CN113862189A - 玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂及其制备方法 - Google Patents

玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂及其制备方法，该玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂包括阿氏芽孢杆菌C1TB‑10、短小芽孢杆菌C1TB‑17、阴沟肠杆菌C1TB‑26、恶臭假单胞菌C1GB‑15、植物乳杆菌C1GB‑21、微黄青霉C1TF‑23；且阿氏芽孢杆菌C1TB‑10、短小芽孢杆菌C1TB‑17、阴沟肠杆菌C1TB‑26、恶臭假单胞菌C1GB‑15、植物乳杆菌C1GB‑21、微黄青霉C1TF‑23按体积比为1：1：1：1：1：1的比例混合制成。本发明采用多种微生物菌株复配而成，通过添加外源植物促生菌、益生菌和生防菌一体化微生物制剂，达到促进植物生长，改善土壤环境和肥效，抑制土传病原菌生长，提高植物抗病性的目的。

Description

玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物制剂技术领域，特别是涉及玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂及其制备方法。
背景技术
甘肃省气候呈现东南湿润、中部干旱和西北高寒的特征，使得中晚熟玉米品种种植数量较多，生育期偏长，环境条件与物候期延长为病虫害发生创造了良好的生存环境；另一方面，河西玉米种植连续多年作业，致使土壤中的病残体和病原菌源基数累积上升，氮肥的过量施用和大水漫灌使得土传病害得以广泛传播。
玉米病害已成为我国玉米种植业减产、减收的最主要问题，同时使农民的经济效益受到损害。化学防治虽然能够在极短的时间内，在大范围内预防和控制玉米病害的患病率，但随之而来的是病菌和虫害产生抗药性、农药残留过多，环境污染严重，人类健康受到威胁等问题。生物防治避免了化学农药使用带来的一系列植保、环境、能源和健康等方面的问题。
微生物制剂对植物促生作用，通过植物根际或共生微生物产生植物激素改善植物生长，例如：吲哚乙酸、赤霉素、细胞***素和乙烯等；微生物产生维生素，如：烟酸、泛酸、生物素和VB12等，在生物体内是多种酶的辅酶或辅基；微生物生长过程分泌核酸类物质，促进植物根部对磷钾的吸收，增强植物光合作用。微生物将植物不易吸收的无机微量元素转化成易吸收的有机微量元素，促进植物吸收营养；微生物分泌的一些诱导物，提高土壤酶活性，有利于土壤养分的转化，改善植物对营养的吸收。
微生物制剂对植物生防作用，包括拮抗作用，生防菌通过分泌抗菌物质，如：抗生素、细菌素和其它抗菌蛋白等，改变了生存环境，从而抑制病原菌的生长；重寄生作用，生防菌株分泌的活性物质被病原菌识别，生防菌紧密缠绕病原菌菌丝，通过分泌胞外水解酶降解病原菌细胞壁，使菌丝断裂或解体，致使病原菌生长受阻；竞争作用，生防菌定植在植物体内，并快速繁殖，这一过程消耗大量营养，导致病原菌营养缺乏而抑制生长；诱导抗性，生防菌可以激发植物潜在的抗病性，从而起到防止病害发生的作用。
复合微生物制剂的功能性好于单一微生物制剂，本发明筛选出植物促生微生物、益生微生物和生防微生物3种功能性微生物，复配功能性微生物制备成制剂，也复配了其代谢产物和多种生物活性因子，使复合微生物制剂功能多元化，同时增强了制剂的稳定性。
发明内容
本发明提供了玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂及其制备方法。
本发明所采用的技术方案是：
玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂，玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂，包括阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26、恶臭假单胞菌C1GB-15、植物乳杆菌C1GB-21、微黄青霉C1TF-23；且阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26、恶臭假单胞菌C1GB-15、植物乳杆菌C1GB-21、微黄青霉C1TF-23按体积比为1：1：1：1：1：1的比例混合制成；
有效活菌数为：阿氏芽孢杆菌5.0×108cfu/g，短小芽孢杆菌4.0×108cfu/g，阴沟肠杆菌4.0×108cfu/g，恶臭假单胞菌6.0×108cfu/g，植物乳杆菌5.0×108cfu/g，微黄青霉6.0×108cfu/g；其中，
阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)C1TB-10在细菌培养基菌落呈乳白色，表面凸起，光滑，不透明，边缘整齐；该菌为植物促生菌，产植物激素，于2021年9月9日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC32850；
所述短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)C1TB-17在细菌培养基上菌落成乳白色，表面皱褶，边缘不整齐；菌体呈杆状，两端钝圆；该菌为植物益生菌，有钝化土壤重金属，改善土壤质量的功能，于2021年9月9日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC32852；
