DE2813021C2 - Antibiotika KA-6606 I, II, III und IV, diese Antibiotika enthaltende Mittel und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen - Google Patents

Antibiotika KA-6606 I, II, III und IV, diese Antibiotika enthaltende Mittel und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen

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DE2813021C2
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Kazuhiro Kamiya
Takafumi Kunieda
Toshimi Mizoguchi
Toshihito Mori
Masahito Higashimurayama Tokyo Nakayama
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Description

mit folgender Zuordnung der Bezeichnung und der Bedeutung von R:
KA-6606
II
IH
IV
-CO-CH2-NH2
-H
-CO-CH1-NH-CO-NH2
-CO-CH2-NH-CHO
30
3-5
und deren Säureadditionssalze.
2. Antibiotische Mittel, enthaltend mindestens eines der Antibiotika gemäß Anspruch 1 und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel oder einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
3. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man Saccharopolyspora hirsuta KC-6606 (FERM-P 3912) unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40° C kultiviert aus der Kulturbrühe das Antibiotika-Gemisch KA-6606 gewinnt, hieraus die Antibiotika KA-6606 I, II, III und/oder IV abtrennt und in an sich bekannter Weise gegebenenfalls in ein Säureadditiionssalz überführt.
4. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums KA-6606 II, dadurch gekennzeichnet, daß man eines der gemäß dem Verfahren nach Anspruch 3 erhaltenen Antibiotika KA-6606 I, III oder IV mit einem Alkali oder einer Säure in an sich bekannter Weise hydrolysiert.
Die Erfindung betrifft die Antibiotika KA-6606 I, II, III und IV, diese Antibiotika enthaltende Mittel und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen.
Es wurden verschiedene mikroorganismen aus Erde isoliert, um Antibiotika aufzufinden, die durch diese Mikroorganismen hergestellt werden. Auf diese Weise ist die Isolierung eines zu der Art Saccharopolyspora gehörenden, ein Antibiotikum erzeugenden Stammes aus der Erde in Kobe, Japan, gelungen. Aus den nachstehend beschriebenen bakteriologischen Eigenschaften wird geschlossen, daß es sich bei dem Stamm um eine natürliche Mutante von Saccharopolyspora hirsuta handelt. Der Stamm wurde daher als Saccharopolyspora hirsuta KC-6606 bezeichnet Der Stamm KC-6606 wurde unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 3912 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 20501 bei der American Type Culture Collection und unter der Hinterlegungsnummer DSM 1238 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Göttingen hinterlegt.
Es wurde bestätigt, daß die durch den Stamm KC-6606 erzeugten Antibiotika in der Literatur noch nicht beschrieben sind und daß sie eine antibakterielle Aktivität gegen grampositive Bakterien, gramnegative Bakterien und säurebeständige Bakterien haben. Diese Substanz wurde als Substanz KA-6606 bezeichnet Es wurde weiterhin festgestellt, daß durch Behandlung mit einer pharmazeutisch annehmbaren anorganischen uilei uiganischcr. Säure die r.sue aritibiotisch wirksame Substanz KA-6606 leicht in ein Antibiotikum in Form eines Säureadditionssalzes umgewandelt werden kann. Weitere Untersuchungen haben ergeben, daß die Sub-
bo stanz KA-6606 in vier Antibiotika, nämlich KA-6606 K KA-6606 II, KA-6606 III und KA-6606 IV, aufgetrennt werden, kann und daß die Substanzen KA-6606 I, KA-6606 III. und KA-6606 IV durch Behandlung mit Alkalien oder Säuren leicht in KA-6606 II umgewandelt wer-
65 den können.
Gegenstand der Erfindung sind die Antibiotika KA-6606 I, II, III und IV der allgemeinen Formel
CH
C—NH
NH2
NCH3 OCH3
mit folgender Zuordnung der Bei.: „hnung und der Bedeutung von R:
KA-6606
-CO-CH5-NH2
-H
-CO-CH2-NH-CO-NH2
-CO-CHj-NH-CHO
und deren Säureadditionssalze.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind antibiotische Mittel, enthaltend mindestens eines der obengenannten Antibiotika und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmitte! oder einen pharmazeutisch annehmbaren Träger sowie Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 1 genannten Antibiotika.
Bekannte Antibiotika, die den antibiotischen Substanzen KA-6606 der Formel I am ähnlichsten sind, sind Fortimicin A, B und C (vgl. die offengelegten Unterlagen der japanischen Patentanmeldungen 6487/78 [ofTengelegt am 20.1.1978], 29 789/75 [ofTengelegt am 25. 3. 1975], 145 588/75 [ofTengelegt am 21.11.1975], 18 888/77 [offengelegt am 12. 2. 1977] und 83 513/77 [ofTengelegt am 12. 7. 1977] sowie JP-PS 46 311/77 [ausgegeben am 24. ί I. 1977]). Fortimicin ist ein Antibiotikum, das durch den Stamm Micromonospora sp. MK-70 (FERM PNr. 1J60, ATCC 21819) gebildet wird. Es wird in »The Journal of Antibiotics«. Band XXX, Seiten 552 bis 563, beschrieben. Von der Substanz KA-6606 der oben angegebenen Formel I unterscheidet es sich durch >o eine unterschiedliche ehernsiche Struktur, da die Substanz KA-6606 in 2-StelIung keine Hydroxylgruppe aufweist und eine unterschiedliche Konfiguration der Aminogruppe in 1-Stellung besitzt.
Die erfindungsgemäße Substanz KA-6606 hat, wie π nacnstenena Geschrieben wird, eine bessere aniibakicrielle Aktivität als Fortimicin.
Die erfindungsgemäßen neuen Antibiotika können in der Weise hergestellt werden, daß man Saccharopolyspora hirsuta KC-6606 (FERM-P 3912) unter aeroben bo Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 20 bis 400C kultiviert, aus der Kulturbrühe das Antibiotika-Gemisch KA-6606 gewinnt, hieraus die Antibiotika KA-6606 I, II, IH und/oder IV abtrennt und in an sich bekannter Weise gegebenenfalls in ein Säureadditionssalz überführt.
Untenstehend wird riie taxonomische Charakterisierung von Saccharopolyspora hirsuta KC-6606 angegeben. Wenn nichts anderes angegeben ist dann wurden die Eigenschaften auf den verschiedenen Kulturmedien " durch übliche Methoden nach 21tägiger Kultivierung bei 27° C beobachtet. Die Farben wurden bei der reifen Kultur nach den Klassifizierungen von >K,u]or Harmony Manual« (Container Corp. Amer. 1958) ausgedrückt.
