CN104328097A - 一种枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，属于微生物发酵技术领域。该方法包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌菌液接种到发酵培养基中，在温度34～38℃、pH值6.3～6.8条件下发酵培养48～72小时；所述发酵培养基为：以质量百分比计，乳糖1.5～2.5％、NH4Cl1～2％、MgSO40.5～0.7％，余量为水。本发明采用枯草芽孢杆菌1.1111(CCTCC NO:M2011286)为发酵菌株，通过优化发酵培养基组成及发酵培养条件，使菌株产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的活性达到最佳，其中纤维素酶酶活达206.72U/ml，甘露聚糖酶酶活达1451.37U/ml，糖化酶酶活达254.72U/ml。本发明采用一菌多酶发酵法，能大幅度提高酶的生产效率，降低生产成本，并且由于各种酶来源于同一菌株，其安全性与复配性能更优。

Description

一种枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，属于微生物发酵技术领域。 
背景技术
饲用酶制剂是一类高效、无毒副作用的环保型“绿色”饲料添加剂，广泛应用于在动物生产中。酶制剂可大大提高动物的生产性能，缓解饲料资源短缺、人畜争粮的局面，有利于保障粮食安全，提供更为安全，优质的动物产品，有利于保障食品安全，减轻环境污染，保障畜禽养殖业的可持续发展。 
早期的酶制剂以动植物作为原料直接提取，但动植物生长周期长，原料有限，加之酶提取工艺复杂等，不适于大规模工业生产。而微生物在酶制剂的生产中有其他生物不可比拟的优越性：微生物对外界环境有很强的适应性和变异能力，人们可利用基因工程和生物学技术按照自己的意愿对微生物进行改造，生产出目的酶；微生物对营养物质的要求不高，大部分是农产品废弃物，价格低廉，易得到，生产成本低；微生物繁殖快，生长周期短，有利于提高酶制剂的产量等。 
研究表明，复合酶制剂较单一酶制剂能更好地改善动物的生产性能，达到生物功能的多样化。但是，目前所应用的复合酶制剂均由不同的菌株单独发酵生产后按照一定的比例混合制成，生产成本过高，复合酶产品质量不稳定，且使用不方便。 
发明内容
本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法。 
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是： 
一种枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌菌液接种到发酵培养基中，在温度34～38℃、pH值6.3～6.8条件下发酵培养48～72小时；所述发酵培养基为：以质量百分比计，乳糖1.5～2.5％、NH4Cl1～2％、MgSO40.5～0.7％，余量为水。 
所述发酵培养的优选条件为：温度36℃，pH值6.5，发酵时间60小时。 
所述发酵培养基优选为：以质量百分比计，乳糖2％、NH4Cl1.5％、MgSO40.6％，余量为水。 
所述枯草芽孢杆菌菌液的制备方法为：将活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，在温度37℃下(180r/min振荡)培养18～24小时；所述种子培养基为：以质量百分比计，蛋白胨1％、酵母浸出物0.5％、NaCl0.5％，余量为水，pH值7.2～7.6。 
所述枯草芽孢杆菌菌液的浓度为5×108～8×108CFU/ml，接种量为3～6％。优选接种量为4％。 
所述活化的枯草芽孢杆菌的制备方法为：将冻干保存的枯草芽孢杆菌接种到普通琼脂培养基中，在温度37℃下培养18～24小时；所述普通琼脂培养基为：以质量百分比计，蛋白胨1％、NaCl0.5％、牛肉膏1％、琼脂粉2％，余量为水，pH值7.2～7.6。 
所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌1.1111(Bacillus subtilis)，保藏编号：CCTCC NO:M2011286，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2011年8月11日，保藏地址：中国武汉市武汉大学。 
所述枯草芽孢杆菌1.1111(Bacillus subtilis)能产生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶、淀粉酶、纤维素酶等多种酶，并对胆酸盐、人工胃液及肠液等表现很强的耐受性。 
本发明的有益效果： 
本发明采用枯草芽孢杆菌1.1111(CCTCC NO:M2011286)为发酵菌株，通过优化发酵培养基组成(如碳源、氮源和无机盐)及发酵培养条件(如发酵温度、pH值、发酵时间和接种量)，使菌株产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的活性达到最佳，其中纤维素酶酶活达206.72U/ml，甘露聚糖酶酶活达1451.37U/ml，糖化酶酶活达254.72U/ml。 
