CN101559088B - 穿心莲总内酯与新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了穿心莲总内酯与新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯的生产工艺，该工艺为先制备穿心莲茎叶提取物，经石油醚脱除叶绿素等脂溶性杂质，将其热溶于低级醇或含水低级醇，以活性炭回流脱色，析除大部分穿心莲内酯结晶后，经过氧化铝柱或碱洗脱去黄酮类，得到穿心莲总内酯，将其以三氯甲烷或二氯甲烷***2-4次，过滤，得滤液与不溶物两部分，滤液浓缩，经溶剂结晶与重结晶，或柱层析分离分别得到脱水穿心莲内酯与去氧穿心莲内酯纯品。不溶物经溶剂结晶与重结晶或柱层析分离分别得到新穿心莲内酯及穿心莲内酯纯品。本发明生产设备简单，工艺路线简化易操作，可实现大批量工业化生产，所得穿心莲总内酯中新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及去氧穿心莲内酯所占比例高，杂质含量少。所得新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及去氧穿心莲内酯单体纯度均达98％以上，可作为中药化学对照品使用，或作为医药及化工原料应用。
Description
技术领域
本发明涉及中草药提取与分离，更确切地说涉及新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及去氧穿心莲内酯的生产工艺。
背景技术
穿心莲又名一见喜，为爵床科植物穿心莲Andrographis Paniculata(Burm.f.)Nees的干燥地上部分。原产印度，我国华东、中南等地区均有栽培。性苦，寒，归心、肺、大肠、膀胱经。具有清热解毒、凉血、消肿止痛等功效。临床主要用于感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，顿咳劳嗽，泄泻痢疾，热淋涩痛，痈肿疮疡，毒蛇咬伤等证。
穿心莲的主要成分含有二萜内酯与黄酮类化合物。二萜内酯类主要为穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、新穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯，其中以穿心莲内酯含量最高，占1.5％以上。穿心莲内酯因在药材中含量高而易提取，故对穿心莲内酯的研究较深入。
现代药理研究表明，穿心莲内酯及其衍生物具有抗炎抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、治疗心脑血管疾病、保肝利胆等作用。新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及去氧穿心莲内酯因在药材中含量较低，常规提取方法不易大量提取，故对其研究相对较少，但因其与穿心莲内酯结构相近，故药理活性相近。
如均具有一定的抗炎抗菌、抗病毒活性；中国专利申请CN1511522的专利“穿心莲二萜内酯在抑制血管生成中的应用”公开了包括穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和新穿心莲内酯在内的穿心莲二萜内酯化合物具有抑制血管生成的作用，可以作为制备抑制血管生成的治疗和预防药物应用。又因结构上的差异，有的方面表现出更强的活性或不同于穿心莲内酯的新的药理作用。
