DD208990A5

DD208990A5 - Verfahren zur herstellung eines neuen, polycyclischen aetherantibiotikums

Info

Publication number: DD208990A5
Application number: DD82241794A
Authority: DD
Inventors: Walter D Celmer; Walter P Cullen; Riichiro Shibakawa; Junsuke Tone
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1981-07-20
Filing date: 1982-07-20
Publication date: 1984-04-18
Also published as: FI822544A0; AU8615582A; ATE16107T1; CS229936B2; SU1151219A3; AR227730A1; YU155982A; DK158746B; DK158746C; HU189600B; PL130945B1; CA1182414A; JPS6248671B2; AU533091B2; KR840000642A; KR860000217B1; NO156653B; ES8308360A1; ZA825129B; YU42781B

Abstract

CP- 53607, EIN NEUES SAURES, POLYCYCLISCHES AETHERANTIBIOTIKUM, UND DESSEN KATIONISCHE SALZE, ERZEUGT DURCH AEROBE SUBMERS-VERMEHRUNG VON STREPTOMYCES HALSTEDII ATCC 31812, ISOLIERT AUS EINER BODENPROBE IN JAPAN, EIN VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG DIESES ANTIBIOTIKUMS UND VERFAHREN ZU SEINER VERWENDUNG ZUR VERBESSERTEN NAHRUNGSMITTELNUTZUNG UND WACHSTUMSFOERDERUNG VON RIND UND SCHWEIN.

Description

79 4 1 ·¹~

P.C. (Ag) 5 3

Verfahren zur Herstellung eines neuen, polycyclischen

Ätherantibiotikums

Anwendungsgebiet der Erfindung und Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Erfindung betrifft einen neuen Vertreter der Gruppe saurer, polycyclischer Äther der Antibiotika,einer Klasse von Verbindungen, die sich biologisch durch ihren Einfluß auf den Kationentransport in Mitochondrien auszeichnen. Diese Familie der Antibiotika umfassen Monensin (J. Amer. Ch em. Soc. 8_9, 5737 (1967)); Nigericin (Biochem. Bibphys. Res. Comm., 33., 29 (1968)); Grisorixin (J. Chem. Soc, Chem. Commun., 1421 (197O)); Dianemycin (J. Antibiotics, 22, 161 (1969)); Salinomycin (J. Antibiotics, 2_7_, 814 (1974)); X-537A (J-. Chem. Soc, Chem. Commun. 967 (1972)); X-206 (J. Chem. Soc, Chem. Commun. 927 (1971)); A2O4A

(J. Amer. Chem. Soc, 9j5, 3399 (1973)); Mutalomvcin

(J. Antibiotics, 3_0/ 903, (1977)); Ionomycin (J. Amer. Chem. Soc, 101 , 3344 (1979)); K-413 (J. Antibiotics, 3_2, 169 (1979)); A-130B und A-130C (J. Antibiotics, 3_3_: 94 (198O)); Leuseramycin (J. Antibiotics, _33_: ¹³⁷' (193O)); und A-28695B (J. Antibiotics, _3_3_, 252 (198O)). Eine Übersicht über dieses Gebiet ist auch von Westley, "Polyether Antibiotics", Adv. Appl. Microbiol. , 2_2, 177 (1977) gegeben worden.

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Die oben aufgeführten polycyclischen Ätherantibiotika sind gegen Gram-positive Bakterien, Fungi und Protozoen aktiv. Diese Antibiotika zeigen starke Wirksamkeit gegen Kokzidien.

Die wohlbekannte Protozoen-Erkrankung Kokzidiose stellt weiterhin ein ernstes Problem dar, und ihre Kontrolle ist für die Veterinär-Wissenschaft, insbesondere für die Geflügelindustrie, von wirtschaftlicher Bedeutung. Die Kokzidiose entsteht durch Infektion durch eine oder mehrere Arten von Eimeria oder Isospora (als zusammenfassende Übersicht vgl. Lund und Farr "Diseases of Poultry", 5. Auflage, Biester und Schwarte, Iowa State University Press, Ames. Ia. 1965, S. 1056-1096). Es gibt sechs Arten von Kokzidien, die leicht unterscheidbare Erkrankung in empfänglichen Hühnern hervorrufen. Eimeria tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. acervulina, E. maxima und E. mivati rufen entweder direkt durch Zerstörung der Epithelzellen des Verdauungstrakts oder indirekt durch die Produktion von Toxineü Schaden hervor. Drei weitere Arten von Protozoen, die zur gleichen Gattung gehören, werden als relativ unschädlich angesehen; E. mitis, E. hagani und E. praecox vermögen jedoch die Gewichtszunahme herabzusetzen, die Futterleistung zu senken und die Eiproduktion zu beeinträchtigen.

Ziel der Erfindung

Im Hinblick auf die großen wirtschaftlichen Verluste aufgrund der Kokzidiose und die Nachteile mancher bekannter Antikokzidienmittel geht die Suche nach besseren Antikokzidienmitteln weiter.

Enteritis ist eine weitere Erkrankung, die schwere wirtschaftliche Verluste bei Züchtern verursachen kann. Enteritis tritt in Geflügel, Schweinen, Rindern und Schafen auf und wird

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hauptsächlich anaeroben Bakterien, hauptsächlich Clostridium perfringens, und Viren zugeschrieben. Enterotoxämie in Wiederkäuern, wofür ein Beispiel die "Überfreß-Krankheit" bei Schafen ist, ist ein durch C. perfringens-Infektion verursachter Zustand.

Schweine-Dysenterie ist eine der am weitesten verbreiteten Schweinekrankheiten in den Vereinigten Staaten. Außerdem herrscht diese Krankheit in vielen änderen Ländern und verursacht Schweinezüchtern auf der ganzen Welt Bestandsverluste im Werte von vielen Tausenden von Mark. Kürzlich wurde gefunden, daß eine große Spirochäte der diese Krankheit auslösende Organismus ist. Dieser Organismus, Treponema hyodysenteriae, ist nun isoliert worden und vermag, wie gezeigt, die Krankheit hervorzurufen (D. L. Harris et al., "Swine Dysentery-1 Inoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (New Species) and Reproduction of the Disease", Vet. Med/SAC 67, 61-64, 1972). Die später angegebenen Testdaten betreffen mit diesem Organismus durchgeführte Tests. Zu bemerken ist, daß nicht bekannt ist, ob T. hyodysenteriae der einzige Schweine-Dysenterie verursachende Organismus ist. Aus den zur /'"" Verfügung stehenden Daten jedoch kann geschlossen werden, daß er eine Hauptinfektionsquelle ist.