I. Morphologische Eigenschaften
Dieser Stamm bildet auf anorganische Salze/Stärke-Agarmedium Substrathyphen und Lufthyphen. Die Substrathyphen (Durchmesser 0,5 bis 0,7 μπι) breiten sich
ι in langen Zweigen aus. Sie sind miteinander in komplizierter Weise verschlungen, wobei sie gewöhnlich gestatten, daß einer, sehr selten 2 bis 3 substratsporenartige Körper (Durchmesser 0,8 bis 1,2 μΐη) an den Enden jeder Sporangiophore (Länge ungefähr 2,5 μπι)
ι haften. Gelegentlich wird in der Kolonie eine typische nokardioforme Fragmentierung gefunden. Die Lufthyphen (Durchmesser 0,6 bis 0,9 μίτι) sind kurz. Die reifen Sporen werden als Ketten mit 20 oder mehr Sporen beobachtet. Sie sind zu perlenartigen Ketten von
> Sporen segmentiert, die oftmals durch die Länge aer leeren Hyphen voneinander getrennt sind. Die Sporenketten werden als Schleifen und lockere Spiralen beobachtet. Die Sporen sind oval bis kurzzylindrisch (0,5 bis 0,6 um x 0,7 bis 0,9 μπι). Die Oberflächen der Sporen sind mit einer Hüüc mit haariger Struktur bedeckt.
II. Eigenschaften auf verschiedenen Medien
1. Saccharosenitratagar:
Wachstum: gut
Lufthyphen: gut. pulverförmig. Hülle rosa (5ba) Substrathyphen: butterartig, leicht gelbbraun bis rosenfarbig beige (3gc-4gc)
Lösliches Pigment: helirosa mit einem Stich gelbbraun
Wachstum: mäßig bis gut
Lufthyphen: gut, pulverförmig, weiß (a) Substrathyph« .i: butterartig, leicht elfenbeinfarbig (2ca)
Lösliches Pigment: hellgelb
3. Glucose-Asparaginagar (Schrägkulturt: Wachstum: mäßig
Lufthyphen: keine
Substrathyphen. butteraftig bis gelatinös, loblar-
ben (2fb)
Lösliches Pigment: leicht hellgelb
4. Glycerin-Asparaginagar (ISP-Medium Nr. 5)
Wachstum: mäßig
Lufthyphen: schlecht, pulverförmig, weiß (a) • Substrathyphen: gelatineartig, leicht elfenbeinfarben (2ca)
Lösliches Pigment: leicht hellgelb
5. Anorganische Sake-Stärkeagar (ISP-Medium Nr.4) Wachstum: gut
Lufthyphen: schlecht, pulverförmig, weiß (a) Substrathyphen: knorpelig, leicht elfenbeinfarben bis lohfarberi {2ca-2fb)
Löslichss Pigment: keines
6. Tyrosinagar (Schrägkultur, ISP-Medium Nr. 7): Wachstum: mäßig
Lufthyphen: gut, pulverförmig, weiß (a) Substrathyphen: bütterförmig bis gelatinös, leicht elfenbeinfarben bis lohfarben (2ca-2fb) Lösliches Pigment: leicht hellgelb
7. Nährmittelagar:
Wachstum: mäßig
Lufthyphen: keine
Substrathyphen: gelatinös, lohfarben (2fb) Lösliches Pigment: keines
8. Hefeextrakt-Malzextraktagar (ISP-Medium Nr.2): Wachstum: gut
Lufthyphen: spärlich, pulverförmig, weiß (a) Substrathyphen: gelatinös, bambusfarben (2g) Lösliches Pigment: hellgelb
9. Hafermehlagar (ISP-Medium Nr.3): Wachstum: schlecht
Lufthyphen: keine
Substrathyphen: farblos
Lösliches Pigment: keines
10. Pepton-Hefeextrakt-EisenagariSchrägkultur, ISP-Medium Nr. 6):
Wachstum: mäßig
Lufthyphen: schlecht, pulverförmig, weiß (a) Substrathyphen: butterartig bis gelatinös, leicht mefonengelb (2ea)
Lösliches Pigment: leicht hellgelb
11. Bennett's Agar:
Wachstum: gut
Lufthyphen: keine
Substrathyphen: gelatinös, leicht elfenbeinfarben (2ca)
Lösliches Pigment: leicht heilgelb
Wie oben beschrieben wurde, bildet der Stamm KC-6606 auf verschiedenen Agarmedien Substrathyphen und Lufthyphen. Die sporenartigen Substratkör*>er haften an den Substrathyphen. Die Sporenletten haften an den Substrathyphen« Die Substrathyphen fragmentieren gelegentlich zu stabförmigen Elementen. Die Oberflächen der Sporen sind mit einer Hülle mit haariger Struktur bedeckt.
Die Analyse der; Zellwandjzjigte^daß sie Mesodiami-
t(r nopimelinsäure und SÄrabinos& iund Galactose als Zucker enthielt Es wird daher angenommen, daß die Zellwand dieses Stamms vom Typ IV ist.
Die Analyse der Fettsäuren in der Zellwand zeigte, daß sie kein LCN-A (Lipidcharakteristikum von Nokardia) enthält.
Bekannte Stämme mit diesen Charakteristiken sind im Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage (1975) aufgesucht worden. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Art Mikropolyspora eine ähnliehe Art ist. Auch die Art Saccharopolyspora, die von Lacey und Goodfellow (Journal of General Microbiology, Band 88, Seite 75,1975) beschrieben wurde, kann als ähnlicher Stamm angeführt werden. Der erfindungsgemäß verwendete Stamm unterscheidet sich von den Stämmen der Art Mikropolyspora darin, daß er in den Sporen eine haarige Struktur hat und daß die Sporenketten mehr als 20 Sporen enthalten. Er ist jedoch hinsichtlich seiner in'orphologie letzterem ähnlich. Dies führt zu der Annahme, daß der Stamm KC-6606 zu der Art
so Saccharopolyspora gehört. Es gibt noch keine eingeführte Methode zur systematischen Klassifizierung der Art Saccharopolyspora, da nur eine Spezie einer Art berichtet worden ist
Die Unterschiede zwischen dem Stamm KC-6606 und Saccharopolyspora hirsuta sind in Tabelle I zusammengestellt:
Tabelle I
KC-6606
Saccharopolyspora hirsuta
III. Physiologische Eigenschaften
1. Wachstumstemneratur: 18 bis 45°C
2. Verflüssigung von Gelatine: positiv
3. Hydrolyse von Stärke: positiv
4. Einwirkung auf Milch:
Koagulierung: negativ
Peptonisierung: positiv
5. Erzeugung von Melanoidpigment: Negativ in Tyrosinagar und in Pepton-Eisen-Hefeextraktagar
6. Bildung von Nitrit aus Nitrat und seine Ansammlung: positiv
IV. Verwertung von Kohlenstoffquellen
Positiv:
D-Glucose, D-Fructose, Raffinose, Saccharose, D-Marjnit, Galactose, Inulin und Salicin.
