CN101796046A

CN101796046A - 嘧啶衍生物934

Info

Publication number: CN101796046A
Application number: CN200880105690A
Authority: CN
Inventors: B·C·巴拉姆; R·杜克雷; J·G·克特尔
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2007-07-16
Filing date: 2008-07-14
Publication date: 2010-08-04
Also published as: ZA201000107B; CO6260075A2; SV2010003459A; AU2008277446A1; US20090023719A1; US7718653B2; EP2183242A2; CR11220A; MX2010000658A; NI201000011A; KR20100042272A; BRPI0814821A2; ECSP109958A; DOP2010000022A; WO2009010789A3; JP2010533700A; EA201000101A1; WO2009010789A2; CA2693880A1

Abstract

式(I)化合物

，其中A¹、A²或A³之一是N，并且其它独立地选自CH或N；环B是稠合的5或6-元碳环或杂环，其如说明书所述任选被取代，并且R¹、R²、R³、R⁴和n如说明书所述；该化合物是EphB4或EphA2的抑制剂，并且因此可用于作为病情例如癌症治疗的药物组合物。

Description

嘧啶衍生物934

本发明涉及新的嘧啶衍生物、包含这些衍生物的药物组合物和它们在治疗中的用途，尤其在预防和治疗温血动物，例如人的实体肿瘤疾病中的用途。

许多现行治疗细胞增殖疾病，例如牛皮癣和癌的方式，是使用抑制DNA合成的化合物。这种化合物通常对于细胞具有毒性，但它们对于快速***的细胞例如肿瘤细胞的毒性作用是有益的。使用作用机理不是抑制DNA合成的那些药剂作为***的替代方法，可能显示出增强的作用选择性。

近年来发现，由于细胞的一部分DNA转化为癌基因(即，由于激活而引起恶性肿瘤细胞形成的基因)，使细胞发生癌变(Bradshaw，Mutagenesis 1986，1，91)。一些这种癌基因产生了作为生长因子受体的肽。而生长因子受体复合物的激活又导致增加了细胞增殖。例如，已知一些癌基因编码酪氨酸激酶，而且某些生长因子受体也是酪氨酸激酶(Yarden et al.，Ann.Rev.Biochem.，1988，57，443；Larsen et al.，Ann. Reports in Med.Chem.，1989，Chpt.13)。

待鉴别的第一组酪氨酸激酶由病毒癌基因例如例如pp60^v-src酪氨酸激酶(或者称为v-Src)和正常细胞中的相应酪氨酸激酶例如pp60^c-src酪氨酸激酶(或者称为c-Src)引发。

受体酪氨酸激酶在生化信号的传递中是重要的，生化信号的传递能够引发许多细胞应答，包括增殖、存活和迁移。它们是跨细胞膜的巨大酶，并且具有与生长因子例如表皮生长因子(EGF)的胞外结合区域，和作为在蛋白质中磷酸化酪氨酸氨基酸的激酶作用的胞内部分，由此影响细胞增殖。各类受体酪氨酸激酶是已知的(Wilks，Advances in Cancer Research，1993，6043-73)，并且根据它们所结合的不同生长因子家族加以分类。这种分类包括：I类受体酪氨酸激酶，其包括受体酪氨酸激酶的EGF家族，例如EGF、TGFα、Neu和erbB受体；II类受体酪氨酸激酶，其包括受体酪氨酸激酶的胰岛素家族，例如胰岛素和IGF1受体和胰岛素相关的受体(IRR)；和III类受体酪氨酸激酶，其包括受体酪氨酸激酶的血小板衍生的生长因子(PDGF)家族，例如PDGFα、PDGFβ和菌落-刺激因子1(CSF1)受体。

Eph家族是受体酪氨酸激酶的已知的最大家族，在哺乳动物中鉴别了14种受体和8种同源ephrin配体(Reviewed in Kullander and Klein，Nature Reviews Molecular Cell Biology，2002，3，475-486)。该受体家族可以进一步再分为两个子家族，其很大程度上通过胞外域的同源性和它们对于特定配体类型的亲合性来定义它们。通常，所有Eph包含胞内酪氨酸激酶区域和胞外类Ig区域，后者具有富含半胱氨酸的区域(具有19个保守半胱氨酸和2个粘连蛋白III型区域)。Eph的A-类由8个称为EphA1-8的受体组成，其通常与它们的同源ephrinA类配体(称为ephrinA1-5)结合。B-类由称为EphB1-6的6个受体组成，其与它们的同源ephrinB配体(称为ephrinB1-3)结合。对于大部分其它受体酪氨酸激酶配体来说，Eph受体配体是异乎寻常和不同的，因为它们通过ephrinA配体中的糖基磷脂酰肌醇连接基或ephrinB配体中的整体横跨膜区域而结合到细胞上。ephrin配体与Eph伴侣的结合，可以在能够使自身抑制近膜区内的酪氨酸残基磷酸化的Eph胞内区域内引起构型变化，其可以减少催化部位的这种抑制，并能够进行额外的磷酸化，从而稳定激活态构型，并对于下游信号效应产生更多对接位点。

此外，证据表明，Eph/ephrin信号可以调节其它细胞应答，例如细胞增殖和存活。

有越来越多的证据表明，Eph受体信号可以在肿瘤细胞上直接或通过调节血管再生间接地在多种人类癌中促进致肿瘤性。例如，许多Eph受体在各种肿瘤类型中过度表达(Reviewed in Surawska et al.，Cytokine & Growth Factor Reviews，2004，15，419-433，Nakamoto and Bergemann，Microscopy Res and Technique，2002，59，58-67)；在各种肿瘤例如白血病、乳腺、肝、肺、卵巢和***肿瘤中，EphA2及其它EphA受体水平增加。同样，包括EphB4的EphB受体的表达，在肿瘤例如神经母细胞瘤、白血病、乳腺、肝、肺和结肠肿瘤中被上调。此外，各种体外和体内研究，特别是与EphA2和EphB4有关的体外和体内研究表明，Eph受体在癌细胞上的过度表达，能够产生肿瘤发生的表型例如增殖和侵入，与肿瘤生成中的推测作用一致。

例如，使用干扰-RNA或反义寡脱氧核苷酸来抑制EphB4表达，可以在体外和体内异种移植模型中抑制PC3***癌细胞的增殖、存活和侵入(Xia et al.，Cancer Res.，2005，65，4623-4632)。在MCF-10A乳腺上皮细胞中，EphA2过度表达足以引起肿瘤发生(Zelinski et al.，Cancer Res.，2001，61，2301-2306)。已经表明，用治疗抗体(Coffman et al.，Cancer Res.，2003，63，7907-7912)或干扰-RNA(Landen et al.，Cancer Res.，2005，15，6910-6918)抑制EphA2功能，可以在体内异种移植模型中抑制肿瘤生长。在乳腺癌细胞系中，激酶死亡EphA2突变株受体的表达，可以体内抑制异种移植肿瘤的生长和转移病变，与激酶区域的主要作用一致(Fang et al.，Oncogene，2005，24，7859-7868)。

除了Eph受体对于肿瘤细胞的强制作用之外，有很好的证据表明，EphA2和EphB4两者可以有助于肿瘤血管再生(综述于Brantley-Sieders et al.，Current Pharmaceutical Design，2004，10，3431-3442，Cheng et al.，Cytokine and Growth Factor Reviews，2002，13，75-85)。包括EphA2和EphB4两者的Eph家族成员是在内皮细胞上表达的。转基因研究表明，EphB4(Gerety et al.，Molecular Cell，1999，4，403-414)或它的配体ephrinB2(Wang et al.，Cell，1998，93，741-753)的中断，可以引起与血管形成中的关键作用一致的与血管模型缺陷相关的初期致死性。EphB4活化可以体外激发内皮细胞增殖和迁移(Steinle etal.，J.Biol.Chem.，2002，277，43830-43835)。

此外，已经显示，在体内异种移植研究中，使用EphB4的可溶性胞外区域来抑制EphB4信号，可以抑制肿瘤生长和血管生成(Martiny-Baron et al.，Neoplasia，2004，6，248-257，Kertesz et al.，Blood，2005，Pre-published online)。同样，在许多体内模型中，可溶性EphA2可以抑制肿瘤血管再生(Brantley et al.，Oncogene，2002，21，7011-7026，Cheng et al.，Neoplasia，2003，5，445-456)。

因此，人们认为，Eph受体特别是EphB4或EphA2受体的抑制剂，通过直接靶向肿瘤细胞或通过对肿瘤血管再生的影响来作为肿瘤细胞的增殖和存活的选择性抑制剂应该是有价值的。由此，这种抑制剂应该是对于抑制和/或***疾病有价值的治疗剂。

本申请人发现，某些嘧啶化合物可用于抑制EphB4或EphA2，并因此可用于与此类酶有关有治疗。

根据本发明，提供了式(I)化合物

其中A¹、A²或A³的至少一个是N，并且其它独立地选自CH或N；

R¹是氢或者(1-4C)烷基，其任选被一个或多个选自以下的取代基取代：-OR⁵(其中R⁵选自氢或(1-2C)烷基)、氰基、卤素或-NR⁶R⁷(其中R⁶和R⁷独立地选自氢、(1-2C)烷基或(1-2C)烷酰基)；

环B是稠合的5或6-元碳环或杂环，其任选在碳原子上被一个或多个卤素基团或C_1-6烷基基团取代，并且其中在该环中的任一氮原子任选被C_1-6烷基或C_1-6烷基羰基取代；

n是0、1、2或3，

并且各个基团R²独立地选自卤素、三氟甲基、氰基、硝基或下式(i)基团：

-X¹-R¹¹(i)

其中X¹选自直接连接键或者O、S、SO、SO₂、OSO₂、NR¹³、CO、CH(OR¹³)、CONR¹³、N(R¹³)CO、SO₂N(R¹³)、N(R¹³)SO₂、C(R¹³)₂O、C(R¹³)₂S、C(R¹³)₂N(R¹³)和N(R¹³)C(R¹³)₂，其中R¹³是氢或C_1-6烷基，并且

R¹¹选自氢、C_1-6烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基、C_3-8环烷基、芳基或杂环基、C_1-6烷基C_3-8环烷基、C_1-6烷基芳基或C_1-6烷基杂环基，它们的任一个可任选被一个或多个选自以下的基团取代：卤素、三氟甲基、氰基、硝基、羟基、氨基、羧基、氨基甲酰基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔氧基、C_1-6烷基硫基、C_1-6烷基亚磺酰基、C_1-6烷基磺酰基、C_1-6烷基氨基、二-(C_1-6烷基)氨基、C_1-6烷氧基羰基、N-C_1-6烷基氨基甲酰基、N、N-二-(C_1-6烷基)氨基甲酰基、C_2-6烷酰基、C_2-6烷酰基氧基、C_2-6烷酰基氨基、N-C_1-6烷基-C_2-6烷酰基氨基、C_3-6烯酰基氨基、N-C_1-6烷基-C_3-6烯酰基氨基、C_3-6炔酰基氨基、N-C_1-6烷基-C_3-6炔酰基氨基、N-C_1-6烷基氨磺酰基、N，N-二-(C_1-6烷基)氨磺酰基、C_1-6烷磺酰基氨基和N-C_1-6烷基-C_1-6烷磺酰基氨基，R¹¹中的任一杂环基基团任选具有1或2个氧代或硫代取代基；

R³选自：

(i)氢、卤素、硝基、氰基或羟基；

(ii)任选取代的(1-6C)烷基、(2-6C)烯基或(2-6C)炔基基团，其中该任选的取代基选自：氰基；卤素；

下式基团：

-W-R⁹

其中W选自-O-、-S(O)_p-(其中p是0、1或2)、-CO-、-NR^bCO-、-CONR^b-、-NR^bCONR^b-、-SO₂NR^b-、-NR^bSO₂-或-NR^bCOO-；

R^b选自氢或(1-2C)烷基；

并且R⁹选自氢或(1-4C)烷基；

或者-NR¹⁰R^10a，其中R¹⁰和R^10a独立地选自氢或(1-2C)烷基，或者R¹⁰和R^10a连接形成4、5、6或7元杂环状环，该环除了与R¹⁰和R^10a连接的氮原子外任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中存在的任一S原子可任选被氧化以形成SO或SO₂基团，并且其中该环中存在的任一碳原子任选被以下基团取代：氧代、卤素、羟基、氰基、(1-4C)烷基、羟基(1-4C)烷基、(1-4C)烷氧基、(1-2C)烷氧基-(1-4C)烷基、(1-4C)烷酰基、(1-4C)烷磺酰基、(1-4C)烷氧基羰基、(1-6C)烷基氨基羰基或二-(1-6C)烷基氨基羰基，并且该环中存在的任一可用氮原子任选被以下基团取代：(1-4C)烷基、羟基(1-4C)烷基、(1-2C)烷氧基-(1-4C)烷基或(1-4C)烷酰基；

(iii)基团-NR¹²R^12a，其中R¹²和R^12a各自独立地选自氢或(1-6C)烷基，或者R¹²和R^12a连接形成4、5、6或7-元杂环状环，该环除了与R¹²和R^12a连接的氮原子外任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中存在的任一S原子可任选被氧化以形成SO或SO₂基团，并且其中该环中存在的任一碳原子任选被以下基团取代：氧代、卤素、羟基、氰基、(1-4C)烷基、羟基(1-4C)烷基、(1-4C)烷氧基、(1-2C)烷氧基-(1-4C)烷基、(1-4C)烷酰基、(1-4C)烷磺酰基、(1-4C)烷氧基羰基、(1-6C)烷基氨基羰基或二-(1-6C)烷基氨基羰基，并且该环中存在的任一可用氮原子任选被以下基团取代：(1-4C)烷基、羟基(1-4C)烷基、(1-2C)烷氧基-(1-4C)烷基或(1-4C)烷酰基；

