CN111450125A - 罗伊氏乳杆菌ccfm8631的新应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于微生物技术领域，公开了罗伊氏乳杆菌CCFM8631的新应用。实验表明，本发明所述罗伊氏乳杆菌CCFM8631能够减少体重的降低，减轻胶原诱导型类风湿性关节炎体重的降低，减轻大鼠关节肿胀程度；降低促炎因子血清中IL‑1β水平；对类风湿性关节炎大鼠粪便中丁酸盐有显著的恢复作用，使之达到正常水平；可以调节类风湿性关节炎导致的肠道菌群组成紊乱；直接抑制可加剧类风湿性关节炎的Prevotella copri；显著抑制关节炎大鼠的肠系膜处Th17细胞的分化能力。本发明所述罗伊氏乳杆菌CCFM8631可用于制备预防和/或治疗类风湿性关节炎疾病的产品，如药物、菌剂或发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

Description

罗伊氏乳杆菌CCFM8631的新应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及罗伊氏乳杆菌CCFM8631的新应用，尤其是罗伊氏乳杆菌CCFM8631在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎疾病的产品中的应用。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种慢性、全身性的自身免疫性疾病，初期表现为滑膜炎、血管翳的形成，继而关节软骨破坏、骨组织炎症，后期关节硬化、关节腔显著狭窄或消失，最终发展成骨性关节硬化，关节腔狭窄甚至消失，关节畸形，导致功能性残疾。流行病学调查显示，全球约有0.5％-1％的人患有类风湿性关节炎，我国的患病率约为0.32％-0.36％，其中男女发病率约为1：3。这些数据说明类风湿性关节炎作为一类不可忽略的自身免疫性疾病已经威胁到公众健康和幸福感。

类风湿性关节炎确切的病因和发病机制尚不明确，目前主要认为是在遗传、环境、感染和免疫等因素的共同/相互作用下导致的自身免疫性疾病。免疫因素涉及固有免疫和适应性免疫，其中B细胞和CD4+T细胞及其亚群在疾病的发生和发展过程中起到至关重要的作用。机体免疫***受环境因素或自身抗原刺激之后导致免疫***应答紊乱，CD4+T细胞异常发育和分化，B细胞产生自抗体破坏机体免疫耐受，引发自身免疫反应。CD4+T淋巴细胞有多种亚群，与类风湿性关节炎密切相关的是Th17细胞和Treg细胞，Th17/Treg细胞比例的平衡有利于维持机体免疫平衡，Th17细胞的过度分化会导致产生大量的促炎性细胞因子进而加重炎症反应，而Treg的缺乏使得抑炎性细胞因子分泌减少，机体的免疫耐受被破坏。众多的临床研究中检测到RA病人血液中Th17细胞增多而Treg细胞减少，二者比例失衡，在治疗之后恢复平衡。机体的免疫应答是一个复杂而又精确的***反应，免疫反应不仅关系局部应答还会影响***性的免疫应答。肠粘膜作为重要的黏膜位点，肠道免疫影响机体***性免疫应答。肠黏膜位点的免疫反应很大程度由肠道细菌塑造。RA患者的发病初期阶段粪便中Prevotella属的相对丰度显著上升，伴随疾病的发展，疾病后期该菌的丰度下降至正常水平。进一步探究不同种的Prevotella的免疫反应，发现Prevotella copri具有诱发小鼠关节炎的作用，而Prevotella histicola则可缓解关节炎病情。由此推测，肠道可作为治疗RA的靶点，使用特定微生物干预肠道菌群调节肠道免疫，影响***性免疫应答，进而减缓RA相关症状。