本发明采用一菌多酶发酵法生产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶，能大幅度提高酶的生产效率，降低生产成本，并且由于各种酶来源于同一菌株，其安全性与复配性能更优。为进一步实现共发酵产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、糖化酶等奠定了基础，具有重要的研究与开发意义。 
附图说明
图1为本发明试验例中不同碳源对菌株产酶的影响； 
图2为试验例中不同氮源对菌株产酶的影响； 
图3为试验例中不同无机盐对菌株产酶的影响； 
图4为试验例中葡萄糖的标准曲线； 
图5为试验例中甘露糖的标准曲线。 
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。 
实施例1 
本实施例中枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，包括以下步骤： 
(1)将冻干保存的枯草芽孢杆菌接种到普通琼脂培养基中，在温度37℃下培养21小时；枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌1.1111(Bacillus subtilis)，保藏编号：CCTCC NO:M2011286，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2011年8月11日，保藏地址：中国武汉市武汉大学；普通琼脂培养基为：以质量百分比计，蛋白胨1％、NaCl0.5％、牛肉膏1％、琼脂粉2％，余量为水，pH值7.4； 
(2)挑取活化的枯草芽孢杆菌单个菌落接种到种子培养基中，在温度37℃下振荡(180r/min)培养21小时，得到枯草芽孢杆菌菌液，菌液浓度为6×108CFU/ml；种子培养基为：以质量百分比计，蛋白胨1％、酵母浸出物0.5％、NaCl0.5％，余量为水，pH值7.4； 
(3)将枯草芽孢杆菌菌液接种到发酵培养基中，在温度36℃、pH值6.5条件下发酵培养60小时(180r/min振荡)；枯草芽孢杆菌菌液的接种量为4％；发酵培养基为：以质量百分比计，乳糖2％、NH4Cl1.5％、MgSO40.6％，余量为水。 
实施例2 
本实施例中枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌菌液接种到发酵培养基中，在温度38℃、pH值6.3条件下发酵培养48小时(180r/min振荡)；枯草芽孢杆菌菌液的接种量为3％；发酵培养基为：以质量百分比计，乳糖2.5％、NH4Cl2％、MgSO40.7％，余量为水。枯草芽孢杆菌菌液的制备方法同实施例1。 
实施例3 
本实施例中枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌菌液接种到发酵培养基中，在温度34℃、pH值6.8条件下发酵培养72小时(180r/min振荡)；枯草芽孢杆菌菌液的接种量为6％；发酵培养基为：以质量百分比计，乳糖1.5％、NH4Cl1％、MgSO40.5％，余量为水。枯草芽孢杆菌菌液的制备方法同实施例1。 
试验例 
一、菌种 
菌种：枯草芽孢杆菌1.1111(Bacillus subtilis)，保藏编号：CCTCC NO:M2011286，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2011年8月11日，保藏地址：中国武 汉市武汉大学。 
二、培养基 
普通琼脂培养基：以质量百分比计，蛋白胨1％、NaCl0.5％、牛肉膏1％、琼脂粉2％，余量为水，pH值7.2～7.6； 
种子培养基：以质量百分比计，蛋白胨1％、酵母浸出物0.5％、NaCl0.5％，余量为水，pH值7.2～7.6； 
基础发酵培养基：以质量百分比计，蔗糖1％、蛋白胨1％、NaCl0.5％，余量为水，pH值7.2～7.6。 
三、枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的培养基组分、用量及发酵条件优化试验 
1、菌种的活化 
将冻干保存的枯草芽孢杆菌(CCTCC NO:M2011286)接种到普通琼脂培养基中，在温度37℃下培养18～24小时，观察结果，保存备用。 
2、种子液的制备 
挑取活化的枯草芽孢杆菌单个菌落接种到种子培养基中，在温度37℃下振荡(180r/min)培养18～24小时，观察结果，保存备用。 
3、分别将种子液按5％比例接入不同的发酵培养基中，在温度37℃下振荡(180r/min)培养，对发酵培养基组分、用量进行优化，采用单因素试验和正交试验。 
4、单因素试验确定最佳培养基组分 
(1)不同碳源对菌株产酶的影响 