如穿心莲内酯与新穿心莲内酯对卡介苗(BCG)诱导的小鼠腹膜巨噬细胞经脂多糖(LPS)刺激产生NO的抑制作用试验显示：口服新穿心莲内酯(5、25mg/kg)对NO产生的抑制率分别为35％、40％，而口服相同剂量的穿心莲内酯不抑制NO产生，该结果提示新穿心莲内酯在穿心莲抗炎作用中起关键作用{Biol Pharm Bull，2002，25(9)，1169～1774}。
另外有研究发现新穿心莲内酯具有治疗中暑的作用{中国工业医学杂志，2007，20(1)，36～37}。然而目前穿心莲总内酯与新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯的生产工艺却存在很多缺陷。
如目前临床主要应用穿心莲粗提取物，主要通过水或醇类简单提取，含杂质很多，服用剂量大，且粗提取物有效成分含量以穿心莲内酯为主，其它内酯的含量很低，从而影响临床的疗效。现有穿心莲二萜单体成分分离比较常用的方法为将穿心莲内酯以乙醇提取，回收乙醇，经石油醚洗除叶绿素等脂溶性杂质，水液用氯仿振摇，放置过夜，水和氯仿层之间析出物分离新穿心莲内酯与穿心莲内酯，氯仿层用于分离脱水穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯(杨云等主编，天然药物化学成分提取与分离手册(修订版)，中国中医药出版社，582～583)。首先该方法大量使用有毒试剂氯仿萃取，不利于操作人员的劳动保护，环境污染严重，其次，用氯仿萃取时乳化严重，需长时间静置，生产效率低下，另外二萜内酯与黄酮等成分并存，相互助溶，该方法提取很不完全，收得率很低。
中国专利申请CN1962650的专利“一种高纯度脱水穿心莲内酯的制备方法”公开了高纯度脱水穿心莲内酯的制备方法，将穿心莲用乙醇热浸提取，过滤，过大孔吸附树脂柱，收集有效洗脱液，洗脱液浓缩后真空干燥，得干粉，用甲醇溶解，装入硅胶柱，用氯仿和甲醇混合溶剂洗脱，收集有效成份的洗脱液后浓缩，用乙醇结晶，重结晶，得高纯度的脱水穿心莲内酯。该方法经大孔吸附树脂除杂后仍混有不少杂质，直接上硅胶柱层析，使用溶剂量大，分离工艺复杂，且采用有毒试剂氯仿和甲醇作为洗脱剂，同样不利于操作人员的劳动保护及环境保护。现有的生产工艺缺点使得目前市场上高纯度的新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及去氧穿心莲内酯难以买到，无法满足药理活性的筛选和临床应用的需求。
发明内容
本发明目的是：由于穿心莲提取物及新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及去氧穿心莲内酯存在很强的药理活性，临床应用与实验研究均需要大量的高品质穿心莲总内酯及各单体纯品，然而目前的生产工艺存在不少缺点，不能满足需求，故寻找一种工艺简便，适合工业化批量生产的生产工艺极为重要。
本发明的技术方案是：通过以下步骤实现
1、通过常规提取方法，包括采用乙醇等溶剂冷浸、热浸或渗漉等方法对穿心莲茎叶进行提取，回收乙醇制备含穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及去氧穿心莲内酯的提取物，并用石油醚脱除叶绿素等脂溶性杂质。
2、上述所得脱叶绿素提取物热溶于含C1-C5的低级醇或含水低级醇，以活性炭回流脱色，趁热过滤，回收溶剂至适量，缓慢加水适量，放置，析出大部分穿心莲内酯结晶，过滤，母液浓缩，放置，再析出小部分穿心莲内酯结晶，过滤，滤液回收溶剂至干，得浸膏。
3、上述所得浸膏溶于有机溶剂，包括低级醇或含水低级醇，乙酸乙酯、乙酸丁酸，乙酸甲酯、丙酮、含水丙酮、乙酸乙酯-石油醚混合液、乙酸丁酯-石油醚混合液。过氧化铝柱，有机溶剂洗脱，洗脱液浓缩，得脱黄酮杂质浓缩物。或溶于脂溶性溶剂，如乙酸乙酯，乙酸丁酸，正丁醇、乙酸乙酯-石油醚混合液、乙酸丁酯-石油醚混合液等，弱碱洗去黄酮杂质，Nacl溶液或水洗涤，溶剂浓缩，得脱黄酮杂质浓缩物。或溶于脂溶性溶剂，弱碱洗去黄酮杂质，Nacl溶液或水洗涤，溶剂浓缩，溶于有机溶剂，再过氧化铝柱，有机溶剂洗脱，洗脱液浓缩，得脱黄酮杂质浓缩物。
