CH640001A5

CH640001A5 - Verfahren zur herstellung von piperidin-derivaten.

Info

Publication number: CH640001A5
Application number: CH1188178A
Authority: CH
Inventors: Shingo Matsumura; Hiroshi Enomoto; Yoshiaki Aoyagi; Yoji Ezure; Yoshiaki Yoshikuni; Masahiro Yagi
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1977-11-21
Filing date: 1978-11-20
Publication date: 1983-12-15
Also published as: FR2409308A1; DE2850467B2; GB2009598B; DE2850467C3; IT1111058B; FR2409308B1; GB2009598A; DE2850467A1; US4198481A; JPS5484094A; JPS569919B2; IT7851974A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Moranolin bzw. dessen Salzen.

Moranolin ist ein 3,4,5-Trihydroxy-piperidin-Derivat, welches die folgende Formel

HG

HO'

N-H

nü

aufweist. Moranolin ist eine den Blutzuckerspiegel senkende Substanz, die aus der rohen weissen Rinde der Maulbeere extrahiert und isoliert wird.

Es hat sich gezeigt, dass diese Substanz als Medizin wirksam ist, und in diesem Zusammenhang sei auf die Veröffentlichung von Yagi et al., im Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan, Band 50, Seite 571 (1976) und auf die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 83951/77 hingewiesen.

Es wurden jetzt ausgedehnte Forschungsarbeiten unternommen, um ein Verfahren zur Herstellung dieser wertvollen, den Blutzuckerspiegel erniedrigenden Substanz mit der Bezeichnung Moranolin nach einem Fermentationsverfahren zu entwickeln. Es wurde nun überraschenderweise herausgefunden, dass ein Mikroorganismenstamm, der zur Gattung Streptomyces gehört, Moranolin bildet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Moranolin oder dessen Salzen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Moranolin bildenden Stamm der Gattung Streptomyces züchtet, um Moranolin in dem Zuchtmedium zu erzeugen, und das Moranolin oder dessen Salz aus dem Zuchtmedium gewinnt.

Beliebige Moranolin bildende Stämme der Gattung Streptomyces können zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens herangezogen werden.

Bevorzugte Stämme, die zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens herangezogen werden, sind Stämme von Streptomyces lavendulae. Als typisches Beispiel hierfür sei der Stamm mit der Bezeichnung «Streptomyces lavendulae SEN-158» genannt, der bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 26. September 1978 mit der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 31434 hinterlegt ist. Dieser spezielle Stamm wurde ferner auch beim Fermentation Research Institute (FRI = FERM), Agency of Industriai Science and Industry, Inage, Chiba-City, Japan, am 18. November 1977 mit der Hinterlegungsnummer FERM-Nr. 4301 hinterlegt.

Der fragliche Stamm mit der Hinterlegungsnummer

ATTC-Nr. 31434 wurde aus Bodenproben isoliert, die in der Stadt Sapporo gewonnen wurden. Als Resultat der mykologi-schen Untersuchungen wurde dieser Stamm als zur Klasse Streptomyces lavendulae gehörend identifiziert.

Es werden nun die mikrobiologischen Eigenschaften dieses Stammes beschrieben:

Zur Bestimmung der mikrobiologischen Eigenschaften wurden Versuche nach den Arbeitsverfahren des International Streptomyces Project (I.S.P.) [siehe die Veröffentlichung von E.B. Shirling et al. in Intern. J. Systematic Bacteriol., Band 16 (3), Seiten 313-340 (1966)] durchgeführt. Zuchtmedien, die in dieser Literaturstelle veröffentlicht sind und auch in dem Buch «Industriai Examination Standards, Applied Microorganism Industry» sowie auch dem Buch «The Acti-nomycetes» von S.A. Waksman, Band 2, Jahrgang 1961, wurden angewandt. Farben wurden nach dem Buch «Color Har-mony Manual» beschrieben, und zusätzliche Bemerkungen wurden dort, wo es nötig war, beigefügt.

Beschreibung des Moranolin bildenden Stammes:

a) Morphologische Eigenschaften

Sporen wurden sehr reichlich auf den Luftmycelen unter günstigen Bedingungen gebildet. Die Sporen sind zylindrisch und haben Dimensionen von 0,5 bis 0,7 x 0,7 bis 1,0 (i. Die Oberfläche der Sporen erscheint bei Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop glatt.