Leistungssteigerung (gesteigerte Wachstumsgeschwindigkeit und/oder erhöhte Leistung der Futternutzung) bei Wiederkäuern wie Rindern, ist ein weiteres wirtschaftlich wünschenswertes Ziel der Veterinärwissenschaft. Von besonderem Interesse ist die durch Steigerung der Futternutzungsleistung erzielte Wachstumsförderung. Der Mechanismus der Nutzung des Hauptnähranteils (Kohlenhydrate) von·Futtermitteln für Wiederkäuer ist gut bekannt. Mikroorganismen im Pansen des Tieres bauen Kohlenhydrate zu Monosacchariden ab und wandeln dann diese Monosaccharide in Pyruvate um. Pyruvate werden durch mikrobiologische Prozesse im Stoffwechsel zu Acetaten, Butyraten

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oder Propionaten, die insgesamt als flüchtige Fettsäuren bekannt sind, umgewandelt. Zur eingehenderen Erörterung vgl. Leng in "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et al., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 1970, S. 408-410.

Die relative Effizienz der Nutzung flüchtiger Fettsäuren wird von McCullough in "Feestuffs", 19. Juni 1971, S. 19, Eskeland et al. in J. An. Sei. 33, 282 (1971) und Church et al. in "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Band 2, 1971, S. 622 und 625 diskutiert. Wenngleich Acetate und Butyrate genutzt werden, werden Propionate mit größerer Wirksamkeit verwertet. Ferner können Tiere, wenn zu wenig Propionat zur Verfugung steht, Ketose entwickeln. Eine vorteilhafte Verbindung stimuliert daher Tiere zur Produktion eines höheren Anteils an Propionaten aus Kohlenhydraten, wodurch die Kohlenhydrat-Nutzungsleistung erhöht und auch das Auftreten von Ketose verringert wird.

Eine weitere Krankheit/ die Züchtern wirtschaftliche Verluste zufügt, wird durch den Protozoen-Parasiten der Gattung Theileria verursacht. Diese Erkrankung, Theileriose, ist auch als "Ostküstenfieber", "Küstenfieber", "Rhodesisches Zeckenfieber" bekannt. Der Theileria-Parasit .überschwemmt die roten Blutzellen, zerstört sie aber nicht, was akute oder chronische Fieberinfektionen auslöst. Bei Rindern zeichnet sich die Erkrankung durch hohes Fieber, Anschwellen der Lymphknoten, Auszehrung und hohe Mortalität aus. Diese Krankheit ist in Ost- und Zentralafrika ein sehr ernstes Problem. Zur näheren Erörterung von Theileriose vgl. "The Merck Veterinary-Manual", Siegmund et al., Merck & Co., Rahway, N.J., 5. Auflage S. 431-433 (1979) .

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Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung ist mit einem neuen sauren, polycyclischen Äther-Antibiotikum befaßt, das durch aerobe Submers-Vermehrunc von Streptomyces halstedii ATCC 31812, isoliert aus einer Bodenprobe aus Japan, in wässrigen Nährmedien produziert wird. Das Antibiotikum und seine kationischen Salze sind gegenüber einer Vielzahl von Mikroorganismen aktiv und kontrollieren wirksam Kokzidiose, Enteritis, Schweine-Dysenterie und Theileriose und sind bei Geflügel und Wiederkäuern wachsturnsfördernd wirksam.

Die Figuren zeigen Infrarot-Absorptionsspektren in Kaliumbromid:.

Fig. 1 ist das IR-Spektrum des Antibiotikums 53 607 in der Natriumsalzform,

Fig. 2 ist das IR-Spektrum des Antibiotikums 5 3 607 in der freien Säureform.

Der das erfindungsgemäße Antibiotikum erzeugende Mikroorganismus wurde aus einer Bodenprobe, genommen in Hiroshima, Japan, isoliert. Der Mikroorganismus hatte laut Prüfung die morphologischen Merkmale eines Streptomyces. Wie gefunden wurde, hatte er enge Hyphen der Actinomycetalen und ein Luft-' mycel mit Sporenketten, wie sie für die Gattung Streptomyces charakteristisch sind. Die gattungsmäßige Identität wurde weiter durch Zellwandanalyse gestützt.

Eine Kultur des Mikroorganismus wurde von einer Schrägkultur in flüssiges ATCC Nr. 17 2-Medium eingeimpft und vier Tage· bei 28 C auf einem Schüttler gezüchtet. Dann wurde vom Schüttler genommen, zentrifugiert, dreimal mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen und auf Medien verpflanzt,

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wie sie gewöhnlich zur Identifizierung von Vertretern der Actinomycetalen verwendet werden.

Die Inkubation erfolgte bei 2 8°C, sofern nicht anders angegeben, und Ergebnisse wurden zu geeigneten Zeiten aufgezeichnet, hier wiedergegebene Ergebnisse nach 2 Wochen Inkubation, sofern nicht anders angegeben.

Die zur Charakterisierung der Kultur verwendeten Identifikationsmedien und Hinweise für deren^; Zusammensetzung waren wie folgt:

1. Trypton-Hefeextraktbrühe (ISP Nr.1-Medium, Difco).

2. Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP Nr. 2-Medium, Difco).

3. Hafermehl-Agar (ISP Nr. 3-Medium, Difco).

4. Anorganische Salze-Stärke-Agar (ISP Nr. 4-Medium, Difco).

5. Glyzerin-Asparagin-Agar (ISP Nr. 5-Medium, Difco).

6. Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP Nr. 6-Medium, Difco).