(iv)式(II)基团：

-X-R¹⁴

其中X选自-O-、-S(O)_p-(其中p是0、1或2)、-CO-、-NR^cCO-、-CONR^c-、-NR^cCOO-和-NR^cSO₂-，

其中R^c选自氢或(1-2C)烷基；

R¹⁴是(1-4C)烷基基团，其任选被卤素、羟基、氰基、(1-4C)烷氧基取代，或者R¹⁴是

-NR¹⁵R¹⁶

其中R¹⁵和R¹⁶独立地选自氢、(1-2C)烷酰基或(1-2C)烷基，或者R¹⁵和R¹⁶连接形成4、5、6或7-元杂环状环，该环除了与R¹⁵和R¹⁶连接的氮原子外任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中存在的任一S原子可任选被氧化以形成SO或SO₂基团，并且其中该环中存在的任一碳原子任选被以下基团取代：氧代、卤素、羟基、氰基、(1-4C)烷基、羟基(1-4C)烷基、(1-4C)烷氧基、(1-2C)烷氧基-(1-4C)烷基、(1-4C)烷酰基、(1-4C)烷磺酰基、(1-4C)烷氧基羰基、(1-6C)烷基氨基羰基或二-(1-6C)烷基氨基羰基，并且任一可用氮原子任选被以下基团取代：(1-4C)烷基、羟基(1-4C)烷基、(1-2C)烷氧基-(1-4C)烷基或(1-4C)烷酰基；或者

(v)通过碳原子连接的4-7元杂环基团；并且

R⁴是基团-NR¹⁷R¹⁸，其中R¹⁷和R¹⁸连接形成4、5、6或7元杂环状环，该环除了与R¹⁷和R¹⁸连接的氮原子外任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中存在的任一S原子可任选被氧化以形成SO或SO₂基团，并且其中该环中存在的任一碳原子任选被以下基团取代：氧代、卤素、羟基、氰基、(1-4C)烷基、羟基(1-4C)烷基、(1-4C)烷氧基、(1-2C)烷氧基-(1-4C)烷基、(1-4C)烷酰基、(1-4C)烷磺酰基、(1-4C)烷氧基羰基、(1-6C)烷基氨基羰基或二-(1-6C)烷基氨基羰基，并且该环中存在的任一可用氮原子任选被以下基团取代：(1-4C)烷基、羟基(1-4C)烷基、(1-2C)烷氧基-(1-4C)烷基或(1-4C)烷酰基；或其药学可接受的盐。

在本说明书中，通用术语“烷基”包括直链和支链烷基基团两者例如丙基、异丙基和叔丁基。然而提供个别烷基基团例如“丙基”仅特指直链形式，提及个别支链烷基基团例如“异丙基”仅特指支链形式。类似规定适用于其它通用术语，例如(1-6C)烷氧基包括甲氧基、乙氧基和异丙氧基，(1-6C)烷基氨基包括甲基氨基、异丙基氨基和乙基氨基，以及二-[(1-6C烷基]氨基包括二甲基氨基、二乙基氨基和N-甲基-N-异丙基氨基。类似地烯基和炔基基团可以是直链或支链的。

术语“芳基”是指苯基或萘基，特别是苯基。

术语“卤素”或“卤素”包括氟、氯、溴或碘。

术语“杂环基”或“杂环”是指饱和、部分饱和或不饱和的单环、二环或三环，其含有3-15个原子，其中至少一个原子选自氮、硫或氧。除非另有说明，这些基团可以是碳或氮连接的。此外，或者环硫原子可以任选被氧化形成S-氧化物。更特别地，“杂环基”是饱和、部分饱和或不饱和的单环或二环，其含有3-12个原子。单环状环适宜的含有3-7个环原子，特别是5或6个环原子。

术语“杂环基”的实例和适宜取值是噻吩基、哌啶基、吗啉基、呋喃基、噻唑基、吡啶基、咪唑基、1，2，4-***基、硫吗啉基、香豆素基、嘧啶基、酞基、吡唑基、吡嗪基、哒嗪基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、四氢呋喃基、[1，2，4]噻唑并[4，3-a]嘧啶基、哌啶基、吲哚基、1，3-苯并间二氧杂环戊烯基和吡咯烷基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、异噁唑基、苯并呋喃基、1，2，3-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、嘧啶基、2，1-苯并异噁唑基、4，5，6，7-四氢-2H-吲唑基、咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、2，3-二氢-1-苯并呋喃基、2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环基(benzodioxinyl)、1，3-苯并噻唑基、3，4-二氢-2H-苯并二氧杂环庚烯基(benzodioxepinyl)、2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环基、色满基、2，3-二氢苯并呋喃基、咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑基、异二氢吲哚基、噁唑基、哒嗪基、喹噁啉基、四氢呋喃基、4，5，6，7-四氢-1-苯并呋喃基、4，5，6，7-四氢-2H-吲唑基、4，5，6，7-四氢-1H-吲哚基、四氢吡喃基或1，2，3，4-四氢喹啉基。

杂环基基团在性质上可以是非芳香族或芳香族的。芳香族的杂环基基团称为杂芳基。杂芳基基团是完全不饱和的单环或二环，其含有3-12个碳原子，其中至少一个原子选自氮、硫或氧，除非另有说明，其可以是碳或氮连接的。适宜的“杂芳基”是指完全不饱和的含有5或6个原子的单环或者含有8-10个原子的双环，其中至少一个原子选自氮、硫或氧，除非另有说明，其可以是碳或氮连接的。术语“杂芳基”的实例和适宜取值是噻吩基、呋喃基、噻唑基、吡唑基、异噁唑基、咪唑基、吡咯基、噻二唑基、异噻唑基、***基、吡喃基、吲哚基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、苯并噻吩基、吡啶基和喹啉基。

本发明特别新颖的化合物包括例如式I化合物或其药学可接受的盐，其中，除非另有说明，各个R¹、n、R²、R³、R⁴、A¹、A²、A³或B具有上文定义的或者下文段落(1)至(45)任一项的含义：

(1)R¹是(1-4C)烷基；

(2)R¹选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基丙基或环丙基甲基；

(3)R¹选自氢、甲基、乙基、异丙基或环丙基甲基；

(4)R¹是甲基；

(5)R¹是异丙基；

(6)R¹是环丙基甲基；

(7)R¹是乙基；

(8)R¹是氢；

(9)n是0、1或2；

(10)n是0或1；

(11)n是0；

(12)n是1；

(13)各个存在的R²基团独立地选自卤素、三氟甲基、氰基、羟基、C_1-6烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基和C_1-6烷氧基；

(14)各个存在的R²基团独立地选自氯、氟、溴、三氟甲基、氰基、羟基、甲基、乙基、乙炔基、甲氧基和乙氧基；

(15)各个存在的R²基团是卤素，

(16)各个存在的R²基团选自溴、氯或氟。

(17)各个存在的R²基团是氯，

(18)R³选自：

(i)氢、卤素、硝基、氰基或羟基；

(ii)任选取代的(1-6C)烷基基团，其中该任选的取代基选自氰基、卤素或下式基团：

-W-R⁹

其中W选自-O-、-S(O)_p-(其中p是0、1或2)、-CO-、-NR^bCO-或-CONR^b-；R^b选自氢或(1-2C)烷基；并且R⁹选自氢或(1-4C)烷基；

或者-NR¹⁰R^10a，其中R¹⁰和R^10a独立地选自氢、(1-2C)烷酰基或(1-2C)烷基，或者R¹⁰和R^10a连接形成5或6元杂环状环，该环除了与R¹⁰和R^10a连接的氮原子外任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中该环在任一可用碳原子上任选被一个或两个选自以下的取代基取代：氧代、卤素、羟基、氰基、(1-4C)烷基或(1-4C)烷磺酰基，并且该环中存在的任一可用氮原子任选被(1-4C)烷基或(1-4C)烷酰基取代；

(iii)基团-NR¹²R^12a，其中R¹²和R^12a各自独立地选自氢或(1-6C)烷基，或者R¹²和R^12a连接形成5、6或7-元杂环状环，该环除了与R¹²和R^12a连接的氮原子外包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中该环在任一可用碳原子上任选被一个或两个选自以下的取代基取代：氧代、卤素、羟基、氰基、(1-4C)烷基或(1-4C)烷磺酰基，并且该环中存在的任一可用氮原子任选被(1-4C)烷基或(1-4C)烷酰基取代；或者

(iv)式(II)基团：

-X-R¹⁴

其中X选自-O-、-S(O)_p-(其中p是0、1或2)、-CO-、-NR^cCO-、-CONR^c-或-NR^cCOO-，

其中R^c选自氢或(1-2C)烷基；

-NR¹⁵R¹⁶

其中R¹⁵和R¹⁶独立地选自氢、(1-2C)烷酰基或(1-2C)烷基，或者R¹⁵和R¹⁶连接形成5或6-元杂环状环，该环除了与R¹⁵和R¹⁶连接的氮原子外任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中该环在任一可用碳原子上任选被一个或两个选自以下的取代基取代：氧代、卤素、羟基、氰基、(1-4C)烷基或(1-4C)烷磺酰基，并且该环中存在的任一可用氮原子任选被(1-4C)烷基或(1-4C)烷酰基取代；

(19)R³选自：

(i)氢、卤素、氰基或羟基；

(ii)任选取代的(1-4C)烷基基团，其中该任选的取代基选自氰基、卤素或下式基团：

-W-R⁹

其中W选自-O-、-S(O)_p-(其中p是0、1或2)、-CO-、-NR^bCO-或-CONR^b-；R^b选自氢或(1-2C)烷基

并且R⁹选自氢或(1-4C)烷基；

或者-NR¹⁰R^10a，其中R¹⁰和R^10a独立地选自氢或(1-2C)烷基，或者R¹⁰和R^10a连接形成5或6元杂环状环，该环除了与R¹⁰和R^10a连接的氮原子外任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中该环在任一可用碳原子上任选被一个或两个选自以下的取代基取代：氧代、卤素、羟基、氰基或(1-4C)烷基，并且该环中存在的任一可用氮原子任选被(1-4C)烷基取代；

(iii)基团-NR¹²R^12a，其中R¹²和R^12a各自独立地选自氢或(1-6C)烷基，或者R¹²和R^12a连接形成5、6或7-元杂环状环，并且其中除了与R¹²和R^12a连接的氮原子外该环任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中该环在任一可用碳原子上任选被一个或两个选自以下的取代基取代：氧代、卤素、羟基、氰基或(1-4C)烷基，并且该环中存在的任一可用氮原子任选被(1-4C)烷基取代；或者

(iv)式(II)基团：

-X-R¹⁴

其中X选自-O-、-S(O)_p-(其中p是0、1或2)或-CONR^c-，

其中R^c选自氢或(1-2C)烷基；

R¹⁴是(1-4C)烷基基团，其任选被卤素、羟基、氰基、(1-4C)烷氧基取代；

(20)R³选自：

(i)氢、卤素或氰基；

(ii)任选取代的(1-2C)烷基基团，其中该任选的取代基选自氰基、卤素、下式基团：

-W-R⁹

并且R⁹选自氢或(1-4C)烷基；

或者-NR¹⁰R^10a，其中R¹⁰和R^10a独立地选自氢或(1-2C)烷基)，或者R¹⁰和R¹¹连接形成5或6元杂环状环，该环除了与R¹⁰和R¹¹连接的氮原子外任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中该环在任一可用碳原子上任选被一个或两个选自以下的取代基取代：氧代、卤素、羟基、氰基或(1-4C)烷基，并且该环中存在的任一可用氮原子任选被(1-4C)烷基取代；

(iii)基团-NR¹²R¹³，其中R¹²和R¹³各自独立地选自氢或(1-6C)烷基，或者R¹²和R¹³连接形成5、6或7-元杂环状环，并且其中除了与R¹²和R¹³连接的氮原子外该环任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中该环在任一可用碳原子上任选被一个或两个选自以下的取代基取代：氧代、卤素、羟基、氰基或(1-4C)烷基，并且该环中存在的任一可用氮原子任选被(1-4C)烷基取代；或者

(iv)式(II)基团：

-X-R¹⁴

其中X选自-O-、-S(O)_p-(其中p是0、1或2)或

-CONR^c-，

其中R^c选自氢或(1-2C)烷基；

(21)R³是基团-NR¹²R^12a，其中R¹²和R^12a各自独立地选自氢或(1-6C)烷基，或者R¹²和R^12a连接形成5、6或7-元杂环状环，并且其中除了与R¹²和R^12a连接的氮原子外该环任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中该环在任一可用碳原子上任选被一个或两个选自以下的取代基取代：氧代、卤素、羟基、氰基、(1-4C)烷基或(1-4C)烷磺酰基，并且该环中存在的任一可用氮原子任选被(1-4C)烷基或(1-4C)烷酰基取代；

(22)R³是基团--NR¹²R^12a，其中R¹²和R^12a连接形成6元杂环状环，该环除了与R¹²和R^12a连接的氮原子外任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中该环在任一可用碳原子上任选被一个或两个选自以下的取代基取代：氧代、卤素、羟基、氰基或(1-4C)烷基，并且任一可用氮原子任选被以下基团取代：(1-4C)烷基、羟基(1-4C)烷基或(1-4C)烷酰基；

