CN104762229A - 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种枯草芽孢杆菌菌株SB13(Bacillus subtilis)，其于2014年02月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8867；并同时揭露了利用该枯草芽孢杆菌菌株SB13(Bacillus subtilis)制备所得的同时含有内切葡聚糖酶和木聚糖酶的复合液，即枯草芽孢杆菌菌株SB13(Bacillus subtilis)能以豆腐废水为唯一的营养物质发酵生长，并同时生产出内切葡聚糖酶和木聚糖酶的酶液，从而为豆腐废水的回收利用增加途径，同时为饲料加工业中内切葡聚糖酶和木聚糖酶制剂的生产提供了新的发酵菌源。

Description

一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用
【技术领域】
本发明涉及一种微生物及其应用，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌菌株，其能利用豆腐废水同时产内切葡聚糖酶和木聚糖酶。
【背景技术】
为了充分利用资源、节约成本，纤维素及半纤维素含量高的物质如米糠、小麦次粉、棉籽粕、秸秆粉、牧草等常被用作原料替代价格高的玉米、大豆、小麦等物质；然高比例的粗纤维日粮不仅不能被畜禽直接吸收利用，还容易引起畜禽腹泻、生长缓慢等各种问题。为改善饲料品质，饲料厂和养殖场已经充分认识到饲料中添加酶类物质，特别是纤维素酶和半纤维素酶等不能被动物自身合成的非消化酶等的重要性。
植物细胞壁的主要成分由纤维素、半纤维素及木质素构成，纤维素与半纤维素相互交连，纤维素酶水解植物纤维素释放出游离糖后,使得纤维素与半纤维素交连体得到松驰，半纤维素暴露并被木聚糖酶迅速分解成木糖等物质。因为内切葡聚糖酶和木聚糖酶是降解纤维素和半纤维素的最主要水解酶类之一，因此,通过内切葡聚糖酶与木聚糖酶的双重水解作用可将饲料中高含量的纤维素、半纤维素降解成易被动物吸收利用的可溶性小分子类碳水化合物，从而不仅增加饲料的适口性，更提高饲料的吸收利用率，极大促进畜禽的健康成长。
对于饲料加工业，添加单一的酶制剂不仅不能同时满足降解植物细胞壁中纤维素和半纤维素的需求，而且逐一添加各种酶制剂也大大增加了企业的生产成本，因此从应用效果和生产成本的角度出发各类复合酶制剂已越来越受到企业的青睐，大量的动物实验也表明添加复合酶制剂确实大大提高饲料的利用效率。目前选育出来的应用广泛的优良菌种多为木霉、青霉属、黑曲霉等真菌类，由于该类菌生产纤维素酶所用的生产周期长，产酶的同时也产生大量的有毒物质，其代谢产生的粗酶并不能直接添加到饲料中，因此诸如 膜过滤等除去有毒物质以提纯纤维素酶的技术程序基本上是生产工业纤维素酶制剂中必不可少的环节，且不说酶在除去有毒物质这一过程中出现大量的损耗，这一生产程序的使用及生产周期之长也极大增加企业的生产成本。
此外，豆腐废水，是豆腐在生产过程中形成的豆腐沥水，其产生量是大豆干重的3-5倍。豆腐水固形物含量约占1％，主要由可溶性蛋白质、低聚糖、维生素、脂类、微量元素等组成。我国是豆腐生产和消费的大国，其生产产生大量高浓度有机废水进人地面水,在环境中发酵引起附近水质的严重恶化，严重威胁人类生存环境。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种枯草芽孢杆菌菌株SB13(Bacillus subtilis)，该枯草芽孢杆菌菌株SB13(Bacillus subtilis)于2014年02月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.8867。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本实验室取福建省南平市忙砀山周边农田中采集的含腐烂稻草土壤，将该土壤进行培养富集并筛选出能同时产内切葡聚糖酶和木聚糖酶的菌株，对该菌株的理化特性等进行鉴定，最终鉴定其为枯草芽孢杆菌菌属的一个菌株。
进一步地，利用该菌株制备一种同时含有内切葡聚糖酶和木聚糖酶的复合液，其制备方法的具体操作如下：
收集传统豆腐制作法废弃的豆腐废水，调pH值至7.0，之后置于发酵罐中经121℃高压灭菌25min，接着将所述的枯草芽孢杆菌菌株SB13以106cfu/mL的接种量接种于该发酵罐内，曝气、33℃条件下发酵培养3天，即可得同时含有内切葡聚糖酶和木聚糖酶的复合液。
