CN101575582A - 具有抗炎活性的乳杆菌分离株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明揭示两株具有抗炎活性以及有益的益生性质的乳杆菌分离株，也就是沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)GMNL－76以及罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL－89，它们分别以保藏编号BCRC 910355与BCRC 910340被保藏于食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)，以及以保藏编号CCTCC M 207153与CCTCC M 207154被保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。这两株乳杆菌分离株及其继代培养后代可被用于制备各式的食品产品，以及用于制备用于治疗和/或缓解与炎症有关联的疾病(诸如类风湿性关节炎)的药物组合物。

Description

具有抗炎活性的乳杆菌分离株及其用途

技术领域

本发明是有关于两株具有抗炎活性以及有益的益生性质(beneficial probiotic properties)的乳杆菌分离株，也就是沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)GMNL-76以及罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89，它们分别以保藏编号BCRC910355与BCRC 910340被保藏于食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)，以及以保藏编号CCTCC M207153与CCTCC M 207154被保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。这两株乳杆菌分离株及其继代培养后代可被用于制备各式的食品产品，以及用于制备用于治疗和/或缓解与炎症有关联的疾病(诸如类风湿性关节炎)的药物组合物。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性自身免疫疾病，它会造成关节(例如手、足、腕、肘、膝以及踝关节)的肿胀、变形、疼痛、萎缩以及僵硬。长期的慢性关节炎会逐渐侵蚀掉正常的关节骨细胞，导致关节变形以致最后丧失功能。此外，类风湿性关节炎也会侵犯关节以外的部位，例如腺体(诸如唾液腺、泪腺以及淋巴腺等)、器官(诸如肝脏、脾脏、心脏以及肺脏等)或***(诸如循环***以及神经***)，进而造成类风湿性血管炎、胸膜肺征候(pleuropulmonary manifestations)(包括间质纤维化、胸膜肺结节、肺炎与动脉炎)以及费耳提氏综合征等。

类风湿性关节炎的发病年龄主要是落在40至50岁之间，而女性的发病率是男性的2至4倍。至今，类风湿性关节炎的确切致病原因仍是未知，但是，先前的研究显示：遗传倾向、环境诱发、自身免疫现象、慢性炎症、细胞运输以及治疗等都可能与类风湿性关节炎的免疫发病机制有关联。

类风湿性关节炎的主要病灶是滑膜组织。正常关节内的滑膜细胞不会超过3层，但在关节炎患者的关节内则会出现明显的增生。类风湿性关节炎有可能是肇因于患者的免疫细胞不正常地攻击自身的关节软骨与滑膜组织的II型胶原(collagen type II，CII)。类风湿性关节炎患者可被检测出具有对II型胶原具特异性的自身抗体和/或类风湿因子。类风湿因子是由IgG的Fc区域的糖基化缺陷而引发的自身抗体，其中以IgM最多见，而IgG、IgA也有发现。类风湿因子在大约80％的类风湿性关节炎患者中可检测到，它与原始抗原结合之后所形成的免疫复合物会沉积于滑膜、软骨或血管中而造成病变。

已知细胞因子涉及到许多重要的生物学过程，包括：炎症、组织修复、细胞生长、纤维化、血管发生，以及免疫应答。因此，细胞因子在自身免疫疾病中扮演一个重要的角色。

在M.Feldmann et al.(1996)，Annu.Rev.Immunol.，14：397-440此篇回顾性论文中，M.Feldmann等人借由分析类风湿性关节炎的滑膜组织中细胞因子的表达与调控来探讨RA的发病机制，其中细胞因子被区分为下面四大类别：(1)促炎细胞因子；(2)免疫调节性细胞因子；(3)趋化性细胞因子；以及(4)促有丝***细胞因子等。

促炎细胞因子是一群由1型T辅助细胞(简称Th1细胞)所产生的能够调节延迟型过敏反应的分子，包括：白细胞介素-1(IL-1)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等。在风湿性疾病中所观察到的软骨破坏已被普遍地认为是基质金属蛋白酶(MMP)的活性所造成，该基质金属蛋白酶是由对促炎细胞因子(诸如IL-1或TNF-α)有反应并被活化的巨噬细胞与成纤维细胞所产生。M.Feldmann等人进一步提到：将IL-1或TNF-α注射至经胶原免疫的小鼠或大鼠体内，或将IFN-γ局部注射到经II型胶原免疫的小鼠的脚掌中，皆会加速关节炎的发生并增高疾病的严重性(M.Feldmann et al.(1996)，同上述)。

免疫调节性细胞因子(也被称为抗炎细胞因子)是一群由2型T辅助细胞(简称Th2细胞)所产生的能够抑制炎症反应的分子，包括：IL-4、IL-10、IL-13以及转化生长因子-β(TGF-β)等。在G.Garcia et al.(1999)，Journal of Autoimmunity，13：315-324中，G.Garcia等人提到：TGF-β与IL-10这两种免疫调节性细胞因子不仅会抑制诱发MMP的促炎细胞因子的生成，也会诱发MMP的天然抑制剂(也就是基质金属蛋白酶的组织抑制剂TIMP)的生成。G.Garcia等人进一步提到：IL-10被广为知晓除了会抑制从Th1细胞生成IFN-γ之外，还会抑制从其它的白细胞群生成各种不同的细胞因子。IL-10会抑制从巨噬细胞生成IL-1、IL-6、TNF-α、IL-8以及G-CSF(粒细胞集落刺激因子)，并且会抑制从多形核细胞生成IL-1、TNF、IL-8、巨噬细胞炎性蛋白质1α(MIP1α)以及巨噬细胞炎性蛋白质1β(MIP1β)，而这些细胞因子与趋化因子之中的大多数涉及到关节炎的病理过程(G.Garcia et al.(1999)，同上述)。

这些研究结果显示：与Th1细胞有关的促炎细胞因子(诸如TNF-α与IFN-γ)会促进炎症而使得类风湿性关节炎的病况更为恶化，而与Th2细胞有关的免疫调节性细胞因子(诸如IL-10与IL-4)除了可以抑制促炎细胞因子的生成之外，也可通过诱导TIMP的生成来减少软骨破坏。

目前尚无药物可有效地治愈类风湿性关节炎，因此临床上所使用的药物仅能着重于防止关节与其它组织或器官的炎症与破坏、修复受损关节以减轻疼痛、以及维持关节的功能并防止变形等。治疗的模式可区分为药物治疗、手术治疗、康复治疗、运动治疗以及饮食控制等。药物治疗主要是针对炎症的症状进行治疗，而现今常用于治疗类风湿性关节炎的药物可被归纳为下面五大类(谢调扬与陈培瑛(2001)，“类风湿性关节炎的治疗”，药学杂志，17(4)：109-116)：

1.生物应答调节剂(BRM)：例如依那西普(商品名称为

)与英利西单抗(商品名称为

)，它们是抗-TNF药剂，可借由特异性地结合至TNF-α来抑制TNF-α的生物活性，进而减轻TNF-α所造成的炎症现象；

2.非甾体抗炎药(NSAID)：例如阿司匹林与布洛芬，此类药物具有消炎与止痛的功效，因此可供用于缓解类风湿性关节炎患者长期或短期的疼痛与炎症；

3.疾病改善型抗风湿药(DMARD)：例如来氟米特(商品名称为

)、氨甲碟呤、青霉胺、羟氯喹以及金化合物等，它们适用于对NSAID没有反应的类风湿性关节炎患者。DMARD借由调节会引起类风湿性关节炎的异常免疫反应来延缓疾病过程，而使用此类药物来进行治疗时必须有医师的监督以避免副作用的发生；