(23)R³是下式基团：

其中Y’选自O、S、NR^y’或CR^z’，其中R^y’选自氢、(1-2C)烷基、羟基(1-2C)烷基、(1-2C)烷氧基(1-2C)烷基或(1-2C)烷酰基，并且R^z’选自氢、羟基、(1-2C)烷基、羟基(1-2C)烷基、(1-2C)烷氧基(1-2C)烷基或(1-2C)烷酰基；

(24)R³是下式基团：

其中Y’选自O、NR^y’或CR^z’，其中R^y’选自氢或(1-2C)烷基，并且R^z’选自氢或羟基；

(25)R³选自吗啉-4-基、4-甲基哌嗪-1-基或4-羟基哌啶-1-基；

(26)R³是吗啉-4-基；

(27)R³是卤素例如氯；

(28)R³是4-7元杂环基团，其是通过碳原子连接的；

(29)R³是5-6元杂环基团，其是通过碳原子连接的；

(30)R³是5-6元杂芳基基团，其是通过碳原子连接的；

(31)R³选自碳连接的吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫吗啉基、噁唑烷基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、***基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基或嘧啶基；

(32)R⁴是基团-NR¹⁷R¹⁸，其中R¹⁷和R¹⁸连接形成5或6元杂环状环，该环除了与R¹⁷和R¹⁸连接的氮原子外任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中存在的任一S原子可任选被氧化以形成SO或SO₂基团，并且其中该环在任一可用碳原子上任选被一个或两个选自以下的取代基取代：氧代、卤素、羟基、氰基、(1-4C)烷基或(1-4C)烷磺酰基，并且任一可用氮原子任选被以下基团取代：(1-4C)烷基、羟基(1-4C)烷基或(1-4C)烷酰基；

(33)R⁴是基团-NR¹⁷R¹⁸，其中R¹⁷和R¹⁸连接形成6元杂环状环，该环除了与R¹⁷和R¹⁸连接的氮原子外任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中该环在任一可用碳原子上任选被一个或两个选自以下的取代基取代：氧代、卤素、羟基、氰基或(1-4C)烷基，并且任一可用氮原子任选被以下基团取代：(1-4C)烷基、羟基(1-4C)烷基或(1-4C)烷酰基；

(34)R⁴是下式基团：

其中Y选自O、S、NR^y或CR^z，其中R^y选自氢、(1-2C)烷基、羟基(1-2C)烷基、(1-2C)烷氧基(1-2C)烷基或(1-2C)烷酰基，并且R^z选自氢、羟基、(1-2C)烷基、羟基(1-2C)烷基、(1-2C)烷氧基(1-2C)烷基或(1-2C)烷酰基；

(35)R⁴是下式基团：

其中Y选自O、NR^y或CR^z，其中R^y选自氢或(1-2C)烷基，并且R^z选自氢或羟基；

(36)R⁴选自吗啉-4-基、4-甲基哌嗪-1-基或4-羟基哌啶-1-基；

(37)R⁴是吗啉-4-基；

(38)A¹或A²是氮，并且A³是CH；

(39)A²或A³是CH；

(40)A¹是氮，并且A²和A³是CH；

(41)A¹和A³二者均是氮，并且A²是CH；

(42)A²和A³二者均是氮，并且A¹是CH；

(43)环B选自-CR²²＝CR²²-CR²²＝CR²²-、-N＝CR²²-CR²²＝CR²²-、CR²²＝N-CR²²＝CR²²-、-CR²²＝CR²²-N＝CR²²-、-CR²²＝CR²²-CR²²＝N-、-N＝CR²²-N＝CR²²-、-CR²²＝N-CR²²＝N-、-N＝CR²²-CR²²＝N-、-N＝N-CR²²＝CR²²-、-CR²²＝CR²²-N＝N-、-CR²²＝CR²²-O-、-O-CR²²＝CR²²-，-CR²²＝CR² ²-S-、-S-CR²²＝CR²²-、-CR²²H-CR²²H-O-、-O-CR²²H-CR²²H-、-CR²²H-CR²²H-S-、-S-CR²²H-CR²²H-、-O-CR²²H-O-、-O-CF₂-O-、-O-CR²²H-CR²²H-O-、-S-CR²²H-S-、-S-CR²²H-CR²²H-S-、-CR²²＝CR²²-NR²⁰-、-NR²⁰-CR²²＝CR²²-、-CR²²H-CR²²H-NR²⁰-、-NR²⁰-CR²²H-CR²²H-、-N＝CR²²-NR²⁰-、-NR²⁰-CR²²＝N-、-NR²⁰-CR²²H-NR²⁰-、-OCR²²＝N、-N＝CR²²-O-、-S-CR²²＝N-、-N＝CR²²-S-、-O-CR²²H-NR²⁰-、-NR²⁰-CR²²H-O-、-S-CR²²H-NR²⁰-、-NR²⁰-CR²²H-S-、-O-N＝CR²²-、-CR²²＝N-O-、-S-N＝CR²²-、-CR²²＝N-S-、-O-NR²⁰-CR²²H-、-CR²²H-NR²⁰-O-、-S-NR²⁰-CR²²H-、-CR²²H-NR²⁰-S-、-NR²⁰-N＝CR²²-、-CR²²＝N-NR²⁰-、-NR²⁰-NR²⁰-CR²²H-、-CR²²H-NR²⁰-NR²⁰-、-N＝N-NR²⁰-或-NR²⁰-N＝N-，其中各个R²⁰独立地选自氢、C_1-6烷基或C_1-6烷基羰基，并且其中各个R²²独立地选自氢、卤素或C1_-6烷基；

(44)环B选自-O-CR²²H-O-、-NR²⁰-N＝CR²²-或-CR²²＝N-NR²⁰-，其中各个R²⁰独立地选自氢、C_1-6烷基或C_1-6烷基羰基，并且其中各个R²²独立地选自氢、卤素或C_1-6烷基；

(45)环B选自-NR²⁰-N＝CR²²-或-CR²²＝N-NR²⁰-，其中各个R²⁰独立地选自氢、C_1-4烷基或C_1-4烷基羰基，并且其中各个R²²独立地选自氢、卤素或C_1-4烷基。

适宜地，n是0或1。

B基团的特别实例说明如下，并且包括例如下文定义的基团B’。特别地，B是-OCH₂O-、-NR²⁰-N＝CR²²-或-CR²²＝N-NR²⁰-。

当n不为0时，R²或R^2a基团的特别实例选自卤素、三氟甲基、氰基、羟基、C_1-6烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基和C_1-6烷氧基。

例如，R²或R^2a可选自氯、氟、溴、三氟甲基、氰基、羟基、甲基、乙基、乙炔基、甲氧基和乙氧基。

在一个实施方案中，R²或R^2a是卤素，例如溴、氯或氟，并且特别是氯。

在特别的实施方案中，n是1并且R²或R^2a是卤素例如氯。

环B 的实例包括由以下式的基团组成的那些：-CR²²＝CR²²-CR²²＝CR²²-、-N＝CR²²-CR²²＝CR²²-、-CR²²＝N-CR²²＝CR²²-、-CR²²＝CR²²-N＝CR²²-、-CR²²＝CR²²-CR²²＝N-、-N＝CR²²-N＝CR²²-、-CR²²＝N-CR²²＝N-、-N＝CR²²-CR²²＝N-、-N＝N-CR²²＝CR²²-、-CR²²＝CR²²-N＝N-、-CR²²＝CR²²-O-、-O-CR²²＝CR²²-、-CR²²＝CR²²-S-、-S-CR²²＝CR²²-、-CR²²H-CR²²H-O-、-O-CR²²H-CR²²H-、-CR²²H-CR²²H-S-、-S-CR²²H-CR²²H-、-O-CR²²H-O-、-O-CF₂-O-、-O-CR²²H-CR²²H-O-、-S-CR²²H-S-、-S-CR²²H-CR²²H-S-、-CR²²＝CR²²-NR²⁰-、-NR²⁰-CR²²＝CR²²-、-CR²²H-CR²²H-NR²⁰-、-NR²⁰-CR²²H-CR²²H-、-N＝CR²²-NR²⁰-、-NR² ⁰-CR²²＝N-、-NR²⁰-CR²²H-NR²⁰-、-OCR²²＝N-、-N＝CR²²-O-、-S-CR²²＝N-、-N＝CR²²-S-、-O-CR²²H-NR²⁰-、-NR²⁰-CR²²H-O-、-S-CR²²H-NR²⁰-、-NR²⁰-CR²²H-S-、-O-N＝CR²²-、-CR²²＝N-O-、-S-N＝CR²²-、-CR²²＝N-S-、-O-NR²⁰-CR²²H-、-CR²²H-NR²⁰-O-、-S-NR²⁰-CR²²H-、-CR²²H-NR²⁰-S-、-NR²⁰-N＝CR²²-、-CR²²＝N-NR²⁰-、-NR²⁰-NR²⁰-CR²²H-、-CR²²H-NR²⁰-NR²⁰-、-N＝N-NR²⁰-或-NR²⁰-N＝N-，其中各个R²⁰独立地选自氢、C_1-6烷基或C_1-6烷基羰基，并且其中各个R²²独立地选自氢、卤素或C_1-6烷基。

在特别的实施方案中，其中基团B包括多于一个基团R²⁰或R²²，至少一个此基团是氢。

基团R²⁰的实例包括氢、甲基、乙基或甲基羰基，特别是氢。

基团R²²的实例包括氢、氯、氟、甲基或乙基，特别是氢。

在特别的实施方案中，环B是稠合的5元环。为此B的特别实例是下式的基团：-CH＝CH-O-、-O-CH＝CH-、-CH＝CH-S-、S-CH＝CH-、-CH₂-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-S-、-S-CH₂-CH₂-、-O-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-O-、-S-CH₂-S-、-S-CH₂-CH₂-S-、-CH＝CH-NR²⁰-、-NR²⁰-CH＝CH-、-CH₂-CH₂-NR²⁰-、-NR²⁰-CH₂-CH₂-、-N＝CH-NR²⁰-、-NR²⁰-CH＝N-、-NR²⁰-CH₂-NR²⁰-、-OCH＝N-、-N＝CH-O-、-S-CH＝N-、-N＝CH-S-、-O-CH₂-NR²⁰-、-NR²⁰-CH₂-O-、-S-CH₂-NR²⁰-、NR²⁰-CH₂-S-、-O-N＝CH-、-CH＝N-O-、-S-N＝CH-、-CH＝N-S-、-O-NR²⁰-CH₂-、-CH₂-NR²⁰-O-、-S-NR²⁰-CH₂-、-CH₂-NR²⁰-S-、--NR²⁰-N＝CH-、-CH＝N-NR²⁰-、-NR²⁰-NR²⁰-CH₂-、-CH₂-NR²⁰-NR²⁰-、-N＝N-NR²⁰-或-NR²⁰-N＝N-。

R²⁰的特别实例包括氢、甲基和乙酰基。例如，R²⁰是氢。

在一个实施方案中，环B包括一个氮原子。例如，其是式-CH＝CH-NR²⁰-或-NR²⁰-CH＝CH-的基团。

环B还可包括两个氮原子。例如，其可以是下式的基团：-NR²⁰-N＝CH-、-CH＝N-NR²⁰-、-NR²⁰-NR²⁰-CH₂-或-CH₂-NR²⁰-NR²⁰，并且特别是基团-NR²⁰-N＝CH-或-CH＝N-NR²⁰-。此类环，特别是其中R²⁰是氢，形成了本发明特别的方面。

在另一实施方案中，环B包括一个氮和一个氧原子。其因此适宜地选自-O-N＝CH-、-CH＝N-O-、-O-NR²⁰-CH₂-或-CH₂-NR²⁰-O-。

在再进一步的实施方案中，环B是式-O-CH₂-O-或-O-CF₂-O-的基团，特别是-O-CH₂-O-。

当n是1或更多时，取代基R³适宜地位于该环的可用的邻位-碳上，形成式(IA)化合物

其中A¹、A²、A³、B、R¹、R²、R³和R⁴具有上文所述关于式(I)的任一项定义，R^2a是上文定义的基团R²，并且特别是卤素，以及m是0、1或2。

适宜地在式(IA)中，m是0。

特别地，式(I)化合物的实例是式(IB)化合物

其中A¹、A²、A³、R¹、R²、R³、R⁴和n具有上文所述关于式(I)的任一项定义。

在另一实施方案中，本发明提供了式(IC)化合物

在式(IC)中对于A¹、A²、A³、R¹、R²、R³、R⁴、n和R²⁰的特别选项如上文关于式(I)所述。在式(IC)化合物的情况下，适宜地，n是0。

在另一实施方案中，本发明提供了式(ID)化合物

在式(ID)中对于A¹、A²、A³、R¹、R²、R³、R⁴、n和R²⁰的特别选项如上文关于式(I)所述。在式(ID)化合物的情况下，适宜地，n是0。

在另一实施方案中，本发明提供了式(IE)化合物或其药学可接受的盐

其中：

A¹是N，并且A²和A³均是CH；

A¹和A²均是N，并且A³是CH；或者

A²是N，并且A¹和A³均是CH；

B是-OCH₂O-、-NH-N＝CH-或-CH＝N-NH-；

R¹是氢或(1-4C)烷基基团；

R²是卤素；和

n是0或1。

在特别的实施方案中，本发明提供了上文定义的式(IE)化合物，其中A¹是N，并且A²和A³均是CH。

在另一实施方案中，本发明提供了上文定义的式(IE)化合物，其中B是-OCH₂O-或-CH＝N-NH-。

在进一步的实施方案中，本发明提供了上文定义的式(IE)化合物，其中R¹是(1-4C)烷基基团，并且在一个特别的实施方案中R¹是甲基。

在进一步的实施方案中，本发明提供了上文定义的式(IE)化合物，其中R²是氯，并且在一个特别的实施方案中n是1，并且R²位于与胺连接子邻位的可用碳原子上的氯。

在进一步的实施方案中，本发明提供了上文定义的式(IE)化合物，其中n是0。

在式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物的进一步的组中，A²或A³的至少一个是-CH-。

在式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物的再进一步的组中，A¹或A²的至少一个是N并且A³是CH，或者A¹或A³的至少一个是N并且A²是CH。