Bei der mikroskopischen Beobachtung wurden gebogene, in Schleifen gelegte und gekräuselte Sporenketten am Oberende der langen Lufthyphen beobachtet. Dieser Stamm gehört also nach der Klassifikation von I.S.P. in die Gruppe Rerinaculiaperti. Mehr als 10 Sporen pro Kette wurden beobachtet. Üblicherweise werden auch wenige Windungen von Spiralen und stark ausgedehnte Primitivspiralen beobachtet. Eine Fragmentierung der Substratmycele wird nicht beobachtet. Diese oben beschriebene Morphologie kann auf Salz-Stärke-Agar-Agar, Hafermehl-Agar-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar-Agar beobachtet werden. Auf Hefe-Malz-Agar-Agar treten reichlich Sporenketten auf, aber es werden auch Schleifen, Krümmungen und gelockte Sporenketten beobachtet.

b) Farbe der Kolonie

Die Luftmassen auf Hefe-Malz-Agar-Agar sowie auf Gly-cerin-Asparagin-Agar-Agar und auf Salz-Stärke-Agar-Agar, sowie auf Hafermehl-Agar-Agar zeigen eine Färbung in den roten Farbserien des Tresner-Backus-Farbrades (Tresner-Backus Color Wheels). Es ist nämlich die Farbe der Luftmas-sen zu Beginn der Entwicklung der Kultur weiss, und sie wird dann später lavendelfarben, und zwar im Farbton 5ec-6ec, und schliesslich geht sie in ein leicht gräuliches Rotbraun im Farbton 5ge über.

c) Rückseite der Kolonie

Es wird kein feststellbares Pigment gebildet. Die Kultur ist nämlich auf einem Hefe-Malz-Agar-Agar leicht braun, auf einem Hafermehl-Agar-Agar farblos bis blass-braun, und auf Salz-Stärke-Agar-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar-Agar farblos bis gräulich-weiss bis blass-grau. Die Pigmente stellen keine Indikatoren für den pH-Wert dar.

d) Farbe im Medium (lösliche Pigmente)

Melanoidpigment wird in einem Pepton-Hefe-Eisen-Agar-Agar gebildet. Es wird kein eigentliches Pigment beobachtet, ausser einem blassen oder leicht braunen in dem Hefe-Malz-Agar-Agar. Die Pigmente sind keine Indikatoren für den pH-Wert.

e) Verwendung von Kohlenstoff liefernden Materialien

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Prüfung der Saccharide, die im I.S.P. beschrieben sind: D-Glucose wird verbraucht. Jedoch werden L-Arabinose, Saccharose, D-Xylose, D-Fructose, Raffinose, L-Inosit, D-Mannit und Rhamnose nicht verbraucht. Überprüfung anderer Saccharide: Mannose, Maltose und Salicin werden verbraucht, jedoch werden Lactose, Galactose und Inulin nicht verbraucht.

Andere Eigenschaften

In der folgenden Tabelle werden die Eigenschaften der Kultur in verschiedenen Kulturmedien nach 14tägiger Bebrütung bei 27 ° C angegeben.

Eigenschaften der Kultur in verschiedenen Zuchtmedien

Zuchtmedium

Wachstum

Luft-Mycele Bildung

Farbe

Farbe der Sub-strat-Mycele

Lösiliche Pigmente

Saccharose-Nitrat- karg Agar-Agar

Glycerin-Nitrat-Agar- gut Agar

Glycerin-Asparagin- gut Agar-Agar

Glucose-Asparagin-Agar-Agar gut

Salze-Stärke-Agar-Agar gut

Tyrosin-Agar-Agar gut

Nähr-Agar-Agar gut

Hafermehl-Agar-Agar gut

Hefe-Malz-Agar-Agar gut

Pepton-Hefe-Eisen- gut Agar-Agar

Emerson-Agar-Agar gut

Kartoffelscheibe gut karg mässig gut gut gut gut karg gut gut keines karg keine weiss weiss lavendel (Farbton 5ec) bis leicht gräulich rötl.-braun (Farbton 5ge)