4、上述所得脱黄酮杂质浓缩物热溶于有机溶剂中，包括低级醇或含水低级醇，乙酸乙酯、乙酸丁酸，乙酸甲酯、丙酮、含水丙酮、乙酸乙酯-石油醚混合液、乙酸丁酯-石油醚混合液，放冷析晶，过滤，得穿心莲总内酯。
5、上述所得的穿心莲总内酯以三氯甲烷或二氯甲烷***2-4次，过滤，得滤液与不溶物两部分。滤液浓缩，浓缩物主要为脱水穿心莲内酯与去氧穿心莲内酯，仅含微量穿心莲内酯与新穿心莲内酯，再经溶剂结晶与重结晶，或柱层析分离分别得到脱水穿心莲内酯与去氧穿心莲内酯纯品。不溶物主要为穿心莲内酯与新穿心莲内酯混合物，仅含微量脱水穿心莲内酯与去氧穿心莲内酯，再经溶剂结晶与重结晶或柱层析分离分别得到新穿心莲内酯及穿心莲内酯纯品。
产品检测使用高效液相色谱仪，紫外检测器。C18-ODS柱；流动相：乙腈∶水(35∶65)；脱水穿心莲内酯检测波长：254nm；新穿心莲内酯与穿心莲内酯检测波长：225nm；去氧穿心莲内酯检测波长：205nm；流速：1.0ml/min。样品进样浓度约0.1mg/ml，进样量为10μl，穿心莲总内酯采用外标法进行定量分析。新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及去氧穿心莲内酯的纯度分析采用峰面积归一化法检测。
本发明的优点是：
1、本发明所得的穿心莲总内酯中新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及去氧穿心莲内酯所占比例高，三者总含量大于50％。总内酯中新穿心莲内酯、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及去氧穿心莲内酯的总量大于80％。
2、由于穿心莲茎叶提取物中穿心莲内酯占总内酯的主要成分，含量远高于其它内酯，故先分出提取物中的大部穿心莲内酯，有利于各单体分离的后续处理，可大大减少后续处理过程中的溶剂使用量，从而节约时间和成本。
3、穿心莲茎叶中含大量黄酮类化合物，本发明中将穿心莲茎叶提取物过氧化铝柱，或溶于脂溶性溶剂，弱碱洗，去除大部分黄酮杂质，有利于总内酯的析晶，对析出的总内酯即便采用结晶与重结晶等简化的处理方法便可得到各纯品。同已有方法相比，极大地简化了分离步骤，节约了时间和成本，提高了产品的收率。
4、本发明分离新穿心莲内酯、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及去氧穿心莲内酯的工艺，同现有柱层析和萃取分离方法相比，有害溶剂使用量少，有利于操作人员的劳动保护和环境保护。
5、本发明生产设备简单，工艺路线简化易操作，可实现大批量工业化生产。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
具体实施方式
实施例1 穿心莲总内酯的制备
取穿心莲茎叶粗粉2kg，用18倍量95％乙醇分2次热浸提取，回收乙醇浸提液，用水稀释至约4000ml，用石油醚6000ml分3次洗除叶绿素等脂溶性杂质，水溶液浓缩，将浓缩浸膏热溶于1500ml95％乙醇，以50g活性炭回流脱色，趁热过滤，回收乙醇至800ml，缓慢加水200ml，在加完水时应没有固体析出，放置，析出大部分穿心莲内酯结晶，过滤，母液浓缩至400ml，放置，再析出小部分穿心莲内酯结晶，过滤，滤液回收溶剂至干，得浸膏，将其加热溶于1000ml95％乙醇，再用95％乙醇1000ml稀释，此溶液冷却到室温后逐渐通过500克Al2O3短柱，溶液通过后，柱用1000ml95％乙醇洗涤，合并乙醇液，真空浓缩至干，加入200ml95％乙醇热溶，溶解后边加热边加入与乙醇相同体积的去离子水，在加完水时应没有固体析出。首先室温放置，然后转移至冰箱中过夜，待结晶完全析出，真空过滤，滤液浓缩至约200ml，同上法析晶，真空过滤，合并结晶，用50％乙醇重结晶，得穿心莲总内酯精品35.6g(滤液中仍可回收穿心莲总内酯)。
