CN102399718A - 副干酪乳酸杆菌株gmnl-133、用于改善异位性皮肤炎或其它过敏疾病的组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种经分离的副干酪乳酸杆菌株GMNL-133，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2011331。所述副干酪乳酸杆菌株GMNL-133可用于制造治疗异位性皮肤炎或其它过敏疾病的组合物。此外，本发明涉及一种包括所述副干酪乳酸杆菌株GMNL-133的组合物，且副干酪乳酸杆菌株GMNL-133的含量可有效治疗异位性皮肤炎或其它过敏疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳酸杆菌株及其用途，特别是涉及一种副干酪乳酸杆菌株及包括它的用于改善过敏疾病的组合物及用途。
背景技术
过敏是一种后天获得的对正常无害物质产生免疫上的不良反应。过敏反应引起的症状有瘙痒、咳嗽、气喘、喷嚏、泪眼、发炎及疲乏等。人们认为过敏反应包括早期专一性免疫反应及晚期炎症反应。据报导，过敏原(如花粉及尘螨)通过刺激高亲和力免疫球蛋白E(IgE)中介早期的过敏反应。具体而言，当肥大细胞及嗜碱性粒细胞受到过敏原刺激时，会释放组织胺及细胞激素。细胞激素随后通过聚集发炎细胞中介晚期的过敏反应。亦有报导指出嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞和血小板的汇集开启晚期恶性的炎症反应循环。晚期的过敏反应增强最初的免疫反应，转而促使释放更多的发炎细胞。
现已有多种疗法用于治疗过敏症状，包含使用抗过敏剂及组织胺H-受体拮抗剂(抗组织胺)。抗组织胺可减轻由组织胺作用于目标组织引起的充血、瘙痒及肿胀等症状，并且可预防或缓和诸多由肥大细胞去颗粒引起的症状。但是，同时亦有报导，指出抗组织胺会产生一些副作用，例如警觉性降低、反应迟钝及嗜睡。
异位性皮肤炎是儿童最常见的一种过敏症。治疗异位性皮肤炎的传统方法为局部类固醇疗法，但其实异位性皮肤炎症状很难根除，且停药后经常复发。再者，长期使用类固醇疗法容易产生副作用，例如皮肤萎缩变薄、皮肤色素改变、长毛、长痘等。因此，副作用少且安全性高，可以放心使用的药剂成为病人和临床上所期望。
益生菌近年来被医学界和科学界认定有助人体健康，且无副作用。***粮食农业组织(FAO)以及世界卫生组织(WHO)将益生菌(probiotics)定义为：活的微生物，当它呈适当数量给药时，可赋予宿主一健康益处(health benefit)。目前可作为益生菌使用的微生物有许多种类，例如乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双叉杆菌属 (Bifidobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、酵母菌属(yeasts)、链球菌属(Streptococcus)等等。
乳酸杆菌属是一群革兰氏阳性的兼性厌氧菌，普遍存在于人类的胃肠道与***内，能够发酵糖类并以乳酸为主要代谢产物。有许多的研究以及临床试验皆陆续证实乳酸杆菌与健康之间存在有重要的相关性。目前，乳酸杆菌已被发现的功效包括：(1)增进肠道微生物群的菌相平衡；(2)预防腹泻；(3)降低结肠癌的危险性；(4)刺激胃肠上皮黏膜***的正常发展与功能；(5)产生各种维生素与营养素；以及(6)预防与治疗***炎。
发明内容
本发明的一方面在于提供一种经分离的副干酪乳酸杆菌株GMNL-133，其保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2011331。
本发明的另一方面在于提供一种副干酪乳酸杆菌株GMNL-133的用途，其用于制造治疗异位性皮肤炎的组合物。
根据本发明的上述方面，提出一种用于治疗异位性皮肤炎的组合物，包括副干酪乳酸杆菌株GMNL-133，且该副干酪乳酸杆菌株GMNL-133的含量可有效改善异位性皮肤炎。
本发明的又一方面在于提供一种副干酪乳酸杆菌株GMNL-133的用途，其用于制造治疗过敏疾病的组合物。
根据本发明的上述方面，提出一种用于治疗过敏疾病的组合物，包括副干酪乳酸杆菌株GMNL-133，且副干酪乳酸杆菌株GMNL-133的含量可有效改善过敏疾病。
根据本发明一实施例，副干酪乳酸杆菌株GMNL-133可为活菌或是经过热处理的死菌。而治疗异位性皮肤炎或过敏疾病的组合物可为医药组合物或食品组合物。