lavendel bis leicht gräulich rötl.-braun (Farbton 5ge)

lavendel bis gräulich gelblich raso (Farbton 5 de)

gräulich gelblich rosa (Farbton 5dc)

weiss gräulich-rot (Farbton 5dc bis 5ge)

lavendel bis gräulich-rot weiss farblos, transparent farblos bis blassbraun farblos bis gräulich farblos bis gräulich-weiss farblos bis gräulich-weiss gräulich-weiss blass-braun farblos bis blassbraun braun rötlich-bräunlich bis schwarz blassbraun schwärzlich-braun keine keine keine keine keine keine blass-braun keine blassbraun dunkelbraun bis schwarz braun schwärzlich-braun

Eigenschaften der Kultur auf anderen Medien

Glucose- Pepton-Gelatine-Zuchtmedium: 40

Auf diesem Medium zeigt der Mikroorganismus ein gutes Wachstum unter Ausbildung von lavendelfarbenen Luftmyce-len und eines blassbraunen vegetativen Mycels. Es bildet sich in dem Medium ein schwärzlich-braunes lösliches Pigment. Die Gelatine wird bei der Züchtung leicht verflüssigt. 45

Cellulose-Zuchtmedium :

Es wurde ein karges Wachstum sowohl auf der Czapek-Nitratlösung und auch auf der Czapek-Ammoniumchloridlösung beobachtet. 50

Trypton-Hefeextrakt-Brühe :

Auf diesem Medium wurde ein gutes Wachstum beobachtet, wobei sich ein leicht braunes oder schwärzlich-braunes lösliches Pigment bildete. 55

Biochemische Eigenschaften des Mikroorganismus :

1. Verflüssigung von Gelatine: schwach positiv

2. Reduktion von Nitrat: schwach positiv

3. Hydrolyse von Stärke: positiv t>o

4. Koagulation von Milch: negativ

5. Peptonisierung von Milch: schwach positiv

6. Bildung von Schwefelwasserstoff : negativ

7. Bildung von Melanoid-Pigment: positiv

8. Tyrosinase: negativ °5

9. Züchtungstemperaturen: Diese Versuche wurden bei den folgenden Temperaturen durchgeführt: 5°C, 10°C,

13°C, 17°C, 22°C, 26°C, 30°C, 34°C, 37-38°C, 42°C, 46°C

und 50 °C. Es wurde dabei kein Wachstum unterhalb von 10°C bzw. oberhalb von 42°C beobachtet. Bei der Temperatur von 13 °C und auch bei der Temperatur im Bereich von 37 bis 38 °C war das Wachstum spärlich, bei den anderen angeführten Temperaturen war jedoch das Wachstum gut. Es stellte sich heraus, dass die optimale Temperatur für die Züchtung bei etwa 26 °C liegt.

10. Wachstum in Abhängigkeit von dem angewandten pH-Bereich: Es wurde ein Wachstum bei einem pH-Wert von 4,5 bis 9,0 beobachtet, und das Optimum des Wachstums zeigte sich bei einem pH-Bereich von 6 bis 7,5.

11. Cellulase: negativ

Aus den oben angegebenen mikrobiologischen Eigenschaften des fraglichen Mikroorganismus konnte bestätigt werden, dass der Stamm SEN-158, der zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens angewandt wird, zur Gattung Streptomyces gehört. Der angewandte Stamm zeigt als wesentliche Eigenschaften diejenige, dass er Luftmycele im Bereich der roten Farbserie (hauptsächlich lavendelfarben) besitzt, und dass er morphologische Eigenschaften besitzt, die denjenigen des Retinaculiaperti-Typs entsprechen. Ferner ist die Oberfläche der Sporen Glatt und die Farbe des Substrat-Mycels und das lösliche Pigment sind nicht bedeutend.

Basierend auf diesen charakteristischen Eigenschaften wurde der fragliche Stamm in Lichte der in der Literatur gegebenen Lehren überprüft, wie zum Beispiel der Angaben von E.B. Shirling und D. Gottlieb in Intern. J. Systematic Bacteriol., 18(2), 69-189 (1968) sowie 18(4), 279-392 (1968) sowie 19(4), 391-512 (1969) und 22(4), 265-394 (1972) und ferner der Angaben von S.A. Waksman in «The Actinomyce-

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tes», Band 2 (1961). Als Ergebnis dieser Untersuchungen wurde der fragliche Stamm als Streptomyces lavendulae identifiziert.