7. Czapek-Saccharose-Agar - S.A. Waksman "The Actinomycetes", Band 2, Medium Nr. 1, S. 328, 1961.

8. Glukose-Asparagin-Agar - Ibid., Medium Nr. 2, S. 328.

9. Bennett's Agar - Ibid., Medium Nr. 30, S. 331. 10.. Emerson's Agar - Ibid., Medium Nr. 28, S. 331.

11. Nähragar - Ibid., Medium Nr. 14, S. 330.

12. Gordon und Smith's Tyrosin-Agar - R.E. Gordon und M.M. Smith, Jr. Bact. 6_9, 147-150, 1955.

13. Kasein-Agar - Ibid.

14. Calcium-malat-Agar - S.A. Waksman, Bact. Rev. 21 , 1-29, 1957.

15. Gelatine - R.E. Gordon und J.M. Mihm, Jr. Bact. 73, 15-27, 1957.

16. Stärke - Ibid.

17. Organische Nitratbrühe - Ibid.

18. Dextrose-Nitrat-Brühe - S.A. Waksman "The Actinomycetes", Band 2, Medium Nr. 1, S. 328, 1961, mit 3 g Dextrose für 30 g Saccharose und ohne Agar.

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19. Kartoffel-Karotten-Agar - M.P. Lechevalier, Jr. Lab. and Clin.Med. 1_\_, 934-9 44, 1968, verwendet aber nur 30 g Kartoffeln, 2,5 g Karotten und 20 g Agar.

20. 2 % Leitungswasser-Agar.

21. Magermilch - Difco.

22. Cellulose-Nutzung -

a) H. L. Jensen, Proc. Linn. Soc. N.S.W. _5_5_, 231-248, 1930.

b) M. Levine und H. W. Schoenlein "A Compilation of Culture Media", Medium Nr. 2511, 1930.

23. Kohlenhydrate - ISP Nr. 9-Medium, Difco; Nonomura und Ohara's C-2-Medium in Nonomura, H. und Y. Ohara,

J. Ferment. Technol. 4_9, 887-894, 1971.

24. Temperaturbereich - ATCC-Medium 172 in "ATCC Culture Collection Catalogue", 14. Auflage, S. 518, 19 80.

Die neue Kultur (Pfizer N393-39) wurde auf den verschiedenen Medien mit in herkömmlicher Terminologie beschriebenen Farben wie folgt beschrieben, aber exakte Farben wurden durch Vergleich mit Farbplättchen aus dem Color Harmony Manual, 4. Auflage, bestimmt:

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar - Wachstum gut, cremefarben bis blaßgelblich (nahe 2 ca), mäßig erhöht, eben, gerauht bis runzlig, kein Luftmyzel; Unterseiten ebenso, wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.

Hafermehl-Agar - Wachstum mäßig, grau bis bräunlichgrau (2 ge, 2 Ig bis 2 ni), dünn bis leicht erhoben, glatt mit kleinen weißen Punkten; Luftmyzel spärlich, weiß bis blaßgräulich; Unterseite wie Oberfläche; lösliches Pigment, blaßgelblich.

Anorganische Salze-Stärke-Agar - Wachstum mäßig, gelblichbraun bis braun (2 ic, 3 ne bis 3 Ie) , dünn, glatt, kein Luftmyzel; Unterseite wie Oberfläche, kein lösliches Pigment

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Glyzerin-Asparagin-Agar - Wachstum bescheiden bis mäßig, mattweiß, dünn, glatt mit einigen kleinen weißen Tüpfelchen; Luftmyzel spärlich, weiß; Unterseite wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.

Gordon and Smith's Tyrosin-Agar - Wachstum bescheiden bis mäßig, farblos bis cremefarben (2 ca), dünn, glatt, kein Luftmyzel; Unterseite wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.

Czapek-Saccharose-Agar - Wachstum mäßig, farblos bis mattweiß, dünn, glatt, mit einigen kleinen weißen Tüpfelchen auf Luftmyzel; Unterseite wie Oberfläche, kein lösliches Pigment.

Glucose-Asparagin-Agar - Wachstum mäßig, gelblichgrau bis lavendelgrau (2 ig, 3 ge bis 3 ig), dünn, glatt, aber nahe dem Rand leicht runzlig; Luftmyzel blaßgräulich (2 ge); Unterseite wie Oberfläche; lösliches Pigment blaßgelblich.

Calciummalat-Agar - Wachstum dürftig, farblos, mit einem mattweißen Rand, untergetaucht, glatt, mit kleinen Tüpfelchen gräulichen Luftmyzels (nahe Grau-Serie 2 de bis 2 fe); Unterseite wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.

Kasein-Agar - Wachstum mäßig, blaßbräunlich (2 ne bis 3 ne) , dünn, glatt bis leicht aufgerauht, kein Luftmyzel; Unterseite wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.

Bennett's Agar - Wachstum gut, braun (3 ng bis 3 ni), erhoben, runzlig, kein Luftmyzel; Unterseite wie Oberfläche; lösliches Pigment, blaßgelblich (2 ca).

Emerson's Agar - Wachstum mäßig bis gut, blaßgelblichbraun (2 ca bis 3 ca) bis grünlichgrau (23 ge bis 23 ig), dünn bis erhoben, glatt bis leicht aufgerauht oder als membranartige Napfe auftretend, ' die unregelmäßig runzlig waren, kein Luftmyzel; Unterseite wie Oberfläche, kein lösliches Pigment.

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Nähragar - Wachstum dürftig bis mäßig, blaßgelblich (2 ca) , dünn, glatt, kein Luftmycel; Unterseite wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.

Gelatineagar - Wachstum mäßig, blaßgelblich (2 ca), dünn, glatt, kein Luftmyzel; Unterseite wie Oberfläche, kein lösliches Pigment.

Stärkeagar - Wachstum gut, cremefarben, blaßgelblich bis blaßgelblichbraun (2 ca bis nahe 3 gc), dünn bis leicht erhoben, glatt, aber gegen die Kanten runzlig, kein Luftmyzel; Unterseite wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.

Kartoffel-Karotten-Agar - Wachstum mäßig, cremefarben (2 ca) mit einem gräulichen bis dunkengräulichen Rand (nahe Grau-Serie 2 fe, 2 ih bis 2 ml), dünn, glatt, Luftmyzel grau bis dunkelgrau; Unterseite wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.

Leitungswasser-Agar - Wachstum dürftig, farblos bis mattweiß, dünn, glatt, mit einigen kleinen weißen Tüpfelchen von Luftmyzel; Unterseite wie Oberfläche; kein lösliches Pigment.