所述阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)C1TB-26在细菌培养基菌落较小，表面凸起，呈微黄色，不透明，短杆状，无芽孢；该菌株为植物促生菌，有溶磷固氮，改善土壤微生物菌群结构的功能，于2021年9月9日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC30522；
所述恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)C1GB-15在细菌培养基菌落呈白色，表面光滑，边缘整齐，菌体呈短杆状；为植物生防菌，有抑制病原菌生长，产植物激素的功能，于2021年9月9日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC 31637；
所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)C1GB-21在细菌培养基菌落呈乳白色，圆形，表面光滑，不透明；该菌为植物益生菌，有产生多种氨基酸，维生素，促进植物生长，防治病原菌的功能，于2021年9月9日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC 31252；
所述微黄青霉(Penicilliumminioluteum)C1TF-23在真菌培养基菌落由最初的白色变为暗绿色，菌丝呈紧密绒状，菌丝为有隔菌丝，菌丝被分隔成多个细胞，顶端不形成膨大顶囊，分生孢子链呈帚状，分生孢子呈椭圆形；该菌为植物生防菌，有抑制病原菌生长的功能，于2021年9月9日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC 61609。
本发明还提供了玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：微生物斜面种子的制备：将阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26、恶臭假单胞菌C1GB-15接种于细菌固体斜面培养基，30℃恒温培养48h后，即为种子斜面；将植物乳杆菌C1GB-21接种于MRS固体斜面培养基，37℃恒温培养48h后，即为种子斜面；将微黄青霉C1TF-23接种于真菌固体斜面培养基，30℃恒温培养48h后，即为种子斜面；
步骤二：微生物液体种子的培养：将阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26、恶臭假单胞菌C1GB-15接种于细菌液体培养基，在温度为30℃，转速为200r/min震荡培养30h后，即为液体种子；将植物乳杆菌C1GB-21接种于MRS液体培养基，在温度为37℃，转速为200r/min震荡培养30h后，即为液体种子；将微黄青霉C1TF-23接种于真菌液体斜面培养基，在温度为30℃，转速为200r/min震荡培养30h后，即为液体种子；
步骤三：菌株液体扩大培养：将阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26、恶臭假单胞菌C1GB-15接种于50L发酵罐中，培养基为细菌液体培养基，接种量为10％，在温度为30℃，转速为200r/min培养30h，直至阿氏芽孢杆菌C1TB-10菌液中有效活菌数为5×108CFU/mL，短小芽孢杆菌C1TB-17菌液中有效活菌数为4×108CFU/mL，阴沟肠杆菌C1TB-26菌液中有效活菌数为5×108CFU/mL，恶臭假单胞菌C1GB-15菌液中有效活菌数为6×108CFU/mL；
将植物乳杆菌C1GB-21接种于50L发酵罐中，培养基为MRS液体培养基，接种量为10％，在温度为37℃，转速为200r/min培养30h，直至植物乳杆菌C1GB-21菌液中有效活菌数为4×108CFU/mL；
将微黄青霉C1TF-23接种于50L发酵罐中，培养基为真菌液体培养基，接种量为10％，在温度为30℃，转速为200r/min培养36h，直至菌液中有效活孢子数为6×108CFU/mL；
步骤四：微生物制剂的制备：将步骤三中分别扩大培养的微生物菌剂按体积比1：1：1：1：1：1混合均匀，即得到玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂；
步骤五：微生物菌肥的制备：将步骤四的玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂与有机肥按体积比1:20混合均匀后，即得到玉米促生、益生、生防微生物菌肥。
其中，步骤一、步骤二、步骤三中细菌固体斜面培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH至7.0；在121℃高压蒸汽灭菌20min；
MRS固体斜面培养基为：酪蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，Tween 801g，磷酸氢二钾2g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH至6.8；在121℃高压蒸汽灭菌20min；