实施例2 三种穿心莲二萜内酯单体的分离
取实施例1中的穿心莲总内酯20g，研细，以三氯甲烷200ml***，过滤，不溶物分别再以三氯甲烷200ml、100ml***2次，过滤，合并三氯甲烷液，得三氯甲烷液与不溶物两部分。将三氯甲烷液回收至干，热溶于100ml95％乙醇，放置，析出去氧穿心莲内酯片状结晶，母液浓缩至60ml，放置，析出脱水穿心莲内酯针状结晶，余下母液继续适当浓缩交替析晶，合并去氧穿心莲内酯结晶，分别以乙醇、丙酮重结晶得纯品3.6g(滤液中仍可回收去氧穿心莲内酯)。合并脱水穿心莲内酯结晶分别以乙酸乙酯与50％乙醇重结晶得纯品3.2g(滤液中仍可回收脱水穿心莲内酯)。将不溶物热溶于100ml95％乙醇，放置，析出新穿心莲内酯棱状结晶，母液浓缩至80ml，放置，析出穿心莲内酯四方型结晶，余下母液继续适当浓缩交替析晶，合并新穿心莲内酯结晶，以乙醇重结晶得纯品4.5g(滤液中仍可回收新穿心莲内酯)。
实施例3 穿心莲总内酯的制备
取穿心莲茎叶粗粉1kg，用15倍量95％乙醇分2次冷浸提取，每次24小时，回收乙醇浸提液，用水稀释至约2000ml，用石油醚3000ml分3次洗除叶绿素等脂溶性杂质，水溶液浓缩，将浓缩浸膏热溶于1000ml甲醇，以30g活性炭回流脱色，趁热过滤，回收甲醇至约500ml，缓慢加水100ml，在加完水时应没有固体析出，首先室温放置，然后转移至冰箱中过夜，待穿心莲内酯结晶完全析出，真空过滤，滤液浓缩至约350ml，同上法放置，继续析出少量穿心莲内酯结晶，真空过滤，滤液回收溶剂至干，得浸膏，将其热溶于1500ml乙酸乙酯，冷却到室温后逐渐通过300克Al2O3短柱，溶液通过后，柱用1000ml乙酸乙酯洗涤，合并乙酸乙酯，真空浓缩至干，加入200ml丙酮热溶，溶解后边加热加入与丙酮相同体积的去离子水，在加完水时应没有固体析出。首先室温放置，然后转移至冰箱中过夜，待结晶完全析出，真空过滤，滤液浓缩至约200ml，同上法析晶，真空过滤，合并结晶，将其溶于50％丙酮重结晶，得穿心莲总内酯精品20.2g(滤液中仍可回收穿心莲总内酯)。
实施例4 三种穿心莲二萜内酯单体的分离
取实施例3中的穿心莲总内酯15g，研细，以二氯甲烷15ml***，过滤，不溶物分别再以二氯甲烷200ml、100ml***2次，过滤，合并二氯甲烷液，得二氯甲烷液与不溶物两部分。将二氯甲烷液回收至干，以50ml丙酮溶解，将其与10克硅胶(100-200目)拌样，于旋转蒸发仪上蒸干溶剂，取出，60℃干燥，研细，备用。另取200-300目的硅胶200g，与石油醚(60～90°)搅拌均匀，搅除气泡后湿法装柱，用石油醚(60～90°)洗脱平衡，上样，用石油醚(60～90°)/醋酸乙酯梯度洗脱，硅胶薄层层析跟踪检测，点样于以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF254薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯(4∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，相同流份合并，所得去氧穿心莲内酯用丙酮结晶与重结晶，得片状结晶纯品2.8g(滤液中仍可回收去氧穿心莲内酯)，脱水穿心莲内酯用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂结晶与重结晶，得针状结晶纯品2.4g(滤液中仍可回收脱水穿心莲内酯)。将不溶物热溶于80ml95％乙醇，放置，析出新穿心莲内酯棱状结晶，母液浓缩至50ml，放置，析出穿心莲内酯四方型结晶，余下母液继续适当浓缩交替析晶，合并新穿心莲内酯结晶，以乙醇重结晶得纯品3.2g(滤液中仍可回收新穿心莲内酯)。