Die biochemischen Eigenschaftsanmerkungen- sind nachfolgend zusammengefaßt:

1. Melanin wird nicht erzeugt.

2. Hydrogensulfid wird nicht erzeugt.

3. Gelatine verflüssigt.

4. Stärke hydrolysiert.

5. Nitrat zu Nitrit reduziert.

6. Geringes Wachstum auf Jensen's Cellulose.

7. Kein Wachstum auf Levine und Schoenlein's Cellulose.

8. Keine Zersetzung auf beiden Cellulosemedien .

9. Keine Koagulation an Milch.

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- ίο -

10. Keine Peptonisierung an Milch.

11. Kein Abbau von Kasein, Calciunxmalat und Tyrosin. 1 2. Kohlenhydrat-Verwertung.:

I. Auf Nonomura's Medium, Glukose, Arabinose und Xylose verwertet; Raffinose zweifelhaft verwertet; Saccharose, Inosit, Mannit, Fruktose und Rharnnose nicht verwertet.

II. Auf ISP Nr. 9-Medium Glukose, Arabinose, Xylose und Saccharose verwertet; Fruktose, Inosit, Mannit, Raffinose und Rhamnose nicht verwertet.'

Die folgenden morphologischen Beobachtungen erfolgten auf Kartoffel-Karotten-Agar nach 15 Tagen Inkubation:

Sporenmasse in der grauen Farbserie; Sporenketten gerade, gekrümmt, unregelmäßig gebogen oder wellig, selten hakenförmig, 10 bis 30 Sporen pro Sporenkette, selten weniger als 10 Sporen pro Sporenkette; Sporen oval, elliptisch bis stäbchenfÖrmig, 1-1,8 χ O,8-O,9 pm, glatt, nach Raster-Elektronenmikroskopie.

Die Beziehung von Temperatur zu Wachstumsgeschwindigkeit wurde wie folgt ermittelt:

Temperatur Wachstum

21 C gut bis ausgezeichnet

2 8°C gut

37°C mäßig

45°C dürftig

Wie oben bemerkt, unterstützte die Zellwandanalyse die gattungsmäßige Identität der Kultur als Spezies von Streptomyces. Analyse ganzer Zellen zeigte die Anwesenheit von LL-Diaminopimelinsäure und Glycin, aber das Fehlen von diagnostischen Zuckern. Die für die Ganzzellen-Aminosäuren-

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und Zucker-Analysen angewandten Methoden sind in B. Becker et al., Appl. Microbiol. V2, 421-423, 1964, und in M.P. Lechevalier, J. Lab. Clin. Med. 7_1_/ 93.4-944, 1968, beschrieben.

Die Kultur N393-39 zeichnet sich durch blaßgraue bis graue Farbe der Sporen in der Masse, gerade bis gebogene Sporenketten, glatte Sporen und das Unvermögen zur Produktion von Melanin aus. Die Gegenwart von LL-Diaminopimelinsäure und das Fehlen diagnostischer Zucker in den Ganzzellen-Hydrolysaten belegen die Zuordnung zur Gattung Streptomyces. Die Kultur ähnelt stark Streptomyces halstedii, beschrieben von E.B. Shirling und D. Gottlieb, 19 68, Int. J. Syst. Bacteriol. 18, 69-189, und somit wurde diese Art von Stamm von S. halste ATCC 1089 7 zum Vergleich herangezogen. Beide Kulturen stimmen in den folgenden Eigenschaften miteinander überein: Morphologie der Sporenketten, Morphologie der Sporenoberfläche, negative Melaninproduktion, und in den meisten biochemischen Eigenschaften. Die Kultur N393-39 Unterscheidet sich von S. halstedii durch das Fehlen von Luftmyzel auf vielen Medien; eher bräunliche als gräuliche bis schwarze Kolonie untersei-ts auf ISP Nr. 2, ISP Nr. 3 und ISP Nr. 4-Medien; negative H_S-Produktion und das Unvermögen zur Verwertung von Fructose. Da diese Unterschiede nur geringfügige Abwandlungen unter Stämmen einer Art von Streptomyces sind, wird N393-39 als neuer Stamm von Streptomyces halstedii (Waksman und Curtis), Waksman und Kenrici, angesehen.

Die neue Kultur (Pfizer N393-39) wurde am 23. Februar 1981 der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, übergeben und erhielt die Bezeichnung Streptomyces halstedii ATCC 31812. Der Fortbestand der Hinterlegung dieser Kultur bei der American Type Culture Collection, Rockville, Marylane und die leichte Zugänglichkeit seitens der Öffentlichkeit sind über die tatsächliche Lebensdauer des Patents im Falle

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seiner Erteilung gesichert. Der Zugang zur Kultur ist während der Anhängigkeit der Anmeldung unter 37 CFR 1.14 und 35 USC möglich. Alle Beschränkungen der Verfügbarkeit seitens der Öffentlichkeit der hinterlegten Kultur werden nach Patenterteilung unwiderruflich beseitigt.

Das Kultivieren der Kultur Streptomyces halstedii ATCC 31812 kann unter ähnlichen Bedingungen erfolgen, wie sie bei früheren Fermentationen angewandt wurden, die Polyäther-Antibiotika lieferten. Vgl. z.B. die. US-PS 4 195 079. Das Kultivieren erfolgt vorzugsweise in wässrigen Nährmedien unter aeroben Submers-Bedindungen unter Rühren bei einer Temperatur von 2 4 bis 36 C. Zum Kultivieren brauchbare Nährmedien umfassen eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, wie Zucker, Stärken und Glycerin, eine Quelle für organischen Stickstoff, wie Kasein, enzymatisches Abbauprodukt von Kasein, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Weizengluten, Sojamehl, Fleischmehl und Fischmehl. Eine Quelle für Wuchsstoffe, wie. Kornlösliches,und Hefeextrakt,sowie Salze, wie Natriumchlorid und Calciumcarbönat, und Spurenelemente, wie Eisen, Magnesium, Zink, Kobalt und Mangan, können auch mit vorteilhaften Ergebnissen genutzt werden. Wenn während der Fermentation übermäßiges Schäumen auftritt, können Antischaummittel, wie pflanzliche Öle oder Silikone, dem Fermentationsmedium zugesetzt werden. Belüftung des Mediums in Behältern für Submers-Wachsturn wird bevorzugt zu etwa 0,5 bis 2 Vol. steriler freier Luft pro VoL. Fermentationsbrühe pro min, in die Brühe durch einen Sprinkler gepreßt, aufrechterhalten. Bewegung kann mit"'Hilfe von Rührern aufrechterhalten werden, wie sie dem Fachmann auf dem Fermentationsgebiet im allgemeinen vertraut sind. Die Rührgeschwindigkeit hängt von der Art des verwendeten Rührers ab. Ein Schüttelkolben wird gewöhnlich mit 150 bis 200 Zyklen pro min betrieben, während ein Fermentator gewöhnlich bei 300 bis 600 UpM betrieben wird. Aseptische Bedingungen müssen natürlich während des Übertragens des Organismus und seines Wachstums aufrechterhalten werden.