真菌固体斜面培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml,自然PH；马铃薯洗净去皮后称取200g并切成小块，加水煮沸20分钟，用八层纱布过滤，加热，加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，高压121℃灭菌20分钟后备用。
其中，步骤二和步骤三中的液体培养基相同，且与步骤一中细菌、MRS、真菌培养基相同，区别为不添加琼脂。
本发明采用的是复合微生物制剂，其中阿氏芽孢杆菌可合成铁载体，产生吲哚乙酸(IAA)等植物激素，对植物的生长促进作用具有广谱性；还可以保护植物，预防重金属、亚硝酸盐对植物的毒害作用，促进磷钾肥吸收。短小芽孢杆菌具有钝化土壤重金属的功能，修复土壤污染，促进植物生长；同时分泌多种抗菌物质，抑制多种土传病原真菌的生长。阴沟肠杆菌具有溶磷、固氮的作用，改善土壤细菌菌群多样性，提高土壤酶活和肥效；同时对植物病害具有生防效果。恶臭假单胞菌通过较强的定植能力，充分利用根分泌物和根际土壤中的养料，减少病原菌生长所必须的营养物质，从而抑制病原菌生长；还可以产生抗生素、铁载体及其他促生物质，促进植物生长。植物乳杆菌产生多种氨基酸和维生素，促进植物根部营养吸收能力；产生大量乳酸和细菌素，有效抑制有害菌的生长，具有良好的益生功能。微黄青霉通过分泌代谢产物，及通过营养竞争、重寄生、抗生作用等方面抑制病原菌的生长，还能产生吲哚乙酸等植物激素。以上菌株无相互拮抗，相互抑制作用，不同菌株有不同功能，菌株复配后形成复合微生物制剂，通过外源添加的额方式施用于土壤，经过大量繁殖形成优势菌群，从而达到对植物促生、益生、生防的效果。
本发明的优点如下：
(1)本发明微生物制剂由具有促生、益生、生防3种功能的6种微生物复配而成，菌株之间无抑制作用，6种功能性微生物菌种协同作用，共同发挥促生、益生、生防的作用；
(2)本发明微生物制剂中促生菌株，不仅分泌大量的植物激素，促进植物生长，同时具有解磷固氮，提高土壤肥效，改善土壤微生物菌群结构的作用；
(3)本发明微生物制剂中益生菌株，不仅可以分泌植物激素，产生多种氨基酸，维生素等有益于植物生长的物质，还具有抑制病原菌生长的功能；
(4)本发明微生物制剂中生防菌株，不仅具有较好的抑制病原菌生长，防治植物病害发生的作用，还可以分泌植物激素，促进植物健康生长；
(5)本发明微生物制剂与有机肥混合均匀后施用，实现了农牧废弃物循环利用，减少了畜禽粪便的污染，还提高了土壤肥效，更有利于植物生长；
(6)本发明微生物制剂施用后同时发挥了植物促生、益生及生防的功效，且生产工艺简单，便于实现工业化生产。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，都属于本发明保护的范围。
实施例1
功能菌株的筛选
(1)菌株的分离纯化
微生物菌株筛选分离自甘肃河西玉米制种基地健康玉米根部根际土壤，具体为：取10g健康当归根际土样，加入到装有100mL无菌水的三角瓶中，在200rpm在摇床上震荡30min后，取1mL混匀后的液体土样，加入到新的装有9mL无菌水的试管中，在震荡器中震荡5min后，再取1mL液体土样加到新的装有9mL无菌水的试管中，直至将土样稀释到10-8。依次选取10-4、10-5、10-6和10-7浓度的土样，分别吸取100μL涂布于细菌固体培养基、MRS固体培养基和真菌固体培养基上，在30℃恒温培养，待菌物长出后通过平板划线法，分离纯化出菌株，将菌株制成斜面，4℃保存备用。
细菌固体斜面培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH至7.0。在121℃高压蒸汽灭菌20min。
MRS固体斜面培养基为：酪蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，Tween 801g，磷酸氢二钾2g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.8。在121℃高压蒸汽灭菌20min。
真菌固体斜面培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml,自然PH。马铃薯洗净去皮后称取200g并切成小块，加水煮沸20分钟，用八层纱布过滤，加热，加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，高压121℃灭菌20分钟后备用。
(2)菌株解磷能力测定
将菌株分别接种于PKO无机磷培养基，28℃、180r/min培养48h，采用钼锑抗显色法测定解磷的能力，取菌株培养液于10000r/min离心15min，吸取上清液2～10mL于50mL容量瓶中，用水稀释至20mL，加2,6-二硝基酚指示剂2滴，用10％氢氧化钠或稀硫酸溶液调节pH至溶液刚呈微黄色，然后加入钼锑抗显色剂5mL，摇匀，定容至刻度。在室温20℃～25℃下放置30min，测定OD690值。
PKO无机磷培养基为：(NH4)2SO40.1g，蔗糖10.0g，NaCl 0.5g，KCl 0.2g，MgSO40.1g，FeSO40.03g，MnSO40.03g，Ca3(PO4)23.0g，酵母浸粉0.5g，蒸馏水1000mL；
(3)菌株固氮能力测定