Negativ:
L-Arabinose, D-Xylose, Inosit, L-Rhamnose, Sorbit, Lactose und Dulcit
Verwertung von Zuckern
Xylose - +
Rhamnose - +
Sorbit - +
^0 Inosit - +
Erzeugung und Akkumulierung von Nitrit + -
Da der Stamm KC-6606 und Saccharopolyspora hirsuta einander in den Grundeigenschaften, wie der Morphologie, der Eigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien und den physiologischen Eigenschaften, entsprechen, jedoch hinsichtlich der Verwertung von Kohlenstoffquellen und der Bildung und Ansammlung von Nitrit sich unterscheiden, kann davon ausgegangen werden, daß diese Stämme zu der gleichen Spezies gehören.
Aufgrund dieser Umstände wird von den Erfindern der fragliche Stamm als natürlicheMutante von Saccharopolyspora angesehen. Er wurde als Stamm Saccharopolyspora hirsuta KC-6606 bezeichnet Der erfindungsgemäß verwendete Stamm von Saccharopolyspora hirsuta ist gegenüber einer Veränderung seiner Charakteri-
stiken empfindlich. Er kann leicht durch künstliche Mutationsmaßnahmen, wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, verschiedene Chemikalien; wie Nitrosoguanidine oder Mitomycin etc., mutiert werden. Alle solche Mutanten, die die Fähigkeit haben, das Antibiotikum KA-6606 zu erzeugen, können fur die Zwecke der Erfindung verwendet werden. Bei dieser Gelegenheit wirb Jarauf hingewiesen, daß die Fähigkeit von Stämmen von Saccharopolyspora,hirsute, Antibiotika zu erzeugen, bislang noch nicht beschrieben wurde.
Geeignete Kulturmedien fur die Fermentation des die Substanz KA-6606 erzeugenden Stamms der Art Satcharopolyspora enthalten Kohlenstoff- und StickstofTquellen und als fakultative Bestandteile anorganische Salze (Mineralien), sehr kleine Mengen von Schwermetallen etc.
Es können verschiedene Kohlenstoffquellen verwendet werden. Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Stärke, Glycerin, Maltose, Dextrin, Saccharose, Fructose und Molassen, die entweder allein oder als geeignete Gemische verwendet werden können. Kohlenwasserstoffe, organische Säuren und Pflanzenöle können ebenfalls verwendet werden, wenn der jeweilige Stamm sie als Kohlenstoffquelle verwerten kann. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellflüssigkeit, Casamino-Säure, lösliches Destillationsprodukt, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff und Natriumnitrat. Diese Substanze können entweder für sich oder als geeignete Gemische verwendet werden. Beispiele für geeignete anorganische Salze sind Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumchlorid, Calciumcarbonat. Calciumhydroxid, Kobalt(III)-chlorid, Zinksulfat, Eisen(III)-chlorid und Eisen(IIVsulfat
Anorganische Substanzen und organische Substanzen (z. B. Aminosäuren), die das Wachstum des Stammes unterstützen und die Bildung der Substanz KA-6606 fördern, können erforderlichenfalls ebenfalls zu dem Kulturmedium gegeben werden. Wenn eine Belüftungskultrviepjngsmethode angewendet wird, dann können zu dem Kulturmedium auch Antischaummittel, wie z. B. Fettsäureöle, Siliconöle und Paraffine, zugesetzt werden.
Die Kultivierung kann in einem festen Medium durchgeführt werden. Vorzugsweise wird jedoch, wie bei dem allgemeinen Herstellungsverfahren für Antibiotika, ein flüssiges Kultivierungsverfahren, insbesondere ein Tauchkultivierungsverfahren, angewendet. Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die Kuitivierungstemperaiur beträgt im allgemeinen etwa 20 bis etwa 400C, vorzugsweise etwa 27°C. Vorzugsweise wird während der Kultivierung der pH-Wert des Kulturmediums bei etwa 4 bis etwa 20 gehalten. Die Kultivierungsperiode beträgt im allgemeinen etwa 2 bis etwa 6 Tage.
Als Ergebnis der Kultivierung wird die Substanz KA-6606 erzeugt und diese sammelt sich in der Kulturbrühe an. Wenn die in der Kulturbrühe erzeugte Menge der Substanz KA-6606 ein Maximum erreicht, dann wird die Kultivierung abgebrochen und die Substanz KA-6606 kann aus der Kulturbrühe gesammelt werden.
Da die Substanz KA-6606 eine wasserlösliche basische Substanz ist, die in Wasser löslich ist, jedoch in üblichen organischen Lösungsmitteln nur geringfügig: löslich ist, kann sie aus der Kulturbrühe durch übliche Maßnahmen zur Isolierung und Reinigung von wasserlöslichen basischen Antibiotika abgetrennt werden.
So kann z. B. ein Adsorptions-Desorptions-Verfahren unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes, von Aktivkohle, Cellulose, Silicagel, Aluminiumoxid oder ein Verfahren zur Extraktion mit Butanol, Amylalkohol unter Verwendung einer höheren Fettsäure als Adjuvans angewendet werden.
Wenn z. B. das Filtrat der Kulturbrühe in eine Säule aus einem schwach sauren Kationenaustauscherharz eingegeben wird, dann wird die Substanz KA-6606 dar-"auf adsorbiert. Die Substanz KA-6606 wird sodann durch Elution mit 0,1 bis 3,0 n-Alkali oder Säure oder mit verschiedenen Salzlösungen isoliert. Das resultierende aktive Eluat wird Iyophilisiert, wodurch ein rohes Pulver der Substanz KA-6606 erhalten wird.