在式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物的再进一步的组中，A¹是N并且A²和A³是CH。

式(I)化合物的特别实例是：

N4-(5-氯苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-4-基)-N2-(2，6-二吗啉代吡啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；

N4-(5-氯苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-4-基)-N2-(2，6-二吗啉代吡啶-4-基)-N4-甲基嘧啶-2，4-二胺；

N2-(2，6-二吗啉代吡啶-4-基)-N4-(1H-吲唑-4-基)嘧啶-2，4-二胺；

N′-(1H-吲唑-4-基)-N′-甲基-N-(2-吗啉-4-基吡啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；

N-(2，6-二吗啉-4-基吡啶-4-基)-N′-(1H-吲唑-4-基)-N′-甲基-嘧啶-2，4-二胺；

N-(4-氯-6-吗啉-4-基-吡啶-2-基)-N′-(1H-吲唑-4-基)-N′-甲基-嘧啶-2，4-二胺；

N-(2，6-二吗啉-4-基嘧啶-4-基)-N′-(1H-吲唑-4-基)-N′-甲基-嘧啶-2，4-二胺；

N-(2-氯-6-吗啉-4-基-吡啶-4-基)-N′-(1H-吲唑-4-基)-N′-甲基-嘧啶-2，4-二胺；

N′-(5-氯-1，3-苯并间二氧杂环戊烯-4-基)-N-(4-吗啉代-2-吡啶)嘧啶-2，4-二胺；

N′-(5-氯-1，3-苯并间二氧杂环戊烯-4-基)-N-(6-吗啉代-2-吡啶)嘧啶-2，4-二胺；

N-(4，6-二吗啉-4-基嘧啶-2-基)-N′-(1H-吲唑-4-基)-N′-甲基-嘧啶-2，4-二胺；或者

N′-(5-氯-1，3-苯并间二氧杂环戊烯-4-基)-N-[2-甲基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]嘧啶-2，4-二胺或其药学可接受的盐。

本发明化合物的适宜的药学可接受的盐例如是足够碱性的本发明化合物的酸加成盐，例如与例如无机酸或有机酸的酸加成盐，该无机酸或有机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、三氟乙酸、枸橼酸或马来酸。此外，足够酸性的本发明化合物的适宜的药学可接受的盐是碱金属盐例如钠盐或钾盐，碱土金属盐例如钙盐或镁盐，铵盐或者与提供生理学可接受的阳离子的有机碱成的盐，例如与甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟基乙基)胺成的盐。

式(I)化合物可具有手性中心，并且有时可具有几何异构中心(E-和Z-异构体)，其理解为，本发明涵盖所有此类光学异构体、非对映异构体和几何异构体，它们具有EphB4或EphA2抑制活性。

本发明涉及式(I)化合物的任何和全部互变异构体，它们具有that具有EphB4或EphA2抑制活性。

还应理解，某此式(I)化合物可以以溶剂化以及非溶剂化形式存在，例如水合形式。应理解，本发明涵盖所有此类溶剂化形式，其具有EphB4或EphA2抑制活性。此活性可使用下文提及的实验技术来评价。

光学活性形式的合成可以通过本领域公知的有机化学的标准技术来进行，例如通过从光学活性起始物质合成，或者通过外消旋形式的拆分。

式I化合物可通过对于化学家而言显而易见的各种常规方法制备。特别地，式I化合物可以通过使式(II)化合物：

其中A¹、A²、A³、R³和R⁴是如关于式I所定义的，条件是任何官能团是任选被保护的，并且L是离去基团，与式(III)化合物反应

其中B、R¹、n和R²是如关于式I所定义的，条件是任何官能团是任选被保护的。然后，可以使用常规方法除去任何保护基团，并且如果需要，可以再次使用本领域公知的常规化学方法将式I化合物转化成不同的式I化合物或盐。

适宜的离去基团L是卤素例如氯。该反应适宜地在有机溶剂例如C_1-6烷醇(例如，正丁醇、异丙醇或2-戊醇)、二甲基乙酰胺(DMA)或N-甲基吡咯烷(NMP)或者它们的混合物中进行。适宜地将酸，特别是无机酸例如盐酸加至该反应混合物中。反应适宜地在高温下进行，例如在80-150℃的温度下，方便地在溶剂的回流温度下进行。

或者，(II)和(III)之间的反应可以通过过渡金属复合物来催化，例如钯催化剂。适宜的钯催化剂的实例包括Pd2(dba)3(三(二苯亚甲基丙酮)二钯)、Pd(PPh₃)₄和Pd(OAc)₂。此钯催化的反应方便地在适宜的碱存在下进行，该碱例如碳酸钾、碳酸铯、磷酸钾、叔丁醇钠或1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)。用于此反应的适宜溶剂包括甲苯、二噁烷或乙二醇二甲醚(DME)。用于此反应的适宜配体包括Xantphos(4，5-二(二苯膦)-9，9--二甲基呫吨)、BINAP(2，2’-二(二苯膦)-1，1’-联萘基)或DPPF(1，1’-二(二苯膦)二茂络铁)。该反应方便地在高温下进行，通常在使用的具体溶剂的回流温度下进行。90-140℃的温度是常用的。

可通过多种方法制备式(II)化合物，所述方法包括，例如，其中的L是卤素，通过使式(IV)化合物

其中A¹、A²、A³、R³和R⁴是如关于式I所定义的，与适宜的卤化剂例如磷酰氯反应。

反应是在使用适宜的卤化试剂的反应条件下进行。例如，其可以在高温下进行，例如50-100℃的温度下，在有机溶剂例如乙腈或二氯甲烷(DCM)中进行。

式(IV)化合物是适宜地通过使式(V)化合物

与式(VI)化合物反应制备

其中A¹、A²、A³、R³和R⁴是如关于式I所定义的。

该反应适宜地在溶剂例如例如二甘醇二甲醚中以及在高温例如120-180℃下，并且方便地在溶剂的回流温度下完成。

其中L是氯的式(II)化合物还可通过使式XIII化合物

其中A¹、A²、A³、R³和R⁴是如关于式I所定义的，与4-氯-2-甲基磺酰基嘧啶在适宜的碱例如氢化钠存在下反应来制备。

或者，式I化合物可通过使式(VII)化合物

其中B、R¹、n和R²是如关于式I所定义的，条件是任一官能团可任选被保护，并且L’是离去基团例如上文关于式(II)所述的那些或者可以是-SO₂Me，与上文定义的式(VI)化合物反应来制备。

此外，可以使用常规方法除去任何保护基团，并且如果需要，可以再次使用常规化学方法将式I化合物转化成不同的式I化合物或盐。

进行此反应的条件是与上文所述化合物(II)和(III)之间反应所需要的那些广泛相似。

式(VII)化合物适宜地通过使上文所述式(III)化合物，其中任一胺基团特别的任选被保护，与式(VIII)化合物反应来制备

其中L¹和L²是离去基团例如卤素，并且特别是氯。

该反应适宜地在碱例如有机碱例如三乙胺或N.N-二异丙基乙胺存在下来完成。该反应还适宜地在高温下进行，例如在80至120℃，在适宜的有机溶剂例如C_1-6烷醇例如乙醇中进行。该反应还可以在强碱例如氢化钠存在下，在有机溶剂例如DMA中进行。当使用该碱性反应条件时，适用于低温例如-20℃至20℃，方便的为约0℃。

其中R¹不同于氢的式(VII)化合物亦可通过使式(IX)化合物

其中L是如前文定义的离去基团，并且B和R²以及n是如关于式I所定义的，与以下化合物反应来制备

R^1’-X

其中X是适宜的离去基团例如卤素并且R^1’是如上文关于式I定义的但是不同于氢。

此反应方便地使用碱例如碳酸铯在溶剂例如二甲基甲酰胺中进行。

其中R¹不同于氢的式I化合物亦可从其中R¹为氢的式I化合物通过式(X)化合物

其中A¹、A²、A³、B、R²、n、R³和R⁴是如上文关于式I定义的；

与以下化合物的反应来制备

R^1’-X

其中X适宜的离去基团例如卤素，R¹是如上文关于式I定义的但不同于氢，以及P是适宜的用于此反应的保护基团，例如4-甲氧基苄基基团。

此反应方便地使用强碱例如氢化钠在适宜的溶剂例如二甲基甲酰胺中进行。此反应形成了一个反应实例，其中的式(I)化合物被转化成不同的式(I)化合物，但是还有许多适宜转化反应的其它实例，这对化学家而言是显而易见的。

制备式I化合物的另一方法是使式(XI)化合物

其中A¹、A²、A³、R¹、R³和R⁴是如上文关于式I定义的；

与式(XII)化合物反应

其中B、R²和n是如上文关于式I定义的，并且L”是卤素例如溴，其中任一官能团根据需要而被保护。

此反应适宜地在适宜的催化剂例如钯催化剂存在下进行。适宜的钯催化剂的实例包括Pd2(dba)3(三(二苯亚甲基丙酮)二钯)、Pd(PPh₃)₄和Pd(OAc)₂。此钯催化的反应方便地在适宜的碱例如碳酸钾、碳酸铯、磷酸钾、叔丁醇钠或1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)存在下进行。用于此反应的溶剂包括甲苯、二噁烷或乙二醇二甲醚(DME)。用于此反应的适宜配体包括Xantphos(4，5-二(二苯膦)-9，9-二甲基呫吨)、BINAP(2，2’-二(二苯膦)-1，1’-联萘基)或DPPF(1，1’-二(二苯膦)二茂络铁)。该反应方便地在高温下进行，通常在所用的特定溶剂的回流温度下进行。90-140℃的温度是常用的。

式(III)化合物是已知化合物，或者它们可以从已知化合物使用类似方法制备，这些方法对于熟练化学家而言是显而易见的。例如，其中R¹是氢的式(III)化合物可通过式(XIII)化合物的氢化而获得

其中B、R²和n是如上文关于式(I)定义的，并且其中任一官能团根据需要而被保护。适宜的氢化条件包括在压力下在铂催化剂存在下使用氢气体。该反应适宜地在有机溶剂例如乙醇和乙酸乙酯中完成。式(III)化合物的其它实例以及它们的制备描述于WO2001094341。

式(VIII)化合物亦是已知化合物，或者它们可以从已知化合物使用类似方法制备，所述方法对于熟练化学家而言是显而易见的。

式(VI)化合物亦是已知化合物，或者它们可以从已知化合物使用常规方法制备。

可以使用本领域常规的标准操作将式I化合物转化成其它式I化合物。可用于将式I化合物转化成不同的式I化合物的转化反应的类型的实例包括，通过芳香取代反应或者亲核取代反应的方式引入取代基，取代基的还原，取代基的烷基化和取代基的氧化。用于此操作法的试剂和反应条件是化学领域公知的。

芳香取代反应的特别实例包括在Friedel Crafts条件下使用烷基卤化物和路易斯酸(例如三氯化铝)引入烷基基团；以及引入卤素基团。亲核取代反应的特别实例包括使用标准条件引入烷氧基基团或者引入烷基氨基基团、二烷基氨基基团或者含N杂环。还原反应的特别实例包括用硼氢化钠使羰基基团还原成羟基基团，或者通过催化氢化用镍催化剂使硝基基团还原成氨基基团，或者通过在盐酸存在下用铁并加热处理使硝基基团还原成氨基基团。

使用上述方法制备特别的式I化合物例如式IA、IB、IC、ID或IE化合物形成了本发明进一步的方面。

还要理解，在本文提及的某些反应中，可能需要或者期望保护该化合物中的任何敏感基团。需要或者期望保护的情况以及对于保护作用的适宜方法是本领域技术人员已知的。可根据标准操作使用常规保护基团(示例说明参见T.W.Green，Protective Groups in OrganicSynthesis，John Wiley and Sons，1991)。因此，如果反应物包括例如氨基、羧基或羟基的基团，则在本文提及的某此反应中期望保护该基团。

对于氨基或烷基氨基的适宜保护基是例如酰基，例如烷酰基，如乙酰基，烷氧羰基例如甲氧基羰基、乙氧基羰基或叔丁氧基羰基，芳基甲氧基羰基，例如苄氧基羰基，或芳酰基，例如苯甲酰基。上述保护基的脱保护条件必须随所选择的保护基而变化。因此，例如，酰基例如烷酰基或烷氧基羰基或芳酰基，可以用适宜的碱例如碱金属氢氧化物例如氢氧化锂或氢氧化钠水解来除去。或者，酰基例如叔丁基氧羰基，可以用适宜的酸例如盐酸、硫酸或磷酸或三氟乙酸处理来除去，芳基甲氧基羰基例如苄氧基羰基基团在催化剂例如钯披炭上氢化或用路易斯酸例如三(三氟乙酸)硼处理来除去。伯氨基的合适的其它保护基是例如邻苯二甲酰基团，其可以用烷基胺例如二甲基氨基丙胺或用肼处理来除去。

