CN102309001A - 用于治疗过敏的乳酸菌菌株的食品组合物以及医药组合物 - Google Patents

Abstract

本发明是有关新颖的乳酸菌菌株及含过去未知可用于增进它抗过敏能力的该菌株的新颖组合物，该组合物可呈食品或医药组合物形式存在。其中亦说明如何筛选测定该乳酸菌株组合物而增进Th1型免疫能力藉此调控因过敏而反应过度的Th2型的免疫反应的方法。

Description

用于治疗过敏的乳酸菌菌株的食品组合物以及医药组合物

技术领域

本发明是有关一种食品组合物以及医药组合物，特别是一种包含抗过敏的乳酸菌菌株的食品组合物以及医药组合物。

背景技术

一般食用含乳酸菌(LAB)的产品仅具有调整肠道的健康效果，虽然有数以万计的乳酸菌菌株存在于自然界，但仅有少数乳酸菌株具有抗过敏的特质。少数这些细菌株所具有的耐酸与耐胆盐能力、吸附黏膜表皮细胞的能力以及在通过肠胃道后仍可存活的能力等特性，是筛选有促进健康效果的菌株时的重要依据。时至今日，仅有少数几株经证明其具有抗过敏健康效果的乳酸菌菌株被确认出来，而乳酸菌对身体健康的功能在于菌株(strain)的特异性而非菌种(species)，此种对于人的身体健康有特殊功效的菌株称为功能性益生菌(Guidelines for the evaluation of probiotics in food；Report of j oint FAO/WHOworking group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food；London Ontario，Canada April 30and May 1，2002：1-7)。

国内外有许多乳酸菌与过敏反应有关的文献报导。在针对乳酸菌减低过敏的能力进行动物试验的研究方面，热致死的乳酸菌L.plantarum L-137所作的动物试验能够诱导DBA/2鼠的巨噬细胞与脾脏细胞产生IL-12及IFN-γ，并且能抑制已具酪蛋白(casein)专一性的IgE，增加对酪蛋白专一性的IgG1抗体(Murosaki，1998)。针对OVA-TCR-Tg鼠喂食L.casei Shirota四周，增加脾脏细胞分泌IFN-γ和IL-12，降低分泌IL-4和IL-5(Shida et al.，2002)。OVA致敏BALB/c鼠喂食乳酸菌Lactobacillus发酵奶27天，可降低血清中具有OVA特异性IgE(Ishida et al.，2003)。C3H/Hej鼠经OVA与霍乱毒素(cholera toxin)致敏，喂食B.bifidum BGN4、L.casei 911，可使血清中具OVA特异性IgE、IgA及总IgE、IgG1降低(Kim et al.，2005)，这些文献证实在过敏模式的动物试验上，喂食乳酸菌能够降低血清中IgE的含量，藉此改善过敏的情形。

乳酸菌在临床实验上，具有过敏疾病的患者确实能改善过敏反应，合并服用干燥的乳酸菌L.rhamnosus及L.reuteri六周，对过敏疾病有益处，以问卷调查家长评估益生菌对一至十三岁儿童异位性皮肤炎，发现56％的儿童异位性皮肤炎有改善(Rosenfeldt et al.，2003)。Ishida(2005)学者针对四十九位过敏性鼻炎患者，饮用L.acidophilus strain L-92，也发现过敏症状获得改善。服用L.fermentum VRI 003 PCCTM八周，五十三位具有异位性皮肤炎症状的小孩可以增加PBMC细胞产生IFN-γ，并改善过敏情形(Prescott et al.，2005)。

(2006)等学者研究指出针对五十四位具有异位性皮肤炎患者所作的试验，给予服用L.rhamnosus strain GG及安慰剂后，能有效改善过敏症状。

研究指出乳酸菌细胞壁成分具有免疫调节能力，包括Peptidoglycans(PG)、Lipoteichoic acids(LTA)、Phosphopolysaccharide。例如L.lactis细胞壁中的Phosphopolysaccharide能刺激小鼠白血球产生IFN-γ，Teichoic acid和Muramyldipeptide增加刺激PBMC产生IFN-γ(Cross et al.，2001)；L.paracasei KW3110细胞壁成分LTA可影响NF-κB讯号传递途径，具有很强的免疫调控能力(Fujiwara et al.，2004)。