采用划线接种的方法，挑取菌株划线于Ashby固体培养基上，在30℃下培养10天，连续转接3次，第3次依然能在Ashby培养基上生长的细菌则可被视为具有固氮能力。
所述Ashby培养基为：KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g,CaCO35.0g,甘露醇10.0g,CaSO4·2H2O 0.1g,蒸馏水1000mL，pH6.8～7.0。
(4)菌株分泌吲哚乙酸的定量测定
IAA标准曲线的绘制
配置100μg/mL的IAA母液，用蒸馏水进行梯度稀释配置5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL和25μg/mL，每组设3组重复实验。采用Salkowski法进行测定，吸取待测液1mL，滴加1mL Salkowski比色液，在避光条件下显色30min后，迅速用分光光度计进行比色(530nm)，统计数据绘制标准曲线。
菌株分泌IAA的定量测定
将菌株分别接种于含有L-色氨酸的细菌培养液中，28℃、180r/min培养48h，于10000r/min离心10min，吸取离心上清液1mL，加4mL Salkowski比色液，在避光条件下显色30min后，迅速用分光光度计进行比色(530nm)。测量三组数据，结果取平均值，在标准曲线上找到相对应的产IAA的量。
Salkowski比色液：50mL35％HCLO4+1mL0.5mol/LFeCL3。
(5)菌株分泌赤霉素的定量测定
标准曲线的绘制
分别配制浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、3.0μg/mL的标准赤霉素溶液，取5mL标准液溶于适量的70％(体积分数)乙醇中，取0.5mL加入4.5mL98％(体积分数)浓硫酸混匀后定容至25mL，测定反应产物在412nm处的吸光值。绘制相应的标准曲线。
菌株分泌赤霉素的定量测定
将菌株分别接种于细菌培养液中，28℃、180r/min培养48h，于10000r/min离心10min，取5mL发酵液溶于适量的70％乙醇中，取0.5mL加入4.5mL98％浓硫酸混匀后定容至25mL，在412nm下测定吸光度。测量三组数据，结果取平均值，在标准曲线上找到相对应的产赤霉素的量。
(6)病原菌拮抗菌株筛选
病原菌的筛选：从甘肃河西玉米制种基地中采集玉米茎腐病和玉米枯纹病病株，经真菌平板分离筛选，分别从玉米病株中分离筛选出病原微生物，通过真菌ITS特异区鉴定，病原菌分别为谷禾镰刀菌(Fusariumgraminearum)和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)。
抑菌实验：配制营养琼脂固体培养基，取病原微生物谷禾镰刀菌和立枯丝核菌4mm菌饼，放置在培养皿中央部位，在30℃恒温培养24h后，再分别取各个菌株菌饼，放置在距离病原菌约25mm的上下左右4个方位，每个处理3次重复，同时设置空白对照组；30℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，观察抑菌效果，测定抑菌率。抑菌率(％)＝(对照生长半径-处理生长半径)/对照生长半径×100％。
营养琼脂固体培养基为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0。121℃高压灭菌20min后，倒入培养皿中。
(7)功能菌株的鉴定
1)细菌菌株鉴定
采用试剂盒法(OMEGA美国)提取各个菌株的基因组DNA，选择细菌16SrDNA通用引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'扩增，扩增产物送上海生工测序，所得的DNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对分析。
2)真菌菌株的鉴定
采用试剂盒法(OMEGA美国)提取各个菌株的基因组DNA，选择真菌ITS通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’、ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’扩增，扩增产物送上海生工测序，所得的DNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对分析。
(8)结果
经鉴定C1TB-10为阿氏芽孢杆菌，具有最佳的产吲哚乙酸和赤霉素的能力，同时具有固氮和解磷能力。该菌株于2021年保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC 32850；
C1TB-17为短小芽孢杆菌具有最佳解磷能力，同时可以产吲哚乙酸和赤霉素，对病原菌有一定的抑制效果。该菌株于2021年保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC 32852；
C1TB-26为阴沟肠杆菌具有最佳的产赤霉素和吲哚乙酸的能力，同时具有固氮和解磷能力。该菌株于2021年保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC 30522；
C1GB-15为恶臭假单胞菌有较好的抑制病原菌生长的功能，同时可以产吲哚乙酸。该菌株于2021年保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC31637；