羟基的适宜保护基是例如酰基，例如烷酰基例如乙酰基，芳酰基例如苯甲酰基，或芳基甲基，例如苄基。上述保护基的脱保护条件必须随所选择的保护基而变化。由此，例如，酰基例如烷酰基或芳酰基，可以例如用适宜的碱例如碱金属氢氧化物例如氢氧化锂或氢氧化钠水解来除去。或者，芳基甲基例如苄基可以例如通过在催化剂，例如钯披炭上氢化来除去。

羧基的适宜保护基是，例如酯化基团，例如甲基或乙基，其可以例如通过用碱例如氢氧化钠水解来除去；或者例如叔丁基，其可以通过用酸，例如有机酸例如三氟乙酸处理来除去；或者例如苄基，其可以通过在催化剂，例如钯披炭上氢化来除去。

可以使用化学领域众所周知的传统方法、在任何方便的合成步骤中除去保护基。

使用本领域常规的标准方法，式I的化合物可以转变为其它式I的化合物。

可用于将式(I)化合物转化成不同的式(I)化合物的转化反应的类型的实例包括，通过芳香取代反应或者亲核取代反应的方式引入取代基，取代基的还原，取代基的烷基化和取代基的氧化。用于此操作法的试剂和反应条件是化学领域公知的。

使用上述方法，制备式(I)的具体化合物，例如式(IA)、(IC)和(IE)的化合物，形成本发明的另一方面。

按照本发明的另一方面，提供了药物组合物，其包含上文所定义的式(I)的化合物，尤其是式(IA)、(IB)、(IC)或(IE)的化合物或其药学可接受的盐或前药，以及药学可接受的稀释剂或载体。

组合物可以是适合于口服给药的形式，例如片剂或胶囊，适于肠胃外注射(包括静脉内，皮下，肌内，血管内或输注)的无菌溶液、悬浮液或乳剂形式，适于局部给药的软膏或乳膏形式，或者适于直肠给药的栓剂形式。

通常上述组合物可以使用常规赋形剂，用常规方式来制备。

通常以5-5000mg/m²动物身体面积的单位剂量范围，即大约0.1-100mg/kg的单位剂量将式(I)化合物给予温血动物，并且通常提供治疗有效剂量。单位剂量形式例如片剂或胶囊通常含有例如1-250mg活性组分。优选使用1-50mg/kg范围内的日剂量。然而，日剂量需根据所治疗的宿主、具体给药途径和所治疗疾病的严重程度而变化。因此，治疗任何具体患者的医师可以确定最佳剂量。

如下文所述的活性筛选结果表明，本发明的化合物可望有效用于治疗单独或部分地由EphB4或EphA2介导的疾病或医学病症，即所述化合物可以使需要这种治疗的温血动物产生EphB4或EphA2抑制效果。由此，本发明化合物提供了一种特征在于通过抑制EphB4或EphA2来治疗有害细胞增殖的方法，即所述化合物可以通过抑制EphB4或EphA2的单独或部分介导产生抗增殖效果。

根据本发明的另一方面，提供了用于通过治疗法治疗人或动物体的方法的如上文定义的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物，或其药学可接受的盐或前药。

为此，根据本发明进一步的方面，提供了用作医药的如上文定义的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物，或其药学可接受的盐或前药。

根据本发明进一步的方面，提供了如上文定义的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物，或其药学可接受的盐或前药在制备用于在温血动物例如人中产生EphB4或EphA2抑制作用的医药中的用途。

根据本发明此方面的进一步特征，提供了在有此治疗需要的温血动物例如人中产生EphB4或EphA2抑制作用的方法，该方法包括给所述动物施用有效量的如上文定义的式(I)化合物，或其药学可接受的盐或前药。

根据本发明进一步的方面，提供了如上文定义的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物，或其药学可接受的盐或前药在制备用于在温血动物例如人中产生抗血管生成作用的医药中的用途。

根据本发明此方面的进一步特征，提供了在有此治疗需要的温血动物例如人中产生抗血管生成作用的方法，该方法包括给所述动物施用有效量的如上文定义的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物，或其药学可接受的盐或前药。

根据本发明此方面的另外特征，提供了在有此治疗需要的温血动物例如人中治疗癌症的方法，该方法包括给所述动物施用有效量的如上文定义的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物，或其药学可接受的盐或前药。

根据本发明此方面的进一步特征，提供了如上文定义的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物，或其药学可接受的盐或前药在制备用于治疗癌症的医药中的用途。

根据本发明此方面的另外特征，提供了用于治疗癌症的如上文定义的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物，或其药学可接受的盐或前药。

根据本发明此方面的另外特征，提供了用于治疗实体肿瘤疾病特别是成神经细胞瘤、乳癌、肝癌、肺癌和结肠癌或者非白血性白血病的如上文定义的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物，或其药学可接受的盐或前药。

根据本发明此方面的另外特征，提供了如上文定义的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物，或其药学可接受的盐或前药用于制备治疗癌症的医药的用途。

在本发明进一步的方面中，提供了如上文定义的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物，或其药学可接受的盐或前药在制备用于治疗实体肿瘤疾病特别是成神经细胞瘤、乳癌、肝癌、肺癌和结肠癌或者非白血性白血病的医药中的用途。

在本发明进一步的方面中，提供了在有此治疗需要的温血动物例如人中治疗成神经细胞瘤、乳癌、肝癌、肺癌和结肠癌或者非白血性白血病的方法，该方法包括给所述动物施用有效量的如上文定义的式(I)化合物，或其药学可接受的盐或前药。

上文所定义的EphB4或EphA2抑制活性可以作为单一疗法应用，也可以用除了本发明的化合物外还包括一种或多种其它物质和/或治疗。这种联合治疗可以同时、先后或分别施用单独治疗部分来实现。在肿瘤的治疗中，各种治疗的联用对每个患有癌症的患者的治疗是常用的。除了上文所定义的抗血管生成治疗之外，这种联合治疗的其它部分可以是：手术、放射线疗法或化学疗法。这种化学疗法可以包括一种或多种下列类型的抗肿瘤药物：

(i)在医学肿瘤学中使用的其它抗增殖/抗肿瘤药和其组合，例如烷基化剂(例如顺铂，卡铂，环磷酰胺，氮芥，美法仑，苯丁酸氮芥，马利兰和亚硝基脲)；代谢拮抗剂(例如抗叶酸物，例如氟嘧啶如5-氟尿嘧啶和替加氟，雷替曲塞，氨甲喋呤，阿糖胞苷和羟基脲)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类抗生素例如阿霉素，博来霉素，多柔比星，柔红霉素，表柔比星，伊达比星，丝裂霉素-C，放线菌素和光神霉素)；抗有丝***剂(例如长春花生物碱如长春新碱，长春碱，长春地辛和长春瑞滨，以及紫杉烷类药物如紫杉酚和泰索帝(taxotere))；以及拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素类如依托泊苷和替尼泊苷，安吖啶，托泊替康和喜树碱)；

(ii)细胞抑制剂，例如抗***(例如它莫西芬，托瑞米芬，雷洛昔芬，屈洛昔芬和iodoxyfene)，***受体下调节剂(例如氟维司群)，抗雄激素剂(例如比卡鲁胺，氟他胺，尼鲁米特和醋酸环丙氯地孕酮)，LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林，亮丙瑞林和布舍瑞林(buserelin))，孕激素(例如醋酸甲地孕酮)，芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑，来曲唑，伏氯唑(vorazole)和依西美坦)以及5α-还原酶抑制剂，例如非那雄胺；

(iii)抗癌细胞侵入药剂(例如金属蛋白酶抑制剂如马立马司他(marimastat)和尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体功能的抑制剂；

(iv)生长因子功能的抑制剂：例如包括下列的抑制剂：生长因子抗体、生长因子受体抗体(例如抗-erbb2抗体曲妥单抗[Herceptin^TM]和抗-erbbl抗体西妥昔单抗[C225])、法尼基转移酶抑制剂、MEK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂以及丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂例如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(erlotinib，OSI-774)和6-丙烯酰基酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI1033))，例如血小板衍生的生长因子家族的抑制剂以及例如肝细胞生长因子家族的抑制剂；

(v)血管形成药剂，例如抑制血管内皮生长因子的效果的那些药剂(例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗[Avastin^TM]，例如国际专利WO 97/22596，WO 97/30035，WO 97/32856和WO 98/13354中公开的那些化合物)，以及通过其它机理工作的那些化合物(例如利诺胺、整联蛋白αvβ3功能的抑制剂和血管抑素)；

(vi)管损伤剂例如康普瑞汀A4和公开在国际专利申请WO99/02166、WO00/40529、WO 00/41669、WO01/92224、WO02/04434和WO02/08213中公开的化合物；

(vii)反义疗法，例如针对上述靶标的那些疗法，例如ISIS 2503，一种抗-ras反义药剂；

(viii)基因治疗方法，包括例如取代畸变基因例如畸变的p53或畸变的BRCA1或BRCA2的方法，GDEPT(基因引导的酶前体药物疗法)方法例如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些方法，和提高患者对于化疗或放射线疗法的耐受性的方法，例如多重耐药性基因治疗；

(ix)免疫治疗方法，包括例如提高患者肿瘤细胞的免疫原性的体外和体内方法，例如用细胞素例如白细胞介素2、白细胞介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子进行转染，降低T细胞无反应性的方法，使用转染的免疫细胞例如细胞因子-转染的树状突细胞的方法，使用细胞因子-转染的肿瘤细胞系的方法以及使用抗特应抗体的方法；

(x)细胞周期抑制剂，包括例如CDK抑制剂(例如flavopiridol)和其它细胞周期检查点的抑制剂(例如检查点激酶)；极光体激酶的抑制剂以及其它涉及有丝***和胞质***调的激酶的抑制剂(例如有丝***驱动蛋白)；以及其它组蛋白脱乙酰基酶抑制剂；和

(xi)分化剂(例如维甲酸和维生素D)。

根据本发明的该方面，提供了药物组合物，其包含上文所定义的式(I)化合物和上文所定义的用于联合治疗癌症的其它抗肿瘤物质。

按照上面的陈述，治疗性或预防性治疗特定细胞增殖疾病所需要的剂量大小，必须随所治疗的宿主、施用途径和所治疗疾病的严重程度而变化。设计了例如1-100mg/kg、优选1-50mg/kg范围内的单位剂量。

除了它们在治疗医药中的用途之外，式(I)、(IA)、(IB)、(IC)、(ID)或(IE)化合物及其药学可接受的盐也在体外和体内试验***的开发和标准化中用作药理学工具，在实验动物例如猫、狗、兔子、猴子、大鼠和小鼠中用于评价抗血管生成活性的抑制剂的效果，作为寻找新的治疗剂的一部分。

现在用下面的实施例举例说明本发明，其中通常地：

(i)在室温操作，即在17至25℃范围内、在惰性气体例如氮气或氩气的氛围中进行操作，除非另有说明；

(ii)通常，反应过程之后进行薄层色谱(TLC)和/或分析型高压液相色谱(HPLC)；所给出的反应时间不一定是可达到的最小所需时间；

(iii)必要时，用无水硫酸镁干燥有机溶液，使用传统层分离技术或ALLEXIS(MTM)自动液体处理器进行后处理过程，通过真空旋转蒸发或在Genevac HT-4/EZ-2中进行蒸发。

(iv)产率，如果给出的话，不一定是可得到的最大值，如果需要大量反应产物，必要时可以重复反应；

(v)通常，通过核磁共振(NMR)和/或质谱技术确定式I的最终产物结构；电喷雾质谱数据可使用Waters ZMD或Waters ZQ LC/质谱仪获取正和负离子数据，通常，只报道与母体结构有关的离子；质子NMR化学位移值使用Bruker Spectrospin DPX300光谱仪(在300MHz的场强下操作)、Bruker Dpx400(在400MHz下操作)或Bruker Advance(在500MHz下操作)以δ标度测定。使用下列缩写：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br，宽峰；

(vi)除非另有说明，包含不对称碳和/或硫原子的化合物不进行拆分；

(vii)不一定将中间体完全纯化，但利用TLC、分析型HPLC、红外(IR)和/或NMR分析来评价它们的结构和纯度；

(viii)除非另有说明，柱色谱(利用快速方法)和中压液相色谱(MPLC)是在Merck Kieselgel硅胶(Art.9385)上进行的；

(ix)在C18反相硅胶上进行制备HPLC，例如在Waters‘Xterra’制备型反相柱(5微米硅胶，19毫米直径，100毫米长度)上，使用极性渐减混合物作为洗脱液，例如水(包含1％醋酸或1％氨水(d＝0.88))和乙腈的极性渐减混合物；

(x)使用下列分析型HPLC方法；通常使用反相硅胶，大约每分钟1毫升的流速，利用电喷雾质谱和利用254nm波长处的UV吸光度进行检测；对于每个方法，溶剂A是水，溶剂B是乙腈；使用下列柱和溶剂混合物：