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Inokulum aus der Herstellung des Antibiotikums gemäß der Erfindung kann durch Wachstum aus einer Schrägkultur erhalten werden. Das Wachstum kann zum Beimpfen entweder von Schüttelkolben oder Inokulum-Behältern angewandt oder die Inokulum-Behälter können von den Schüttelkolben aus mit Keimen beimpft werden. Das Wachstum wird in Schüttelkolben sein Maximum im allgemeinen in 2 bis 4 Tagen erreicht haben, während Inokulum in Submers-Inokulum-Behältern gewöhnlich in der günstigsten Periode in 1,5 bis 3 Tagen sein wird.

Das Fortschreiten der Antibiotikum-Produktion währender Fermentation und die Bioaktivität der Fermentationsbrühe können durch Biotest der Brühe unter Anwendung eines empfindlichen Stammes von Staphylococcus aureus oder Bacillus subtilis erfaßt werden. S. aureus ATCC 6538 und B. subtilis ATCC 6633 eignen sich als Stämme für diesen Zweck. Standard-Plattentesttechnik wird angewandt, wobei die eine mit der Brühe gesättigte Filterpapierscheibe umgebende Hemmzone als Maß für die Stärke des Antibiotikums herangezogen wird. Auch Dünnschichtchromatograpie mit Kieselgel ist ein brauchbares Hilfsmittel zur Analyse des in Fermentationsmedien produzierten Antibiotikums und des Mittels aus rohen und gereinigten, aus -^ den Fermentationsbrühen extrahierten Materialien. Die Analtech Kieselgel-GF-Chromatogramme werden mit Äthylacetat/Methanol (9:1) oder Chloroform/Methanol (9:1) entwickelt. Die antibiotische Verbindung wird durch Sprühen mit Vanillin in äthanolischer Schwefelsäure (3 g Vanillin und 9 7 ml Äthanol und 3 ml konz. Schwefelsäure) und Erwärmen der Dünnschichtchromatographieplatte auf 80 C sichtbar gemacht. Das Antibiotikum erscheint als rosafarbener Fleck. Die Platte kann auch mit Agar überlagert werden, das entweder mit S. aureus oder B. subtilis bekeimt ist und 16h bei 37°C inkubiert wird, um das Antibiotikum sichtbar zu machen.

Das durch Fermentation von S. halstedii ATCC 31812 produzierte Antibiotikum kann getrennt und gewonnen werden, indem die ganz

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unfiltrierte Fermentationsbrühe mit einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Äthylacetat, Methylisobuty!keton oder Butanol bei dem natürlich vorherrschenden pH-Wert extrahiert wird. Der Losungsmittelextrakt kann dann im Vakuum zu einem dünnen Sirup eingeengt werden.

Eine typische Methode zur Trennung und Gewinnung des Antibiotikums gemäß der Erfindung (nachfolgend "antibiotische Verbindung 53 607") ist wie folgt:

Die ganze Brühe aus der Fermentation von S. halstedii ATCC 31 812 wurde mit Methylisobutylketon extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt lieferte ein dunkles Öl nach dem Abziehen des Lösungsmittels unter Vakuum. Das Öl wurde in Chloroform gelöst und auf ein Kieselgelbett gegossen. Das Kieselgelbett wurde dann nacheinander mit Chloroform, Äthylacetat und Aceton gewaschen. Die Waschanteile wurden dünnschichtchromatographisch geprüft und die antibiotische Verbindung 53 607 fand sich fast ausschließlich in der Äthylacetatfraktion. Diese wurde zur. Trockne eingeengt und die- anderen Fraktionen verworfen. Die trockene Äthylacetatfraktion wurde säulenchromatographisch weiter gereinigt, indem sie in Äthylacetat aufgenommen und auf eine mit Kieselgel, aufgeschlämmt in Äthylacetat und eluiert mit Äthylacetat, gepackte Säule gegeben wurde. Säulenschnitte, die die antibiotische Verbindung 53607 enthielten (dünnschichtchromatographisch bestimmt) wurden vereinigt und das Volumen eingeengt. Dieses Material wurde dann an einer mit Sephadex LH-20 in Methanol gepackten Säule chromatographiert,und die die antibiotische Verbindung 53 607 enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, auf ein geringeres Volumen eingeengt und dann in Chloroform aufgenommen. Die Chloroformlösung wurde mit 5 %iger Mononatriumphosphat-Pufferlösung, mit Phosphorsäure auf pH 4,5 eingestellt , gewaschen. Die Lösungsmittelphase wird dann mit 5 Gew./VoI.-%iger Dinatriumphosphat-Pufferlösung, deren pH-Wert mit Natriumhydroxidlösung auf 9,0 eingestellt war, gewaschen. Die Lösungsmittelphase wird dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet

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794

1 -

15 -

und eingeengt. Der Rückstand wurde in Aceton aufgenommen und in einen Kühlschrank gebracht, worauf die antibiotische Verbindung 53 607 als Natriurnsalz kristallisierte. Die freie Säure kann durch Waschen einer Äthylacetat-Lösung des Natriumsalzes mit auf pH 4,5 eingestelltem Wasser erhalten werden. Abdampfen des Lösungsmittels lieferte Kristalle der freien Säure der antibiotischen Verbindung 53 607.

Die Analyse der antibiotischen Verbindung 53 607 zeigt folgende Struktur:

H CH.

CH.