本发明的有益效果在于：提供一种枯草芽孢杆菌菌株SB13(Bacillus subtili)，该菌株SB13能以豆腐废水为唯一的营养物质发酵生长，并同时生产出内切葡聚糖酶和木聚糖酶的酶液，从而为豆腐废水的回收利用增加途径，同时为饲料加工业中内切葡聚糖酶和木聚糖酶制剂的生产提供了新的发酵菌源。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是本发明中菌株SB13的菌落形态图。
图2是本发明中菌株SB13的革兰氏染色示意图。
图3是本发明中菌株SB13的细菌形态图(扫描电镜)。
图4是本发明中PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳图。
图5是本发明中枯草芽孢杆菌菌株SB13的***发育树。
【具体实施方式】
本发明一种枯草芽孢杆菌菌株SB13(Bacillus subtilis)是通过培养富集福建省南平市忙砀山周边农田中采集的含腐烂稻草土壤，并筛选出能同时产内切葡聚糖酶和木聚糖酶的菌株，且通过该菌株制备获得一种同时含有内切葡聚糖酶和木聚糖酶的复合液。
一、该菌株SB13的筛选分离 
从福建省南平市芒砀山周边农田采集含有腐烂稻草的土壤，在室温下自然干燥7天，之后称5g干燥后的土壤于装有195ml富集培养基的三角瓶中，于160r/min条件下30℃恒温培养富集5d，得富集菌液；分别取1g富集菌液进行稀释，稀释倍数分别为10-5、10-6、10-7，接着将稀释液分别涂布于刚果红固体培养基中，挑出能在此刚果红固体培养基生长的且能产生透明圈的菌落，并平板划线纯化培养，将纯化的菌接种于分离培养基中发酵培养，然后吸取发酵培养菌液0.1ml于用打孔器处理过的刚果红固体培养基的孔中培养，观察孔边透明圈的形成情况，选取透明圈形成最明显的菌株，为了方便描述，将选取的菌株命名为菌株SB13。
其中，富集培养基：(NH4)2SO42g/L、KH2PO43g/L、MgSO4·7H203g/L、CaCl23g/L、MnSO4·H2O 0.16g/L、ZnSO4·7H2O 0.14g/L、CoCl20.2g/L、稻草粉150g/L、豆渣粉5g/L；分离培养基：(NH4)2SO41.5g/L、KH2PO42.0g/L、MgSO40.3g/L、CaC120.3g/L，FeSO40.1g/L、ZnSO40.1g/L、CMC-Na 10g/L、山毛榉木聚糖10g/L、pH调至7.4；刚果红培养基：(NH4)2SO42g/L、MgSO4·7H203g/L、KH2PO41g/L、NaCl 0.5g/L、CMC-Na 10g/L、木聚糖10g/L、 刚果红0.2g/L、pH 7.0；在刚果红培养基中加入20g/L琼脂则形成刚果红固体培养基。
二、该菌株SB13的鉴定
形态学鉴定： 
对菌株SB13的主要形态进行鉴定，具体地，对菌株SB13进行菌落形态观察(结果如图1所示)、电子显微镜观察菌体的革兰氏染色形态(结果如图2所示)、JSM-6380LV扫描电镜观察菌体形态(结果如图3所示)，即该菌株SB13的主要形态如下：菌落圆，光滑、无色素、不透明，后期起皱，可以变为褐色，革兰氏阳性，孢子中生、椭圆，宽0.6-0.7μm，长1.5-2.8μm。
生理生化特征的鉴定：
对菌株SB13的生理生化特征进行鉴定，鉴定结果见表1，具体为：VP、淀粉水解和过氧化氢实验均显示阳性，说明该菌株可以分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇，能产生淀粉酶将淀粉水解为糖类物质；不能利用明胶，且产氨实验、MR实验呈阴性；能发酵利用D-果糖产酸、产气，发酵利用蔗糖、葡萄糖产酸、不产气。
表1 菌株SB13的生理生化特征
注：生理学特征：“+”表示阳性，“–”表示阴性；糖类发酵实验结果记录：“++”表示产酸、产气，“––”表示不产酸、不产气，“w–”表示弱阳性产酸、不产气，“+–”表示产酸、不产气。
分子生物学鉴定：
采用TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取目标菌株即菌株SB13的基因组DNA；委托生物工程(上海)有限公司利用DNA合成仪合成的 引物(如SEQ ID NO：1、2所示)：F968:5’-AAC GCG AAG CTT AC-3’和L1401:5’-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3’。