在C18反相硅胶上进行制备型HPLC，在Phenomenex“Gemini”制备型反相柱(5微米硅胶，110A，21.1毫米直径，100毫米长度)上，使用极性渐减混合物作为洗脱液，例如水(包含1％甲酸或1％氨水)作为溶剂A和乙腈作为溶剂B的极性渐减混合物；使用下列任何一个制备型HPLC方法：

方法A：溶剂梯度9.5分钟，每分钟25ml，分别从溶剂A和B的85∶15混合物至溶剂A和B的5∶95混合物。

方法B：溶剂梯度9.5分钟，每分钟25ml，分别从溶剂A和B的60∶40混合物至溶剂A和B的5∶95混合物。

(xi)如果以酸加成盐形式获得某些化合物，例如单盐酸盐或二-盐酸盐，盐的化学计量是基于化合物中碱基的数目和性质，通常不测定盐的精确化学计量，例如利用元素分析数据；

(xii)已使用以下缩写：

DMSO 二甲基亚砜

NMP 1-甲基-2-吡咯烷酮

DMA N，N-二甲基乙酰胺

DCM 二氯甲烷

实施例1

N4-(5-氯苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-4-基)-N2-(2，6-二吗啉代吡啶 -4-基)嘧啶-2，4-二胺

使2，6-二吗啉代吡啶-4-胺(140mg，0.53mmol)，2-氯-N-(5-氯苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-4-基)嘧啶-4-胺(150mg，0.53mmol)，1，8-二氮杂双环-[5.4.0]-十一碳-7-烯(0.158mL，1.06mmol)，二(二苯亚甲基丙酮)钯(0)(45.5mg，0.08mmol)和9，9-二甲基-4，5-二(二苯膦)呫吨(92mg，0.16mmol)溶解于二噁烷(3mL)，并密封在微波管中。使反应脱气，用氮吹扫，并在120℃下加热过夜。使反应混合物过滤，再用二氯甲烷充分洗涤。将滤液浓缩至干燥，用二氯甲烷(15ml)稀释，用水(30ml)和盐水(15ml)洗涤，用硫酸镁干燥，浓缩。将粗产物通过快速色谱法在硅胶上纯化，洗脱使用了0至50％乙酸乙酯/二氯甲烷。将溶剂蒸发至干燥，得到N4-(5-氯苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-4-基)-N2-(2，6-二吗啉代吡啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺(80mg，29.6％)为浅裼色泡沫状物。NMR 光谱：(DMSOd₆)3.09-3.25(m，8H)，3.57-3.70(m，8H)，6.00(s，2H)，6.17(d，1H)，6.52(s，2H)，6.91(d，1H)，7.04(d，1H)，8.02(d，1H)，9.02(s，1H)，9.03(s，1H)；质谱：MH⁺512。

用作起始物质的2-氯-N-(5-氯苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-4-基)嘧啶-4-胺制备如下：

在0℃下，将氢化钠(13.4g，60％分散液，在矿物油中)滴加至在DMA(100ml)中的(5-氯-1，3-苯并间二氧杂环戊烯-4-基)胺(11.5g，如WO2001094341所述制备)中。加入2，4-二氯嘧啶(10g)，再将反应温热至室温，搅拌过夜。使反应小心用水淬灭，将该溶液过滤，浓缩，再将残余物溶解于DCM中，用水和盐水洗涤，干燥，浓缩，得到2-氯-N-(5-氯苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-4-基)嘧啶-4-胺为暗棕色油状物，其未经进一步纯化即被使用(16g，85％)；NMR光谱(300MHz，DMSO)6.10(s，2H)，6.58(d，1H)，6.94(d，1H)，7.05(d，1H)，8.15(d，1H)，9.76(s，1H)；质谱M⁺284。

用作起始物质的2，6-二吗啉代吡啶-4-胺制备如下：

将4-氨基-2，6-二氯-吡啶(900mg，5.52mmol)，吗啉(4.8ml，55.2mmol)和DMA(1.0ml，11mmol)的混合物在Personal ChemistryEMRYSTM Optimizer EXP微波合成器中在240℃下加热30分钟。冷却之后，在真空下除去吗啉，将该残余物用30％氢氧化铵水溶液处理，再将所得混合物用二氯甲烷萃取。蒸发溶剂，残余物在硅胶上纯化(3％MeOH/DCM)，接着在醚中研磨，得到2，6-二吗啉-4-基吡啶-4-胺(950mg，65％产率)。NMR光谱(500MHz，CDCl₃)3.39-3.42(m，8H)，3.77-3.79(m，8H)，3.91(bs，2H)，5.39(s，2H).质谱：MH⁺265。

实施例2

N4-(5-氯苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-4-基)-N2-(2，6-二吗啉代吡啶 -4-基)-N4-甲基嘧啶-2，4-二胺

使2，6-二吗啉代吡啶-4-胺(160mg，0.60mmol)和2-氯-N-(5-氯苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-4-基)-N-甲基嘧啶-4-胺(180mg，0.60mmol)根据实施例1的操作法进行反应，得到N4-(5-氯苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-4-基)-N2-(2，6-二吗啉代吡啶-4-基)-N4-甲基嘧啶-2，4-二胺(80mg，25.2％)为淡黄色泡沫状物。NMR光谱(CDCl₃)3.23-3.58(m，11H)，3.72-3.90(m，8H)，5.65(s，1H)，6.03(s，2H)，6.50(s，2H)，6.79(d，1H)，6.99(d，1H)，7.17(s，1H)，7.90(s，1H)；质谱：MH⁺526。

2-氯-N-(5-氯苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-4-基)-N-甲基嘧啶-4-胺用作起始物质的制备如下：

使2-氯-N-(5-氯[d][1，3]苯并间二氧杂环戊烯-4-基)嘧啶-4-胺(1.5g，5.30mmol，参见实施例1，起始物质)溶解于DMF(30mL)中。加入碳酸钾(1.1g，8.0mmol)，接着加入碘甲烷(0.36mL，5.8mmol)，再使该混合物在室温下搅拌过夜。减压蒸发之后，使该残余物溶解于乙酸乙酯中，用水和盐水洗涤，干燥，蒸发，得到棕色油状物(1.54g，98％)，其放置固化；NMR光谱(500MHz，DMSOd6 at 353°K)3.33(s，3H)，6.29(s，2H)，7.12(bs，1H)，7.00(d，1H)，7.10(d，1H)，8.12(bs，1H)；质谱MH⁺298。

实施例3

N2-(2，6-二吗啉代吡啶-4-基)-N4-(1H-吲唑-4-基)嘧啶-2，4-二胺

使N-(2-氯嘧啶-4-基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吲唑-4-胺(400mg，1.09mmol)和2，6-二吗啉代吡啶-4-胺(289mg，1.09mmol)根据实施例1的操作法反应。过滤固体并蒸发溶剂之后，将所得胶状物溶解于TFA(8.2mL)和茴香醚(0.594mL，5.47mmol)中，并密封在微波管中。在PersonalChemistry EMRYS^TM Optimizer EXP微波合成器中使反应加热至130℃历经30分钟时间。将反应混合物浓缩至干燥，用二氯甲烷(20ml)稀释，用水(20ml)、盐水(20ml)洗涤，用硫酸镁干燥，浓缩。将粗产物通过快速色谱法在硅胶上纯化，洗脱使用了0至5％甲醇/二氯甲烷。将溶剂蒸发至干燥。将所得固体用二乙基醚/石油醚(1/1)研磨，通过过滤收集，再在真空下干燥，得到N2-(2，6-二吗啉代吡啶-4-基)-N4-(1H-吲唑-4-基)嘧啶-2，4-二胺(178mg，34.4％)为浅裼色固体。NMR光谱：(DMSOd₆)3.17(bs，8H)，3.61(bs，8H)，6.47(s，1H)，6.59(s，2H)，7.22(s，1H)，7.27(s，1H)，7.79(s，1H)，8.12(s，1H)，8.21(s，1H)，9.16(s，1H)，9.46(s，1H)，13.06(s，1H)；质谱：MH⁺474。

用作起始物质的N-(2-氯嘧啶-4-基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吲唑-4-胺制备如下：

向在25℃下的4-硝基-1H-吲唑(10g，61.30mmol)和碳酸钾(9.32g，67.43mmol)在DMF(100mL)中的混悬液中加入4-甲氧基苄基氯(9.14mL，67.43mmol)。使所得混合物在110℃下搅拌2小时。使反应混合物冷却，再用水稀释。水层用DCM(2x100mL)萃取。有机层用MgSO₄干燥，过滤，浓缩。将残余物通过快速色谱法在硅胶上纯化，洗脱使用了0至2％乙酸乙酯/二氯甲烷。将溶剂蒸发至干燥，得到1-(4-甲氧基苄基)-4-硝基-1H-吲唑(9.00g，51.8％)为橙色固体。NMR光谱：(DMSOd₆)3.70(s，3H)，5.73(s，2H)，6.87(d，2H)，7.25(d，2H)，7.65(dd，1H)，8.17(d，1H)，8.34(d，1H)，8.54(s，1H)。

将1-(4-甲氧基苄基)-4-硝基-1H-吲唑(9g，31.77mmol)和氧化铂(IV)(0.433g，1.91mmol)在乙醇(150mL)/乙酸乙酯(10mL)中的混悬液在40psi和25℃下氢化2小时。将所得混合物过滤，浓缩滤液至干燥，得到1-(4-甲氧基苄基)-1H-吲唑-4-胺(8.03g，100％)为黄-橙色固体。质谱：MH⁺254。

将2，4-二氯嘧啶(3.71g，24.87mmol)、1-(4-甲氧基苄基)-1H-吲唑-4-胺(6g，23.69mmol)和N，N-二异丙基乙胺(4.54mL，26.06mmol)在乙醇(60mL)中的混悬液在90℃下搅拌65小时。将反应混合物浓缩至干燥，用乙酸乙酯(100ml)稀释，用水(100ml)和盐水(100ml)洗涤，用硫酸镁干燥，浓缩。将粗产物通过快速色谱法在硅胶上纯化，洗脱使用了5至70％乙酸乙酯/石油醚。将溶剂蒸发至干燥，得到N-(2-氯嘧啶-4-基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吲唑-4-胺(5.53g，64％)为粉色固体。NMR光谱：(DMSOd₆)3.70(s，3H)，5.57(s，2H)，6.86(d，2H)，6.93(d，1H)，7.22(d，2H)，7.37(dd，1H)，7.48(d，1H)，7.59(d，1H)，8.22(d，1H)，8.23(s，1H)，10.13(s，1H)；质谱：MH⁺366

实施例4至8

使N-(2-氯嘧啶-4-基)-1-(4-甲氧基苄基)-N-甲基-1H-吲唑-4-胺(304mg，0.80mmol)相应的氨基杂芳基(0.80mmol)、1，8-二氮杂双环-[5.4.0]-十一碳-7-烯(0.239mL，1.60mmol)、二(二苯亚甲基丙酮)钯(0)(69mg，0.12mmol)和9，9-二甲基-4，5-二(二苯膦)呫吨(139mg，0.24mmol)混悬于二噁烷(5mL)中，并密封在微波管中。使反应混合物脱气，用氮气吹扫，并在油浴中在120℃下过夜。使反应混合物冷却至室温，过滤，用二氯甲烷洗涤。将滤液浓缩至干燥。使该残余物溶解于20％的水在三氟乙酸中的溶液(5mL)，再使反应加热至75℃达24小时。使该混合物浓缩至干燥，置于甲醇(2.5mL)-甲苯(2.5mL)中，浓缩至干燥。使该残余物溶解于DMF(1mL)中，用7N甲醇制氮中和，再通过制备型HPLC使用Waters X-Bridge反相柱(C-18，5微米硅胶，19mm直径，100mm长，流速为40ml/分钟)纯化，洗脱液为极性渐渐减少的水(含0.2％碳酸铵)和乙腈的混合物。将含有需要的化合物的级分蒸发至干燥，得到需要的产物。

N-(2-氯嘧啶-4-基)-1-(4-甲氧基苄基)-N-甲基-1H-吲唑-4-胺用作起始物质的制备如下：

在0℃和氮气下，将甲基碘(1.021mL，16.40mmol)滴加至N-(2-氯嘧啶-4-基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吲唑-4-胺(4g，10.93mmol，实施例3起始物质)和碳酸钾(2.267g，16.40mmol)在DMF(40mL)中的搅拌的混悬液中。使所得混悬液在0℃下搅拌15分钟，再使之温热至室温。使反应混合物在室温下搅拌过夜，过滤，用乙酸乙酯洗涤。将滤液浓缩至干燥，用二氯甲烷(40ml)稀释，用水(40ml)、盐水(40ml)洗涤，用硫酸镁干燥，浓缩。将残余物通过快速色谱法在硅胶上纯化，洗脱使用了0至45％乙酸乙酯/石油醚，得到N-(2-氯嘧啶-4-基)-1-(4-甲氧基苄基)-N-甲基-1H-吲唑-4-胺(3.4g，82％)为淡橙色固体。NMR光谱：(DMSOd₆)3.50(s，3H)，3.71(s，3H)，5.63(s，2H)，6.19(d，1H)，6.89(d，2H)，7.16(d，1H)，7.29(d，2H)，7.49(dd，1H)，7.81(d，1H)，7.96(d，1H)，8.00(s，1H)；质谱：MH⁺380。