4.皮质类固醇：此类药物对于治疗类风湿性关节炎十分有效，但是会产生许多副作用。皮质类固醇通常是以口服或注射的剂型进行施用，但是经常注射皮质类固醇会伤害软骨，因此注射次数以每年1至2次为限。目前，口服***是医师最常开立的处方笺；以及

5.其它：例如透明质酸(诸如透明质酸钠(商品名称为))及其衍生物(诸如Hylan G-F 20(商品名称为))。透明质酸是关节软骨与滑液的主要成份，因此借由透明质酸的关节内注射可以达到刺激软骨细胞增生、保护与润滑关节，以及减轻炎症的效用。

有关用于治疗类风湿性关节炎的药物的选用，一般初期会以效力较弱、安全性较高的NSAID作为第一线用药，若治疗效果不显著，再以效力较强的DMARD作为第二线用药。当这两类药物均无法达到所期望的疗效时，则会考虑使用皮质类固醇或施行手术。虽然药物具有减轻疼痛、僵硬感及炎症的功效，但长期服用可能会产生失眠、耳鸣、水肿、胃溃疡、胃出血、胃穿孔(gastrobrosia)、皮肤敏感性、蛋白尿、糖尿病、高血压、骨质疏松症、白内障、抵抗感染能力降低等副作用，同时在治疗的过程中需要定期地作血液生化、血清检查，以确保治疗成效以及避免上述副作用的发生。

迄今，尚未有一种可以有效地治疗或缓解类风湿性关节炎并且不会产生非所需的副作用的药物。

***粮食农业组织(FAO)以及世界卫生组织(WHO)将益生菌定义为：活的微生物，当它呈适当数量进行施用时，可赋予宿主一健康益处(Guidelines for the Evaluation of Probioticsin Food，Joint FAO/WHO Working Group Report on DraftingGuidelines for the Evaluation of Probiotics in Food，April 30 andMay 1，2002)。目前可作为益生菌使用的微生物有许多种类，例如乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、酵母、链球菌属(Streptococcus)等等，特别是前两个菌属的菌种。

Eli Metchnikoff在1908年提出：存在于胃肠道(GI tract)内的有害腐败菌会被产酸的乳杆菌所抑制或拮抗(Eli Metchnikoff，1908，The Pro longation Of Life，Ed.P.Chalmers Mitchell，G.P.Putnam’s Sons，The Knickerbocker Press，New York & London)。之后，有许多的研究以及临床试验也陆续证实乳杆菌与健康之间存在有重要的相关性。

乳杆菌是一群革兰氏阳性的兼性厌氧菌，它们普遍存在于人类的胃肠道与***内，它们能够发酵糖类并以乳酸为主要代谢产物。乳杆菌已被发现的功效包括：(1)增进肠道菌群的菌相平衡；(2)预防腹泻；(3)降低结肠癌的危险性；(4)刺激胃肠上皮粘膜***的正常发育与功能；(5)产生各种维生素与营养素；以及(6)预防与治疗***病。

基于乳杆菌的有益益生性质，本领域技术人员致力于开发具有所期望的生物活性的乳杆菌分离株。在此方面，可以参见，例如：TW 588109揭示鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)Tcell-1及其用途。TW I241912揭示6株具有降低与同化胆固醇能力的新的耐酸与耐胆盐乳杆菌分离株，它们是加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)B21T1、B21T6、C21T1、X21B7与B38T38以及嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)B6T7。TW I283268公开了鼠李糖乳杆菌GM-020及其治疗肥胖的用途。TW I284149揭示副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-32及其治疗过敏相关疾病的用途。另外，TW200611973揭示发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)GM-090能有效刺激IFN-γ的分泌和/或治疗过敏。

此外，Jae-Seon So等人报导：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的口服施用会抑制胶原诱发性关节炎(CIA)以及降低脚掌肿胀、淋巴细胞浸润和软骨组织的破坏。干酪乳杆菌通过CD4⁺T细胞降低II型胶原-反应性促炎分子(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IFN-γ、TNF-α以及Cox-2)。施用干酪乳杆菌也降低NF-κB向细胞核内的移位以及CII-反应性Th1-型IgG同种型IgG2a和IgG2b，同时上调免疫性IL-10水平(Jae-Seon So et al.(2008)，Mol.Immunol.，45(9)：2690-2699；Epub 2008 Feb 19)。

如果类风湿性关节炎可以通过服用乳杆菌分离株来达到治疗效果，应可为患者提供一用药安全而且价格不贵的药品。

为达到这个目的，申请人从本土的成人胃肠道标本中筛选出两株乳杆菌分离株，它们在种系上(phylogenetically)是不同于各自所属菌种中已公开的菌株，而且具有能够刺激产生大量的IL-10以及较少量的IFN-γ和/或TNF-α的抗炎活性，因而被预期可用于治疗与炎症有关联的疾病，包括但不限于，类风湿性关节炎。

发明内容

于是，在第一个方面，本发明提供一种具有抗炎活性的乳杆菌属菌种(Lactobacillus sp.)的分离株，其中该分离株是：

(i)一选自于下列的保藏菌株：

(a)沙克乳杆菌GMNL-76，其以保藏编号BCRC 910355被保藏于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心，以及以保藏编号CCTCC M 207153被保藏于中国典型培养物保藏中心；以及

(b)罗伊氏乳杆菌GMNL-89，其以保藏编号BCRC 910340被保藏于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心，以及以保藏编号CCTCC M 207154被保藏于中国典型培养物保藏中心；或

(ii)在(i)项中的所述保藏菌株的继代培养后代。

在第二个方面，本发明提供一种食品产品，其包含有一如上所述的乳杆菌属菌种的分离株以及一可食性材料。

在第三个方面，本发明提供一种可用于治疗和/或缓解与炎症有关联的疾病的药物组合物，其包含有一如上所述的乳杆菌属菌种的分离株。

在第四个方面，本发明提供一种用于治疗个体的与炎症有关联的疾病的方法，其包括对需要该治疗的个体施用一如上所述的乳杆菌属菌种的分离株。

附图说明

下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其它目的与特征，可借由参照下文的描述、所附的权利要求书和附图而变得更为明显，附图中：

图1显示患有胶原诱发性关节炎的大鼠在经连续喂食本发明的乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89历时8周之后被收集血清并进行IL-10的ELISA试验的结果，其中不患有关节炎并被喂食以逆渗透水的大鼠以及患有关节炎但被喂食以逆渗透水的大鼠是分别作为对照组以及安慰剂组；

图2显示患有胶原诱发性关节炎的大鼠在经连续喂食本发明的乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89历时8周之后被收集血清并进行IFN-γ的ELISA试验的结果，其中不患有关节炎并被喂食以逆渗透水的大鼠以及患有关节炎但被喂食以逆渗透水的大鼠分别是作为对照组以及安慰剂组；

图3显示患有胶原诱发性关节炎的大鼠在经连续喂食本发明的乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89历时8周之后被收集血清并进行TNF-α的ELISA试验的结果，其中不患有关节炎并被喂食以逆渗透水的大鼠以及患有关节炎但被喂食以逆渗透水的大鼠是分别作为对照组以及安慰剂组；

图4显示本发明的乳杆菌分离株GMNL-76的16S rDNA核苷酸序列；

图5显示分别以本发明的乳杆菌分离株GMNL-76以及2株以往的沙克乳杆菌BCRC 12933与BCRC 17500的基因组DNA作为模板并使用Lac P2引物进行随机扩增的多态性DNA(RAPD)分析，继而以1.8％琼脂糖凝胶进行电泳后，于紫外光下观察所得到的照相结果，其中在(A)区中，泳道M1：DNA梯(100-3000bp)，泳道1：GMNL-76；在(B)区中，泳道M2：DNA梯(100-3000bp)，泳道2：BCRC 12933；以及在(C)区中，泳道M3：DNA梯(100-3000bp)，泳道3：BCRC 17500；