实施例5 穿心莲总内酯的制备
取穿心莲茎叶粗粉1kg，用15倍量95％乙醇浸泡24小时后渗漉，回收乙醇浸提液，用水稀释至约2000ml，用石油醚3000ml分3次洗除叶绿素等脂溶性杂质，水溶液浓缩，将浓缩浸膏热溶于1000m95％乙醇，以30g活性炭回流脱色，趁热过滤，回收乙醇至约500ml，缓慢加水100ml，在加完水时应没有固体析出，首先室温放置，然后转移至冰箱中过夜，待穿心莲内酯结晶完全析出，真空过滤，滤液浓缩至约350ml，同上法放置，继续析出少量穿心莲内酯结晶，真空过滤，滤液回收溶剂至干，得浸膏，将其热溶于1000ml正丁醇，冷却到室温后逐渐通过300克Al2O3短柱，溶液通过后，柱用1000ml正丁醇洗涤，合并正丁醇液，真空浓缩至干，加入200ml甲醇热溶，溶解后边加热加入与甲醇相同体积的去离子水，在加完水时应没有固体析出。首先室温放置，然后转移至冰箱中过夜，待结晶完全析出，真空过滤，滤液浓缩至约200ml，同上法析晶，真空过滤，合并结晶，将其热溶于50％乙醇中，放冷至析晶完全，过滤，得穿心莲总内酯精品18.9g(滤液中仍可回收穿心莲总内酯)。
实施例6 三种穿心莲二萜内酯单体的分离
取实施例5中的穿心莲总内酯15g，研细，以二氯甲烷150ml***，过滤，不溶物分别再以二氯甲烷150ml、100ml***2次，过滤，合并二氯甲烷液，得二氯甲烷液与不溶物两部分。将二氯甲烷液回收至干，以50ml丙酮溶解，将其与10克硅胶(100-200目)拌样，于旋转蒸发仪上蒸干溶剂，取出，60℃干燥，研细，备用。另取200-300目的硅胶200g，与石油醚(60～90°)搅拌均匀，搅除气泡后湿法装柱，用石油醚(60～90°)洗脱平衡，上样，用石油醚(60～90°)/醋酸乙酯，梯度洗脱，硅胶薄层层析跟踪检测，点样于以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF254薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯(4∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，相同流份合并，所得去氧穿心莲内酯用丙酮结晶与重结晶，得片状结晶纯品2.3g(滤液中仍可回收去氧穿心莲内酯)，脱水穿心莲内酯用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂结晶与重结晶，得针状结晶纯品1.9g(滤液中仍可回收脱水穿心莲内酯)。将不溶物用50ml95％乙醇加热溶解，将其与10克中性氧化铝(100-200目)拌样，于旋转蒸发仪上蒸干溶剂，取出，60℃干燥，研细，备用。另取150g中性氧化铝(100-200目)，与二氯甲烷搅拌均匀，搅除气泡后湿法装柱，用二氯甲烷洗脱平衡，上样，用二氯甲烷/无水乙醇梯度洗脱，硅胶薄层层析跟踪检测，点样于以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF254薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯(4∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，相同流份合并，所得新穿心莲内酯用乙醇结晶与重结晶，得棱柱状结晶纯品2.6g(滤液中仍可回收新穿心莲内酯)。