^a用作起始物质的2-吗啉代吡啶-4-胺制备如下：

将2-氯-6-吗啉代吡啶-4-胺(567mg，2.65mmol，参见注解e)和10％钯披炭(57mg)在乙酸乙酯(8mL)-乙醇(1.6mL)中的混悬液在1atm和室温下氢化5小时。加入N，N-二异丙基乙胺(0.55mL)。将该混合物过滤，再将滤液浓缩至干燥。将残余物用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，用硫酸镁干燥，浓缩，得到2-吗啉代吡啶-4-胺(265mg，56％)为白色固体。NMR光谱：(DMSOd₆)3.37-3.43(m，4H)，3.69-3.76(m，4H)，6.03(d，1H)，6.32(dd，1H)，7.53(bs，2H)，7.62(d，1H)；质谱：MH⁺180

^b该化合物是通过快速色谱法在硅胶上重新纯化的，洗脱使用了0至4％甲醇/二氯甲烷。

^c该化合物是通过快速色谱法在硅胶上重新纯化的，洗脱使用了0至4％甲醇/二氯甲烷。

用作起始物质的4-氯-6-吗啉-4-基-吡啶-2-胺制备如下：

使2-氨基-4，6-二氯-吡啶(900mg，5.52mmol，描述于Rec.Trav.Chim.Pays-Bas 1950，vol.69，p.673-690)、吗啉(4.80ml，55.2mmol)和DMSO(0.39ml，5.52mmol)的混合物在Personal Chemistry EMRYS^TMOptimizer EXP微波合成器中在170℃下加热30分钟。冷却之后，在真空中除去吗啉，将残余物用30％氢氧化铵处理，再将所得混合物用二氯甲烷萃取。蒸发溶剂，残余物在硅胶上纯化(3至4％MeOH/DCM)，得到4-氯-6-吗啉-4-基-吡啶-2-胺(890mg，72％产率)及其异构体6-氯-4-吗啉-4-基-吡啶-2-胺(190mg，16％产率)。NMR光谱(500MHz，CDCl3)3.43-3.45(m，4H)，3.76-3.78(m，4H)，4.30(bs，2H)，5.91(s，1H)，5.97(s，1H).质谱：MH⁺214。

^d在该脱保护步骤中用20％水/TFA，将该混合物在75℃下搅拌24小时，然后在140℃下搅拌15分钟。

用作起始物质的2，6-二吗啉-4-基嘧啶-4-胺制备如下：

将4-氨基-2，6-二氯嘧啶(1.64g，10.0mmol)、吗啉(8.7ml，100mmol)和DMA(1.90ml，20mmol)的混合物在180℃下加热1小时。冷却之后，在真空中除去吗啉，再将残余物在硅胶上纯化(2至4％MeOH/DCM)，得到2，6-二吗啉-4-基嘧啶-4-胺(2.1g，79％产率)为白色固体。NMR光谱(500MHz，CDCl3)3.45-3.49(m，4H)，3.71-3.75(m，12H)，4.37(bs，2H)，5.07(s，1H).质谱：MH⁺266。

^e用作起始物质的2-氯-6-吗啉-4-基-吡啶-4-胺制备如下：

将4-氨基-2，6-二氯-吡啶(2.0g，12.2mmol)、吗啉(10.7ml，123mmol)和DMSO(0.87ml，12.3mmol)的混合物在Personal ChemistryEMRYS^TM Optimizer EXP微波合成器中在170℃下加热1小时。冷却之后，在真空中除去吗啉，将该残余物用30％氢氧化铵处理，再将所得混合物用二氯甲烷萃取。蒸发溶剂，残余物在硅胶上纯化(2至3％MeOH/DCM)，得到2-氯-6-吗啉-4-基-吡啶-4-胺(1.4g，53％产率)。NMR光谱(500MHz，CDCl3)3.42-3.44(m，4H)，3.76-3.78(m，4H)，4.07(bs，2H)，5.69(s，1H)，6.04(s，1H).质谱：MH⁺214。

实施例9、10和11是根据实施例1所述相同操作制备的，不同之处在于加热是在微波反应器中在150℃下10分钟。使粗制混合物在制备型HPLC-MS***(柱：C18，5微米，19mm直径，100mm长，洗脱使用含有2g/l碳酸铵的水和乙腈的混合梯度)上纯化。蒸发收集的级分，得到需要的化合物。

实施例9

N′-(5-氯-1，3-苯并间二氧杂环戊烯-4-基)-N-(4-吗啉代-2-吡啶)嘧啶-2，4-二胺

从4-吗啉代吡啶-2-胺(描述于Bioorg.Med.Chem.Lett.2006，vol.16，p.839)制备，31％产率。

NMR光谱(500MHz，DMSOd6)3.01(m，4H)，3.66(m，4H)，5.99(s，2H)，6.16(d，1H)，6.46(dd，1H)，6.91(d，1H)，7.05(d，1H)，7.56(s，1H)，7.88(d，1H)，8.05(d，1H)，8.70(br s，1H)，9.09(br s，1H).质谱MH+427

实施例10

N′-(5-氯-1，3-苯并间二氧杂环戊烯-4-基)-N-(6-吗啉代-2-吡啶)嘧啶-2，4-二胺

从6-吗啉代吡啶-2-胺(描述于WO2002014311，p.111)制备，26％产率。

NMR光谱(500MHz，DMSOd6)3.38(m，4H)，3.66(m，4H)，6.03(s，2H)，6.19(d，1H)，6.31(d，1H)，6.93(d，1H)，7.04(d，1H)，7.25(t，1H)，7.33(d，1H)，8.03(d，1H)，8.47(s，1H)，9.11(s，1H).质谱MH+427

实施例11

N-(4，6-二吗啉-4-基嘧啶-2-基)-N′-(1H-吲唑-4-基)-N′-甲基-嘧啶 -2，4-二胺

此化合物是从4，6-二吗啉代嘧啶-2-胺根据实施例4的相同操作使用碳酸钾(20eq.)替代1，8-二氮杂双环-[5.4.0]-十一碳-7-烯并且用甲苯为溶剂制备的。

NMR光谱(500MHz，DMSOd6)3.51-3.57(m，8H)，3.52(s，3H)，3.61-3.67(m，8H)，5.61(s，1H)，5.69(d，1H)，7.09(d，1H)，7.43(dd，1H)，7.54(d，1H)，7.82(d，1H)，7.89(s，1H)，8.54(s，1H)，13.32(s，1H)质谱MH+489

4，6-二吗啉代嘧啶-2-胺是使用以下操作法制备的：

将2-氨基-4，6-二氯嘧啶(1g，6.10mmol)和吗啉(5.33ml，60.9mmol)溶解于DMA(1.1ml)中，并密封在微波管中。在微波反应器中将该混合物加热至150℃历经20分钟时间。将反应混合物用AcOEt稀释，过滤，滤液浓缩，得到油状物。将粗产物通过快速色谱法在硅胶上纯化，洗脱使用了0至4％甲醇/二氯甲烷。将溶剂蒸发至干燥，得到4，6-二吗啉代嘧啶-2-胺(1.15g，71％)为白色泡沫状物。

NMR光谱(500MHz，DMSOd6)3.38-3.44(m，8H)，3.57-3.64(m，8H)，5.31(s，1H)，5.65(bs，2H)

实施例12

N′-(5-氯-1，3-苯并间二氧杂环戊烯-4-基)-N-[2-甲基-6-(4-甲基哌嗪 -1-基)嘧啶-4-基]嘧啶-2，4-二胺

在氮气下使2-甲基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-胺(71mg)、乙酸钯(1mg)、Xantphos(24mg)、碳酸铯(166mg)和2-氯-N-(5-氯-1，3-苯并间二氧杂环戊烯-4-基)嘧啶-4-胺(117mg)溶解于二噁烷(4ml)，并在微波反应器中在150℃下加热60分钟。使反应冷却，再在乙酸乙酯和水之间分配。将有机层干燥，浓缩，得到棕色固体，将其通过反相色谱法纯化，得到N′-(5-氯-1，3-苯并间二氧杂环戊烯-4-基)-N-[2-甲基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]嘧啶-2，4-二胺为黄色固体(25mg，13％)；NMR光谱(300MHz，CDCl₃)2.30(s，3H)，2.37(s，3H)，2.55(br s，4H)，3.64(br s，4H)，5.90(s，2H)，5.95(d，1H)，6.58-6.68(m，1H)，6.78-6.95(m，1H)，7.40(s，1H)，8.09(d，1H)；质谱M⁺455。

用作起始物质的2-甲基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-胺是如下制备的：

使6-氨基-2-甲基嘧啶-4-醇(5g)混悬于亚磷酰氯(phosphorousoxychloride，50ml)中，再在80℃下加热1小时。加入数滴DMF，再将反应加热至105℃达3小时，得到橙色溶液。使反应浓缩，在真空中浓缩，再与甲苯共沸。将该残余物小心地在乙酸乙酯和冰冷的饱和碳酸氢钠水溶液之间进行分配。分离有机层，用水和盐水洗涤，干燥，在真空中浓缩，得到6-氯-2-甲基嘧啶-4-胺为黄色固体，其未经进一步纯化即被使用(3g，68％)；NMR光谱(300MHz，CDCl₃)2.50(s，3H)，5.00(br s，2H)，6.30(s，1H)；质谱MH⁺+CH₃CN 185。将6-氯-2-甲基嘧啶-4-胺(2.45g)混悬于1-甲基哌嗪(24ml)中，再在微波反应器中使反应在140℃下加热20分钟。使反应冷却，再在真空中浓缩。使该残余物溶解于甲醇中，用聚合物结合的碳酸盐树脂中和1小时，然后过滤，浓缩，得到橙色固体，将其与乙酸乙酯研磨，得到2-甲基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-胺为乳膏状固体(2.64g，81％)；NMR光谱(300MHz，CDCl₃)2.20(s，3H)，2.30(s，3H)，2.40(m，4H)，3.50(m，4H)，4.40(br s，2H)，5.40(s，1H)；质谱MH⁺208。

实施例13

生物学试验

A)体外EphB4酶活性试验

该试验使用Alphascreen^TM荧光检测技术，检验了EphB4-介导的-多肽底物的磷酸化的抑制剂。简要地说，在镁-ATP的存在下，用生物素-化的多肽底物(生物素-聚-GAT)培养重组体EphB4。通过与抗生蛋白链菌素涂渍的供体珠粒(其结合了含有任何磷酸化酪氨酸残基的生物素底物)一起加入EDTA来终止反应。存在于受体珠粒上的抗磷酸酪氨酸抗体与磷酸化底物结合，由此使得供体和受体珠粒紧密地接近。随后在680nm处激发供体珠粒，产生单氧物种，其在受体珠粒上与化学发光体相互作用，在520-620nm处引起光发射。信号强度与底物磷酸化的水平成正比，并由此通过信号减小来测定抑制。

含水化合物制备

将试验化合物制备为10mM的在DMSO中的储备溶液(Sigma-Aldrich Company Ltd，Gillingham，Dorset SP8 4XT CatalogueNo.154938)，并用5％DMSO连续稀释，得到6倍所需最后浓度的试验浓度范围。将2μl每个化合物稀释物的等分样品转入低容量白色384-孔试验板(Greiner，Stroudwater Business Park，Stonehouse，Gloucestershire，GL10 3SX，Cat No.784075)的合适孔中，一式两份。每个板还包括对照孔：使用含有2μl的5％DMSO的孔产生最大信号，使用含有2μl的0.5M EDTA(Sigma-Aldrich Company Ltd，Catalogue No.E7889)的孔产生相当于100％抑制的最小信号。

声学法化合物制备

将测试化合物在100％DMSO中制备，并分配在多份的试验板的目标孔中，其中使用了Labcyte Echo550(Sunnyvale，California 94089，USA)。为了确保每一孔含有总计120nl DMSO，将孔根据需要全部装填。最大对照孔含有DMSO，最小对照孔含有120nl化合物，其浓度足以竞争抑制酶活性。化合物的测试范围为所需最终浓度的100x。

对于使用含水化合物制备的该试验，除了化合物或对照物之外，试验板的每个孔还含有：包含最后缓冲液(10mM Tris，100μM EGTA，10mM乙酸镁，4μM ATP，500μM DTT，1mg/ml BSA)的10μl试验混合物，0.25ng重组体活性EphB4(氨基酸563-987；Swiss-Prot Acc.No.P54760)(ProQinase GmbH，Breisacher Str.117，D-79106 Freiburg，Germany，Catalogue No 0178-0000-3)和5nM聚-GAT底物(CisBioInternational，BP 84175，30204 Bagnols/Cèze Cedex，France，CatalogueNo.61GATBLB)。然后将试验板在室温下培养1小时。

对于使用通过声学分配法(acoustic dispensing)制备的化合物的试验，将该试验混合物调节至最终试验体积为12ul，其中含有与测试含水化合物时所使用10ul试验混合物相同浓度的试剂。

不考虑化合物制备的方法，通过加入5μl/终止缓冲液(10mM Tris，495mM EDTA，1mg/ml BSA)(包含AlphaScreen抗磷酸酪氨酸-100受体珠粒和抗生蛋白链菌素涂渍的供体珠粒(Perkin Elmer，Catalogue No6760620M)各自0.25ng)来终止反应。在自然光照条件下密封板，用铝箔包装，并在暗处进一步培养20小时。

在Perkin Elmer EnVision平板读数器上测定得到的试验信号。从所有值中减去最小值，并且将信号对应于化合物浓度绘图，得到IC₅₀数据。用于产生化合物稀释液的该方法在数据库中用IC₅₀值记录。来自使用声学分配法制备的化合物的数据标记为“回声(Echo)”，其它结果标记为“原始(Genesis)”。在体外EphB4酶试验中测试本发明化合物，由此获得的IC₅₀值提供以以下表A。