图6显示本发明的乳杆菌分离株GMNL-89的16S rDNA核苷酸序列；以及

图7显示分别以本发明的乳杆菌分离株GMNL-89以及5株以往的罗伊氏乳杆菌BCRC 14625、BCRC 16090、BCRC 16091、BCRC 17476与BCRC 17478的基因组DNA作为模板并使用LacP2引物进行RAPD分析，继而以1.8％琼脂糖凝胶来进行电泳后，于紫外光下观察所得到的照相结果，其中在(A)区中，泳道M1：DNA梯(100-3000bp)，泳道1：GMNL-89；在(B)区中，泳道M2：DNA梯(100-3000bp)，泳道2：BCRC 14625；在(C)区中，泳道M3：DNA梯(100-3000bp)，泳道3：BCRC 16090；在(D)区中，泳道M4：DNA梯(100-3000bp)，泳道4：BCRC 16091；在(E)区中，泳道M5：DNA梯(100-3000bp)，泳道5：BCRC 17476；以及在(F)区中，泳道M6：DNA梯(100-3000bp)，泳道6：BCRC17478。

发明详细说明

类风湿性关节炎是一种全身性的慢性疾病，但目前临床上所用的药物并无法有效地治疗类风湿性关节炎，而且长期使用此类药物还会引起非所需的不利副作用。

此外，先前的研究指出：与Th1细胞有关的促炎细胞因子(诸如IFN-γ以及TNF-α)会促进炎症而使得类风湿性关节炎的病况更为恶化，而与Th2细胞有关的免疫调节性细胞因子(诸如IL-10与IL-4)可以抑制促炎细胞因子的生成以及可通过诱导TIMP的生成来减少软骨破坏。因此，本发明人推论：类风湿性关节炎的治疗也许可以借由调控免疫调节性细胞因子以及促炎细胞因子的分泌量来达成。

乳酸菌，特别是乳杆菌属的菌株，是为人所熟悉与广泛使用的益生性微生物，它们已被证实具有许多有益于宿主健康的功效，例如：增进肠道菌群的菌相平衡、预防腹泻、降低结肠癌的危险性、刺激胃肠上皮粘膜***的正常发育与功能、产生各种维生素与营养素以及预防与治疗***病等。

因此，申请人尝试从被视为是益生性微生物的乳酸菌当中找出具有有利的抗炎活性的乳杆菌分离株以用于治疗类风湿性关节炎。

于是，申请人以来自台湾健康成人的胃肠道标本作为乳杆菌分离株的分离来源，并将所得到的分离株分别与实验动物的单核细胞进行共培养以刺激单核细胞分泌细胞因子，然后使用IL-10以及IFN-γ作为筛选标记，而筛选出能够刺激单核细胞分泌大量的IL-10以及较少量的IFN-γ和/或TNF-α的两株乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89，它们经特征鉴定被分别归属于沙克乳杆菌以及罗伊氏乳杆菌。

沙克乳杆菌GMNL-76以及罗伊氏乳杆菌GMNL-89已分别于2007年6月14日以及2006年11月14日以保藏编号BCRC 910355与BCRC 910340被保藏于台湾的食品工业发展研究所(FoodIndustry Research and Development Institute，FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center，BCRC)(300新竹市食品路331号)。这两个分离株也依据布达佩斯条约的规定，于2007年11月19日分别以保藏编号CCTCC M207153与CCTCC M 207154被保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉，武汉大学，430072，中华人民共和国)。

当本发明的沙克乳杆菌GMNL-76以及罗伊氏乳杆菌GMNL-89被喂食给患有胶原诱发性关节炎的大鼠时，可观察到大鼠血清中的IL-10升高而IFN-γ与TNF-α降低，这显示本发明的乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89能够使大鼠的关节炎症状况不再恶化。

相比于以往菌株沙克乳杆菌BCRC 12933与BCRC 17500以及罗伊氏乳杆菌BCRC 14625、BCRC 16090、BCRC 16091、BCRC17476与BCRC 17478，沙克乳杆菌GMNL-76与罗伊氏乳杆菌GMNL-89在活体外刺激单核细胞分泌IL-10的能力分别地要比它们各自所属菌种的以往菌株更佳。

基于上述的有利生物活性，本发明的两株乳杆菌分离株或它们的继代培养后代被预期具有可用于治疗与炎症有关联的疾病的潜力。于是，本发明提供一种用于治疗与炎症有关联的疾病的药物组合物，其包含有：

(i)至少一种选自于下列的保藏菌株：

(a)沙克乳杆菌GMNL-76，其以保藏编号BCRC 910355被保藏于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心，以及以保藏编号CCTCC M 207153被保藏于中国典型培养物保藏中心；以及

(b)罗伊氏乳杆菌GMNL-89，其以保藏编号BCRC 910340被保藏于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心，以及以保藏编号CCTCC M 207154被保藏于中国典型培养物保藏中心；或

(ii)在(i)项中的该保藏菌株的继代培养后代。

本发明也提供一种用于治疗个体的与炎症有关联的疾病的方法，其包括对需要该治疗的个体施用如上所述的乳杆菌属分离株或其继代培养后代。

依据本发明，所述与炎症有关联的疾病是选自于下列所构成的组：类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、脊椎炎、银屑病关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎以及银屑病(Eveline Trachsel et al.(2007)，ArthritisResearch & Therapy，9(1)：R9，Published online 2007 January 29.doi：10.1186/ar2115；Suchita Nadkarni et al.(2007)，The Journalof Experimental Medicine，204：33-39；Richard O Williams et al.(2007)，Current Opinion in Pharmacology，7：412-417)。在本发明的一个优选实施方式中，所述与炎症有关联的疾病是类风湿性关节炎。

依据本发明的药物组合物可利用本领域熟练技术人员所详知的技术，将上述的乳杆菌分离株或其继代培养后代配制于一药学上可接受的载体中，然后制成适用于口服施用的剂型。在本发明的一个优选实施方式中，所述药物组合物呈选自于下列一组中的剂型：溶液、悬浮液、乳剂、粉末、片剂、丸剂、糖浆、锭剂、含锭、咀嚼胶、胶囊、膏剂以及类似物。

如本文中所用的，术语“药学上可接受的载体”意指一种当被施用时不会在被施用个体内造成过敏性反应或其它非所需的效用的载体。依据本发明，所述药学上可接受的载体可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂、乳化剂、悬浮剂、分解剂、粘合剂、赋形剂、稳定剂、螯合剂、稀释剂、胶凝剂、防腐剂、润滑剂以及类似物。

此外，本发明的沙克乳杆菌GMNL-76以及罗伊氏乳杆菌GMNL-89也被发现具有耐胆盐与耐胃酸特性，因而适用于作为一种胃肠道益生菌。例如，这种分离株或其继代培养后代可用作食品添加剂，经现有的方法在原料制备时添加，或是不参与发酵而于发酵制作过程之后添加，而与任一种可食性材料被配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。

因此，本发明也提供一种食品产品，其包含有一如上所述的乳杆菌分离株或其或其继代培养后代以及一种可食性材料。

适用于本发明的可食性材料包括但不限于：液体乳制品，例如乳、浓缩乳；发酵乳，例如酸乳酪、酸乳、冷冻酸乳酪、乳酸菌发酵饮料；奶粉；冰淇淋；奶酪；干酪；豆浆；发酵豆浆；蔬果汁；果汁；运动饮料；甜点；果冻；糖果；婴儿配方奶粉；保健食品；动物饲料；膳食补充剂等等。