分别采用2％可溶性淀粉、葡萄糖﹑乳糖、麦芽糖、蔗糖作为碳源，替代基础发酵培养基中1％蔗糖，培养基其他组分及用量不变。接种枯草芽孢杆菌，摇瓶发酵培养48小时，取5ml枯草芽孢杆菌发酵液，4000r/min离心10min，取上清液按体积比1:6(1:5～1:8均可)用乙酸-乙酸钠稀释后得到粗酶液，分别在540nm下测纤维素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的OD540值，以确定最佳碳源，试验结果见图1。以不加碳源的培养基为空白对照。 
从图1可知，蔗糖为碳源时，甘露聚糖酶酶活最高；葡萄糖为碳源时，纤维素酶酶活最高；乳糖为碳源时，甘露聚糖酶酶活最高。综合各酶酶活，以乳糖为碳源的培养基中各种酶的吸光值均较高，因此，乳糖是菌株发酵产纤维素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的最优碳源。 
(2)不同氮源对菌株产酶的影响 
分别采用1％胰蛋白胨、酵母膏﹑(NH4)2SO4﹑NH4NO3﹑NH4Cl替代基础发酵培养基中1％蛋白胨，培养基其他组分及用量不变。接种枯草芽孢杆菌，摇瓶发酵培养48小时，取5ml枯草芽孢杆菌发酵液，4000r/min离心10min，取上清液按体积比1:6用乙酸-乙酸钠稀释后得到粗酶液，分别在540nm下测纤维素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的OD540值，以确定最佳氮源，试验结果见图2。以不加氮源的培养基为空白对照。 
由图2可知，以NH4Cl为氮源时，糖化酶酶活最高；以(NH4)2SO4为氮源时，甘露聚糖酶酶活最高；以NH4NO3为氮源时，纤维素酶酶活最高。综合各酶酶活，以NH4Cl为氮源时，纤维素酶、甘露聚糖酶及糖化酶酶活均相对较高。 
(3)不同无机盐对菌株产酶的影响 
分别采用0.5％K2HPO4、MgSO4、FeSO4替代基础发酵培养基中0.5％NaCl，培养基其他组分及用量不变。接种枯草芽孢杆菌，摇瓶发酵培养48小时，取5ml枯草芽孢杆菌发酵液，4000r/min离心10min，取上清液按体积比1:6用乙酸-乙酸钠稀释后得到粗酶液，分别在540nm下测纤维素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的OD540值，以确定最佳无机盐，试验结果见图3。以不加无机盐的培养基为空白对照。 
由图3可知，在以NaCl为无机盐的培养基中，菌株产的甘露聚糖酶活性最高；在以FeSO4为无机盐的培养基中，菌株产的纤维素酶活性最高；在以MgSO4为无机盐的培养基中，菌株产的糖化酶活性最高。综合各酶酶活，以MgSO4为无机盐时，纤维素酶、甘露聚糖酶及糖化酶活性均相对较高。 
5、正交试验确定最佳培养基配方 
以单因素试验结果确定培养基组分，改变各组分的浓度，配制不同的培养基(浓度设置见下见表1)。接种枯草芽孢杆菌，摇瓶发酵培养48小时，取5ml枯草芽孢杆菌发酵液，4000r/min离心10min，取上清液按体积比1:6用乙酸-乙酸钠稀释后得到粗酶液，分别在540nm下测纤维素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的OD540值，以确定最佳培养基配方，极差分析结果见下表2。 
表1 发酵培养基正交实验L9(34)设计 
水平 A(碳源，％) B(氮源，％) C(无机盐，％)
1 2 1.5 0.4
2 1.5 1 0.5
3 1 0.5 0.6
表2 试验结果极差分析表 
由表2可知，纤维素酶的最佳培养基组合为A1B3C3，主次顺序CAB；β-甘露聚糖酶的最佳培养基组合为A3B1C1，主次顺序BCA；糖化酶的最佳组合为A1B1C3，主次顺序ACB。 
因素A对糖化酶的影响排第一位，为主要因素，取A1；对纤维素酶的影响排第二位，取A1；对β-甘露聚糖酶的影响排第三位，取A3；因此因素A可取A1。因素B对β-甘露聚糖酶的影响排第一位，为主要因素，取B1；对纤维素酶和糖化酶的影响均排第三位，分别取B3和B1；因此因素B可取B1。因素C对纤维素酶的影响排第一位，为主要因素，取C3；对β-甘露聚糖酶和糖化酶的影响均排第二位，分别取C1和C3；因此因素C可取C3。 
综上所述，产纤维素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的最佳培养基组合为A1B1C3，即乳糖2％，NH4Cl1.5％，MgSO40.6％。 
6、正交试验确定最佳发酵条件 
按最佳培养基配方制备培养基，对影响酶产生的发酵温度、pH值、发酵时间及接种量分别设置水平(见下表3)。接种枯草芽孢杆菌，摇瓶发酵培养48小时，取5ml枯草芽孢杆菌发酵液，4000r/min离心10min，取上清液按体积比1:6用乙酸-乙酸钠稀释后得到粗酶液，分别在540nm下测纤维素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的OD540值，以确定最佳发酵条件，极差分析结果见下表4。 
表3 发酵条件正交实验L16(45)设计 
水平 A(发酵温度，℃) B(PH) C(发酵时间，T) D(接种量，％)
1 34 6.5 24 3
2 36 6.8 36 4
3 38 7.2 48 5
4 40 7.5 60 6
表4 试验结果极差分析表 