表A

实施例编号	EphB4酶试验平均IC₅₀值(μM)	化合物制备的方法
实施例编号	EphB4酶试验平均IC₅₀值(μM)	化合物制备的方法	1	0.501α	原始
2	0.605α	原始	1	0.501α	原始
2	0.605α	原始	3	0.243	原始

实施例编号	EphB4酶试验平均IC₅₀值(μM)	化合物制备的方法
实施例编号	EphB4酶试验平均IC₅₀值(μM)	化合物制备的方法	4	0.146α0.003	原始回声
5	0.553α0.002	原始回声	4	0.146α0.003	原始回声
5	0.553α0.002	原始回声	6	0.973α0.007	原始回声
7	0.778α0.003	原始回声	6	0.973α0.007	原始回声
7	0.778α0.003	原始回声	8	0.445α0.004	原始回声
9	0.1700.052α	原始回声	8	0.445α0.004	原始回声
9	0.1700.052α	原始回声	10	0.817α0.064α	原始回声
11	3.03α0.486α	原始回声	10	0.817α0.064α	原始回声
11	3.03α0.486α	原始回声	12	6.440	原始

α仅测试一次。

B)体外EphB4细胞试验

通过在用化合物处理细胞之后来测定EphB4的磷酸化降低，该试验鉴别了细胞EphB4的抑制剂。端点试验使用夹心ELISA来检验EphB4磷酸化状态。简要地说，将得自于处理了的细胞溶解产物的Myc-标记的EphB4借助于抗-c-Myc抗体捕集在ELISA板上。然后使用与HRP辍合的普通磷酸酪氨酸抗体，通过HRP催化的比色输出信号来测定所捕集的EphB4的磷酸化状态，EphB4磷酸化的水平与颜色强度成正比。用分光光度法在450nm处测定吸光度。

使用标准技术，由cDNA(使用RT-PCR，由HUVEC制备)克隆全长人EphB4(Swiss-Prot Acc.No.P54760)。然后将cDNA片段亚克隆到包含Myc-His附加表位的pcDNA3.1表达载体中，在C-末端产生包含Myc-His标记的全长EphB4(Invitrogen Ltd.Paisley，UK)。在37℃，在5％CO₂条件下，将CHO-K1细胞(LGC Promochem，Teddington，Middlesex，UK，Catalogue No.CCL-61)中，该培养基包含10％热失活的胎儿小牛血清(PAA lab GmbH，Pasching，Austria Catalogue No.PAA-A15-043)和1％ glutamax-1(Invitrogen Ltd.，Catalogue No.35050-038)。使用标准稳定转染技术，使CHO-K1细胞稳定地表达EphB4-Myc-His结构，产生下文称为EphB4-CHO的细胞。

对于每个试验，将10,000个EphB4-CHO细胞种入Costar 96-孔组织培养皿(Fisher Scientific UK，Loughborough，Leicestershire，UK.，Catalogue No.3598)的每个孔中，并在完全培养基中培养过夜。第2天将细胞在90μl/孔的培养基中培养过夜，该培养基包含0.1％Hyclone汽提的血清(Fisher Scientific UK，Catalogue No.SH30068.02)。将试验化合物制备为10mM的在DMSO中的储备溶液(Sigma-Aldrich Company Ltd，Gillingham，Dorset SP8 4XT Catalogue No.154938)，并用无血清培养基连续稀释，得到10倍所需最后浓度的试验浓度范围。将每个化合物稀释物的10μl等份样品转入到细胞板的孔中，一式两份，并将细胞在37℃培养1小时。每个板还包括对照孔：使用未处理的细胞产生最大信号，使用包含参比化合物(已知消除了EphB4活性)的孔产生相当于100％抑制的最小信号。

在4℃下，将重组体ephrin-B2-Fc(R&D Systems，Abingdon SciencePark，Abingdon，Oxon OX14 3NB UK，Catalogue No.496-EB)(EphB4的同源配体的Fc标记形式)以3μg/ml的浓度与0.3μg/ml抗人类IgG、特定Fc片段在无血清培养基中预先群集30分钟，不时地进行混合。用化合物处理之后，在37℃，将细胞用群集的ephrin-B2(以1μg/ml的最后浓度)激发20分钟，以引起EphB4磷酸化。激发之后，除去培养基，并将细胞在100μl/孔的溶解缓冲液(25mM Tris HCl，3mM EDTA，3mMEGTA，50mM NaF，2mM原钒酸盐，0.27M蔗糖，10mM β-甘油磷酸盐，5mM焦磷酸钠，2％Triton X-100，pH 7.4)中溶解。

在4℃，在磷酸盐缓冲盐水((10μg/ml；在AstraZeneca制备)中，用100μl的抗-c-Myc抗体将ELISA Maxisorp 96-孔板(Nunc；FisherScientific UK，Loughborough，Leicestershire，UK.，Catalogue No.456537)的每个孔涂渍过夜。在室温下，将板用包含0.05％Tween-20的PBS洗涤两次，用250μl/孔的3％TopBlock(Fluka)(Sigma-Aldrich CompanyLtd，Gillingham，Dorset SP8 4XT，Catalogue No.37766)封闭至少2小时。在4℃下，将板用PBS/0.05％Tween-20洗涤两次，用100μl/孔的细胞溶解产物培养过夜。用PBS/0.05％Tween-20洗涤ELISA板四次，并在室温下用100μl/孔HRP-辍合的4G10抗磷酸酪氨酸抗体(Upstate，Dundee Technology Park，Dundee，UK，DD2 1SW，Catalogue No.16-105)(在3％Top Block中稀释至1∶6000)培养1小时。用PBS/0.05％Tween-20洗涤ELISA板四次，并用100μl/孔TMB底物(Sigma-Aldrich CompanyLtd，Catalogue No.T0440)显影。15分钟之后，加入25μl/孔2M硫酸来终止反应。使用Tecan SpectraFluor Plus，在450nm处测定吸光度。从所有值中减去最小值，并且将信号对应于化合物浓度绘图，得到IC₅₀数据。

在以上试验中本发明化合物是有活性的，例如在试验A和试验B中通常显示出IC₅₀值低于30μM。例如以上实施例3的化合物在试验A中显示出0.243μM的IC₅₀，在试验B中显示出0.026μM的IC₅₀。本发明优选化合物具有的IC₅₀值在试验A中低于μM，在试验B中低于0.5μM。

C)体外EphA2酶活性试验

该试验使用Alphascreen^TM荧光检测技术，检验了EphA2-介导的-多肽底物的磷酸化的抑制剂。简要地说，在镁-ATP的存在下，用生物素-化的多肽底物(生物素-聚-GAT)培养重组体EphA2。通过与抗生蛋白链菌素涂渍的供体珠粒(其结合了含有任何磷酸化酪氨酸残基的生物素底物)一起加入EDTA来终止反应。存在于受体珠粒上的抗磷酸酪氨酸抗体与磷酸化底物结合，由此使得供体和受体珠粒紧密地接近。随后在680nm处激发供体珠粒，产生单氧物种，其在受体珠粒上与化学发光体相互作用，在520-620nm处引起光发射。信号强度与底物磷酸化的水平成正比，并由此通过信号减小来测定抑制。

对于该试验，除了化合物或对照物之外，试验板的每个孔还含有：包含最后缓冲液(10mM Tris，100μM EGTA，10mM乙酸镁，4μM ATP，500μM DTT，1mg/ml BSA)的10μl试验混合物，0.5ng重组体活性EphA2(氨基酸591-976；Swiss-Prot Acc.No.P29317)(ProQinase GmbH，Breisacher Str.117，D-79106 Freiburg，Germany，Catalogue No0178-0000-3)和5nM聚-GAT底物(CisBio International，BP 84175，30204Bagnols/Cèze Cedex，France，Catalogue No.61GATBLB)。然后将试验板在室温下培养1小时。

通过加入5μl/终止缓冲液(10mM Tris，495mM EDTA，1mg/ml BSA)(包含AlphaScreen抗磷酸酪氨酸-100受体珠粒和抗生蛋白链菌素涂渍的供体珠粒(Perkin Elmer，Catalogue No 6760620M)各自0.25ng)来终止反应。在自然光照条件下密封板，用铝箔包装，并在暗处进一步培养20小时。

在Perkin Elmer EnVision平板读数器上测定得到的试验信号。从所有值中减去最小值，并且将信号对应于化合物浓度绘图，得到IC₅₀数据。在体外EphA2酶活性试验中测试本发明的实施例9和10，由此获得的IC₅₀值分别为0.131和0.566μM。

Claims

1.式(I)化合物或其药学可接受的盐：

其中

A¹、A²或A³的一个是N，并且其它独立地选自CH或N；

n是0、1、2或3；和

各个基团R²独立地选自卤素、三氟甲基、氰基、硝基或下式(i)基团：

-X¹-R¹¹(i)

其中X¹选自直接连接键或者O、S、SO、SO₂、OSO₂、NR¹³、CO、CH(OR¹³)、CONR¹³、N(R¹³)CO、SO₂N(R¹³)、N(R¹³)SO₂、C(R¹³)₂O、C(R¹³)₂S、C(R¹³)₂N(R¹³)和N(R¹³)C(R¹³)₂，其中R¹³是氢或C_1-6烷基；和

R³选自：

(i)氢、卤素、硝基、氰基或羟基；

下式基团：

-W-R⁹

R^b选自氢或(1-2C)烷基；

并且R⁹选自氢或(1-4C)烷基；

(iv)式(II)基团：

-X-R¹⁴

其中R^c选自氢或(1-2C)烷基；

-NR¹⁵R¹⁶

(v)通过碳原子连接的4-7元杂环基团；并且

R⁴是基团-NR¹⁷R¹⁸，其中R¹⁷和R¹⁸连接形成4、5、6或7元杂环状环，该环除了与R¹⁷和R¹⁸连接的氮原子外任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中存在的任一S原子可任选被氧化以形成SO或SO₂基团，并且其中该环中存在的任一碳原子任选被以下基团取代：氧代、卤素、羟基、氰基、(1-4C)烷基、羟基(1-4C)烷基、(1-4C)烷氧基、(1-2C)烷氧基-(1-4C)烷基、(1-4C)烷酰基、(1-4C)烷磺酰基、(1-4C)烷氧基羰基、(1-6C)烷基氨基羰基或二-(1-6C)烷基氨基羰基，并且该环中存在的任一可用氮原子任选被以下基团取代：(1-4C)烷基、羟基(1-4C)烷基、(1-2C)烷氧基-(1-4C)烷基或(1-4C)烷酰基。

2.权利要求1的化合物，其中B选自OCH₂O-、-OCF₂O-、-CH＝CH-NR²⁰-或-NR²⁰-CH＝CH-、-O-N＝CH-、-CH＝N-O-、-O-NR²⁰-CH₂-、-CH₂-NR²⁰-O-、-NR²⁰-N＝CH-、-CH＝N-NR²⁰-、-NR²⁰-NR²⁰-CH₂-或-CH₂-NR²⁰-NR²⁰，其中各个R²⁰独立地选自氢、C_1-6烷基或C_1-6烷基羰基。

3.权利要求2的化合物，其中B是-NR²⁰-N＝CH-、-CH＝N-NR²⁰-或-OCH₂O-。

4.权利要求3的化合物，其中该化合物是式(IB)或(IC)化合物：

其中A¹、A²、A³、R¹、R²、R³、R⁴和n如权利要求1所定义。

5.前述权利要求任一项的化合物，其中R¹是氢或甲基。

6.前述权利要求任一项的化合物，其中R⁴是下式基团：

其中Y选自O、NR^y或CR^z，其中R^y选自氢或(1-2C)烷基，并且R^z选自氢或羟基。

7.前述权利要求任一项的化合物，其中R³是基团-NR¹²R^12a，其中R¹²和R^12a各自独立地选自氢或(1-6C)烷基，或者R¹²和R^12a连接形成5、6或7-元杂环状环，并且其中除了与R¹²和R^12a连接的氮原子外该环任选包含一个或两个选自O、N或S的其它杂原子，并且其中该环在任一可用碳原子上任选被一个或两个选自以下的取代基取代：氧代、卤素、羟基、氰基、(1-4C)烷基或(1-4C)烷磺酰基，并且该环中存在的任一可用氮原子任选被(1-4C)烷基或(1-4C)烷酰基取代。

8.前述权利要求任一项的化合物，其中n是0或1，并且当n是1时，R²选自卤素、三氟甲基、氰基、羟基、C_1-6烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基和C_1-6烷氧基。

9.前述权利要求任一项的化合物，其中A¹是氮。

10.权利要求1的化合物，其选自：

N2-(2，6-二吗啉代吡啶-4-基)-N4-(1H-吲唑-4-基)嘧啶-2，4-二胺；

N-(4，6-二吗啉-4-基嘧啶-2-基)-N′-(1H-吲唑-4-基)-N′-甲基-嘧啶-2，4-二胺；N′-(5-氯-1，3-苯并间二氧杂环戊烯-4-基)-N-[2-甲基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]嘧啶-2，4-二胺；或者

它们药学可接受的盐。

11.一种药物组合物，其包含权利要求1至10任一项的化合物和药学可接受的载体或稀释剂。

12.制备式(I)化合物的方法，其包括：

(A)使式(II)化合物与式(III)化合物反应，