根据本发明另一实施例，治疗异位性皮肤炎或过敏疾病的组合物可进一步包含至少一种其它菌株，该其它菌株选自于由嗜酸性乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、奶酪乳酸杆菌(Lactobacillus cremors)、鼠李糖 乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)及上述菌的任意组合所组成的族群。
附图简要说明
图1为分离株GMNL-133于显微镜下的形态图。
图2为副干酪乳酸杆菌株GMNL-133与其它市售产品中副干酪乳酸杆菌株的RAPD电泳图。
图3为副干酪乳酸杆菌株GMNL-133与其它市售产品中副干酪乳酸杆菌株分别刺激小鼠脾脏细胞产生的IFN-γ表达量的柱形图。
图4A至4B分别为致敏小鼠模式实验中，各组的血清中IgE与IgG2a表达量以安慰剂组的表达量标准化的柱形图，*标记表示与安慰剂组相比具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。
图5A至5D分别为致敏小鼠模式实验中，各组的脾脏细胞培养液中的TGF-β、IFN-γ、IL-10以及IL-17表达量以安慰剂组的表达量标准化的柱形图，*标记表示与安慰剂组相比具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。
图6A为异位性皮肤炎小鼠模式实验中，各组小鼠右耳厚度结果的柱形图，*标记表示与安慰剂组相比具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。
图6B至6C分别为异位性皮肤炎小鼠模式实验中，各组小鼠血清中的IgE以及IgG1表达量以安慰剂组的表达量标准化的柱形图，*标记表示与安慰剂组相比具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。
图6D为异位性皮肤炎小鼠模式实验中，各组小鼠耳部组织中的TNF-α的表达量以安慰剂组的表达量标准化的柱形图，*标记表示与安慰剂组相比具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。
具体实施方式
目前有报导指出通过调节细胞激素可治疗过敏。其中，γ-干扰素(IFN-γ)可抑制II型辅助T细胞(Th2)的细胞激素的过度表达，特别是抑制介白素-4(IL-4)的分泌，进而降低B淋巴细胞的增殖。此外，IFN-γ还可刺激I型辅助T细胞(Th1)的免疫反应，抑制IgE的合成。因此，相信IFN-γ对于治疗过敏有效。
因此，本发明提供一新颖的副干酪乳杆菌株GMNL-133，所述菌株GMNL-133 具刺激小鼠的脾脏细胞分泌IFN-γ的能力，可用于制造治疗过敏疾病的组合物。副干酪乳杆菌株GMNL-133依据布达佩斯条约的规定，于2011年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(中国，武汉，武汉大学，430072)，保藏号为CCTCCM2011331。此副干酪乳杆菌株GMNL-133(CCTCC M 2011331)可包含至少一种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂等其它成分，例如葡萄糖、麦芽糊精、婴儿奶粉、果寡糖、硬脂酸镁、优格香料、其它难以分离的成分、或上述的任意组合，且此其它成分以及配制方法为本发明技术领域所属技术人员所熟知。另外，副干酪乳杆菌株GMNL-133(CCTCC M 2011331)的用量可为每千克约1×106至约1×1011个菌落形成单位(CFU/g)。
所谓“过敏疾病”是指异位性皮肤炎、过敏性鼻炎与气喘、以及一些特定的食物与昆虫叮咬引起的过敏。这些疾病会导致相当程度的发炎反应，造成皮肤、黏膜组织或是血管的慢性发炎。
根据本发明一实施例，治疗过敏疾病的组合物包含副干酪乳杆菌株GMNL-133，且副干酪乳酸杆菌株GMNL-133的含量可有效改善过敏疾病。
上述副干酪乳酸杆菌株GMNL-133可为活菌或是经过热处理的死菌。治疗过敏疾病之组合物可为口服组合物，例如医药组合物或食品组合物。