Beispiele für schwach saure Kationenaustauscherharze, die zur Gewinnung der Substanz KA-6606 verwendet werden können, sind Amberlite® IRC-50, IRC-84 und CG-50 und Diaion® WK-10 und WK-20 Alkalien, die für die Elution verwendet werden können, sind
z. B. eine Ammoniumhydroxidlösung und eine wäßrige Natriumhydroxidlösung. Beispiele für geeignete Säuren sind Ameisensäure, Salzsäure und Schwefelsäure. Die Salzlösungen können z. B. eine Lösung von Am ioniumcarbonat oder eine Lösung von Ammoniumformiat sein. Ein weiteres Beispiel einer g^signeten Gewinnungsmethode ist ein Verfahren, bei dem man den pH-Wert des Filtrats der Kulturbrühe auf 7 bis 9 einstellt, das Filtrat mit Aktivkohle kontaktiert, damit das KA-6606 auf der Aktivkohle adsorbiert wird, und die Substanz mit saurem Wasser oder Salzsäure/Methanol eluiert.
Die Substanz KA-6606, die nach den oben beschriebenen Methoden isoliert werden kann, kann in KA-6606 I, II, III und IV aufgetrennt werden, indem man sie in Wasser oder verdünntem Ammoniumhydroxid auflöst, in eine Säule eines Adsorptionsmittels., wie z. B. eines schwach sauren Ionenaustauscherharzes des oben beschriebenen Typs oder eines schwach sauren Ionenaustauschers, z. B. von CM-Sephadexe oder CM-CeHulose, einbringt, damit die Substanz an dem Adsorbens adsorbiert wird, und sodann mit einer alkalischen wäßrigen Lösung, z. B. verdünnter Ammoniumhydroxidlösung, oder einer wäßrigen Lösung von Ammoniumcarbonat oder Ammoniumformiat, durch eine Gradientenmethode oder eine stufenweise Methode eluliert. Bei dieser Trennmethode werden die ersten mehreren Komponenten in Spurenmengen eluiert. Sodann werden KA-6606 IV und KA-6606 III als freie Basen in dieser Reihenfolge eluiert. Bei der weiteren Elution werden nacheinander KA-6606 I und KA-6606 getrennt Djs resultierende KA-6606 L. II, III und IV können
durch Chromatographie auf Cellulose, Silicagel, Sephadex® (z. B. LH 20) etc. gereinigt werden. So kann es z. B.
auf einer Silicagelsäule mit einem Gemisch (1:8:3) aus Chloroform/MethanoI/17% Ammoniumhydroxid als Elutionsmittel chromatographicrt werden.
Die Substanzen KA-6606 I, Π, ΙΠ und IV, die nach dem oben beschriebenen Verfahren getrennt werden können, liegen in Form der freien Basen vor. Gero wünschtenfalls können sie in Form der reinen freien Base erhalten werden, indem man sie auf einer Säule aus einem stark basischen Anionenaustauscherharz, z. B. Dowex* 1X2 (Dow Chemical), adsorbieren läßt, mit entionisiertem Wasser eluiert, aktive Fraktionen
es sammelt und die gesammelten Fraktionen Iyophilisiert. Diese Substanzen KA-6606 I, Π, HI und IV, die als freie Basen erhalten werden, können in ihre Säureadditionssalze durch Behandlung mit pharmazeutisch an-
nehmbaren anorganischen oder organischen Säuren umgewandelt werden. Beispiele für solche Säuren sind anorganische Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure und Bromwasserstoffsäure, sowie organische Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure.
" Die Substanzen KA-66Q6 Ϊ, KA-6606III und KA-6606 IV können in die Substanz KA-6606 II durch Behandlung mit Alkalien oder Sauren umgewandelt werden. Die Umwandlung kann in der Weise bewirkt werden, daß man die Substanzen KA-6606 I, KA-6606 III und KA-6606 IV mit einer 0,1 bis 4 N-wäßrigen Lösung eines alkalischen Reagens, wie z. B. von Natriumhydroxid oder Bariumhydroxid, oder mit einer 0,1 bis 1 N-wäßrigen Lösung eines sauren P.eagens, wie z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, behandelt.
Im Falle der Verwendung eines alkalischen Reagens kann ein stark basisches Anionenaustauscherharz (z. B. Amberlite® IRA 400 [OH9-Form] oder Dowex® 1X2 [OH®-Form]) zugesetzt werden, und die Reaktion kann im suspendierten Zustand durchgeführt werden. Gleichermaßen kann bei Verwendung des stark sauren Reagens ein stark saures Kationenaustauscherharz, z. B. Amberlite® IR 120 (H®-Form) oder Dowex® 50X8 (H®-Form) zugesetzt werden, und die Reaktion kann im suspendierten Zustand durchgeführt werden. Die Reaktion kann gewöhnlich etwa 0,5 bis 3 h lang bei etwa 30 bis 1000C durchgeführt werden.
Nachstehend werden die physikalischen und chemischen Eigenschaften der neuen Antibiotika KA-66061, II, III und IV der Strukturen 1-a bis I-d beschrieben.
KA-6606 1 (freie Base)
(1) N3tur: weißes Pulver
(2) Molekularformel: C17H35O5N5
(3) Elementaranalyse:
gefunden (%): C 52,10
errechnet (%): C 52,42
H 8,84 N 17,83
H 9,06 N 17,99
3,40 (3 H, s. OCH3) 5,00 (IH, d, anomerer H)
(13) Massenspektrum (m/e):
389 (M+), 276, 258, 248, 230, 180,
(14) Papierchromatographie:
RrWert: 0,53
Filterpapier: Whatman Nr. 1
Lösungsmittel: eine untere Schicht von Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)
(15) Dünnschichtchromatographie:
Molekulargewicht: 389 (Massenspektrum)
Schmelzpunkt: 115 bis 135°C
Spezifische Drehung· ta]i'+ 104° (c 1, H2O)
Ultraviolettabsorptionsspektrum:
Bei 220 bis 360 nm findet sich keine charakteristische Absorption. Es liegt lediglich eine endständige Absorption vor.
Infrarotabsorptionsspektrum:
Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette ist in Fig. 1 gezeigt. Löslichkeit:
Sehr leicht löslich in Wasser. Leicht löslich in Methanol, leicht löslich in Äthanol. Unlöslich in 'Chloroform, Äthylacetat, Diäthyläther, Hexan und Petroläther.
Farbreaktion:
Ninhydrinreaktion und Rydon-Smith-Reaktion: "positiv; Sakaguchi-Reaktion, Maltol-Reaktion, Eisen-(III)-chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion:
negativ
Stabilität:
Stabil bei einem pH-Wert von 3 bis 8. Im basischen und stark sauren Bereich allmähliche Zersetzung und Inaktivierung.