Da es sich zeigte, dass der Stamm SEN-158 eine derartig wertvolle Eigenschaft besass, indem er eine den Blutzuckerspiegel vermindernde Substanz bildet, nämlich Moranolin, wurde der Stamm zur Unterscheidung von bereits bekannten Stämmen als «Streptomyces lavendulae SEN-158» bezeichnet.

Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens nicht nur der oben im Detail beschriebene Stamm Streptomyces lavendulae und Mutanten dieses Stammes, die durch Mutation des Stammes erhalten wurden, verwendet werden können, sondern auch beliebige andere zur Gattung Streptomyces gehörende Stämme herangezogen werden können, um das erfindungsge-mässe Verfahren durchzuführen, unter der Voraussetzung, dass diese fraglichen Stämme Moranolin bilden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird der Moranolin bildende Streptomyces-Stamm, beispielsweise der Stamm «Streptomyces lavendulae SEN-158», nach Verfahren gezüchtet, die üblich für die Kultivierung von Mikroorganismen sind. Als Kohlenstoff lieferndes Material kann bei der Durchführung dieses Verfahrens Glucose,

Stärke, Glycerin und ähnliches verwendet werden, und als Stickstoff lieferndes Material kann Sojabohnenpulver, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser und ähnliches eingesetzt werden. Wenn eine geeignete Menge an Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumchlorid, Calciumcarbonat und ähnliches dem Zuchtmedium zugesetzt wird, dann können gute Ergebnisse erhalten werden. Ausserdem können ganz geringe Mengen Eisensulfat, Magnesiumsulfat und ähnlichem zugesetzt werden. Die Züchtung kann nach irgendeiner stationären Züchtungsmethode durchgeführt werden, oder nach der Schüttelkultur-Methode oder der Methode durch submerse durchmischende Belüftung. Von diesen Methoden ist die Methode bei der durch von unten herkommender Belüftung eine Durchmischung der Kultur erreicht wird, also die durch submerse Belüftung hervorgerufene Durchmischung der Zuchtmethode speziell bevorzugt. Wenn die Züchtung bei einer Temperatur im Bereich von 22 bis 30 °C, und vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 27 °C, und unter Einhaltung eines pH-Wertes im Bereich von 6 bis 8 während einer Zeit von 48 bis 72 Stunden durchgeführt wird, dann wird in dem Zuchtmedium Moranolin gebildet.

Zur Extraktion und Isolierung des Moranolins aus der Zuchtbrühe können verschiedene Methoden angewandt werden, die üblicherweise zur Extraktion und Reinigung von wasserlöslichen Substanzen herangezogen werden. Beispielsweise kann eine Adsorption unter Verwendung von Aktivkohle, eine Ionenaustauschermethodik, eine Methode der chromatographischen Fraktionierung unter Verwendung einer Säule aus Polyamid, Sephadex, Cellulose oder Silicagel, oder eine Gegenstromverteilung zur Extraktion, zur Abtrennung und zur Reinigung des Moranolins herangezogen werden. Von diesen erwähnten Methoden ist die Ionenaustauschermethode oder eine Fraktionierungsmethode unter Verwendung von Aktivkohle speziell bevorzugt.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird nun anhand des folgenden Beispiels näher erläutert. ;