C1GB-21为植物乳杆菌有较好的产吲哚乙酸的功能，且有一定的抑制病原菌生长的功效。该菌株于2021年保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC 31252；
C1TF-23为微黄青霉具有最佳的抑菌效果。该菌株于2021年保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC 61609；
表1微生物菌株功能性测定结果
Figure BDA0003310063420000111
Figure BDA0003310063420000121
实施例2
玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：微生物斜面种子的制备：将阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26、恶臭假单胞菌C1GB-15接种于细菌固体斜面培养基，30℃恒温培养48h后，即为种子斜面；将植物乳杆菌C1GB-21接种于MRS固体斜面培养基，37℃恒温培养48h后，即为种子斜面；将微黄青霉C1TF-23种于真菌固体斜面培养基，30℃恒温培养48h后，即为种子斜面。
细菌固体斜面培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH至7.0。在121℃高压蒸汽灭菌20min。
MRS固体斜面培养基为：酪蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，Tween 801g，磷酸氢二钾2g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.8。在121℃高压蒸汽灭菌20min。
真菌固体斜面培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml,自然PH。马铃薯洗净去皮后称取200g并切成小块，加水煮沸20分钟，用八层纱布过滤，加热，根据实际需要加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，高压121℃灭菌20分钟后备用。
步骤二：微生物液体种子的培养：将阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26、恶臭假单胞菌C1GB-15接种于细菌液体培养基，在温度为30℃，转速为200r/min震荡培养30h后，即为液体种子；将植物乳杆菌C1GB-21接种于MRS液体培养基，在温度为37℃，转速为200r/min震荡培养30h后，即为液体种子；将微黄青霉C1TF-23种于真菌液体斜面培养基，在温度为30℃，转速为200r/min震荡培养30h后，即为液体种子。
所述液体培养基与步骤一中细菌、MRS、真菌培养基相同，区别为不添加琼脂。
步骤三：菌株液体扩大培养：将阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26、恶臭假单胞菌C1GB-15分别接种于50L发酵罐中，培养基为细菌液体培养基，接种量为10％，在温度为30℃，转速为200r/min培养30h，直至阿氏芽孢杆菌C1TB-10菌液中有效活菌数为5×108CFU/mL，短小芽孢杆菌C1TB-17菌液中有效活菌数为4×108CFU/mL，阴沟肠杆菌C1TB-26菌液中有效活菌数为5×108CFU/mL，恶臭假单胞菌C1GB-15菌液中有效活菌数为6×108CFU/mL。将植物乳杆菌C1GB-21接种于50L发酵罐中，培养基为MRS液体培养基，接种量为10％，在温度为37℃，转速为200r/min培养30h，直至植物乳杆菌C1GB-21菌液中有效活菌数为4×108CFU/mL。
将微黄青霉C1TF-23接种于50L发酵罐中，培养基为真菌液体培养基，接种量为10％，在温度为30℃，转速为200r/min培养36h，直至菌液中有效活孢子数为6×108CFU/mL。
所述细菌液体培养基、MRS液体培养基和真菌液体培养基与步骤二相同。
步骤四：微生物制剂的制备：将步骤三中分别扩大培养的微生物菌剂按体积比1：1：1：1：1：1混合均匀，即得到玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂。
步骤五：微生物菌肥的制备：将步骤四的玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂与有机肥按体积比1:20混合均匀后，即得到玉米促生、益生、生防微生物菌肥。
实施例3
玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂的制备方法，与实施例2不同之处在于，菌株液体扩大培养：将阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26，恶臭假单胞菌C1GB-15分别接种于50L发酵罐中，培养基为细菌液体培养基，接种量为10％，在温度为30℃，转速为200r/min培养30h，直至阿氏芽孢杆菌C1TB-10菌液中有效活菌数为4×108CFU/mL，短小芽孢杆菌C1TB-17菌液中有效活菌数为6×108CFU/mL，阴沟肠杆菌C1TB-26菌液中有效活菌数为4×108CFU/mL，恶臭假单胞菌C1GB-15菌液中有效活菌数为5×108CFU/mL。将植物乳杆菌C1GB-21接种于50L发酵罐中，培养基为MRS液体培养基，接种量为10％，在温度为37℃，转速为200r/min培养30h，直至植物乳杆菌C1GB-21菌液中有效活菌数为6×108CFU/mL。将微黄青霉C1TF-23接种于50L发酵罐中，培养基为真菌液体培养基，接种量为10％，在温度为30℃，转速为200r/min培养36h，直至菌液中有效活孢子数为5×108CFU/mL。将分别扩大培养的微生物菌剂按体积比1：1：1：1：1：1混合均匀，即得到玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂，将玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂与有机肥按体积比1:20混合均匀后，即得到玉米促生、益生、生防微生物菌肥。
实施例4
玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂的制备方法，与实施例2不同之处在于，菌株液体扩大培养：将阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26、恶臭假单胞菌C1GB-15分别接种于50L发酵罐中，培养基为细菌液体培养基，接种量为10％，在温度为30℃，转速为200r/min培养30h，直至阿氏芽孢杆菌C1TB-10菌液中有效活菌数为5×108CFU/mL，短小芽孢杆菌C1TB-17菌液中有效活菌数为6×108CFU/mL，阴沟肠杆菌C1TB-26菌液中有效活菌数为5×108CFU/mL，恶臭假单胞菌C1GB-15菌液中有效活菌数为4×108CFU/mL。将植物乳杆菌C1GB-21接种于50L发酵罐中，培养基为MRS液体培养基，接种量为10％，在温度为37℃，转速为200r/min培养30h，直至植物乳杆菌C1GB-21菌液中有效活菌数为6×108CFU/mL。将微黄青霉C1TF-23接种于50L发酵罐中，培养基为真菌液体培养基，接种量为10％，在温度为30℃，转速为200r/min培养36h，直至菌液中有效活孢子数为4×108CFU/mL。将分别扩大培养的微生物菌剂按体积比1：1：1：1：1：1混合均匀，即得到玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂，将玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂与有机肥按体积比1:20混合均匀后，即得到玉米促生、益生、生防微生物菌肥。
实施例5
田间应用效果：
将实施例2、实施例3和实施例4制备的微生物菌肥施用于甘肃河西地区玉米制种基地，同时设置不添加菌剂空白对照组，每个处理3个重复，试验采用完全随机区组设计。统计玉米产量、茎腐病和枯纹病发病率。
试验结果：与对照组相比，实施例2、实施例3和实施例4施用玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂后，玉米常见病害茎腐病和枯纹病发病率均有不同程度降低，制种玉米产量均有明显提高。说明本发明玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂，能够缓解玉米茎腐病和枯纹病的发病率，同时改善玉米根部生态环境，促进玉米生长，提高玉米制种产量。
表2微生物制剂对玉米产量及病害防治的效果
Figure BDA0003310063420000161
指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂，其特征在于：包括阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26、恶臭假单胞菌C1GB-15、植物乳杆菌C1GB-21、微黄青霉C1TF-23；且阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26、恶臭假单胞菌C1GB-15、植物乳杆菌C1GB-21、微黄青霉C1TF-23按体积比为1：1：1：1：1：1的比例混合制成；
有效活菌数为：阿氏芽孢杆菌5.0×108cfu/g，短小芽孢杆菌4.0×108cfu/g，阴沟肠杆菌4.0×108cfu/g，恶臭假单胞菌6.0×108cfu/g，植物乳杆菌5.0×108cfu/g，微黄青霉6.0×108cfu/g；其中，
阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)C1TB-10，于2021年9月9日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC 32850；
所述短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)C1TB-17，于2021年9月9日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC 32852；
所述阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)C1TB-26，于2021年9月9日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC 30522；