Die antibiotische Verbindung 5 3 607 zeigt Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum einer Reihe Gram-positiver Mikroorganismen. In der folgenden Tabelle I sind die Ergebnisse von in vitro-MHK-Tests zusammengefaßt. Für diesen Test wird jeder Mikroorganismus in eine Reihe von Teströhrchen eingeeimpft, die Nährmedium und unterschiedliche Konzentrationen der Verbindunc 53 607 enthalten, um die minimale Konzentration des Antibiotikums in pg/ml zu bestimmen, die das Wachstum des Organismus über einen Zeitraum von 2 4 h hemmt (MHK).

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Tabelle

Organismus

MHK, pg/ml Verbindung 53 607 (Natriumsalz)

Staphylococcus aureus

Streptococcus faecal is Streptococcus pyogenes Corynebacterium pyogenes Bacillus subtil is Bacteroides fragilis

Bacteroides vulgatis Haemophilus influenza

Pasteurella multocida Clostridium perfringens

Neisseria sicca Staphylococcus epidermidis

Fusobacterium necrophorum Treponema hyodysenteriae

01A005	0	,78
01A052	0	,78
01A110	1	,56
01A400	1	,56
02A006	1	»56
020203	<0	,01
11D001	25
06A001	0	,39
78C004	12	,5
78C009	6	,25
78C010	6	,25
78E032	3	,12
54A036	6	,25
54AO37	3	,12
54A059	12	,5
59A001	>20 0
10A002	0	,98
10A003	0	,98
66C000	25
01B087R	0	,78
01B111RR	0	,78
01B12 5	1	,56
84C004	3	,12
94A001	0	,39
94A002	0	,098

Gegenüber den Gram-negativen Bakterien, wie Escheri chia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsieila pneumoniae, Serratia marcescens und Enterobacteriacese aerogenes, waren die MHK-Werte in jedem Falle > 50.

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Die antibiotische Verbindung 53 607 und ihre kationischen Salze zeigen ausgezeichnete Aktivität gegenüber Kokzidien-Infektionen bei Geflügel. Wenn in Hühnerfutter zu Gehalten von 50 bis 200 TpM eingearbeitet, sind diese Verbindungen bei der Kontrolle von Infektionen durch Eimeria tenella, E. acervulina, E. maxima, E. brunetti und E. necatrix wirksam.

Wirksamkeitsdaten für die antibiotische Verbindung 53 607 und ihre Salze gegenüber Kokzidien-Infektionen bei Geflügel wurden wie folgt erhalten: Gruppen von 3 bis 5 10Tage alten weißen Leghorn-SPF-Hahnkücken wurden mit einem Mischfutter gefüttert, das antibiotische Verbindung 53 607 oder ihr Natrium- und/oder Kaliumsalz , darin gleichförmig verteilt, enthielt. Nach 2 4 h bei dieser Diät wurde jedes Kücken per os mit Oocysten der speziell zu testenden Art von Eimeria beimpft Weitere Gruppen von 3 bis 5 10Tage alten Kücken wurden mit ähnlicher Mischdiät ohne antibiotische Verbindung 53 607 oder ihre Salze . gefüttert. Sie wurden auch nach 24 h infiziert und dienten als infizierte Kontrollen. Wieder eine andere Gruppe von 3-5 10 Tage alten Kücken wurde mit Mischfutter gefüttert,das frei von antibiotischer Verbindung 53 607 war, und wurden nicht mit Kokzidien infiziert. Diese dienten als normale Kontrollen. Die Ergebnisse der Behandlung wurden nach 5 Tagen im Falle von E. acervulina und nach 6 Tagen für alle anderen ermittelt. Tabelle II faßt die erzielten Ergebnisse zusammen.

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Tabelle II

Art der Eimeria	Infektion tenella	Dosis (TpM) 200	durschnittl. Ver- .. Infektionsgrad hältnis 1,3 0,41	0,32 (0	,37)	Gewichts zunahme (%) 37	(60)
		100	1,0 (1,3)	0,86 (0	,09)	57	(97)
		50	2,7 (0,3)	0,95 (0	,49)	22	(10 2.)
		25	3,0 (1,7)	0,75		47
Eimeria	acervulina	200	1,5	0,60		2
		100	1,2	1,00		22
		50	2,0	1,00		18
		25	2,0	__		7
Eimeria	necatrix	200	——	0,00
		100	0,0	0,11		69
		50	0,2	0,33		99
		25	0,6	0,94		111
Eimeria	maxima	200	1,5	0,50		10
		100	0,8	0,63		37
		50	1,0	0_T88		70
		25	1,4	—		51
Eimeria	brünetti	200	——	0,22		—
		100	0,4	0,55		47
		50	1,0	1,44		49
		25	2,6	4 7

Die zur Messung der Antikokzidien-Aktivität herangezogenen Kriterien bestanden aus Schädigungswerten von 0 bis 4 für Ξ. tenella nach J. E. Lynch "A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity", Am. J. Vet. Res

22., 324-326 (19-61); und 0 bis 3 für die anderen Arten auf der Grundlage einer Abwandlung des Bewertungssystems nach dem Vorschlag von J. Johnson und W. H. Reid "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks", Έχρ. Parasit. 2_8, 30-36 (1970)

Ein konstantes Verhältnis wurde durch Teilen des Schädigungswertes einer jeden behandelten Gruppe durch den Schädigungswert der infizierten Kontrolle aufgestellt.

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Der Wert von Tierfutter wurde allgemein direkt durch Füttern des Tieres bestimmt. Die GB-PS 1 197 826 gibt im einzelnen eine in vitro-Pansentechnik an, wodurch die durch Mikroorganismen bewirkten Änderungen in Futtermitteln leichter und mit größerer Genauigkeit bei der Auswertung von Tierfuttern gemessen werden. Bei dieser Technik wird eine Vorrichtung verwendet, in der die Verdauungsprozesse der Tiere durchgeführt und in vitro untersucht werden. Das Tierfutter, Pansen-Inokulum und verschiedene Wachstumsförderer werden in eine Laboreinheit unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen eingeführt und wieder, ausgebracht und erfolgte Änderungen kritisch und fortschreitend während des Verbrauchs der Nahrung durch die Mikroorganismen untersucht. Eine Steigerunc des Propionsäuregehalts der Pansenflüssigkeit zeigt an, daß eine wünschenswerte Reaktion der gesamten Wiederkäuerleistunc durch den Wachstumsförderer in der Futtermittelzusammensetzung erreicht wurde. Die Änderung im Propionsäuregehalt wird als Prozentsatz des in der Kontroll-Pansenflüssigkeit gefundenen Propionsäuregehalts ausgedrückt. Langfristige in vivo-Futterstudien werden herangezogen, um eine zuverlässige Korrelation zwischen Propionsäurezunahme in der Pansenflüssic keit und verbesserter Tierleistung aufzuzeigen.