(12) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (<5D2o, ppm):
1,25 (3H,d, C-CH3)
3,05 (3 H, s, N-CHj)
3,07 (2 H, s, COCH2N)
Rf-Wert Lösungsmittel
0,56 Butanol/Äthanol/Chloroform/17%
Ammoniumhydroxid (4:2:5:2)
0,60 Chloroform/Methanol/17% Ammo-
niumhydroxid (1:8:3)
0,10 untere Schicht von Chloroform/
Methanol/17% Ammoniumoxid
(2:1:1)
0,76 obere 5>chicht von Chloroform/
Methanol/17% Ammoniumhydroxid
(2:1:1)
in TLC-Aluminium-Blatt (Silicagel 60 F254 0,2 mm) (Merck) wurde verwendet.
Tetra-N-acetylderivat von KA-6606 I
π (1) Natur: farbloses kristallines Pulver
(2) Molekularformel: C25H43O9N5
(3) Elementaranalyse:
gefunden (%):
errechnet (%):
C 53,51 C 53,85
H 7,58 H 7,77
N 12,44 N 12,56
b-Molekulargewicht: 557 (Massenspektrum) Schmelzpunkt: 160 bis 166°C Spezifische Drehung: \a\£+112° (c I, H2O) Kemmagnetisches Resonanzspektram (δθ2θ, ppm):
1.10 (3 H, d, C-CH3)
1,95, 2,00, 2,05, 2,07 (3 H, s, COCH3) 3,09 (3 H, s, N-CH3) 3,42 (3 H, s, 0-CH3)
4.11 (2 H. s, COCH2N) 4,95 (1H, d, anomerer H)
(8) Massenspektrum (m/e):
557 (M+), 342, 314, 296, 227
Substanz KA-6606 II (freie Base)
(1) Natur: weißes Pulver
(2) Molekularformel: C15H32O4N4
(3) Elementaranalyse:
gefunden (%): C 53,97 H 9,51 N 16,55 errechnet (%): C 54,19 H 9,70 N 16,85
(4) Molekulargewicht: 332 (Massenspektrum)
(5) Schmelzpunkt: 88 bis 95° C
(6) Spezifische Drehung: \μΫο +139,5° (c 1, H2O)
(7) Ultraviolettabsorptionsspektrum:
Bei 220 bis 360 nm findet sich keine spezifische
Absorption, jedoch liegt eine endständige Absorption vor.
(8) Infrarotibsorptionsspektrum:
Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette ist in Fig. 2 angegeben.
(9) Löslichkeit:
Sehr leicht löslich in Wasser; leicht löslich in Methanol; leicht löslich in Äthanol' unlöslich in Chloroform, Äthylacetat, Diäthyläther, Hexan und Petroläther.
(10) Farbreaktion:
Ninhydrinreaktion und Rydon-Smith-Reaktion: positiv, Sakaguchi-Reaktion, Maltolreaktion, Eis: (III)-chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktiom negativ.
(11) Stabilität:
Stabil bei einem pH-Wert von mindestens 2. Im stark sauren Bereich allmähliche Zersetzung und Inaktivierung.
(12) Kemmagnetisches Resonanzspektrum («5D2o, ppm):
1,25 (3H,d, C-CH3)
2,70 (3 H, s, N-CH3)
3,45 (3 H, s, 0-CH3)
4,95 (1H, d, anomerer H).
(13) Massenspektrum (m/e):
332 (M+), 283, 219, 119,143
(14) Papierchromatographie:
RrWert: 0,86
Filterpapier: Whatman Nr. 1 Lösungsmittel: untere Schicht von Chloroform/ Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)
(15) Dünnschichtchromatographie:
(4) Molekulargewicht: 500 (Massenspektruiw)
(5) Schmelzpunkt: 139 bis 141°C
(6) Spezifische Drehung: [a]$ +52° (c 1, H2O)
(7) Kemmagnetisches Resonanzspektrum (<$d2o> PPm):
1,09 (3 H, d, C-CH3)
1,98, 1,99, 2,01, 2,13 (3 H, s, CO-CH3) 3,10(3H,s,N-CH3)
3,40 (3 H, s, 0-CH3)
4,96 (1H, d, anomerer H)
(8) Massenspektrum (m/e):
500(M+), 303, 271,257,227
35
Rf-Wert Lösungsmittel
0,57 ButanoI/Äthanol/Chloroform/17%
Ammoniumhydroxid (4:5:2:5)
0,52 Chloroform/Methanol/17% Ammo
niumhydroxid (1:8:3)
0,16 untere Schicht von Chloroform/
Methanol/17% Ammoniumhydroxid
(2:1:1)
0,80 obere Schicht von Chloroform/
Methanol/17% Ammoniumhydroxid
(2:1:1)
TLC-Aluminium-Blatt (Silicagel 60 F254 0,2 inm) (Merck Co.) wurde als Platte verwendet
Penta-N-acetylderivat der Substanz KA-6606 Π
(1) Natur: farblose Nadeln
(2) MolekuIarfÖrmel: C23H40O8N4 · H2O
(3) Elementaranalyse:
gefunden (%):
errechnet (%):
C 52,99 H 7,65 N 10,52 C 53,27 H 8,16 N 10,80 Substanz KA-6606 IH (freie Base)
(1) Natur: weißes Pulver
(2) Molekularformel: C18H36O6N6
(3) Elementaranalyse:
gefunden (%): C 49,51 H 8,11 N 19,10 errechnet (%): C 49,99 H 8,39 N 19,43
(4) Molekulargewicht: 432 (Massenspektrum)
(5) Schmelzpunkt: 145 bis 152°C
(6) Spezifische Drehung: ia\i'+ 103°(c 1, H2O)
(7) Uliraviolettabsorptionsspektrum:
Bei 220 bis 360 nm wird keine spezifische Absorption festgestellt,]edoch liegt eine endständige Absorption vor.
(8) Infrarotabsorptionsspektrum:
Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette ist in Fig. 3 angegeben.
(9) Löslichkeit:
Sehr leicht löslich in Wasser; leicht löslich in Methanol; leicht löslich in Äthanol; unlöslich in Chloroform, Äthylacetat, Diäthyläther, Hexan und Petroläther.
(10) Farbreaktion:
Ninhydrin-Reaktion und Rydon-Smith-Reaktion: positiv; Sakaguchi-Reaktion, Maltolreaktion, Eisen-(III)-chlorid-Reaktion und Fehling-Reak;:on: negativ
(11) Stabilität:
Stabil bei einem pH-Wert von 3 bis 8. Im basischen und stark sauren Bereich allmähliche Zersetzung und Inaktivierung.