由表4可知，纤维素酶的最佳发酵条件为A2B1C2D2，主次顺序BADC；β-甘露聚糖酶的最佳发酵条件为A2B4C2D2，主次顺序ACBD；糖化酶的最佳发酵条件为A3B1C4D3，主次顺序CABD。 
因素A对β-甘露聚糖酶的影响排第一位，为主要因素，取A2；对纤维素酶和糖化酶的影响均排第二位，为次主要因素，分别取A2和A3；因此因素A可取A2。因素B对纤维素酶的影响排第一位，为主要因素，取B1；对β-甘露聚糖酶和糖化酶的影响均排第三位，为次要因素，分别取B4和B1；因此因素B可取B1。因素C为糖化酶的影响排第一位，为主要因素，取C4；对β-甘露聚糖酶的影响排第二位，为次主要因素，取C2；对纤维素酶的影响排第四位，为次要因素，取C2；因此因素C可取C4。因素D对纤维素酶的影响排第三位，为次要因素，取D2；对β-甘露聚糖酶和糖化酶的影响均排第四位，为次要因素，分别取D2和D3；因此因素D可取D2。 
综上所述，产纤维素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的最优发酵条件组合为A2B1C4D3，即发酵温度36℃，pH6.5，发酵时间60小时，接种量4％。 
7、枯草芽孢杆菌在最佳培养基配方及发酵条件下产纤维素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的酶活测定 
将枯草芽孢杆菌种子液分别接种到基础发酵培养基1、种子培养基2和最佳发酵培养基3中，按照最佳发酵条件进行发酵，取5ml枯草芽孢杆菌发酵液，4000r/min离心10min，取上清液按体积比1:6用乙酸-乙酸钠稀释后得到粗酶液，分别在540nm下测纤维素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的OD540值，依据标准曲线分别计算纤维素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的酶活，试验结果见下表5。 
表5试验结果极差分析表 
由表5可知，纤维素酶、甘露聚糖酶及糖化酶酶活在最佳培养条件下达到最高，纤维素酶酶活达206.72U/ml，甘露聚糖酶酶活达1451.37U/ml，糖化酶酶活达254.72U/ml。 
葡萄糖标准曲线：依据实验结果，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的浓度为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。如图4所示，吸光值(y)与甘露糖浓度(x)呈正相关，线性回归方程y＝0.9696x-0.027，R2＝0.9954。 
甘露糖标准曲线：依据实验结果，以吸光度为纵坐标，甘露糖的浓度为横坐标，绘制甘露糖标准曲线，如图5所示：吸光值(y)与甘露糖浓度(x)呈正相关，回归方程为y＝0.9582x+0.0099，相关系数R2＝0.9973。 

Claims (6)

1.一种枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌菌液接种到发酵培养基中，在温度34～38℃、pH值6.3～6.8条件下发酵培养48～72小时；所述发酵培养基为：以质量百分比计，乳糖1.5～2.5％、NH4Cl1～2％、MgSO40.5～0.7％，余量为水。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为：温度36℃，pH值6.5，发酵时间60小时。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其特征在于：所述发酵培养基为：以质量百分比计，乳糖2％、NH4Cl1.5％、MgSO40.6％，余量为水。
4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌菌液的浓度为5×108～8×108CFU/ml，接种量为3～6％。
5.根据权利要求1-3任一项所述的枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌菌液的制备方法为：将活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，在温度37℃下培养18～24小时；所述种子培养基为：以质量百分比计，蛋白胨1％、酵母浸出物0.5％、NaCl0.5％，余量为水，pH值7.2～7.6。
6.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌产纤维素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其特征在于：所述活化的枯草芽孢杆菌的制备方法为：将冻干保存的枯草芽孢杆菌接种到普通琼脂培养基中，在温度37℃下培养18～24小时；所述普通琼脂培养基为：以质量百分比计，蛋白胨1％、NaCl0.5％、牛肉膏1％、琼脂粉2％，余量为水，pH值7.2～7.6。
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