以提取所获得的菌株SB13的基因组DNA为模板，且以上述引物(F968/L1401)为引物对PCR扩增其16S rDNA基因V6～V8可变区:
PCR反应体系：2*Taq PCR MasterMix 12.5ul，引物(F968)、引物(L1401)及模板DNA各1.0ul，ddH2O 9.5ul；
PCR扩增程序：94℃预变性5min；然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃充分延伸10min，4℃保存。
PCR产物检测及测序分析：取5ul的PCR产物，在加入EB的1.0％的琼脂糖中凝胶电泳分离检验，扩增得到目的片段长约400bp左右(如图4所示),将含有目标片段的产物委托上海生物工程有限公司完成测序，得到的实际核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。并在NCBI数据中对菌株SB13的16S rRNA序列进行Blast比对分析，并利用MEGA 4.0软件构建***发育进化树，进行亲缘关系和***发育分析，如图5所示，从而表明，该菌株SB13在分子***发育分类学上属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌属。
依据同源性在***发育中的分类原则并结合形态、生理生化特征，最终确定菌株SB13属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
三、菌株SB13的特性研究 
接种环挑取1环该菌种即菌株SB13于含有100mL基础液体培养液中，于150r/min、33℃条件下培养24h，得到菌种母液；分别取0.1mL菌种母液接种于数瓶含有100mL豆腐废水的200ml规格三角瓶中，于150r/min、33℃下发酵培养1d至20d；以基础培养基为对照，分别在发酵的第1d、2d至20d取该菌发酵液并测定内切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性，同时测定发酵液中葡萄糖和木糖的含量变化情况。特性研究中所涉及的具体方法及培养基如下：
(1)粗酶液制备：分别在培养1d至20d不同培养时间取发酵后的菌液，并于4℃、5000r/min下离心15min，取上清液即为粗酶液；以煮沸15min的粗酶液为对照(即说明对照组采用的粗酶液需是煮沸15min的，而实验组只需直接加入粗酶液即可)；
(2)内切葡聚糖酶活力(CMCase)的测定：取用0.05mol/L pH 5.0的磷酸缓冲液配制的质量分数为l％的CMC-Na溶液1.7ml，加入0.5mL粗酶液、0.3ml0.05mol/L pH 5.5的磷酸缓冲液，于50℃反应5min后，加入1mL DNS试剂终止反应，沸水浴中煮沸5min，适当比例稀释后于540nm比色；
(3)木聚糖酶活力的测定：取用0.05mol/L pH 5.0的磷酸缓冲液配制的质量分数为l％的木聚糖溶液1.0ml，加入0.5mL粗酶液、1.0ml 0.05mol/L pH5.5的磷酸缓冲液，于50℃反应10min后，加入1mL DNS试剂终止反应，沸水浴中煮沸5min，适当稀释后于540nm比色；
(4)以上酶活力均扣除发酵液和底物的糖含量，以葡萄糖/木糖作标准溶液，以每毫升酶液每分钟生成1ug葡萄糖/木糖作为一个酶活单位(U)；
(5)培养基制备：基础培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、氯化钠5g/L、pH7.6；豆腐废水培养基：根据黄豆与水质量比为1:10的原则，按传统豆腐制作工艺法制作豆腐后，收集最后压豆腐程序中流出的豆腐废水，调pH 7.0即为豆腐废水培养基；
(6)发酵液中葡萄糖/木糖含量的测定：取粗酶液0.5ml(以0.5ml的无菌水为对照)，加入2ml的0.05mol/L pH 5.5的磷酸缓冲液,加入1mL DNS试剂沸水浴中煮沸5min，适当稀释后于540nm比色。
1.菌株SB13内切葡聚糖酶及发酵液中葡萄糖的变化
以基础培养基培养菌株SB13，产生的最大内切葡聚酶活出现在发酵的第3天，活力为102.39±8.76(U/ml)、其后依次下降，发酵到第6d时检测不到酶活力。以豆腐废水培养基培养菌株SB13时，最大酶活出现在发酵第3d，活力为242.08±21.00，提高了1.36倍，在发酵到第10d时酶活依然保持在97.36±1.47的高水平，而后才开始迅速下降(见表2)，说明该菌株SB13不仅可以直接以豆腐废水为直接营养物质进行生长，而且与基础培养基相比，豆腐废水中营养物质的诱导作用使其产内切葡聚糖酶能力达到明显的提高，活力的保持时间也从基础培养基的4d延长到10d，即采用豆腐废水培养该菌产生的内切葡聚糖更容易保存。