此外，依据本发明的食品产品可被制备成其中含有可直接食用的冻干或喷雾干燥菌体粉末的速溶冲泡食品的形式。有关食品产品的制备，可以参见，例如US 6,872,565B2、US 7,244,424B2、US 7,270,994B2、US 7,172,777B 2以及US 6,872,411B1。

依据本发明的食品产品可进一步包含有至少一种益生性微生物。如本文中所用的“益生性微生物”或“益生菌”等术语可被相互交换使用，且意指活的微生物的制备物，当被人类或动物摄食之后，所述微生物可以保持并存活在胃肠道之中，而且能够提供疾病的预防与治疗。

适用于本发明的益生性微生物包括但不限于：乳杆菌属菌种(Lactobacillus sp.)、双歧杆菌属菌种(Bifidobacterium sp.)、链球菌属菌种(Streptococcus sp.)、酵母，以及它们的组合。

优选地，所述乳杆菌属菌种是选自于下列所构成的组：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、双歧乳杆菌(Lactobacillus bifidus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、高加索乳杆菌(Lactobacilluscaucasicus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，以及它们的组合。

优选地，所述双歧杆菌属菌种是选自于下列所构成的组：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)，以及它们的组合。

优选地，所述链球菌属菌种是选自于下列所构成的组：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、双乙酰链球菌(Streptococcus diacetylcatis)，以及它们的组合。

优选地，所述酵母是选自于下列所构成的组：乳酒假丝酵母(Candida Kefyr)、弗罗棱糖酵母(Saccharomyces florentinus)、酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae)，以及它们的组合。

本发明将就下面实施例来作进一步说明，但应了解的是，该等实施例仅是用来作为例示说明，而不应被解释为本发明的实施上的限制。

实施例

实施例1.具有抗炎活性的乳杆菌分离株的初步筛选

实验材料与方法：

A.试验菌株的来源与制备：

申请人于91年2月经由中国医药大学附设医院(台中市)取得众多健康成人的胃肠道标本，并从这些标本中分离出4百余株的乳杆菌分离株。为寻找具有可用于治疗类风湿性关节炎的潜力的益生菌，申请人对这些乳杆菌分离株进行抗炎活性分析，并使用IL-10作为筛选标记。

将各试验菌株接种至Bacto乳杆菌MRS肉汤培养基(DIFCO，Cat.No.0881)内，然后于37℃下厌氧培养12至18小时。所形成的细菌培养物以4,000rpm离心15分钟，倒除上清液，将沉淀物以1X磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤共计3次，然后悬浮于1X PBS中。所形成的菌液以1X PBS调整浓度至1～5×10⁹细胞/mL(以OD₆₀₀进行菌数计数，OD₆₀₀＝1.00＝5.0×10⁸细胞/mL)，并以之作为原液进行10倍连续稀释，生成10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹细胞/mL的试验菌液供随后的实验用。

B.小鼠脾脏单核细胞的制备：

以CO₂处死6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，取出脾脏并用经灭菌的玻棒研磨。将研磨后的脾脏组织与Ficoll-Paque^TM PLUS(17-1441-03，Amersham Biosciences)以1∶1的体积比进行密度梯度离心(720g×20min，在4℃下)。之后，移除红血球，将由此得到的小鼠脾脏单核细胞以含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基调整细胞浓度至4×10⁶细胞/mL备用。

C.乳杆菌分离株刺激小鼠脾脏单核细胞分泌IL-10的评估：

向96孔的培养盘的各孔加入100μL的上述B中所制备的小鼠脾脏单核细胞样品，并分成3组分别加入：(1)试验组，20μL的上述A项中所制备的试验菌液(1×10⁷细胞/mL)；(2)正常对照组，20μL的含有10％FBS的RPMI 1640培养基；以及(3)阳性对照组，20μL的脂多醣(LPS)(大肠杆菌(Escherichia coli)血清型O55：B5，Sigma)。在培养箱(37℃，5％CO₂)中进行培养历时24小时之后，将各孔内的培养液进行离心，并从所收获的上清液取出100μL进行使用Mouse IL-10 OptEIA^TM Set(BD Biosciences，Cat.No.555252)的酵联免疫吸附测定(ELISA)。将各组的实验重复两次。

IL-10的浓度是借由将ELISA试验所测得的OD₄₀₅数值代入下列公式进行计算，并以ELISA单位(％)来表示：

ELISA单位(％)＝[(A-C)/(B-C)]×100

其中：A＝乳杆菌分离株的OD₄₀₅数值

B＝阳性对照组的OD₄₀₅数值

C＝正常对照组的OD₄₀₅数值

结果：

在所有的试验菌株当中，有46株会刺激小鼠脾脏单核细胞分泌较高数量的IL-10，它们的实验结果示于表1中。

表1.乳杆菌分离株刺激小鼠脾脏单核细胞分泌IL-10的功效评估

根据表1所示的实验结果，并同时考虑这46株试验菌株的生长速度、菌数以及在产量上的实用性等因素后，申请人选出GMNL-19、GMNL-76、GMNL-78、GMNL-89、GMNL-94、GMNL-101以及GMNL-161来作进一步试验，以评估它们在刺激人外周血单个核细胞分泌IL-10与IFN-γ上的能力。

实施例2.乳杆菌分离株刺激人PBMC分泌IL-10与IFN-γ能力的评估

实验材料与方法：

A.人外周血单个核细胞的制备：

取经检验合格供实验用的人白细胞浓缩液(台南捐血中心)与Ficoll-Paque^TM PLUS(17-1441-03，Amersham Biosciences)以1∶1的体积比进行密度梯度离心(720g×20min，在4℃下)。之后，移除红血球，将由此得到的人PBMC以含有10％FBS的RPMI1640培养基调整细胞浓度至4×10⁶细胞/mL备用。

B.乳杆菌分离株刺激人PBMC分泌IL-10的评估：

乳杆菌分离株GMNL-19、GMNL-76、GMNL-78、GMNL-89、GMNL-94、GMNL-101以及GMNL-161刺激人PBMC分泌IL-10的能力大体上是参照实施例1的“实验材料与方法”的C“乳杆菌分离株刺激小鼠脾脏单核细胞分泌IL-10的评估”当中所述的操作程序来作评估，不同之处在于：以20μL的浓度为1×10⁸细胞/mL的试验菌液作为试验组，并且使用100μL的上述A项中所制备的人PBMC样品以及Human IL-10 OptEIA^TM Set(BD Biosciences，Cat.No.555157)。

C.乳杆菌分离株刺激人PBMC分泌IFN-γ的评估：

乳杆菌分离株GMNL-19、GMNL-76、GMNL-78、GMNL-89、GMNL-94、GMNL-101以及GMNL-161刺激人PBMC分泌IFN-γ的能力是依照下面所述来作分析。

向96孔的培养盘的各孔加入100μL的上述A中所制备的人PBMC样品，并分成两组分别加入：(1)试验组，20μL的实施例1的“实验材料与方法”的A“试验菌株的来源与制备”当中所制备的试验菌液(1×10⁷细胞/mL)；以及(2)正常对照组，20μL的含有10％FBS的RPMI 1640培养基。在培养箱(37℃，5％CO₂)中培养24小时之后，将各孔内的培养液进行离心，并从所收获的上清液取出100μL进行使用BD OptEIA^TM Human IFN-γELISA Kit II(BD Biosciences，Cat.No.550612)的IFN-γELISA。

