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160518 |