实施例7 穿心莲总内酯的制备
取穿心莲茎叶粗粉1.5kg，用15倍量95％乙醇浸泡24小时后渗漉，回收乙醇浸提液，用水稀释至约3000ml，用石油醚4500ml分3次洗除叶绿素等脂溶性杂质，水溶液浓缩，将浓缩浸膏热溶于1500m95％乙醇，以30g活性炭回流脱色，趁热过滤，回收乙醇至约800ml，缓慢加水200ml，在加完水时应没有固体析出，首先室温放置，然后转移至冰箱中过夜，待穿心莲内酯结晶完全析出，真空过滤，滤液浓缩至约500ml，同上法放置，继续析出少量穿心莲内酯结晶，真空过滤，滤液回收溶剂至干，得浸膏，将其热溶于1500ml正丁醇，冷却到室温后用5％NaHCO3洗涤2次，每次1000ml，再用1％Nacl水溶液洗涤1次，考虑到NaHCO3与Nacl水溶液可能会带去内酯，继而用正丁醇洗涤一次NaHCO3与Nacl水溶液，合并正丁醇液，真空浓缩至干，加入300ml95％醇热溶，溶解后边加热加入与乙醇相同体积的去离子水，在加完水时应没有固体析出。首先室温放置，然后转移至冰箱中过夜，待结晶完全析出，真空过滤，滤液浓缩至约400ml，同上法析晶，真空过滤，合并结晶，将其热溶于50％乙醇中，放冷至析晶完全，过滤，得穿心莲总内酯精品30.8g(滤液中仍可回收穿心莲总内酯)。
实施例8 三种穿心莲二萜内酯单体的分离
取实施例7中的穿心莲总内酯20g，研细，以三氯甲烷200ml***，过滤，不溶物分别再以三氯甲烷150ml、100ml***2次，过滤，合并三氯甲烷液，得三氯甲烷液与不溶物两部分。将三氯甲烷液回收至干，以100ml丙酮溶解，将其与10克中性氧化铝(100-200目)拌样，于旋转蒸发仪上蒸干溶剂，取出，60℃干燥，研细，备用。另取200-300目的中性氧化铝200g，与石油醚(60～90°)搅拌均匀，搅除气泡后湿法装柱，用石油醚(60～90°)洗脱平衡，上样，用石油醚(60～90°)/丙酮梯度洗脱，硅胶薄层层析跟踪检测，点样于以羧甲纤维素钠为黏合剂的硅胶GF254薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯(4∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，相同流份合并，所得去氧穿心莲内酯用丙酮结晶与重结晶，得片状结晶纯品3.1g(滤液中仍可回收去氧穿心莲内酯)，脱水穿心莲内酯用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂结晶与重结晶，得针状结晶纯品2.7g(滤液中仍可回收脱水穿心莲内酯)。将不溶物热溶于100ml95％乙醇，放置，析出新穿心莲内酯棱状结晶，以乙醇重结晶得纯品4.5g(滤液中仍可回收新穿心莲内酯)。
实施例9 穿心莲总内酯的制备
取穿心莲茎叶粗粉2kg，用15倍量95％乙醇分2次热浸提取，回收乙醇浸提液，用水稀释至约4000ml，用石油醚6000ml分3次洗除叶绿素等脂溶性杂质，水溶液浓缩，将浓缩浸膏热溶于1500m95％乙醇，以50g活性炭回流脱色，趁热过滤，回收乙醇至约1000ml，边加热边缓慢加水300ml，在加完水时应没有固体析出，首先室温放置，然后转移至冰箱中过夜，待穿心莲内酯结晶完全析出，真空过滤，滤液浓缩至约800ml，同上法放置，继续析出少量穿心莲内酯结晶，真空过滤，滤液回收溶剂至干，得浸膏，将其热溶于3000ml乙酸乙酯，冷却到室温后用5％Na2CO3洗涤2次，每次2000ml，再用1％Nacl水溶液洗涤1次，考虑到Na2CO3与Nacl水溶液可能会带去内酯，继而用乙酸乙酯洗涤一次Na2CO3与Nacl水溶液，合并乙酸乙酯液，真空浓缩至干，加入400ml95％醇热溶，溶解后边加热加入与乙醇相同体积的去离子水，在加完水时应没有固体析出。首先室温放置，然后转移至冰箱中过夜，待结晶完全析出，真空过滤，滤液浓缩至约400ml，同上法析晶，真空过滤，合并结晶，将其热溶于50％乙醇重结晶，得穿心莲总内酯精品38.3g(滤液中仍可回收穿心莲总内酯)。