(12) Kemmagnetisches Resonanzspektrum (<5D2o. PPm):
1,21 (3 H, d, C-CH3)
3,07(3H,s,N-CH3)
3,40 (3 H, s, 0-CH3)
4,06 (2 H, s, CO-CH2-N)
4,95 (1H, d, anomerer H)
(13) Massenspektrum:
432 (M+), 273, 219, 194, 173,143
(14) Papierchromatographie:
Rf-Wert: 0,27
Filterpapier: Whatman Nr. 1 Lösungsmittel: untere Schichtvon Chloroform/ Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)
55
60
(15) Dünnschichtchromatographie:
(15) Dünnschichtchromatographie:
Rf-Wert Lösungsmittel
Rf-Wert Lösungsmittel
0,55 Butanol/ÄthanoI/CWoroform/17%
Ammoniumhydroxid (4:5:2:5) 0,64 ChIorofonn/MethanoI/17% Ammo-
niumhydroxid (1:8:3) 0,06 untere Schicht von Chloroform/
Methanol/17% Ammoniumhydroxid
(2:1:1)
0,77 obere Schicht von Chloroform/
Methanol/17% Ammoniumhydroxid
0,56 Butanol/Äthanol/ChIorofonn/17%
AmmGniumhydroxid (4:5:2:5)
0,66 Chloroform/Methanol/17% Ammo
niumhydroxid (1:8:3)
0,16 untere Schicht von Chloroform/
' Methanol/17% Ammoniumhydroxid
(2:1:1)
0,76 obere Schicht von Chloroform/
Methanol/17% Ammoniumhydroxid
(2:1:1)
TLC-Aluminium-Blatt (Süicagel 60 F254 0,2 mm) (Merck) wurde als Platte verwendet
Substanz KA-6606 IV (freie Base)
(1) Natur weißes Pulver
(2) Molekularformel: C8H35O6N5
(3) Elementaranalyse:
gefunden (%):
errechnet (%):
C 51,39
C 51,78
H 8,08 N 16,41 H 8,45 N 16,77 TLC-Älünjiuiüui-Blati (Silicagel 60 F254 0,2 min) (Merck) wurde als Platte verwendet
Die Rf-Werte durch Papierchromatographie der neuen Antibiotika KA-6606 I, JL, Ui und IV sind in Tabelle II im Vergleich mit denjenigen von bekannten Antibiotika zusammengestellt Ahnliche Werte, die durch Dünnschichtchromatographie erhalten wurden, sind in Tabelle ΠΙ zusammengestellt.
Molekulargewicht: 417 (Massenspektrum) Schmelzpunkt: 135 bis 1400C Spezifische Drehung: {a]%+ !01° (c 1, H2O) Ultraviolettabsorptronsspektnim: Bei 220 bis 360 nm wird keine spezifische Absorption festgestellt. Lediglich eine endständige Absorption liegt vor.
Infrarotabsorptionsspektrum:
Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette ist in Fig. 4 angegeben.
Löslichkeit:
Sehr leicht löslich in Wasser; leicht löslich in Methanol; leicht löslich in Äthanol; unlöslich in Chloroform, Äthylacetat Diäthyläther, Hexan und Petroläther.
Farbreaktion:
Ninhydrinreaktion und Rydon-Smiih-Reaktion: positiv; Sakaguchi-Reaktion, Maltolreaktion, Eisen-(HD-chiorid-Reaktion und Fehling-Reaktion: negativ.
Stabilität:
Stabil bei einem pH von 3 bis 8. Im basischen und stark sauren Bereich allmähliche Zersetzung und Inaktivierung.
Kernmagnetisches Resonanzspektrum (<?d2o> PPm):
1,23 (3 H, d, C-CH3)
3,09 (3 H, s, N-CH3)
3,40 (3 H, s, 0-CH3)
4,18 (2 H, s, CO-CH2-N)
5,03 (IH, d, anomererH)
(13) Mas.senspektrum (m/e):
417 (M+), 304,276, 258, 219, 173, 143
(14) Papierchromatographie:
RpWert: 0,55
Filterpapier: Whatman Nr. I Lösungsmittel: untere Schicht von Chloroform/ Methanol/l7% Ammoniumhydroxid (2:1:1)
Tabelle II
RrWerte der Substanzen KA-6606 und bekannter Antibiotika
Lösungsmittelsystem:
untere Schicht von Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)
Filterpapier:
Whatman® Nr. 1
Antibiotika
Rf-Wert
„, KA-6606 I
KA-6606 II
KA-6606 III
KA-6606 IV
Gentamicin C1
Gentamicin C2
Gentamicin Cu
Sagamicin
« Sisomicin
Verdamicin
G-52
Fortimicin A
Fortimicin B
Andere1)
0,86 0,27 0,55 0,59 0,35 0,12 0.49 0,12 0.35 0,49 0,32 0,89 0,0-0,05
') Die anderen sind Kanamycin A, B und C, Paromomycin, Neomycin A, B und C, Butirosin A und B, Lividomycin A und B, Ribostamycin, Xylostatin, Gentamicin A und B, Tobramycin, Apramycin, Sorbistin, antibiotische Substanz 460, Hygromacin oder Destomycin.
15
Tabelle ΠΙ
Rr-Werte der Substanzen KA-6606 und bekannter Antibiotika
Lösungsmittelsystem
Lösungsmittel I:
Butanol/Äthanol/CMoroform/17% Ammonium- to hydroxid (4:5:2:5)
Lösungsmittel Π:
Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (1:8:3)
!5
Antibiotika Rf-Wert Lösungsmitteln
Lösungsmittel I 0,60
KA-6606 I 0,56 . 042
KA-6606 Π 0,57 0,64
KA-6606 ΠΙ 0,55 0,66
KA-6606 IV 0,56 0,40
Gentamicin C1 0,52 0,44
Gentamicin C2 0,51 0,34
Gentamicin Cu 0,43 0,32
Sagaroicin 0,45 0^6
Fortimicin A 0,53 0,70
Fortimicin B 0,60
Platte
TLC-Aluminium-Blatt (Silicagel 60 F254 0,2 mm) (Merck)
Die antibiotischen Spektren der neuen Antibiotika KA-66061, Π, ΙΠ und IV sind in Tabelle IV zusammengestellt
Tabelle IV B. anthracii Prot. vulgaris OX-19 Substanzen 0,4 KA-6606 25 in 3 IV 6 Fortimicin 0,8 Amikaciu
cereus Kleb, pneumoniae PCI-602 I 0,2 II 12 1,5 3 A 0,8
subtilis Ps. aerugincsa SHIBATA 0,2 6 0,8 14 0,8 0,8
Staph aureus 209P Micrococcus luteus #12 1,5 50 6 12 6 0,4
SMITH StrepL faecalis TI-13 0,2 6 0,8 1,5 1,5 0,2
E. coll NIHJ A3 0,4 >100 - - 6 1,5
K-12 ML 1410 -. - - Iv
Λ.-1Ι / 		25 >100 >25 >50 100 0,4
K-12 ML 1410 R-811) 315IV) 14 50 12 25 6 12
R-82H) Providencia sp.v) 3 >100 >25 50 12 100
R-IOl"1) Serratia sp. 12 >100 25 >50 50 3
Mycobacterium smegmatis 607 1
J 		>100 12 50 12 3
3 >100 25 50 6 12
1,5 100 6 6 6 3
U >100 12 12 6 6
3 >100 25 25 12 1,5
0,4 100 1,5 3 1,5 1,5
3 >100 >25 >50 6 0,8
3 >100 25 50 12 0,4
£.