目前，类风湿性关节炎在临床上是治疗为主，缺乏预防意识。一般采用非甾体类抗炎药、抗风湿药物和肾上腺糖皮质激素来缓解病情，但是忽视了在临床表现出病情之前的潜伏期，有大量临床研究发现在数月甚至数年前在RA病人血液中就可检测到一些自抗体，如类风湿因子等。因此，亟需寻找一种安全、有效、无副作用的容易实施且能够有效预防和/或缓解类风湿性关节炎的产品。乳酸菌作为一种安全的、可食用的食品，已经在预防或治疗多种疾病的领域有广泛的应用，例如预防或治疗胃肠道疾病、神经性疾病，缓解重金属毒性，促进消化吸收，拮抗致病菌的感染与增强免疫力等。因此，研发能有效干预类风湿性关节炎疾病发生发展的益生菌制品，具有重要的社会价值。尽管有益生菌嗜热链球菌TCI633治疗或缓解骨关节炎疼痛已有相关专利申请(公开号CN108165505A)，但骨关节炎和类风湿性关节炎的发病机制有明显的不同，目前尚无使用罗伊氏乳杆菌改善Th17细胞免疫应答以缓解类风湿性关节炎的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的上述问题，提供了罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM8631在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎疾病的产品中的应用。

在一个实施方案中，本发明考察了罗伊氏乳杆菌CCFM8631对胶原诱导型类风湿性关节炎大鼠的影响，结果显示罗伊氏乳杆菌CCFM8631能够减少胶原诱导型类风湿性关节炎大鼠体重的降低，减轻大鼠关节肿胀程度。

在一个实施方案中，本发明考察了罗伊氏乳杆菌CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠血清中IL-1β的影响，结果显示罗伊氏乳杆菌CCFM8631可降低促炎因子血清中IL-1β水平。因此本发明提供了罗伊氏乳杆菌CCFM8631在制备调节血清中促炎性细胞因子IL-1β的含量的产品中的应用。

在一个实施方案中，本发明考察了罗伊氏乳杆菌CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠粪便中丁酸盐的调节作用，结果显示罗伊氏乳杆菌CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠粪便中丁酸盐有显著的恢复作用，使之达到正常水平。因此本发明提供了罗伊氏乳杆菌CCFM8631提高粪便中丁酸盐的含量的产品中的应用。

在一个实施方案中，本发明考察了罗伊氏乳杆菌CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠粪便菌群的调节作用，结果显示罗伊氏乳杆菌CCFM8631可以调节类风湿性关节炎导致的肠道菌群组成紊乱。

在一个实施方案中，本发明考察了罗伊氏乳杆菌CCFM8631在体外对Prevotellacopri的生长的影响，结果显示罗伊氏乳杆菌CCFM8631直接抑制了可加剧类风湿性关节炎的Prevotella copri。因此本发明提供了罗伊氏乳杆菌CCFM8631抑制Prevotella copri的生长繁殖的产品中的应用。

在一个实施方案中，本发明考察了罗伊氏乳杆菌CCFM8631对肠系膜***中Th17细胞的影响，结果显示罗伊氏乳杆菌CCFM8631显著抑制关节炎大鼠的肠系膜处Th17细胞的分化能力。因此本发明提供了罗伊氏乳杆菌CCFM8631调节肠系膜***处Th17细胞的比例的产品中的应用。

本发明提供了所述罗伊氏乳杆菌CCFM8631在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎疾病的产品中的应用。

本发明所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM8631，已于2017年07月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.14394。