益生菌株对于人体具有良好功效性，且有许多可能的机制被提出说明为何益生菌株对人体有良好的影响。这些机制大都集中在改善肠道黏膜细胞屏蔽功能来直接影响人体的免疫***，例如抑制前发炎细胞激素的分泌、影响调节型T细胞的活性以及调整Th1/Th2之间的平衡。在婴幼儿时期改善调整肠胃道共生菌的菌相是十分重要的，许多过敏的婴幼儿肠道缺乏益生菌菌丛，且肠道菌丛皆存在有较多的产气夹膜梭菌及较少的双歧乳杆菌菌丛。因此益生菌丛存在肠道，对于人体的免疫能力建构及具备健全的免疫调控能力是十分重要的关键。然而，对于益生菌影响人体的机制依旧尚未有定论，针对此点，在未来的发展上，仍需更多的体外及体内试验去说明，对人体有如此良好影响的机制为何以及研究应用于人体上最佳的条件(Michael et al.，2008)。

发明内容

本发明一方面广义的包括由下列任一种生物性培养物：罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)GL-104菌株，中国典型培养物保藏中心保藏号M 209138菌株，以及生理上可接受的赋形剂或稀释剂所组成的食品组合物或医药组合物。

在另一项具体实施例中，包括增强抗过敏能力的生理上可接受的下列任一种菌株的同种或突变种的生物性培养物：罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillusreuteri)GL-104菌株，中国典型培养物保藏中心保藏号M 209138。

又，另一项具体实施例中，本发明可广义的包括经由促进细胞白介素-12(IL-12)或干扰素γ(IFN-gamma)调控Th1型免疫反应而抑制免疫球蛋白IgE，改善Th2型过度免疫反应的过敏现象，其是对哺乳动物给予可达到刺激Th1型免疫效果剂量的任一种前述生物性培养物。

本发明亦可广义的包括本申请案说明书中分开或总合说明的部分、构成要件与特征，及任何包含这些部分、构成要件与特征中任何一种或多种的任何或全部组合，且若本文所述及的明确完整事物已于与本发明有关的相关技艺中出现已知的同等物时，这些已知的同等物将如同独立事项并入本文中。

附图说明

图1显示，当分别以10⁶至10⁸cfu的罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株M 209138与10⁵至10⁷个小鼠脾脏细胞(Splenocyte)共同培养48小时，收取细胞上清液，以酶联免疫分析法侦测干扰素γ(IFN-gamma)在上清液中的含量。其中以无抗过敏功能乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC17001)及实验背景值(Cell only)为负对照组，以发表多数文献证明其有抗过敏功效的乳酸菌(Lactobacillusrhamnosus GG BCRC 16000)及PHA为正对照组，侦测干扰素γ受刺激浓度。结果显示试验组可以显著的刺激小鼠脾脏细胞(Splenocyte)分泌干扰素γ与负对照组(Lactobacillus casei BCRC17001)有显著性差异并比正对照组(Lactobacillusrhamnosus GG BCRC 16000)的刺激量高出近4倍。

图2显示，当分别以10⁶至10⁸cfu的罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株M 209138与10⁵至10⁷个人类外周血单个核细胞(PBMC)共同培养48小时，收取细胞上清液，以酶联免疫分析法侦测干扰素γ(IFN-gamma)在上清液中的含量。其中以无抗过敏功能乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC17001)及实验背景值(Cell only)为负对照组，以发表多数文献证明其有抗过敏功效的乳酸菌(Lactobacillusrhamnosus GG BCRC 16000)及PHA为正对照组，侦测干扰素γ受刺激浓度。结果显示试验组可以显著的刺激人类外周血单个核细胞(PBMC)分泌干扰素γ与负对照组(Lactobacillus casei BCRC17001)有显著性差异并比正对照组(Lactobacillus rhamnosus GG BCRC 16000)的刺激量高出2.2倍。