Beispiel

In einem Erlenmeyer-Kolben eines Rauminhaltes von 500 ml wurden 200 ml eines Kulturmediums eingefüllt. Das Kulturmedium enthielt 1% Glucose, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% Pepton, 0,5% Natriumchlorid und 0,3% Calciumcarbonat und es besass einen pH-Wert von 7. Das Kulturmedium wurde nach üblichen Arbeitsverfahren sterilisiert und dann mit verschiedenen Platinschleifen mit Sporen von Streptomyces lavendulae SEN-158 beimpft, die von Schrägkulturen entnommen wurden. Die Züchtung wurde bei 28 °C während 3 Tagen unter Schütteln mit 200 Umdrehungen pro Minute vorgenommen. Dann wurden 7 Liter eines Zuchtmediums in einen bottichartigen Gärbehältereines Rauminhaltes von 14 Litern eingegeben. Dieses im Gärbehälter befindliche Zuchtmedium enthielt 2% Stärke, 1% Sojabohnenpulver, 0,05% Kaliumchlorid, 0,05% Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,5% Natriumchlorid, 0,2% Natriumnitrat und 0,35% Calciumcarbonat. Das im Gärbehälter befindliche Zuchtmedium wurde dann mit dem vorgezüchteten Medium aus dem Erlen-meyer-Kolben beimpft. Man züchtete bei 28 °C während 48 bis 72 Stunden, wobei eine Belüftungsgeschwindigkeit von 6 bis 7 Litern pro Minute eingehalten wurde, und mit Hilfe eines Flügelrührers mit 300 Umdrehungen pro Minute gerührt wurde.

Dann setzte man 3 kg an High-Flow Super-Cell zu 12 Litern an so erhaltenem Zuchtmedium zu und filtrierte das Zuchtmedium. Zu dem Filtrat gab man 4 Liter Methanol und 500 g Aktivkohle zu, wobei die verwendete Aktivkohle ein Kohlepulver von spezieller Qualität war, die von der Firma Wako Junyaku hergestellt wurde. Nach der Zugabe des Methanols und der Aktivkohle wurde die Mischung 30 Minuten lang gerührt. Dann wurde die Aktivkohle abfiltriert und das Filtrat durch eine Säule geleitet, die mit 2 Litern des Ionenaustauscherharzes Dowex 1X2 (OH--Typ) beschickt war. Das aus der Säule austretende Material wurde durch eine Säule geleitet, die mit 500 ml des Ionenaustauscherharzes Dowex 50WX4 (H+-Typ) beladen war. Die Säule wurde dann mit Wasser gewaschen und die adsorbierten Substanzen wurden ausgelaugt, indem man mit 0,5%igem wässrigem Ammoniak behandelte. Die so gewonnenen Eluate wurden unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der dabei zurückbleibende Rückstand wurde in 10 ml Wasser aufgelöst, und man setzte 2 g Aktivkohle zu der Lösung zu und schüttelte die Mischung während 30 Minuten. Die Aktivkohle wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat durch eine Säule geleitet, die mit 200 ml an Dowex 1X2 (OH ~-Typ) beschickt ist, und das aus der Säule austretende Material wurde dann durch eine Säule geleitet, die mit 200 ml an Dowex 50WX4 (H+-Typ) ist. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und die adsorbierte Substanz herausgelöst, indem man mit 0,28%igem wässrigem Ammoniak behandelte.

Die dabei erhaltenen Eluate wurden unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, und die verbleibenden Feststoffe wurden in einer kleinen Menge an Methanol gelöst. Dann Hess man die Lösung stehen, und es fielen farblose Kristalle an Moranolin aus. Die Ausbeute betrug 600 mg. Das Moranolin wurde dabei in Form von farblosen Kristallen gewonnen, die sowohl gegenüber Säuren als auch gegenüber Alkalien beständig sind, und leicht in Wasser löslich jedoch schwer in Alkoholen löslich sind, und in Lösungsmitteln wie Äther, Benzol und Chloroform unlöslich sind.

Es zeigte sich, dass das so erhaltene Moranolin einen Schöielzpunkt von 204 bis 205 °C aufwies, und dass es, aufgenommen in Wasser, eine spezifische optische Drehung [a]o von 45 °C aufweist.

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Claims

640 001 2 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Moranolin oder dessen Salzen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Moranolin bildenden Stamm der Gattung Streptomyces züchtet, um Moranolin in dem Zuchtmedium zu erzeugen, und das Moranolin oder dessen Salz aus dem Zuchtmedium gewinnt.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Moranolin bildenden Stamm der Gattung Streptomyces einen Stamm von Streptomyces lavendu-lae verwendet, vorzugsweise den Stamm Streptomyces laven-dulae SEN 158, der bei der American Type Culture Collection mit der Nummer ATCC 31434 hinterlegt ist.