Pansenflüssigkeit wird von einer fistelierten Kuh gesammelt, die mit einer handelsüblichen Mastration plus Heu gefüttert wird. Die Pansenflüssigkeit wird sofort durch ein Käsetuch filtriert, und 10 ml werden in einen konischen 50 ml-Kolben gegeben, der 400 mg Standardsubstrat (68 % Maisstärke + 17 % Cellulose + 15 % extrahiertes Sojabohnenmehl), 10 ml eines pH 6,8-Puffers und die Testverbindung enthält. Die Kolben werden mit Sauerstoff-freiem Stickstoff etwa 2 min begast und in einem schüttelnden Wasserbad bei 39°C etwa 16 h inkubiert

Alle Tests werden dreifach durchgeführt.

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Nach Inkubation werden 5 ml der Probe mit 1 ml 25%iger Methaphosphorsäure gemischt. Nach 10 min werden 0,25.ml Ameisensäure zugegeben und das Gemisch bei 1500UpM 10 min zentrifugiert. Proben werden dann durch Gas-Flüssigkeit-Chromatographie nach der Methode von D. W. Kellog, J. Dairy Science 5_2, 1690 (1969) analysiert. Die Peak-Höhen für Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure werden für Proben aus unbehandelten und behandelten Inkubationskolben bestimmt.

Nach dieser in vitro-Arbeitsweise getestet, erbrachte die antibiotische Verbindung 53 607 bei 20 pg/ml etwa 57 %ige Zunahme der Produktion von Propionsäure gegenüber dem Produkt in der Kontrollösung ohne zugesetzte antibiotische Verbindung 53 607. Im Vergleich, dazu erbrachte das im Handel erhältliche Monensin (ein anderes polycyclisch.es Äther-Antibiotikum) bei 10 pg/ml etwa 20 %ige Steigerung der Propionsäure gegenüber der Kontrolle (J. Amer. Chem. Soc. _89_, 5737 (1967)) .

Verglichen mit Salinomycin (J., Antibiotics 2Ί_, 814 (1974)) brachte die antibiotische Verbindung 53 607 etwa 43 %ige Steigerung der Propionsäure bei 20 pg/ml und etwa 40 %ige Steigerung bei 5 pg/ml, verglichen mit der Zunahme von etwa 52 % für Salinomycin bei 5 pg/ml.

Auf der Grundlage dieser Daten kann extrapoliert werden, daß die antibiotische Verbindung 53 607 die Futterverwertung durch Wiederkäuer, wie Rinder und Schafe, und durch monog.astrische Tiere, wie Schweine und Kaninchen, verbessert. Die antibiotische Verbindung 53 607 kann in Futtermittel als freie Säure, Natriumsalz, Kaliumsalz oder deren Gemische eingearbeitet sein. Rohe Formen der antibiotischen Verbindung 53 607 oder getrocknete Fermentationsbrühe mit einem Gehalt des.Antibiotikums können in Futtermittel in Konzentrationen gewünschter Stärke eingearbeitet werden.

24179Ä 1

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Durchführung der Erfindung weiter, es sollte aber klar sein., daß die Erfindung durch diese Beispiele nicht beschränkt wird.

Beispiel

Inokulum

Ein steriles wässriges Medium folgender Zusammensetzung

wurde hergestellt:

Bestandteil g/l

Cerelose 10

Stärke 20

Hefeextrakt 5

NZ-Amin YTT -f) 5

Dikaliumhydrogenphosphat 0,5

Fleischmehl 5

Kobaltchlorid 0,002

Calciumcarbonat 4

O pH 7,1 - 7,2

Zellen einer Schrägkultur von Streptomyces halstedii ATCC 31812 wurden auf eine Reihe von 300 ml-Kolben mit jeweils 40 ml dieses sterilen Mediums übertragen und auf einem Rotationsschüttler bei 28 bis 36°C 3 bis 4 Tage geschüttelt.

Fermentation

Eine Teilmenge der gewachsenen Kultur, ausreichend, um ein 2 Vol/Vol-%iges InOkUl¹Om zu liefern, wurde auf 4 1-Fermentatoren mit jeweils 2 1 des folgenden sterilen Mediums übertragen :

2417 94 1 -»-

Bestandteil g/l -

Cerelose 10

NZ-Amin A +) 5

Stärke 20

Hefeextrakt 5,0

Calciumcarbonat . 1 ,0

Kobaltchlorid 0,002

Wasser zu 1000 ml

+) eingetragenes Warenzeichen für enzymatischen Abbau von Kasein, Humko Sheffield Chemical Co., Inc.

Die Fermentation erfolgte bei 30 C unter Rühren mit 1700 UpM und Belüften mit einem Volumen Luft pro Volumen Brühe pro min, bis wesentliche Aktivität beobachtet wurde (auf der Grundlage antibiotischen Scheibentests gegen B. subtilis ATCC 6633⁺ ), gewöhnlich 3 bis .5 Tage. Die ganze Brühe wurde bei neutralem pH unter Verwendung eines Filterhilfsmittels (Supereel oder CeIite) filtriert, das FiItrat entweder mit Methylisobutylketon oder n-Butanol extrahiert. Die organische Phase wurde von der wässrigen Phase durch Absaugen getrennt und filtriert, um suspendiertes Material zu entfernen. Der Filterkuchen wurde mit Methanol aufgeschlämmt, filtriert, das Methanol verdampft und der Rückstand mit dem gleichen Lösungsmittel extrahiert, das zur Extraktion der filtrierten Brühe verwendet wurde. Die Extrakte wurden vereinigt und im Vakuum zu einem viskosen Öl eingeengt. Das Öl wurde in Heptan suspendiert, mit Kieselgel gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wurde wiederholt mit Heptan gewaschen und das Produkt schrittweise mit Chloroform alleine, Gemischen aus Chloroform und Äthylacetat und schließlich mit Äthylacetat alleine eluiert. Nach Dünnschichtchromatographie und Biotest der Fraktionen wurden die aktiven Fraktionen vereinigt, im Vakuum eingeengt und der Rückstand erneut chromatographiert, um die antibiotische Verbindung 53 607 als Feststoff zu erhalten. IR-Spektrum

24 1 7 9 A 1

(KBr-Preßling), um: 2,95, 3,42, 6,00, 6,37, 6,85, 7,14, 7,30, 7,65, 7,90, 8,10, 9,05, 9,15, 9,67, 10,00, 10,18, 10,53, 11,15, 11,40, 11,75, 13,25. Sie erwies sich als löslich in Chloroform, Äthylacetat, Methanol und Methylisobutylketon; als unlöslich in Wasser.