图3显示，当分别以热致死10⁶至10⁸cfu的罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株M 209138与10⁵至10⁷个人类树突状细胞(dendritic cell)共同培养48小时，收取细胞上清液，以酶联免疫分析法侦测细胞白介素12p40在上清液中的含量。其中以无抗过敏功能乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC17001)及实验背景值(Cellonly)为负对照组，以发表多数文献证明其有抗过敏功效的乳酸菌(Lactobacillusrhamnosus GG BCRC 16000)及LPS为正对照组，侦测细胞白介素12p40(IL-12p40)受刺激浓度。结果显示试验组可以显著的刺激人类树突状细胞分泌细胞白介素12p40(IL-12p40)与负对照组(Lactobacillus casei BCRC17001)有显著性差异，并比正对照组(Lactobacillus rhamnosus GG BCRC 16000)的刺激量高出2倍。

图4显示，罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株M 209138在培养基的活化后，总菌数经由模拟胃酸溶液及胆盐溶液处理不同时间，罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株M 209138的菌数并不受胃酸及胆盐影响而急剧下降，证明本发明的抗过敏乳酸菌菌株可以通过人体消化***严格环境的考验。

图5显示，依据Jacobsen等学者(1999)的分析方法，当每个视野的平均菌数少于40时，判定为不附着(nonadhesive)；当每个视野的平均菌数介于41至100时，判定为附着(adhesive)；当每个视野的平均菌数大于100时，判定为强烈附着(strongly adhesive)。显示罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株M 209138判定为“强烈附着”。

具体实施方式

本发明一方面广义的包括下列生物性培养物：罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)GL-104菌株，中国典型培养物保藏中心保藏号M 209138，以及生理上可接受的赋形剂或稀释剂所组成的食品组合物或医药组合物。

许多文献指出增加第一型T细胞细胞激素包括细胞白介素(IL-12)、干扰素γ(IFN-gamma)的分泌增加，可以有效改善过敏症状；进一步的研究也指出特定的乳酸菌株和树突状细胞上类铎受体(Toll-like receptor)结合，活化细胞内的转译蛋白移至核内而释放大量细胞激素，属于先天免疫的一环，因此某些特定的乳酸菌菌株藉由其细胞壁多糖类物质如肽聚糖(peptidoglycan)、多聚糖(polysaccharide)等，经先天免疫***，确实能活化体内T细胞的发育。

本发明所述的菌株的冷冻干燥培养物已保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学430072。保藏的详细资料如表1所示：

表1

菌株名	编号	日期
			罗伊氏乳酸杆菌GL-104	M 209138	2009年08月14日

如表1所列已保藏的该株乳酸菌已发现具有抗过敏的能力，包括对于异位性皮肤炎、荨麻疹、过敏性鼻炎、食物过敏及气喘的症状有减缓及治疗的功能。

实施例1：抗过敏乳酸菌的形态学及一般性质。

根据16S rDNA序列分析及API细菌鉴定***分析结果来确认菌株在分类学上的特征。发现，丰华菌株编号GL-104为罗伊氏乳酸杆菌。此菌株在形态学及一般性质上的特征详细列于表2：

表2

菌株名	形态特征
		罗伊氏乳酸杆菌GL-104	1.于MRS培养液培养时，菌体呈短杆状，二端呈圆形，通常单独出现、成对或成短链状。2.革兰氏染色阳性杆菌，不生成孢子，不具触酶、氧化酶及运动性，在好氧及厌氧环境均能生长，最适宜的生长温度为37±1℃，属于兼性异质发酵性菌株，葡萄糖代谢时不产生气体。