另外，将人PBMC样品以4×10⁶细胞/mL添加10μg/mL菜豆凝集素(PHA)(Sigma，Cat.No.L2769)的比例进行共同培养历时48小时。离心(720g×20min，在4℃下)之后，将上清液分装保存于-80℃冰箱备用。当进行IFN-γELISA分析时，将该经过PHA处理的上清液(100μL)用作内阳性对照组(internal positivecontrol)。

以微量分注器将经过包被缓冲液(0.1M Na₂HPO₄，0.77mMNaN₃，pH 9.0)予以稀释1000倍的100μL小鼠抗人IFN-γ(BDPharmingen^TM，Cat.No.551221)加入至一个96孔的培养盘(Nunc-Immuno^TM 96 MicroWell^TM Plates，MaxiSorp，Cat.No.442404)的各孔中，于室温(25℃)下以40rpm振荡该培养盘历时1小时，然后将该培养盘置于4℃下过夜。

之后，将该培养盘回温并移除各孔中的液体，然后以洗涤缓冲液(含有0.05％Tween 20的PBS)洗涤各孔2次(每次3分钟)，继而向每孔内加入200μL的封闭缓冲液(含有3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS)，并静置于室温下历时2小时，随后移除封闭缓冲液并用洗涤缓冲液洗涤2次。

将100μL的待测样品加入各孔中，并于4℃下反应过夜。之后，移除各孔中的液体，以洗涤缓冲液洗涤2次，然后将经过稀释缓冲液(含有1％BSA的PBS)予以稀释2000倍的100μL生物素小鼠抗-人IFN-γ(BD Pharmingen^TM，Cat.No.554550)加入至各孔内，并于室温下反应历时2小时。以洗涤缓冲液洗涤2次之后，加入经过稀释缓冲液稀释2000倍的100μL抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶(Streptavidin-AP，BD Pharmingen^TM，Cat.No.554065)，并于室温下反应历时1小时。在移除各孔中的液体之后，以洗涤缓冲液洗涤4次，然后将100μL新鲜配制的对硝基苯酚磷酸盐(pNPP)溶液加入至各孔中。于室温下将培养盘置于暗处以进行显色反应历时30分钟。之后，用ELISA Microplate Reader(Bio-Rad，Model 550)读取各孔在波长405nm下的吸光值(OD₄₀₅)。将各组实验重复两次。

IFN-γ的浓度是借由将ELI SA试验所测得的OD₄₀₅数值代入下列公式进行计算，并以ELISA单位(％)来表示：

ELISA单位(％)＝[(A-C)/(B-C)]×100

其中：A＝乳杆菌分离株的OD₄₀₅数值

B＝内阳性对照组的OD₄₀₅数值

C＝正常对照组的OD₄₀₅数值

结果：

乳杆菌分离株GMNL-19、GMNL-76、GMNL-78、GMNL-89、GMNL-94、GMNL-101以及GMNL-161刺激人外周血单个核细胞分泌IL-10与IFN-γ的结果被分别示于表2与表3中。

表2.乳杆菌分离株刺激人外周血单个核细胞分泌IL-10的功效评估

表3.乳杆菌分离株刺激人外周血单个核细胞分泌IFN-γ的功效评估

从表2可见，在所有的乳杆菌分离株中，乳杆菌分离株GMNL-76与GMNL-89刺激人外周血单个核细胞分泌IL-10的数量最高，这显示这两个分离株对于刺激人外周血单个核细胞分泌IL-10的能力是最佳的。

另从表3可见，在所有的乳杆菌分离株中，乳杆菌分离株GMNL-78刺激人外周血单个核细胞分泌IFN-γ的数量最低，而GMNL-89以及GMNL-76次之，这显示乳杆菌分离株GMNL-78对于刺激人外周血单个核细胞分泌IFN-γ的能力是最差的，而乳杆菌分离株GMNL-89以及GMNL-76对于刺激人外周血单个核细胞分泌IFN-γ的能力也是较差的。

已知促炎细胞因子(诸如IFN-γ与TNF-α)会促进炎症而使得类风湿性关节炎的病况更为恶化，而免疫调节性细胞因子(诸如IL-10)可以抑制促炎细胞因子的生成。申请人据此而推论：若能够刺激人类或动物的单核细胞分泌较多的免疫调节性细胞因子以及较少的促炎细胞因子，应会有利于改善患有RA的人类或动物的病况。而根据表2与表3所示的结果，申请人认为乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89是最具开发潜力的菌株，并以之来进行下面的动物试验。

实施例3.乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89对于带有胶原诱发性关节炎的大鼠的治疗效用评估

实验材料与方法：

A.实验动物：

将得自国家实验研究院实验动物中心(National AppliedResearch Laboratories National Laboratory Animal Center)的雄性LEW/SsNNarl大鼠(6周龄，体重为大约200至250g)用于下面的实验中。所有的实验动物被饲养于一个光照与黑暗各为12小时、室温维持在25±1℃以及湿度维持在60±5％的独立空调的动物房内，而且水分与饲料被充分地供给。给予动物一周时间适应环境，待动物稳定之后才开始进行试验。有关实验动物的处理以及一切实验程序均依据实验动物委员会的标准章程规范来进行。

B.试验菌株的制备：

将乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89分别接种于Bacto乳杆菌MRS肉汤培养基(DIFCO，Cat.No.0881)中，于37℃下厌氧培养至饱和生长状态。以3,000g离心15分钟之后，将沉淀物分别用2mL与1mL的1X PBS(pH7.2)洗涤2次，然后加入1mL的PBS，并于OD₆₀₀测量菌液浓度，结果均达1.0×10¹⁰细胞/mL左右。将菌液(1X PBS)冷冻保存于-80℃下备用。

C.关节炎的诱发：

有关关节炎的诱发是参考Y.Kameyama et al.(2004)，Bone，35：948-956当中所述的方法来进行，并略作修改。将牛II型胶原(简称CII)(Sigma-Aldrich，Cat.No.C1188)溶于0.05M醋酸溶液中以配制具有浓度为2mg/mL的CII溶液。以100μL的CII溶液添加100μL的完全弗氏佐剂(CFA)的方式配制CII乳化液。之后，将200μL的CII乳化液皮下注射至大鼠尾巴内进行初始免疫，并于免疫21天后再加强免疫一次。

D.乳杆菌分离株的喂食：

将大鼠随机地分成4组(每组n＝6)，其中包括3个实验组(GMNL-76组、GMNL-89组与安慰剂组)以及一个对照组。除了对照组之外，其它各组的大鼠均依照上述C“关节炎的诱发”当中所述的方法诱发关节炎的发生。

对于GMNL-76组以及GMNL-89组，从加强免疫后的第7天起，给大鼠喂食上述B“试验菌株的制备”当中所制备的菌液(1.0×10¹⁰细胞/mL/天)。至于安慰剂组以及对照组的大鼠，喂食逆渗透水。

在连续喂食8周之后，通过眼采血收集大鼠的血液并进行离心，将由此得到的血清用于测定IL-10、IFN-γ以及TNF-α的浓度。另外，将经眼采血的各组大鼠进一步用于进行下面的关节炎评估。

E.IL-10、IFN-γ以及TNF-α的浓度测定：

IL-10的浓度测定大体上是参照实施例1的“实验材料与方法”的C“乳杆菌分离株刺激小鼠脾脏单核细胞分泌IL-10的评估”当中所述的操作程序来作评估，但是使用上面D中所得到的大鼠血清以及Rat IL-10 OptEIA^TM Set(BD Bioscience PharMingen，San Diego，CA，Cat.No.2611KI)。