所述恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)C1GB-15，于2021年9月9日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC 31637；
所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)C1GB-21，于2021年9月9日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC 31252；
所述微黄青霉(Penicilliumminioluteum)C1TF-23，于2021年9月9日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏号：GSICC 61609。
2.根据权利要求1所述的玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：微生物斜面种子的制备：将阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26、恶臭假单胞菌C1GB-15接种于细菌固体斜面培养基，30℃恒温培养48h后，即为种子斜面；将植物乳杆菌C1GB-21接种于MRS固体斜面培养基，37℃恒温培养48h后，即为种子斜面；将微黄青霉C1TF-23接种于真菌固体斜面培养基，30℃恒温培养48h后，即为种子斜面；
步骤二：微生物液体种子的培养：将阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26、恶臭假单胞菌C1GB-15接种于细菌液体培养基，在温度为30℃，转速为200r/min震荡培养30h后，即为液体种子；将植物乳杆菌C1GB-21接种于MRS液体培养基，在温度为37℃，转速为200r/min震荡培养30h后，即为液体种子；将微黄青霉C1TF-23接种于真菌液体斜面培养基，在温度为30℃，转速为200r/min震荡培养30h后，即为液体种子；
步骤三：菌株液体扩大培养：将阿氏芽孢杆菌C1TB-10、短小芽孢杆菌C1TB-17、阴沟肠杆菌C1TB-26、恶臭假单胞菌C1GB-15接种于50L发酵罐中，培养基为细菌液体培养基，接种量为10％，在温度为30℃，转速为200r/min培养30h，直至阿氏芽孢杆菌C1TB-10菌液中有效活菌数为5×108CFU/mL，短小芽孢杆菌C1TB-17菌液中有效活菌数为4×108CFU/mL，阴沟肠杆菌C1TB-26菌液中有效活菌数为5×108CFU/mL，恶臭假单胞菌C1GB-15菌液中有效活菌数为6×108CFU/mL；
将植物乳杆菌C1GB-21接种于50L发酵罐中，培养基为MRS液体培养基，接种量为10％，在温度为37℃，转速为200r/min培养30h，直至植物乳杆菌C1GB-21菌液中有效活菌数为4×108CFU/mL；
将微黄青霉C1TF-23接种于50L发酵罐中，培养基为真菌液体培养基，接种量为10％，在温度为30℃，转速为200r/min培养36h，直至菌液中有效活孢子数为6×108CFU/mL；
步骤四：微生物制剂的制备：将步骤三中分别扩大培养的微生物菌剂按体积比1：1：1：1：1：1混合均匀，即得到玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂；
步骤五：微生物菌肥的制备：将步骤四的玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂与有机肥按体积比1:20混合均匀后，即得到玉米促生、益生、生防微生物菌肥。
3.根据权利要求2所述的玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤一中所述细菌固体斜面培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH至7.0；在121℃高压蒸汽灭菌20min；
所述MRS固体斜面培养基为：酪蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，Tween 801g，磷酸氢二钾2g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH至6.8；在121℃高压蒸汽灭菌20min；
所述真菌固体斜面培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml,自然PH；马铃薯洗净去皮后称取200g并切成小块，加水煮沸20分钟，用八层纱布过滤，加热，加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，高压121℃灭菌20分钟后备用。
4.根据权利要求1所述的玉米促生、益生、生防菌肥一体化制剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤二和步骤三中的液体培养基相同，且与步骤一中细菌、MRS、真菌培养基相同，区别为不添加琼脂。
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