在本发明中，所述产品中罗伊氏乳杆菌CCFM8631的活菌数不低于1×10⁹CFU/mL或1×10⁹CFU/mg。

本发明所述产品包括但不限于药物、菌剂或发酵食品。

其中，所述药物含有罗伊氏乳杆菌CCFM8631、药物载体和/或药物辅料。

在本发明中，所述发酵食品是以所述罗伊氏乳杆菌CCFM8631作为发酵剂发酵生产的食品。

在本发明中，所述产品推荐使用剂量为1mL或1mg/天。即每天摄入至少1×10⁹CFU活菌。

本发明所述罗伊氏乳杆菌CCFM8631能够减少体重的降低，减轻胶原诱导型类风湿性关节炎体重的降低，减轻大鼠关节肿胀程度；降低促炎因子血清中IL-1β水平；对类风湿性关节炎大鼠粪便中丁酸盐有显著的恢复作用，使之达到正常水平；可以调节类风湿性关节炎导致的肠道菌群组成紊乱；直接抑制可加剧类风湿性关节炎的Prevotella copri；显著抑制关节炎大鼠的肠系膜处Th17细胞的分化能力。本发明所述的罗伊氏乳杆菌CCFM8631可用于制备预防和/或治疗类风湿性关节炎疾病的产品，如药物、菌剂或发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠的影响；A：体重；B：关节厚度临床分数；C：临床分数；

图2示实施例2CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠血清中细胞因子IL-1β的影响；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001与空白对照组相比较；*P<0.05，**P<0.05，***P<0.05与模型组相比较；

图3示实施例3CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠粪便中丁酸的影响；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001与空白对照组相比较；*P<0.05，**P<0.05，***P<0.05与模型组相比较；

图4示实施例4CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠粪便菌群门水平的影响；A：Bacteroidetes；B：Tenericutes；

图5示实施例4CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠粪便菌群科水平的影响；A：Anaeroplataceae；B：Rikenellaceae；

图6示实施例4CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠粪便菌群属水平的影响；A：Anaeroplasna；B：Paraprevotella；C：Sarcina；

图7示实施例5CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠肠系膜***中Th17细胞分化的影响；

图8示实施例5各组中肠系膜***中Th17细胞的代表性图谱；A：正常组；B：模型组；C：药物组；D：罗伊氏乳杆菌组。

具体实施方式

本发明公开了罗伊氏乳杆菌CCFM8631在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎疾病的产品中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1：罗伊氏乳杆菌CCFM8631对胶原诱导型类风湿性关节炎大鼠的影响

7周龄的SPF(Specific Pathogen Free)级雌性Wistar大鼠饲养在22-24℃，湿度40％-60％，每日光照12h的SPF级环境中，所有动物自由进食及饮水。实验动物适应性饲养1周之后随机分为四组：正常组、模型组、药物甲氨蝶呤组和CCFM8631组，每组8-9只，具体实验处理见表1。

CCFM8631在MRS培养基中活化三代，以5％接种量扩大培养，离心浓缩培养物，用无菌生理盐水清洗三次，菌泥重悬于30％无菌蔗糖溶液中，调整浓度至5×10¹⁰CFU/mL，分装，置于-80℃冰箱，在灌胃前用无菌蒸馏水稀释十倍。

造模方法：牛II型胶原蛋白溶液与氟氏不完全佐剂等体积混合和完全乳化。造模采用两次免疫的方法，初次免疫吸取0.15mL完全乳化的乳液在距离大鼠尾根部1.5cm处进行皮下注射，一周后加强免疫时再次吸取0.15mL完全乳化的乳液在距离大鼠尾根部2.0cm处进行皮下注射。一周后评估类风湿性关节炎的疾病，每周观察大鼠足爪和踝关节红肿状态进行临床评分、称量大鼠体重、量取踝关节厚度。临床评分标准如下：0分：关节没有红斑和肿胀；1分：1个关节肿胀和/或发红；2分：2个关节肿胀或发红；3分：大于2个关节肿胀或发红；4分：整个足爪发红关节炎症严重。一只大鼠的4爪分别评分，每只大鼠得分最高为16分。