根据本发明另一实施例，治疗过敏疾病的组合物可进一步包含至少一种其它菌株。其它菌株选自于由嗜酸性乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、奶酪乳酸杆菌(Lactobacillus cremors)、鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)及上述的任意组合所组成的族群。一般而言，其它菌株的菌量可为约1×107CFU/g或以上。
实施例1、菌株的分离、筛选及鉴定
本发明人自健康人体胃肠道检体分离百余株乳酸杆菌，并建立一分离株菌种库。为寻找具有减缓治疗过敏相关疾病潜力的乳酸杆菌，分别将菌种库中的各乳酸杆菌与小鼠脾脏细胞共培养，进行小鼠脾脏细胞IFN-γ分泌量的分析，进而从中筛选出分离株GMNL-133为一可刺激小鼠脾脏细胞分泌大量IFN-γ的乳酸杆菌。
将此分离株GMNL-133进行各项菌种鉴定分析。图1为分离株GMNL-133于 显微镜下的形态图。分离株GMNL-133初步试验结果显示为革兰氏阳性杆菌，不具触酶、氧化酶及运动性，在好氧及厌氧环境下皆会生长。
再进一步以16S rDNA序列及API 50 CHL鉴定***分析。分离株GMNL-133的16S rDNA部分序列如SEQ ID No：1所示。表一为分离株GMNL-133以API50CHL鉴定***分析的结果。
表一分离株GMNL-133的API 50CHL鉴定***的分析结果
-：负反应；+：正反应；W：微弱正反应
综合上述鉴定结果显示，分离株GMNL-133为副干酪乳酸杆菌。
实施例2、副干酪乳酸杆菌株GMNL-133与其它市售产品的副干酪乳酸杆菌的差异分析
将副干酪乳酸杆菌株GMNL-133与市售酸奶(例如统一LP33酸奶，内含副干酪乳酸杆菌株LP33)、优格(例如日本麒麟公司大人之元气优格，内含副干酪乳酸杆菌株KW3110)、益生菌保健食品(例如百晟生技威敏益生菌，内含副干酪乳酸杆菌株BRAP-01)等含有副干酪乳酸杆菌的产品中的菌株进行差异分析，包含随机扩增多态性DNA(RAPD)电泳分析与API 50CHL鉴定***分析。
RAPD电泳分析利用序列为5’-CCGCGACGTT-3’(SEQ ID No：2)的引物进行聚合酶链式反应，以分析副干酪乳酸杆菌株GMNL-133与市售产品中的副干酪乳酸杆菌株随机扩增多态性DNA间的差异。聚合酶链式反应条件为93℃，10分钟，将双链DNA变性分离为单链。接着进行以下循环35次：93℃，1分钟；36℃，1分钟；74℃，1分钟。最后以74℃进行5分钟来扩增DNA片段。反应完成后以1.5％琼脂糖进行DNA电泳分析。
图2为副干酪乳酸杆菌株GMNL-133与其它市售产品中副干酪乳酸杆菌株的RAPD电泳图。其中泳道M为分子量标志，泳道1至4分别为LP33、KW3110、GMNL-133与BRAP-01的RAPD图谱。由图2结果可知，GMNL-133与KW3110、LP33、BRAP-01的RAPD图谱皆不同。
副杆酪乳酸杆菌株GMNL-133与其它市售产品的副干酪乳酸杆菌株的API 50CHL鉴定***分析的结果如表二所示。
表二副杆酪乳酸杆菌株GMNL-133与其它市售产品的副干酪乳酸杆菌株的API鉴定***分析的结果
-：负反应；+：正反应；W：微弱正反应
由表二可知副干酪乳酸杆菌株GMNL-133、LP33与BRAP-01的生化反应皆不相同。其中，副干酪乳酸杆菌株GMNL-133与LP33对L-山梨糖、甲基-αD-葡萄糖苷、苦杏仁苷与D-含松三糖的生化反应完全不同。而副干酪乳酸杆菌株GMNL-133与BRAP-01则对于L-***糖、D-核糖、甲基-D-木糖苷、L-鼠李糖、肌醇、D-山梨糖醇、D-乳糖、D-蜜二糖、菊糖、D-含松三糖、D-松二糖、D-来苏糖、D-塔格糖与葡萄糖酸的生化反应完全不同。
综上所述可知副干酪乳酸杆菌株GMNL-133、KW3110、LP33与BRAP-01在基因序列以及生化反应皆不相同，四株副干酪乳酸杆菌株确实为不同的菌株，证实本发明的副干酪乳酸杆菌株GMNL-133为一新颖菌株。
实施例3、副干酪乳酸杆菌株GMNL-133与其它副干酪乳酸杆菌株于刺激小鼠脾脏细胞产生IFN-γ的分泌量比较
分别以副干酪乳酸杆菌株GMNL-133与前述各种市售产品中的副干酪乳酸杆菌株，KW3110、LP33及BRAP-01，与正常小鼠的脾脏细胞共同培养后，比较小鼠脾脏细胞的IFN-γ分泌量。
以含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(GIBCO/BRL 