实施例2：抗过敏乳酸菌对促进干扰素γ的分泌调控Th1型免疫能力的作用。

检视该株抗过敏乳酸菌株，罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株M 209138对Th1型免疫能力的增进效果，其是测定小鼠脾脏细胞(Splenocyte)及人类外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)与前述该株抗过敏乳酸菌分别共同培养后测定干扰素γ的分泌量，来验证具有抗过敏能力的菌株。使用如下的实验步骤：

1.取适当小鼠脾脏及人类血液量每次约一颗脾脏及200mL全血。

2.将脾脏放入缓冲溶液中打碎后，100g离心5分钟，取上清液备用。

3.取等比例的血球分离液(Ficoll-paque)与脾脏细胞上清液及血液在18-20℃以400g离心30-40分钟。

4.取脾脏细胞层及人类周边血液白血球细胞层，缓冲溶液清洗细胞2-3次后，以适当的培养基(例如RPMI-1640)悬浮细胞。

5.将细胞与已活化3天的乳酸菌株以1∶10比例共同培养48小时。

6.收取细胞培养的上清液。利用酶联免疫分析法(ELISA)侦测干扰素γ(IFN-gamma)在上清液中的含量。

数据的统计分析如表3、表4及图1、图2所示，以Mean±SD表示。图1及图2所示为当分别以10⁶至10⁸cfu罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株M 209138与10⁵至10⁷个脾脏细胞及人类外周血单个核细胞(PBMC)分别共同培养48小时，收取细胞上清液，以酶联免疫分析法侦测干扰素γ(IFN-gamma)在上清液中的含量。其中以无抗过敏功能乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC 17001)及实验背景值(Cell only)为负对照组，以发表多数文献证明其有抗过敏功效的乳酸菌(Lactobacillus rhamnosus GG B CRC 16000)及PHA(Phytohemagglutinin)为正对照组，侦测干扰素γ受刺激浓度。结果显示试验组可以显著的刺激小鼠脾脏细胞(Splenocyte)及人类外周血单个核细胞(PBMC)分泌干扰素γ与负对照组(Lactobacillus casei BCRC 17001)有显著性差异并比正对照组(Lactobacillusrhamnosus GG BCRC 16000)的刺激量高出近4倍(Splenocyte)及近2.2倍(PBMC)。表3及表4为该株抗过敏菌株及对照组分别与小鼠脾脏细胞及人类外周血单个核细胞(PBMC)培养，刺激干扰素γ的分泌量(means+SD)：

表3Splenocyte

表4PBMC

菌株名称	干扰素γ的分泌量(pg/mL)
		正对照组(L.rhamnosus GG BCRC 16000)	8201±322
罗伊氏乳酸杆菌GL-104M 209138	15826±549
		负对照组(L.casei BCRC17001)	533±153
正对照组(PHA)	14560±1084
		负对照组(Cell only)	46±30

实施例3：抗过敏乳酸菌对促进细胞白介素12p40(IL-12p40)的分泌调控Th1型免疫能力的作用(以树突状细胞dendritic cell为体外功效验证平台)。

检视本发明所述的抗过敏乳酸菌菌株-罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株M209138对Th1型免疫能力的增进效果，其是测定人类树突状细胞(dendritic cell)与前述抗过敏乳酸菌共同培养后测定细胞白介素12p40(IL-12p40)的分泌量，来验证具有抗过敏能力的菌株。使用如下的实验步骤：