表1实验动物分组及处理方法

整个实验周期为7周，通过图1A可知，预灌胃CCFM8631两周对体重没有影响。在加强免疫后1周后出现类风湿性关节炎症状，模型组体重趋于降低，从第3周开始体重显著低于正常组(模型组：250.98±7.02g/只；空白组：294.08±8.97g/只，p<0.001)；而CCFM8631组的大鼠体重与药物组相接近，高于模型组(CCFM8631组：264.66±5.82g/只；药物组：269.59±4.33g/只，p＝0.93)，且药物组没有出现副作用。由图1B和1C可知，第3周时模型组关节严重肿胀和红肿，踝关节厚度约为空白组的1.7倍，关节厚度显著增加，灌胃CCFM8631可缓解踝关节的肿胀踝关节厚度，仅比空白组增加了31.3％。与此相一致的是，CCFM8631也可降低临床评分。罗伊氏乳杆菌CCFM8631能够减少体重的降低，减轻大鼠关节肿胀程度，说明罗伊氏乳杆菌CCFM8631具有改善类风湿性关节炎的作用。

实施例2：罗伊氏乳杆菌CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠血清中IL-1β的影响

实施例1造模实验结束后，大鼠禁食不禁水12h，采集血样，室温静置30min之后，3000g室温离心15min，取上清，使用大鼠IL-1β的ELISA试剂盒(RD1；货号：DY501)测定，根据说明书进行操作。

结果如图2所示，类风湿性关节炎模型组大鼠血清中IL-1β浓度为834.76±223.67ng/mL，比正常组(142.77±49.84ng/mL)显著升高(p＝0.012)。相比于模型组的大鼠，药物组和CCFM8631组的显著降低IL-1β的水平接近于正常组，分别为159.35±39.84ng/mL、175.49±42.29ng/mL。结果提示罗伊氏乳杆菌CCFM8631可降低促炎因子血清中IL-1β水平。

实施例3：罗伊氏乳杆菌CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠粪便中丁酸盐的调节作用

实施例1造模实验结束后，大鼠禁食不禁水12h，收集粪便于液氮，后转移至-80冰箱。在实验前取出，进行真空冷冻干燥。准确称取0.05g冻干后的粪便样品溶解于0.5mL饱和氯化钠溶液中，浸泡30min，组织匀浆机匀浆，加入0.02mL10％硫酸，震荡30s。在通风橱内向粪便溶液中准确加入0.8mL***溶液，震荡30s后离心15min(8000g，4℃)，移取上清液至含有0.3g无水硫酸钠的离心管中，震荡均匀，离心15min(8000g，4℃)，取上清至由GCMS检测粪便中丁酸盐含量。

结果如图3所示，类风湿性关节炎模型组大鼠中丁酸含量相比较下降到正常组的64.0％。CCFM8631的干预使丁酸(图3)的含量显著上升，回升至正常组水平(正常组vsCCFM8631组：8.25±0.67vs 10.01±0.52μmol/g)。结果说明，罗伊氏乳杆菌CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠粪便中丁酸盐有显著的的恢复作用，使之达到正常水平。

实施例4：罗伊氏乳杆菌CCFM8631对类风湿性关节炎大鼠粪便菌群的调节作用

实施例1造模实验结束后收集大鼠的粪便，提取粪便中基因组DNA，对V3-V4区进行特异性PCR扩增，16S rDNA测序，分析粪便菌群变化。结果如图4、图5和图6所示。

如图4所示，与正常组相比，类风湿性关节炎模型组大鼠粪便微生物菌群发生了显著的变化。在门水平上，与正常组相比，模型组的Bacteroidetes(图4A)的相对丰度升高。而Tenericutes(图4B)显著下降，CCFM8631对这种变化有恢复作用，但不显著。在科水平，模型组粪便中Anaeroplasmataceae(图5A)的相对丰度与正常组的含量相比显著降低；而Rikenellaceae(图5B)显著升高，相对丰度由正常组的0.23％上升为1.07％。摄入CCFM8631之后，Anaeroplasmataceae和Rikenellacea的相对丰度恢复正常组的含量。在属水平上，模型组与正常组相比较，Anaeroplasma(图6A)显著下降，Paraprevotella(图6B)上升(p＝0.058)。CCFM8631干预之后Anaeroplasma恢复至正常水平，Paraprevotella丰度不改变。且Sarcina的丰度在模型组中低于空白组，CCFM8631使之恢复且高于正常组(图6C)。说明罗伊氏乳杆菌CCFM8631可以调节类风湿性关节炎导致的肠道菌群组成紊乱的功能。