Gaithersburg，MD，USA)培养取自BALB/c小鼠的脾脏细胞。将4x105个小鼠脾脏细胞添加至96孔板中，并分别加入106上述各乳酸杆菌菌株，于37℃，含5％二氧化碳的环境下培养48小时。之后，将细胞培养上清液以市售ELISA试剂盒(OptEIA Mouse IFN-γSet，BD Biosciences Pharmingen 
San Diego，CA，USA)测定其中的IFN-γ含量。
图3为副干酪乳酸杆菌株GMNL-133与其它市售产品中副干酪乳酸杆菌株分别刺激小鼠脾脏细胞产生的IFN-γ分泌量。由图3结果可知，副干酪乳酸杆菌株GMNL-133能刺激大量IFN-γ分泌产生，且分泌量约为其它市售产品中的副干酪乳杆菌株的至少3倍以上，显示本发明的副干酪乳酸杆菌株GMNL-133较其它副干酪乳杆菌株对于治疗过敏具有较佳的效果。
实施例4、副干酪乳酸杆菌株GMNL-133对于致敏小鼠的细胞激素分泌的影响
致敏小鼠模式的小鼠为购自台湾乐斯科生物科技的雌性BALB/c小鼠。饲育于控制光线及温度的动物房。BALB/c小鼠入室一周后，待动物稳定后开始试验。
将小鼠分为正常组、实验组与安慰剂组进行实验。实验组与安慰剂组小鼠分别在实验开始第0天即利用腹腔注射50μg的卵白蛋白(ovalbumin，OVA)与4mg的铝胶佐剂(aluminum hydroxide adjuvant，alum)至小鼠体内，并于实验第14及28天时，再以25μg的OVA与4mg的alum重复注射小鼠。
于实验进行期间，自第1天开始即每天喂食正常组及安慰剂组小鼠0.5毫升RO水，而实验组小鼠则喂食2x107的副干酪乳杆菌株GMNL-133活菌。实验共进行35天，于第35天将小鼠处死，并于处死前由小鼠尾巴采血，分离出血清供后续进行IgE与IgG2a分析。
将各组BALB/c小鼠以CO2窒息法处死后，以无菌操作技术将脾脏取出置于微生物用培养皿，加入6ml PBS，以玻璃棒将脾脏挤压磨碎至悬浮液状态。吸取悬浮液缓慢加入事先已装好6ml的Ficoll-Hypaque(17-1400-02，Pharmacia)的15ml离心 管，进行梯度离心以将脾脏细胞分离(720g，20min)，沉淀物为红血球。自分界面处取出脾脏细胞，以PBS清洗二次后，以RPMI-1640培养基将细胞浓度调整为4×106cell/ml，将脾脏细胞以每个孔100μl注入96孔板中。
脾脏细胞于添加OVA(培养浓度30μg/mL)培养48小时后取上清液，用ELISA方式侦测TGF-β、IFN-γ、IL-10以及IL-17的浓度。
图4A至4B分别为致敏小鼠模式实验中，各组的血清中IgE与IgG2a表达量以安慰剂组的表达量标准化的柱形图，*标记表示与安慰剂组相比具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。由图4A至4B结果可知，实验组(喂食副干酪乳杆菌株GMNL-133)的BALB/c小鼠血清中的OVA特异性IgE，和安慰剂组相比有显著的下降。然而，实验组(喂食副干酪乳杆菌株GMNL-133)的BALB/c小鼠血清中OVA特异性IgG2a，和安慰剂组相比则是显著的增加。根据文献指出，IgG2a抗体是由Th1细胞所分泌。因此，喂食副干酪乳酸杆菌株GMNL-133可使得BALB/c小鼠的Th1细胞活化，进而减少血清中OVA特异性IgE的产生。
图5A至5D则分别为致敏小鼠模式实验中，各组的脾脏细胞培养液中的TGF-β、IFN-γ、IL-10以及IL-17表达量以安慰剂组的表达量标准化的柱形图，其中*标记表示与安慰剂组相比具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。由图5A至5D结果可知，喂食副干酪乳杆菌株GMNL-133后的实验组和安慰剂组相比，实验组的脾脏细胞培养液中的TGF-β、IFN-γ、IL-10以及IL-17浓度均有显著的增加。
许多过敏性疾病是由于Th1细胞与Th2细胞之间的免疫反应不平衡，且对过敏原的反应较偏向Th2细胞的免疫反应所致。而有文献指出，通过改善Th1/Th2免疫***的平衡，将Th2细胞反应转向Th1免疫反应，可减缓过敏疾病。当免疫反应偏向Th1细胞的免疫途径时，Th1细胞会分泌IFN-γ，帮助IgG2a抗体的产生、活化巨噬细胞、天然杀手细胞与毒杀型T细胞，强化细胞免疫反应。此外，Th17细胞会分泌IL-17，可以作为先天免疫以及后天免疫之间调节的桥梁，也就是说Th17细胞是位于细胞免疫与体液免疫之间调节的枢纽位置。