IFN-γ的浓度测定大体上是参照实施例2的“实验材料与方法”的C“乳杆菌分离株刺激人类PBMCs分泌IFN-γ的评估”当中所述的操作程序来作评估，但是使用上面D中所得到的大鼠血清以及Rat IFN-γOptEIA^TM Set(BD Bioscience PharMingen，SanDiego，CA)。

TNF-α的浓度测定大体上是参照实施例1的“实验材料与方法”的C“乳杆菌分离株刺激小鼠脾脏单核细胞分泌IL-10的评估”当中所述的操作程序来作评估，但是使用上面D中所得到的大鼠血清以及BD OptEIA Rat TNF-αELISA Kit(BD BiosciencePharMingen，San Diego，CA)。

由此所测得的OD₄₀₅数值进而分别根据预先以具有不同已知浓度的IL-10、IFN-γ或TNF-α标准品相对于它们自身的OD₄₀₅数值所作出的相关曲线(correlation curve)而换算成浓度(pg/mL)来表示。

F.关节炎的评估：

将经眼采血的各组大鼠用于进行下面的关节炎评估，而有关大鼠的关节炎评估是参照Y.Kameyama et al.(2004)，Bone，35：948-956当中所述的方法来进行。简略地来说，记录大鼠的四只脚掌关节的红肿、胀大等变化情形，并以下列5种计分作为区别的依据：计分0，未表现任何关节炎症状；计分1，有1个脚趾肿胀；计分2，有3个以上的脚趾肿胀；计分3，整个脚掌肿胀；以及计分4，所有的关节均严重肿胀，无法正常行走而呈蜷缩状。

G.统计分析方法：

本实施例采用SPSS统计软件(10.0版)进行统计分析。由于实验动物的总样本数少于30，所得到的实验数据是以无母数统计方法(nonparametric statistical methods)(也称为曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test))进行分析，以评估对照组、GMNL-76组以及GMNL-89组分别与安慰剂组之间在样本分布上的差异。实验数据是以平均值±偏差值来表示(统计显著性，P＜0.05)。

结果：

各组大鼠在历经连续8周的喂食后，血清中的IL-10、IFN-γ以及TNF-α的浓度被分别显示于表4以及图1至图3中。另外，关节炎评估的计分结果也被归纳于表4中。

表4.历经连续8周的喂食后，各组大鼠血清中的IL-10、IFN-γ与TNF-α的浓度以及关节炎评估的计分结果

分析项目	对照组	安慰剂组	GMNL-76	GMNL-89
					IL-10(pg/mL)	4.56±5.50	6.22±4.811	11.78±3.747	12.44±5.232
IFN-γ(pg/mL)	40.60±4.243	46.78±52.64	12.20±10.923	25.00±26.482
					TNF-α(pg/mL)	3.32±1.757*	39.80±1.998	9.44±3.988*	12.20±6.643*
关节炎程度的计分	0*	12.333±1.155	11.67±2.563	13.42±2.155

1：所有的数据是以曼-惠特尼U检验进行分析。

2：关节炎程度的计分是以大鼠四只脚掌关节的计分总和来表示。

3：^*表示p＜0.05，与安慰剂组相比较。

从表4以及图1至图3可见，GMNL-76组与GMNL-89组的大鼠在分别喂食乳杆菌分离株GMNL-76与GMNL-89后，牠们血清中的IFN-γ以及TNF-α浓度相较于安慰剂组有显著的降低，而IL-10浓度则有显著的增加。

因此，申请人推论：乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89除了能够降低Th 1细胞所分泌的IFN-γ以减轻炎症现象外，也可以降低TNF-α的分泌量，进而减少基质金属蛋白酶的分泌量，使得关节组织中的软骨不会再继续受到破坏。另外，乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89也能提高免疫调节性细胞因子IL-10的分泌量，而让炎症的情况受到控制。因此，虽然关节炎所造成的关节损害已无法逆转，但是通过喂食本发明的乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89，在大鼠的血清中，与炎症相关联的IFN-γ以及TNF-α已有降低的情形，而与抗炎相关联的IL-10则有上升的情形，这表示大鼠的关节炎病况能够获得减轻并且不再继续恶化。

实施例4.乳杆菌分离株GMNL-76与GMNL-89的特征鉴定

为了确认在上面实施例中所筛选出的乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89所属菌种，进行下面的初步试验、16SrDNA序列分析以及随机扩增的多态性DNA分析。

实验材料与方法：

A.初步试验：

对乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89进行初步试验，试验项目包括：革兰氏染色、形态学观察、过氧化氢酶反应、运动性(mobility)、在好氧与厌氧条件下的生长情况等试验。

B.16S rDNA序列分析：

于无菌条件下，将乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89分别接种于1mL的Bacto乳杆菌MRS肉汤培养基(DIFCO，Cat.No.0881)中，并于37℃下培养过夜。之后，将菌液以13,000rpm进行离心历时1分钟，继而移除上清液。向留下的沉淀物加入200μL的ddH₂O以充分悬浮菌体，以13,000rpm进行离心历时1分钟之后移除上清液，并重复此步骤1次。最后，以200μL ddH₂O悬浮经离心而得到的沉淀物，其中含有所述乳杆菌分离株的基因组DNA。

以所得到的基因组DNA作为模版并使用一组被发表于P.S.M.Yeung et al.(2002)，J.Dairy Sci.，85：1039-1051中的针对乳杆菌的16S rDNA而设计的具有下面所示核苷酸序列的引物对PAF引物与536R引物，使用下面表5中所示的反应条件进行聚合酶链反应。

PAF引物：5’-agagtttgatcctggctcag-3’(SEQ ID NO：1)

536R引物：5’-gtattaccgcggctgctg-3’(SEQ ID NO：2)

表5.PCR的反应条件

完成PCR之后，通过1.8％琼脂糖凝胶电泳确认是否得到一大小约为500bp的PCR扩增产物，并从凝胶回收纯化该经确认的PCR产物。该经纯化的PCR产物是委托基龙米克斯生物科技股份有限公司(台湾)进行测序，所得到的测序结果利用NCBI网站中的核苷酸-核苷酸BLAST软件进行比对分析。

C.随机扩增的多态性DNA分析：

在以16S rDNA序列分析确认乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89所属菌种之后，以上述B中所得到的乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89的基因组DNA作为模版，并选用一个发表于M.DE ANGELIS et al.(2001)，Applied and EnvironmentalMicrobiology，67：2011-2020中的具有下面所示核苷酸序列的10-mer引物Lac P2，使用下面表6中所示的反应条件进行PCR反应。

Lac P2引物：5’-atgtaacgcc-3’(SEQ ID NO：3)

表6.P CR的反应条件

完成PCR之后，扩增产物以1.8％琼脂糖凝胶进行电泳，继而染色，然后于紫外光下进行观察并照相。

在这个实验中，同时使用购自于食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)的7株乳杆菌菌株作为比较菌株来进行比对分析，它们分别为：

1.沙克乳杆菌沙克亚种(Lactobacillus sakei subsp.sakei)BCRC 12933(对应于ATCC 31063，分离来源为酸菜)；

2.沙克乳杆菌肉质亚种(Lactobacillus sakei subsp.carnosus)BCRC 17500(对应于LMG 17302，分离来源为生香肠)；

3.罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)BCRC 14625(对应于ATCC 23272与DSM 20016，分离来源为人类粪便)；

4.罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)BCRC 16090(对应于DSM 20015，分离来源为粪肥(manure)；

5.罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)BCRC 16091(对应于DSM 20053，分离来源为人类粪便)；