实施例5：罗伊氏乳杆菌CCFM8631对肠系膜***中Th17细胞的影响

实施例1造模实验结束后，异氟烷麻醉大鼠，心脏采血后，浸泡在75％的酒精中15min，使用无菌器械打开腹腔，无菌取肠系膜***。将肠系膜***制备成单细胞悬浮液，将细胞浓度调整为2×10⁵cells/100μL，加入佛波醇酯12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素的混合物，在37℃细胞培养箱中培养刺激6h。将刺激后的细胞经CD4-FITC细胞表面染色和IL-17A-PE胞内染色之后，流式细胞仪检测Th17细胞比例。

结果如图7所示，与正常组相比，模型组Th17细胞比例显著升高，是正常组的11.83倍。在药物处理下，Th17细胞比例下降为0.33％，是正常组的1.83倍；CCFM8631对Th17细胞有显著的抑制作用，仅为正常组的2倍，抑制效果与药物接近。图8A-D展示的是每组中有代表性的样品的Th17细胞比例(Q2)图。据此可知，关节炎大鼠的肠系膜处Th17细胞的分化能力显著增强(11.66％)，而罗伊氏乳杆菌CCFM8631对此显著抑制(0.38％)。

实施例6：罗伊氏乳杆菌CCFM8631在体外抑制Prevotella copri的生长

在15支装有4.8mL的BHI培养基的试管分为3组，每组5只试管，分别为CCFM8631对照组、Prevotella copri对照组、CCFM8631和Prevotella copri共培养组。对照组中分别加入100μL 1×10⁶CFU/mL的相应菌液和100μL无菌生理盐水，在共培养组分别加入100μL 1×10⁶CFU/mL的CCFM8631菌液和100μL1×10⁶CFU/mL的Prevotella copri；混匀后，置于厌氧工作站于37℃培养24h。培养后分别取1mL采取倾注法进行菌落计数。菌落计数时，CCFM8631对照组使用MRS琼脂培养基、Prevotella copri对照组使用添加5％胆盐和10％马血清的BHI琼脂培养基，共培养组同时使用两种培养基，分别为MRS琼脂培养基(仅CCFM8631生长)、添加5％胆盐和10％马血清BHI琼脂培养基(仅Prevotella copri生长)。计数结果如表2所示。

表2 CCFM8631与Prevotella copri的体外共培养(单位：10⁹CFU/mL)

菌名	CCFM8631对照组	Prevotella copri对照组	共培养组
				CCFM8631	6.1±4.6	—	6.5±9.2
Prevotella copri	—	4.2±1.9	1.9±8.8

由表2可知，CCFM8631与Prevotella copri共培养后，Prevotella copri的生长受到显著抑制，相比于对照组，抑制率达54％，而CCFM8631的生长未受影响，说明罗伊氏乳杆菌CCFM8631直接抑制了可加剧类风湿性关节炎的Prevotella copri。

Claims (6)

1.罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM8631在制备调节血清中促炎性细胞因子IL-1β的含量、抑制Prevotella copri的生长繁殖、提高粪便中丁酸盐的含量、调节肠系膜***处Th17细胞的比例的产品中的应用。

2.罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM8631在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎疾病的产品中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品中，罗伊氏乳杆菌CCFM8631的活菌数不低于1×10⁹CFU/mL或1×10⁹CFU/mg。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品为药物、菌剂或发酵食品。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物含有罗伊氏乳杆菌CCFM8631、药物载体和/或药物辅料。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵食品是以所述罗伊氏乳杆菌CCFM8631作为发酵剂发酵生产的食品。

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