1.抽取适当人类血液量每次约200mL。

2.取等比例的血球分离液(Ficoll-paque)与血液在18-20℃以400g离心30-40分钟。

3.取人类外周血单个核细胞(PBMC)层，缓冲溶液清洗细胞2-3次后，以适当的培养基(例如RPMI-1640)悬浮细胞。

4.人类外周血单个核细胞(PBMC)细胞以CD14⁺microbeads(MiniMACSsystem)将细胞的CD14⁺单核球纯化。

5.以细胞激素(IL-4)及生长激素(GM-CSF)刺激细胞分化成树突状细胞，6-7天的培养时间，将已分化的树突状细胞收集。

6.将抗过敏乳酸菌菌株在共同培养之前3天活化，之后以100℃热致死乳酸菌菌株30分钟。

7.将树突状细胞与已热致死的乳酸菌株以1∶10比例共同培养48小时。

8.收取细胞培养的上清液。利用酶联免疫分析法(ELISA)侦测细胞白介素12p40(IL-12p40)在上清液中的含量。

数据的统计分析如表5及图3所示，以Mean±SD表示。图3所示为当分别以热致死10⁶至10⁸cfu罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株M 209138与10⁵至10⁷个人类树突状细胞共同培养48小时，收取细胞上清液，以酶联免疫分析法侦测细胞白介素12p40(IL-12p40)在上清液中的含量。其中以无抗过敏功能乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC 17001)以及实验背景值(Cell only)为负对照组，以发表多数文献证明其有抗过敏功效的乳酸菌(Lactobacillus rhamnosus GG BCRC16000)及LPS(Lipopolysaccharide)为正对照组，侦测细胞白介素12p40(IL-12p40)受刺激浓度。结果显示试验组可以显著的刺激人类树突状细胞分泌细胞白介素12p40(IL-12p40)与负对照组(Lactobacillus casei BCRC 17001)有显著性差异，并比正对照组(Lactobacillus rhamnosus GG BCRC 16000)的刺激量高出2倍。表5所示为分别以热致死抗过敏乳酸菌菌株以及对照组与树突状细胞培养，刺激细胞白介素12p40(IL-12p40)的分泌量(means±SD)：

表5

菌株名称	细胞白介素12p40的分泌量(pg/mL)
		正对照组(L.rhamnosus GG BCRC 16000)	6905±611
罗伊氏乳酸杆菌GL-104M 209138	14425±1741
		负对照组(L.casei BCRC17001)	51±2
正对照组(LPS)	22103±780
		负对照组(Cell only)	20±147

实施例4：抗过敏乳酸菌的耐胃酸胆盐试验。

检视本发明的抗过敏乳酸菌株-罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株M 209138是否具有通过胃酸胆盐考验的能力顺利在肠道发挥其抗过敏的功能，试验流程如下：

1.将本发明的抗过敏乳酸菌活化3天。

2.取1mL菌液计算原始菌数，剩余的乳酸菌以500g离心10分钟，加入去离子水清洗乳酸菌2-3次。

3.加入以盐酸调配成pH 2.5的培养基中，本发明的抗过敏乳酸菌与pH 2.5的培养基充分混合后，置于37℃培养箱。

4.每小时取出1mL的菌液以去离子水清洗2-3次后，计算存活细胞数，至3小时培养时间为止。

5.剩余菌液离心后沉淀物再以含1.5％(w/V)牛胆汁(ox gall，Sigma)的培养基中回溶，充分混合后，于37℃培养。

6.每小时取出1mL的菌液以去离子水清洗2-3次后，计算存活细胞数，至4小时培养时间为止。

7.记录乳酸菌生长速率，计算乳酸菌对胃酸与胆盐的耐受力，以比较样品中本发明的抗过敏乳酸菌在胃酸及胆盐存在下，菌株生长是否受到抑制。

耐胃酸的能力结果与分析整理于表6及图4所示，图4所示的结果显示，本发明的抗过敏乳酸菌在培养基活化后，将菌株处理酸性缓冲溶液及胆盐，罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株M 209138菌数并不受胃酸及胆盐的影响而急剧下降，证明本发明的抗过敏乳酸菌可以通过人体消化***严格环境的考验。表6为以pH值2.5的盐酸与本发明的抗过敏乳酸菌混合测验其耐胃酸能力(Logmeans±Log SD)：

表6

菌株名称	原始菌数(Logcfu/mL)	pH2.5-1hr(Logcfu/mL)	pH2.5-2hr(Logcfu/mL)	pH2.5-3hr(Logcfu/mL)
					罗伊氏乳酸杆菌M 209138	9.33±0.012	9.15±0.15	8.92±0.28	8.49±0.14