6.罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)BCRC 17476(对应于JCM 1081，分离来源为鸡肠)；以及

7.罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)BCRC 17478(对应于JCM 2762，分离来源为发酵的糖蜜fermented molasses)。

结果：

1.乳杆菌分离株GMNL-76的特征鉴定：

(i)依据初步试验结果，此分离株为革兰氏阳性杆菌，不具运动性，不具过氧化氢酶，不具氧化酶，于好氧及厌氧环境下均可生长；

(ii)此分离株的16S rDNA序列分析结果示于图4中，而经与NCBI网站中的基因数据库比对后，发现此分离株的16S rDNA序列(SEQ ID NO：4)与沙克乳杆菌的16S rDNA的序列相似度最高；以及

(iii)此分离株的RAPD分析结果示于图5中。从图5可见，此分离株的PCR产物的基因指纹图谱与另外2株以往的沙克乳杆菌菌株所具有的基因指纹图谱不相同。

综合以上鉴定结果，本发明的乳杆菌分离株GMNL-76被认为是一株新的沙克乳杆菌分离株。

2.乳杆菌分离株GMNL-89的特征鉴定：

(i)依据初步试验结果，此分离株为革兰氏阳性杆菌，不具运动性，不具过氧化氢酶，不具氧化酶，于好氧及厌氧环境下均可生长；

(ii)此分离株的16S rDNA序列分析结果示于图6中，而经与NCBI网站中的基因数据库比对后，发现此分离株的16S rDNA序列(SEQ ID NO：5)与罗伊氏乳杆菌的16S rDNA序列相似度最高；以及

(iii)此分离株的RAPD分析结果示于图7中。从图7可见，此分离株的PCR产物的基因指纹图谱与另外5株以往的罗伊氏乳杆菌菌株所具有的基因指纹图谱不相同。

综合以上鉴定结果，本发明的乳杆菌分离株GMNL-89被认为是一株新的罗伊氏乳杆菌分离株。

本发明的沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)GMNL-76与罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89已分别于公元2007年6月14日以及2006年11月14日以保藏编号BCRC 910355以及BCRC910340被保藏于食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)(300新竹市食品路331号)。这两个分离株也依据布达佩斯条约的规定，于2007年11月19日分别以保藏编号CCTCC M 207153与CCTCC M 207154被保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉，武汉大学，430072，中华人民共和国)。

实施例5.乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89与以往菌株在刺激小鼠脾脏单核细胞分泌IL-10能力的评估

为了证明能够刺激单核细胞分泌较多的IL-10是乳杆菌分离株GMNL-76以及GMNL-89所特有的生物活性，在下面的实施例中，将它们用于与7株以往菌株(也就是购自于食品工业发展研究所的沙克乳杆菌BCRC 12933与BCRC 17500以及罗伊氏乳杆菌BCRC 14625、BCRC 16090、BCRC 16091、BCRC 17476与BCRC17478)进行比较。

实验材料与方法：

IL-10的浓度测定大体上是参照实施例1的“实验材料与方法”的C“乳杆菌分离株刺激小鼠脾脏单核细胞分泌IL-10的评估”当中所述的操作程序来作评估，并使用本发明的乳杆菌分离株GMNL-76与GMNL-89以及上述的7株以往菌株来进行实验。由此所测得的OD₄₀₅数值进而分别根据预先以具有不同已知浓度的IL-10标准品相对于它们自身的OD₄₀₅数值所作出的相关曲线而换算成浓度(pg/mL)来表示。将各菌株的实验重复2次，实验数据以平均值±偏差值表示。

结果：

下面的表7显示GMNL-76、GMNL-89以及各比较菌株刺激小鼠脾脏单核细胞分泌IL-10的结果。

表7.乳杆菌分离株GMNL-76与GMNL-89以及比较菌株刺激小鼠脾脏单核细胞分泌IL-10的功效评估

菌株编号	IL-10(pg/mL)
		GMNL-76	274.164±9.173
GMNL-89	311.07±11.79
		BCRC 14625	231.52±11.78
BCRC 16090	155.35±12.81
		BCRC 16091	160.874±6.13
BCRC 17476	292.86±24.97
		BCRC 17478	232.269±16.385
BCRC 12933	250.996±3.672
		BCRC 17500	266.958±12.759

从表7可见，在所有的试验菌株当中，以本发明的乳杆菌分离株GMNL-89与以往菌株BCRC 17476对于刺激小鼠脾脏单核细胞分泌IL-10的能力最佳，而GMNL-76次之。表7所示的实验结果再次地证明本发明的乳杆菌分离株GMNL-89以及GMNL-76与它们各自所属菌种的以往菌株是不相同的。

实施例6.沙克乳杆菌GMNL-76与罗伊氏乳杆菌GMNL-89的耐酸性以及胆汁酸盐耐量试验

为确认本发明的沙克乳杆菌GMNL-76以及罗伊氏乳杆菌GMNL-89在摄食之后是否能够通过消化道的严苛条件而存活下来，进行一个模拟人类消化道的连续消化处理的实验。

实验材料：

1.MRS肉汤培养基(pH＝3)：

将55g的MRS粉末(BD，Cat.No.288130)溶于1L的逆渗透水中并予以充分混合，接着用1M HCl将pH值调整至3，继而于121℃下进行灭菌历时15分钟，待冷却之后备用。

2.含有0.2％(w/v)牛胆汁的MRS肉汤培养基：

将55g的MRS粉末溶于1L的逆渗透水中并予以充分混合，继而于121℃下进行灭菌历时15分钟。之后，待温度降至大约45℃，加入2g的牛胆汁粉末(ox gall powder，Sigma)并予以充分混合以得到一含有0.2％(w/v)牛胆汁的MRS肉汤培养基，继而以一孔径为0.45μm的过滤膜予以过滤后备用。

3.MRS琼脂培养盘：

将55g的MRS粉末溶于1L的逆渗透水中，待完全溶解之后加入15g的琼脂糖粉末，然后将所形成的混合物倒入至1L的血清瓶中并于121℃下进行灭菌历时15分钟。之后，待温度降至45℃，在无菌操作条件下，将大约15至20mL的MRS琼脂溶液加入至各个无菌培养皿中，待冷却凝固之后备用。

实验方法：

A.耐酸性试验：

将3mL的于实施例1的“实验材料与方法”的A“试验菌株的来源与制备”当中所得到的试验菌液接种至27mL的MRS肉汤培养基(pH＝3)中并充分混合，接而将所形成的培养物置于37℃下培养历时3小时。之后，取出1mL的培养物并以灭菌水进行系列稀释涂盘(10^-9～10^-1)以检测存活的菌数。

B.胆汁酸盐耐量试验：

于上述A项的耐酸性试验结束后，将剩余的29mL培养物以4,000rpm离心历时15分钟，移除上清液并加入30mL无菌水悬浮菌体。之后，以4,000rpm离心历时15分钟并移除上清液，借此洗除酸性的MRS肉汤培养基。之后，加入30mL的含有0.2％(w/v)牛胆汁的MRS肉汤培养基以悬浮菌体，继而将所形成的培养物置于37℃下培养历时3小时。之后，取出1mL的培养物并以灭菌水进行系列稀释涂盘(10^-9～10^-1)以检测存活的菌数。结果：