同步检测培养基中葡萄糖含量变化情况可知：在基础培养基中，与对 照相比，总体趋势上，发酵前的263.836±7.31(μg/ml)下降到160.726±15.31(μg/ml)，即出现小幅的消耗下降的情况；而在豆腐废水培养基中，与发酵前相比，在发酵1d葡萄糖含量由发酵前的1283.06±31.54(μg/ml)上升到2766.04±38.88，说明该菌株SB13被诱导分泌的大量内切葡聚糖酶将豆腐废水中的大分子碳水化合物分解成葡萄糖，随着发酵时间延长，发酵液中葡萄糖的含量开始逐渐下降，发酵至20d时，下降到312.75±7.67(μg/ml)，从而说明菌株SB13可以利用葡萄糖作为能源及营养物质进行生长。
表2 SB13菌内切葡聚糖酶活力及发酵液中葡萄糖的变化
注：ND为未检出。 
2.菌株SB13木聚糖酶及发酵液中木糖的变化
以基础培养基和豆腐废水培养基分别培养菌株SB13，产生最高木聚糖酶活力值均出现在发酵的第3天，活力分别为350.53±4.70(U/ml)、611.98±18.12(U/ml)，其后逐渐下降，发酵到第20d时均可检测到酶活力，分别为102.63±13.32(U/ml)、175.10±27.37(U/ml)。总体上该菌株SB13在豆腐废水培养基中产生的木聚糖酶的活力均明显高于基础培养基，最高酶活提高了75％。
同步检测培养基中木糖含量变化情况：基础培养基中木糖的含量基本呈现直线下降的趋势，从发酵前的5519.64±223.96(μg/ml)逐渐下降到发酵 20d的1094.02±109.51(μg/ml)；而豆腐废水培养基中木糖在发酵1d时小幅上升，由发酵前的8169.84±194.02(μg/ml)上升到8944.18±161.50(μg/ml)，说明该菌产生的木聚糖酶对豆腐废水中的大分子半纤维素类物质进行了降解，之后逐渐下降，发酵到第20天下降到2540.80±88.20(μg/ml)，说明该菌对利用木糖进行了代谢作用。
表3 SB13菌木糖酶活力及发酵液中木糖的变化
通过上述特性研究可知，该菌株SB13能以豆腐废水为唯一营养物质同时高产内切葡聚糖酶和木聚糖酶，且和基础培养基培养的相比，产生的两种酶的活力得到明显的提高，说明菌株SB13更适合在豆腐废水培养中生长，且该菌株SB13以豆腐废水为培养基生产内切葡聚糖酶和木聚糖酶的最适发酵时间为发酵3d。
四、同时含有内切葡聚糖酶和木聚糖酶的复合液的制备
经由上述菌株SB13的特性研究，同时含有内切葡聚糖酶和木聚糖酶的复合液的具体制备过程如下：
收集传统豆腐制作法废弃的豆腐废水，调pH值至7.0，之后置于发酵罐中经121℃高压灭菌25min，接着将枯草芽孢杆菌菌株SB13以106cfu/mL的接种量接种于该发酵罐内，曝气、33℃条件下发酵培养3天，即可得同时含 有内切葡聚糖酶和木聚糖酶的复合液。
综上，本发明提供一种枯草芽孢杆菌菌株SB13(Bacillus subtili)，该菌株SB13能以豆腐废水为唯一的营养物质发酵生长，并同时生产出内切葡聚糖酶和木聚糖酶的酶液，从而为豆腐废水的回收利用增加途径，同时为饲料加工业中内切葡聚糖酶和木聚糖酶制剂的生产提供了新的发酵菌源；此外，利用该菌株SB13制备同时含有内切葡聚糖酶和木聚糖酶的复合液的过程简单，易于操作。

Claims (2)

1.一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述菌株为枯草芽孢杆菌菌株SB13(Bacillus subtilis)，于2014年02月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8867。
2.一种同时含有内切葡聚糖酶和木聚糖酶的复合液，其特征在于：其制备方法的具体操作如下：收集传统豆腐制作法废弃的豆腐废水，调pH值至7.0，之后置于发酵罐中经121℃高压灭菌25min，接着将权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌菌株SB13以106cfu/mL的接种量接种于该发酵罐内，曝气、33℃条件下发酵培养3天，即可得同时含有内切葡聚糖酶和木聚糖酶的复合液。
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