实施例10 三种穿心莲二萜内酯单体的分离
取实施例9中的穿心莲总内酯30g，研细，以二氯甲烷300ml***，过滤，不溶物分别再以二氯甲烷200ml、100ml***2次，过滤，合并二氯甲烷液，得二氯甲烷液与不溶物两部分。将二氯甲烷液回收至干，热溶于150ml60％乙醇，放置，析出去氧穿心莲内酯片状结晶，母液浓缩至100ml，放置，析出脱水穿心莲内酯针状结晶，去氧穿心莲内酯分别以80％乙醇、丙酮重结晶得纯品4.0g(滤液中仍可回收去氧穿心莲内酯)。脱水穿心莲内酯结晶分别以乙酸乙酯与30％乙醇重结晶得纯品3.8g(滤液中仍可回收脱水穿心莲内酯)。将不溶物热溶于150ml95％乙醇，放置，析出新穿心莲内酯棱状结晶，母液浓缩至80ml，放置，析出穿心莲内酯四方型结晶，新穿心莲内酯以乙醇重结晶得纯品5.6g(滤液中仍可回收新穿心莲内酯)。
实施例11 穿心莲总内酯的制备
取穿心莲茎叶粗粉2kg，用16倍量95％乙醇分2次冷浸提取，回收乙醇浸提液，用水稀释至约4000ml，用石油醚4000ml分2次洗除叶绿素等脂溶性杂质，水溶液浓缩，将浓缩浸膏热溶于1500m95％乙醇，以50g活性炭回流脱色，趁热过滤，回收乙醇至约1000ml，边加热边缓慢加水300ml，在加完水时应没有固体析出，首先室温放置，然后转移至冰箱中过夜，待穿心莲内酯结晶完全析出，真空过滤，滤液浓缩至约800ml，同上法放置，继续析出少量穿心莲内酯结晶，真空过滤，滤液回收溶剂至干，得浸膏，将其热溶于2000ml乙酸丁酯，冷却到室温后用5％NaHCO3洗涤2次，每次1500ml，再用去离子水洗涤1次，考虑到Na2CO3与水溶液可能会带去内酯，继而用乙酸丁酯洗涤一次NaHCO3与水溶液，合并乙酸丁酯液，真空浓缩至干，将其加热溶于1000ml95％乙醇，再用95％乙醇1000ml稀释，此溶液冷却到室温后逐渐通过500克Al2O3短柱，溶液通过后，柱用1000ml95％乙醇洗涤，合并乙醇液，真空浓缩至干，加入1500ml乙酸乙酯热溶，溶解后边加热加入500ml石油醚，在加完石油醚时应没有固体析出。首先室温放置，然后转移至冰箱中过夜，待结晶完全析出，真空过滤，滤液浓缩至约1500ml，同上法析晶，真空过滤，合并结晶，用乙酸乙酯重结晶，得穿心莲总内酯精品52.9g(滤液中仍可回收穿心莲总内酯)。
实施例12三种穿心莲二萜内酯单体的分离
取实施例11中的穿心莲总内酯40g，研细，以三氯甲烷300ml***，过滤，不溶物分别再以三氯甲烷200ml、150ml***2次，过滤，合并三氯甲烷液，得三氯甲烷液与不溶物两部分。将三氯甲烷液回收至干，热溶于100ml丙酮，放置，析出去氧穿心莲内酯片状结晶，母液浓缩至50ml，放置，析出脱水穿心莲内酯针状结晶，去氧穿心莲内酯结晶分别以丙酮重结晶得纯品7.6g(滤液中仍可回收去氧穿心莲内酯)。脱水穿心莲内酯结晶分别以乙酸乙酯与50％丙酮重结晶得纯品4.8g(滤液中仍可回收去氧穿心莲内酯)。将不溶物热溶于200ml95％乙醇，放置，析出新穿心莲内酯棱状结晶，以乙醇及丙酮重结晶得纯品8.1g(滤液中仍可回收去氧穿心莲内酯)。
实施例13产品检测