■\j 		— inn >2C >5Q 12 1,5
6 >100 >25 >50 12 0,2
1,5 >100 25 50 6 1.5
1,5 100 6 12 3 25
0,4 >ioo >25 12 0,8 3
1,5
0,8
I) 3-Phosphortransferase L
II) 3-Phospliortrarisferase II.
III) 2"-NucIeotädyifransferase.
IV) o'-Acetyltransferase. V) 2-Acetyhransferase.
Die akuten Toxizitaten der Substanzen KA-66061, Π, ΙΠ und IV, bestimmt an der Maus, sind wie folgt:
KA-6606 KA-6606 KA-6606 KA-6606 I Π Πι IV
LD50 (mg/kg)
50-100 > 400 >200 >200
200-400 >1000 >800 >800
Durch die Erfindung werden auch antibiotische Mittel zur Verfügung gestellt, das (1) eine wirksame Menge von mindestens einer Verbindung aus der Gruppe erfindungsgemäße Substanzen KA-6606 und pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze davon und (2) ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel oder einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält
Die Menge der Verbindung (1) beträgt beispielsweise 0,01 bis etwa 99,i Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Mittels.
Das erfindungsgemäße antibiotische Mittel kann in jeder beliebigen Dosierungsform, die gewöhnlich verwendet wird, vorliegen. Injizierbare Zubereitungen und Kapseln werden jedoch besonders bevorzugt.
Wie andere bekannte wasserlösliche basische Antibiotika wird vorzugsweise eine injizierbare Zubereitung hergestellt, indem man ein lyophilisiertes Pulver des Antibiotikums, vorzugsweise zusammen mit einem Stabilisator, in ein Gläschen eingegeben wird. Beim Gebrauch wird der Inhalt des Gläschens in einer Auflösungsflüssigkeit für die Verabreichung aufgelöst.
Geeignete Verdünnungsmittel oder Träger sind z. B. flüssige Verdünnungsmittel, wie d-iSv.llie.rtes Wasser zur Injektion und physiologische isotonische Lösung, und feste Träger, wie z. B. Lactose, Stärke, weißer Zucker, Glucose, kristalline Cellulose, Calciumcarbonat, Kaolin, D-Mannit, Magnesiummetasilicataluminat, Calciumsulfat, Calciumphospliat und Bentonit. Die Zugabe von Stabilisatoren, wie z. B. von saurem Natriumbisulfit, wird ebenfalls bevorzugt.
Die Dosis der erfindungsgemäßen antibiotischen Substanz kann geeigneterweise ausgewählt werden. Sie beträgt z. B. etwa 0,01 bis etwa 100 mg/kg/Tag.
Durch die Erfindung werden daher auch antibiotische Mittel für Tiere, wie z. B. Geflügel, Haustiere und Nutzfische, sowie antibiotische Mittel für den Menschen zur Verfugung gestellt. Diese Mittel sind als antibakterielle Mittel mit breitem antibakteriellem Spektrum geeignet.
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.
Beispiel 1
Ein Kulturmedium wurde aus 3% Stärke, 1,5% Sojabohnciiiiicni, G,57o maisCjutli wasser, 0,2% I'ciccxirakt, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,3% Natriumchlorid, 0,3% Calciumcarbonat, 0,001% KobaIt(III)-chloridhexahydrat und Leitungswasser hergestellt. Es wurde auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und sterilisiert. Der Stamm KC-6606 wurde in das Kulturmedium okuliert, und er wurde etwa 50 h lang bei 27° C kultiviert; wodurch eine erste Impfkultur gebildet wurde.
200 ml der ersten Impfkultur wurden in einen 200-1-Fermentator überführt, der 100 1 des gleichen sterilen Mediums wie oben enthielt und 1% BaumwoHsarr.enöl enthielt. Die Kultivierung erfolgte unter Rühren mit 225 Upm bei einer Luftflußgeschwindigkeit von 50 l/min.
bei 27°C über einen Zeitraum von 4 Tagen.
Nach der Kultivierung wurde Schwefelsäure zu der Kulturbrülie zugesetzt, um den pH-Wert auf 2,0 einzustellen. Sodann wurde die Kulturbrühe unter Verwendung von Dicaliie (Dicalite Orient Co.) als Filterhilfsmittel Gltriert Eine verdünnte wäßrige Lösung von Natriumhydroxid wurde zu dem Filtrat gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, und es wurde durch eine Säule aus einem Kationenaustauscherharz, Amberlite® IRC-50 (NHf-Form) geleitet (der AbsüJm wurde verworfen). Nach dem Waschen der Harzsäule mit entionisiertem Wasser wurde die aktive adsorbierte_ Substanz mit 1 N-Ammoniumhydroxidlösung eluiert;" die Aktivität des Eluats wurde nach derPapierscheibenrrethode unter Verwendung einer Agarplatte von Bacillus subtilis bestimmt Die Fraktionen mit einer Aktivität wurden kombiniert und unter vermindertem Druck auf etwa 50 ml eingeengt Das Konzentrat wurde lyophilisiert, wodurch 8,8 g eines rohen Puivers der Substanz KA-6606 erhalten wurden.