沙克乳杆菌GMNL-76与罗伊氏乳杆菌GMNL-89在经过模拟人类消化道的连续消化处理后的生长情况被显示于下面的表8中。

表8.沙克乳杆菌GMNL-76与罗伊氏乳杆菌GMNL-89在经过

模拟人类消化道的连续消化处理后的生长情况

^*：分离株已预先以MRS肉汤培养基(pH＝3)培养历时3小时。

从表8可见，当以pH＝3的MRS肉汤培养基培养本发明的两株乳杆菌分离株历时3小时之后，沙克乳杆菌GMNL-76的活菌数相较于处理前下降达大约99.95％，而罗伊氏乳杆菌GMNL-89的活菌数下降达大约64％。接着，这两个乳杆菌分离株在含有0.2％牛胆汁的MRS肉汤培养基中被培养历时另外3小时之后，活菌数并没有下降的现象，两者的存活率均极为优越。这个结果显示：沙克乳杆菌GMNL-76与罗伊氏乳杆菌GMNL-89能够克服人类消化道的环境压力，在摄食后能有效到达肠内并定殖于肠内。

本案说明书中引述的所有文献数据以及专利文献以它们的整体被并入本案作为参考数据。若有所冲突时，本案的详细说明(包含界定在内)将占上风。

虽然本发明已参考上述特定的实施例进行描述，显然在不背离本发明的范围和精神之下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如权利要求书所示范围的限制。

序列表

<110>景岳生物科技股份有限公司

<120>具有抗炎活性的乳杆菌分离株及其用途

<130>GMNL-76 AND GMNL-89

<160>5

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>PAF primer for PCR amplification of 16S rDNA of Lactobacillus

<400>1

agagtttgat cctggctcag                                               20

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>536R primer for PCR amplification of 16S rDNA of Lactobacillus

<400>2

gtattaccgc ggctgctg                                                 18

<210>3

<211>10

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>10-mer primer for PCR amplification of gene of Lactobacillus

<400>3

atgtaacgcc                                                          10

<210>4

<211>535

<212>DNA

<213>Lactobacillus sakei GMNL-76

<400>4

gggggggggt gctatacatg caagtcgaac gcactctcgt ttagattgaa ggagcttgct     60

cctgattgat aaacatttga gtgagtggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc    120

ctaaagtggg ggataacatt tggaaacaga tgctaatacc gcataaaacc taacaccgca    180

tggtgtaggg ttgaaagatg gtttcggcta tcactttagg atggacccgc ggtgcattag    240

ttagttggtg aggtaaaggc tcaccaagac cgtgatgcat agccgacctg agagggtaat    300

cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct    360

tccacaatgg acgaaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc    420

gtaaaactct gttgttggag aagaatgtat ctgatagtaa ctgatcaggt agtgacggta    480

tccaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg ggggtaatac taaaa         535

<210>5

<211>522

<212>DNA

<213>Lactobacillus reuteri GMNL-89

<400>5

ggcttgggat accgtcactg cgtgaacagt tactctcacg cacgttcttc tccaacaaca     60

gagctttacg agccgaaacc cttcttcact cacgcggtgt tgctccatca ggcttgcgcc    120

cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagta tggaccgtgt ctcagttcca    180

ttgtggccga tcagtctctc aactcggcta tgcatcatcg ccttggtaag ccgttacctt    240

accaactagc taatgcaccg caggtccatc ccagagtgat agccaaagcc atctttcaaa    300

caaaagccat gtggcttttg ttgttatgcg gtattagcat ctgtttccaa atgttatccc    360

ccgctccggg gcaggttacc tacgtgttac tcacccgtcc gccactcact ggtgatccat    420

cgtcaatcag gtgcaagcac catcaatcag ttgggccagt gcgtacgact tgcatgtatt    480

aggcacaccg ccggcgttca tcctgagcca gaacgaactc tc                       522

Claims (17)

1.一种具有抗炎活性的乳杆菌属菌种(Lactobacillus sp.)的分离株，其特征在于：

该乳杆菌属菌种的分离株是：

(i)一种选自于下列的保藏菌株：

(a)沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)GMNL-76，其以保藏编号BCRC 910355被保藏于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心，以及以保藏编号CCTCC M 207153被保藏于中国典型培养物保藏中心；以及

(b)罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89，其以保藏编号BCRC 910340被保藏于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心，以及以保藏编号CCTCC M 207154被保藏于中国典型培养物保藏中心；或

(ii)在(i)项中的所述保藏菌株的继代培养后代。

2.一种可用于治疗和/或缓解与炎症有关联的疾病的药物组合物，其特征在于：

该药物组合物包含有：

(i)至少一种选自于下列的保藏菌株：

(a)沙克乳杆菌GMNL-76，其以保藏编号BCRC 910355被保藏于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心，以及以保藏编号CCTCC M 207153被保藏于中国典型培养物保藏中心；以及

(b)罗伊氏乳杆菌GMNL-89，其以保藏编号BCRC 910340被保藏于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心，以及以保藏编号CCTCC M 207154被保藏于中国典型培养物保藏中心；或

(ii)在(i)项中的所述保藏菌株的继代培养后代。

3.如权利要求2的药物组合物，其特征在于：所述疾病是类风湿性关节炎。

4.如权利要求2的药物组合物，其特征在于：该药物组合物呈可供口服施用的剂型。

5.如权利要求4的药物组合物，其特征在于：所述剂型选自下列所构成的组：溶液、悬浮液、乳剂、粉末、片剂、丸剂、糖浆、锭剂、含锭、咀嚼胶、膏剂以及胶囊。

6.根据权利要求1的乳杆菌属菌种的分离株，在制备用于治疗和/或缓解与炎症有关联的疾病的药物组合物中的用途。

7.如权利要求6的用途，其特征在于：所述疾病是类风湿性关节炎。

8.如权利要求6的用途，其特征在于：所述药物组合物呈可供口服施用的剂型。

9.如权利要求8的用途，其特征在于：

该剂型选自于下列所构成的组：溶液、悬浮液、乳剂、粉末、片剂、丸剂、糖浆、锭剂、含锭、咀嚼胶、膏剂以及胶囊。

10.一种食品产品，其特征在于该食品产品包含有一如权利要求1的乳杆菌属菌种的分离株以及一种可食性材料。

11.如权利要求10的食品产品，其特征在于：

该食品产品进一步包含有至少一种选自于下列一组中的益生性微生物：乳杆菌属菌种(Lactobacillus sp.)、双歧杆菌属菌种(Bifidobacterium sp.)、链球菌属菌种(Streptococcus sp.)、酵母，以及它们的组合。

12.如权利要求11的食品产品，其特征在于：

该乳杆菌属菌种选自于下列所构成的组：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、双歧乳杆菌(Lactobacillus  bifidus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、高加索乳杆菌(Lactobacilluscaucasicus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，以及它们的组合。

13.如权利要求11的食品产品，其特征在于：

所述双歧杆菌属菌种选自下列所构成的组：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，以及它们的组合。

14.如权利要求11的食品产品，其特征在于：

所述链球菌属菌种选自下列所构成的组：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、双乙酰链球菌(Streptococcus diacetylcatis)，以及它们的组合。

15.如权利要求11的食品产品，其特征在于：

所述酵母是选自于下列所构成的群组：乳酒假丝酵母(Candida Kefyr)、弗罗棱糖酵母(Saccharomyces florentinus)、酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae)，以及它们的组合。

16.如权利要求10的食品产品，其特征在于：

所述可食性材料选自下列所构成的组：液体乳制品、发酵乳、奶粉、冰淇淋、奶酪、干酪、豆浆、发酵豆浆、蔬果汁、果汁、运动饮料、甜点、果冻、糖果、婴儿配方奶粉、保健食品、动物饲料以及膳食补充剂。

17.如权利要求10的食品产品，其特征在于：该食品产品被制成速溶冲泡食品的形式。

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