再者，另一群调节型T细胞可通过抑制Th2细胞的免疫反应来达到抑制过敏疾病的发生。调节型T细胞的特征是会分泌IL-10或TGF-β，进而抑制标的细胞的活化与增生。
综上所述，本发明的副干酪乳酸杆菌株GMNL-133可以刺激体内免疫***的Th-17细胞，进而使得Th1/Th2的免疫反应转往Th1途径。再者，本发明的副干酪 乳酸杆菌株GMNL-133也可以刺激调节型T细胞，进而抑制Th2细胞的免疫反应，达到减缓过敏反应。
实施例5、副干酪乳酸杆菌株GMNL-133对于具异位性皮肤炎小鼠的改善效用评估
将购自台湾乐斯科生物科技的6周大的正常雄性BALB/c小鼠饲育于控制光线及温度的动物房。BALB/c小鼠入室一周后，待动物稳定后开始试验。
将小鼠分为正常组、实验组与安慰剂组进行实验。实验组与安慰剂组小鼠分别在实验开始第0天时，将10微升的0.3％三硝氯苯溶液涂布于BALB/c小鼠右耳内侧，之后于实验进行期间，每周三次于相同部位涂布相同剂量的三硝氯苯溶液，以诱发小鼠产生异位性皮肤炎，形成异位性皮肤炎小鼠模式。同时，在实验进行期间，自第1天开始即每天喂食正常组及安慰剂组小鼠0.5毫升RO水，而实验组小鼠则喂食2x107的副干酪乳杆菌株GMNL-133活菌。
实验共进行21天。于第22天将小鼠处死，并于处死前以厚度规测定小鼠右耳厚度、采集小鼠耳部组织及由小鼠尾巴采血，分离出血清供日后进行免疫球蛋白分析。小鼠耳部组织置于含有蛋白酶抑制剂的50mM磷酸缓冲溶液中，进行均质化后，以18870g重力离心30分钟，取上清液以酶联免疫测定法测量上清液中肿瘤坏死因子TNF-α的含量。
图6A图为异位性皮肤炎小鼠模式实验中，各组小鼠右耳厚度结果的柱形图。图6B至6C分别为异位性皮肤炎小鼠模式实验中，各组小鼠血清中的IgE以及IgG1表达量以安慰剂组的表达量标准化的柱形图。图6D图为异位性皮肤炎小鼠模式实验中，各组小鼠耳部组织中的TNF-α的表达量以安慰剂组的表达量标准化的柱形图。图6B至图6D的结果表示方式为以安慰剂组所测得的含量为100％，正常组与实验组所测得的含量分别与安慰剂组比较，*标记表示与安慰剂组相比具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。
根据图6A至6D的结果，显示在异位性皮肤炎小鼠模式下，喂食副干酪乳杆菌株GMNL-133活菌(实验组)的小鼠其耳朵厚度、血清中IgE、IgG1及耳部组织的TNF-α分泌量，与未喂食副干酪乳杆菌株GMNL-133活菌(安慰剂组)的小鼠比较，皆有显著下降。因此，本发明的副干酪乳杆菌株GMNL-133菌株可明显改善异位性皮肤炎的症状，对于生物体内的过敏反应也具有抑制作用。
Claims (10)
1.一种经分离的副干酪乳酸杆菌株GMNL-133，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2011311。
2.根据权利要求1的副干酪乳酸杆菌株GMNL-133的用途，用于制造治疗异位性皮肤炎的组合物。
3.根据权利要求1的副干酪乳酸杆菌株GMNL-133的用途，用于制造治疗过敏疾病的组合物。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其中该副干酪乳酸杆菌株GMNL-133为活菌。
5.根据权利要求2或3所述的用途，其中该组合物为一医药组合物或一食品组合物。
6.一种用于治疗异位性皮肤炎的组合物，包括根据权利要求1的副干酪乳酸杆菌株GMNL-133，且该副干酪乳酸杆菌株GMNL-133的含量可有效改善异位性皮肤炎。
7.一种用于治疗过敏症状的组合物，包括根据权利要求1的副干酪乳酸杆菌株GMNL-133，且该副干酪乳酸杆菌株GMNL-133的含量可有效改善过敏疾病。
8.根据权利要求6或7所述的组合物，其中该副干酪乳酸杆菌株GMNL-133为活菌。
9.根据权利要求6或7所述的组合物，其中该组合物为一医药组合物或一食品组合物。
10.根据权利要求6或7所述的组合物，进一步包含：
至少一种其它菌株，该其它菌株选自于由嗜酸性乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、奶酪乳酸杆菌(Lactobacillus cremors)、鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)及上述的任意组合所组成的一族群。
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