8 g des rohen Pulvers wurden in 50 ml destilliertem Wasser aufgelöst Nach Einstellung des pH-Werts auf 7,0 wurde die Lösung durch eine Säule (3 x 150 cm) eines Kationenaustauscherharzes, Amberlits® CG-501 (NH®-Form) geleitet Nach dem Waschen mit entionisiertem Wasser wurden die aktiven Teile durch Gradientenelution zwischen 51 0,01 N-Ammoniumhydroxidlösung und 5 1 1 N-Aomoniumhydroxidlösung mit einer Fließgeschwindigkeit von 150 ml/h erhalten. Alle Fraktionen mit jeweils 25 ml wurden nach der Papierscheibenmethode bestimmt Fraktionen, die Bestandteile entsprechend KA-6606 I enthielten, Fraktionen, die Bestandteile entsprechend KA-6606 II enthielten, Fraktionen, die Bestandteile entsprechend KA-6606 III enthielten, und Fraktionen, die Bestandteile entsprechend KA-6606 rv enthielten, wurden jeweils gesammelt und lyophilisiert, wodurch 80 mg eines rohen Pulvers, das KA-66061 enthielt, 16 mg eines rohen Pulvers, das KA-6606 II enthielt, 120 mg eines rohen Pulvers, das KA-6606 III enthielt, und 794 mg eine' rohen Pulvers, das KA-6606 IV enthielt, erhalten wurden.
Das lyophilisierte KA-66061 und KA-6606 II wurden in Wasser aufgelöst. Nach Einstellung des pH-Werts auf 7,0 wurden die einzelnen Lösungen durch eine Säule {1 x 150 cm) eines ArJcnenaustauscherharzes, Dowex® 1 x 2 (OHe-Form) geleitet. Der aktive Teil wurde mit entionisiertem Wasser entwickelt. Die aktiven Fraktionen wurden kombiniert und lyophilisiert, wodurch 40 mg KA-6606 I als reine freie Base und 10 mg KA-6606 II als reine freie Base erhalten wurden.
Getrennt wurden 120 mg des rohen Pulvers, das die Substanz KA-6606 III enthielt, in Wasser aufgelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule (2 x 60 cm) von Silicagel geleitet, das mit einem Lösungsmittelgemisch von Chloroform/Methanol/17% Ammoniumh»droxid (1:8:3; gepackt v.ar, u:n das F-A-660* HI mit de?« ohigen Lösungsmittel zu eluieren. Die entsprechenden eluierten Fraktionen wurden unter vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert, wodurch 70 mg eines weißen Pulvers von KA-6606 III erhalten wurden. Die Behandlung von 794 mg des rohen Pulvers, das KA-6606 IV enthielt, auf die obige Weise lieferte 50 mg eines weißen Pulvers von KA-6606 IV.
Die einzelnen lyophilisierten Produkte wurden in Wasser aufgelöst. Nach Einstellung des pH-Werts auf 7,0 wurde die Lösung auf einer Säule (1X10 cm) eines Anionenaustauscherharzes, Dowex® 1 X 2 (OHe-Fofrri) ehromatographiert, und der aktive Teil wurde mit ent-
ionisiertem Wasser eluiert Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 12 mg KA-6606 EQ als reine freie Base und 8 mg KA-6606 IV als reine freie Base erhalten wurden.
Beispiel 2
Ein Kulturmedium wurde aus 2% Stärke, 1% Sojabohnenmehl, 0,5% Maisquellwasser, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,3% Natriumchlorid, 0,3% Calciumcarbonat und Leitungswasser hergestellt Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt, und es wurde sterilisiert. Der Stamm KC-6606 wurde zuerst inokuliert und etwa ^O h iang bei 27° C kultiviert, um eine erste Impfkultur τ, Juden. 100 ml der ersten Impfkultui wurden in eirnn ^0-1-Becherfermentator übertragen, der 10 \ l=s weichen sterilen Mediums wie oben enthielt. Die il*. tivierung wurde unter Rühren mit 250 Upm '·· einer Luftflußgeschwindigkeit von 10 l/min b-?i Z, C und über einen Zeitraum von 4 Tagen durchgt_f"M-.t.
In der gleichen Weise wie im Beispiel 1 wurde die Kulturbrühe behandelt Die gewünschten Produkte wurden isoliert und gereinigt Es wurden 20 mf KA-6606 I als freie Base, 4 mg KA-6606 II als freie Base, 4 mg KA-6606 ΠΙ als freie Base und 5 mg KA-6606 IV als freie Base, alle in gereinigter Form, erhalten.
Beispiel 3
40 mg von KA-6606 I, erhalten im Beispiel 1 oder 2, wurden in 1 Mol einer4 N-wäßrigen Natriumhydroxidlösung aufgelöst, und die Lösung wurde 1 h lang erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde in 100 ml Wasser auf-
gelöst, neutralisiert und durch eine Säule (1X10 cm) eines Kationenaustauscherharzes, Amberlite® CG-50 (NHf-Form) geleitet Die Säule wurde mit 100 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit 1 N-Ammoniumhydroxid eluiert. Fraktionen, die eine antibakterielle Aktivität hatten und die ein positives Ergebnis bei der Ninhydrinreaktion zeigten, wurden gesammelt uud lyophilisiert, wodurch 23 mg eines weißen Pulvers von KA-6606 Π als freie Base erhalten wurden.
Beispiel 4
40 mg von KA-6606 ΙΠ, erhalten im Beispiel 1 oder 2, wurden in 1 ml4N-Natriumhydroxid aufgelöst, und die Lösung wurde lh lang erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde in 100 ml entionisiertem Wasser aufgelöst, neutralisiert und sodann durch eine Säule (1 X10 cm) eines Kationenaustauscherharzes, Amberlite® CG-50 (NH®- Form) geleiigt Die Säule wurde mit 100 ml entionisier-
tem Wasser gfewaschen und mit 1 N-Ammoniumhydroxid eluiert Fraktionen, die ein positives Ergebnis bei der Ninhydrinreaktion zeigten und die <. -.ae antibakterielle Aktivität hatten, wurden gesammelt un. j lyophilisiert, wodurch 18 mg eines weißen Pulvers von KA-6606 II als freie Base erhalten wurden.
Beispiel 5
40 mg von KA-6606 IV, erhalten im Beispiel 1 oder 2, wurden wie im Beispiel 3 behandelt. Als Ergebnis wurden 26 mg eines weißen Pulvers von KA-66G6II als freie Base erhalten.
Hierzu i Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Antibiotika KA-6606 I, Π, ΠΙ und IV der allgemeinen Formel CH3
! O
NH2
NCH3 OCH3
DE2813021A 1977-03-24 1978-03-23 Antibiotika KA-6606 I, II, III und IV, diese Antibiotika enthaltende Mittel und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen Expired DE2813021C2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP3158077A JPS53127401A (en) 1977-03-24 1977-03-24 Novel antibiotics and process for preparing same
JP52133051A JPS5819679B2 (ja) 1977-11-08 1977-11-08 新規抗生物質及びその製法

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