使用岛津高效液相色谱仪，LC-10ATvp溶剂输送泵，SPD-10Avp紫外-可见检测器。HW-2000色谱工作站(上海千谱软件有限公司)。色谱柱：Shim-pack VP-ODS柱(150×4.6mm，5μm)；乙腈∶水(35∶65)；脱水穿心莲内酯检测波长：254nm；新穿心莲内酯与穿心莲内酯检测波长：225nm；去氧穿心莲内酯检测波长：205nm；流速：1.0ml/min；灵敏度：0.02AUFS。样品进样浓度约0.1mg/ml，进样量为10μl，穿心莲总内酯采用外标法进行定量分析，结果见表1。新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及去氧穿心莲内酯的纯度分析采用峰面积归一化法检测，结果见表2。
表1、穿心莲总内酯中各单体的含量检测结果
表2、三种穿心莲二萜内酯单体的纯度检测结果
Claims (2)
1.一种穿心莲总内酯的生产工艺，包括以下步骤：
(1)通过乙醇冷浸或热浸或渗漉提取制备含穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及去氧穿心莲内酯的穿心莲茎叶提取物，并用石油醚脱除叶绿素等脂溶性杂质；
(2)上述所得脱叶绿素提取物热溶于C1-C5的低级醇或C1-C5的含水低级醇，以活性炭回流脱色，趁热过滤，回收溶剂至适量，缓慢加水适量，放置，析出大部分穿心莲内酯结晶，过滤，母液浓缩，放置，再析出小部分穿心莲内酯结晶，过滤，滤液回收溶剂至干，得浸膏；
(3)上述所得浸膏溶于有机溶剂，过氧化铝柱，用有机溶剂洗脱，洗脱液浓缩，得脱黄酮杂质浓缩物；
或溶于脂溶性溶剂，弱碱洗去黄酮杂质后，Nacl溶液或水洗，溶剂浓缩，得脱黄酮杂质浓缩物；
或溶于脂溶性溶剂，弱碱洗去黄酮杂质后，Nacl溶液或水洗，溶剂浓缩，溶于有机溶剂，过氧化铝柱，用有机溶剂洗脱，洗脱液浓缩，得脱黄酮杂质浓缩物；
(4)上述所得脱黄酮杂质浓缩物热溶于有机溶剂中，放冷析晶，过滤，得穿心莲总内酯；
以上各步骤中有机溶剂选自C1-C5的低级醇、C1-C5的含水低级醇、乙酸乙酯、乙酸丁酸、乙酸甲酯、丙酮、含水丙酮、乙酸乙酯-石油醚混合液和乙酸丁酯-石油醚混合液；脂溶性溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丁酸、正丁醇、乙酸乙酯-石油醚混合液和乙酸丁酯-石油醚混合液。
2.一种基于权利要求1的工艺获得新穿心莲内酯或脱水穿心莲内酯或去氧穿心莲内酯的生产工艺，包括：
A)按照权利要求1的工艺步骤获得穿心莲总内酯；
B)将步骤A)所得的穿心莲总内酯以三氯甲烷或二氯甲烷***2-4次，过滤，得滤液与不溶物两部分；滤液浓缩，浓缩物经溶剂结晶与重结晶，或通过柱层析分离分别得到脱水穿心莲内酯与去氧穿心莲内酯纯品；或不溶物经溶剂结晶与重结晶或柱层析分离分别得到新穿心莲内酯及穿心莲内酯纯品。
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Denomination of invention: Production process of total andrographolide, neoandrographolide, dehydroandrographolide and deoxyandrographolide Effective date of registration: 20221019 Granted publication date: 20120725 Pledgee: Shanghai Bank Co.,Ltd. Suzhou Branch Pledgor: LEIYUNSHANG PHARMACEUTICAL GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2022320010593 |