耐胆盐的能力结果与分析整理于表7及图4所示，表7为以1.5％的胆汁(bile)与本发明的抗过敏乳酸菌混合测验其耐胆盐能力(Log means±Log SD)：

表7

菌株名称	原始菌数(Logcfu/mL)	1.5％bile-1hr(Log	1.5％bile-2hr(Log	1.5％bile-3hr(Log	1.5％bile-4hr(Log
								cfu/mL)	cfu/mL)	cfu/mL)	cfu/mL)
罗伊氏乳酸杆菌M 209138	9.33±0.012	8.22±0.39	8.03±0.026	8.11±0.091	7.96±0.15

实施例5：抗过敏乳酸菌对人类肠道表皮细胞(Caco-2)的吸附能力试验。

在活体外采用已分化的细胞株分析本发明的抗过敏乳酸菌菌株吸附人类肠道表皮细胞(Caco-2)的能力。先由人类肠道表皮细胞(Caco-2)单层细胞株于盖玻片上生长至单层细胞后，置入多孔细胞培养盘中。然后将细胞：乳酸菌的比例为1∶200，共同培养1-3小时，以缓冲溶液清洗及利用甲醇固定细胞及剩余的附着菌数后，进行革兰氏染色并确定所附着的菌数。参考Jacobsen等学者(1999)的分析方法，在1000倍显微镜下计数20个视野，当每个视野的平均菌数少于40时，判定为不附着(nonadhesive)；当每个视野的平均菌数介于41至100时，判定为附着(adhesive)；当每个视野的平均菌数大于100时，判定为强烈附着(strongly adhesive)。

数据的统计分析以Mean±SD表示。平均来说，取45个视野的计算值，其结果整理于表8及图5。图5显示罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株M 209138判定为“强烈附着”。表8为本发明的抗过敏乳酸菌对人类肠道表皮细胞(Caco-2)细胞株的吸附能力试验。

表8

菌株名称	Means±SD
		罗伊氏乳酸杆菌M 209138	204±58

由于乳酸菌要发挥抗过敏的效果除了要找出具有特定功能的菌株外，更要确认该菌株能通过人体胃酸胆盐的环境外，还要能对小肠黏膜表皮细胞具有良好吸附能力的乳酸菌菌株，也因为此种特性，本发明的抗过敏乳酸菌才可以提供治疗或舒缓过敏症状的医疗用途。本发明所描述的抗过敏乳酸菌可同时增强Th1途径调控Th2过盛的过敏反应。本发明的一个目标就是继续朝向达成这些需求或至少提供大众在过敏治疗上除类固醇或是抗组织胺的的新选择，本发明找出对人体无副作用且有益健康的抗过敏乳酸菌来作为过敏治疗的新选择。

以上所述的实施例仅是为说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域熟练技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，当不能以之限定本发明的专利范围，即大凡依本发明所揭示的精神所作的均等变化或修饰，仍应涵盖在本发明的专利范围内。

Claims (6)

1.一种食品组合物，包含：

刺激免疫细胞分泌抗过敏相关细胞激素的乳酸菌菌株：罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)GL-104菌株，中国典型培养物保藏中心保藏号M 209138；以及

生理上可接受的赋形剂或稀释剂。

2.如权利要求1所述的食品组合物，其中该赋形剂或稀释剂为一种食品。

3.如权利要求2所述的食品组合物，其中该食品包含发酵乳、酸奶、奶酪、乳制饮品乳粉、茶、咖啡或以上的组合。

4.如权利要求1所述的食品组合物，其中该乳酸菌菌株为具有活性或去活性(inactivated)的菌株。

5.一种用于治疗过敏的医药组合物，包含：

刺激免疫细胞分泌抗过敏相关细胞激素的乳酸菌菌株：罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)GL-104菌株，中国典型培养物保藏中心保藏号M 209138；以及

医药上可接受的赋形剂或稀释剂。

6.如权利要求5所述的医药组合物，其中该乳酸菌菌株为具有活性或去活性(inactivated)的菌株。

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