+) Die Bioaktivität der Brühe und die nachfolgenden Gewinnungsströme wurden unter Verwendung eines empfindlichen Stammes von Bacillus subtilis ATCC 6633 oder Staphylococcus aureus ATCC 6 53 8 verfolgt. Die Komponenten in der Brühe und den Gewinnungsströmen wurden durch Verwendung von Kieselgelplatten in folgendem System sichtbar gemacht: Ähylacetat/Methanol 9:1 oder Chloroform/Methanol 9:1 und die Platte besprüht mit Vanillin (3 g Vanillin in 9 7,0 ml Äthanol und 3,0 ml konz. Schwe-' feisäure) , dann auf 80°C erwärmt. Verbindung 53 607 erscheint als rosafarbener Fleck. Alternativ wurde die Platte mit Agar überlagert, entweder mit S. aureus oder B. subtilis besät, wozu 1,0 ml einer 1%igen Tetrazoliumlösung gegeben wurde, und bei 3 7 C 16 h inkubiert, um das Antibiotikum sichtbar zu machen (klare Bereiche gegen einen rosafarbenen Hintergrund) .

Beispiel 2

Inokulum wurde hergestellt, wie im vorhergehenden Beispiel' beschrieben, außer daß 700 ml Medium pro Kolben verwendet wurden, das Schüttelkolben-Inokulum 3 bis 4 Tage bei 28°C, in zwei Seitenarmflaschen zusammengesetzt, fermentiert wurde

Ein 7730 1(1700 gal)-Fermentator mit 5455'1 (1200 gal) des nachfolgenden sterilen Mediums wurde mit 6 1 (0,1 %) des obigen Inokulums beimpft:

241794 1

Fermentationsmedium

Bestandteil · g/l

Cerelose 1,0

Kasein 5,0

Stärke 5,0

Mais-Quellflüssigkeit 5,0 ml

Calciurncarbonat 3,0

Kobaltchlorid 0,002 Wasser zu 1 1

pH 6,9 - 7,0

Der Fermentator wurde bei 28 C unter Belüften und Rühren mit 1700 UpM gehalten. Nach 120 h wurde der Fermentator abgeerntet. Die ganze Brühe (5455 1 bzw. 1200 gal) wurde mit 1137 1 (250 gal) Methylisobuty !keton extrahiert, die Schichten in einem Extraktor (Podbielniak) getrennt und die organische Phase im Vakuum eingeengt, um 36,4 1 (8 gal) Öl zu erhalten. Das Öl wurde weiter im Vakuum in einem Rotationsverdampfer: eingeengt. Der restliche Sirup wurde in Heptan suspendiert, mit Kieselgel gerührt und filtriert, wobei mehrmals mit Heptan gewaschen wurde. Der gewaschene Filterkuchen.wurde aufgearbeitet, wie in Beispiel 1 beschrieben, um 300 g Öl zu erhalten. Das Öl wurde in einer kleinen Menge Chloroform gelöst, die Lösung auf ein Filter (Lapp) gegossen, das 3,5 kg Kieselgel (Merck, Qualität 60) enthielt und das Kieselgelbett nacheinander mit jeweils 22,7 1 (5 gal) Chloroform, Äthylacetat und Aceton gewaschen. Die Fraktionen wurden dünnschichtchromatcgraphisch geprüft. Das Produkt erwies sich fast ausschließlich als in der Äthylacetatfraktion be- findlich. Die anderen Fraktionen wurden verworfen, die Äthyl-, acetatfraktion im Vakuum zur Trockne eingeengt, um 150 g Konzentrat zu erhalten. Dieses wurde durch Chromatographie an einer 8,0 χ 1000 em-Säule, gepackt mit Kieselgel (Merck, Qualität 60) unter Aufschlämmen mit Äthylacetat, gereinigt.

2417 94 1-»-

Die Säule wurde mit Äthylacetat eluiert, wobei 1 !-Fraktionen mit 60 ml/min genommen wurden. Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt, um 85 g Produkt zu ergeben.

Das Produkt wurde durch eine Säule geführt, die 1 kg Sephadex LH-20 enthielt, wobei mit Methanol bei einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/min eluiert wurde. Es wurden jeweils 300 ml-Fraktionen genommen. Vereinigen der produkthaltigen Fraktionen und Verdampfen des Lösungsmittels lieferte 30 g Feststoff. Dieser wurde in 500 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit einem gleichen Volumen 5 %igen NaH-PO^-Puffers, der mit 85 %iger Phosphorsäure auf pH 4,5 eingestellt worden war, gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit 500 ml 5 % Na₃HPO₄-PUffer, der mit 1 η-Natronlauge auf pH 9,0 eingestellt worden war, gewaschen. Der Extrakt wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in Aceton aufgenommen und konnte im Kühlschrank kristallisieren. Kristalle wurden abfiltriert und unter Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet, um 14g des Natriumsalzes der antibiotischen Verbindung 53 607, Schmp. 199-2O4°C, zu ergeben.

Optische Drehung: / ^a^_7_T) + 44 (c = 1 , Chloroform)

/~^_7_D + 37° (c = 1, Methanol).

UV-Soektrum: Λ , 233 nm (Methanol) E^ =212.

max I cm

IR-Spektrum (KBr-Preßling) pm: 2,95, 3,42, 6,00, 6,37, 6,85, 7,14, 7,30, 7,65, 7,90, 8,10, 9,05, 9,15, 9,67, 10,00, 10,18, 10,53, 11,15, 11,40, 11,75, 13,25.

Das IR-Spektrum ist in Fig. 1 wiedergegeben.

Elementaranalysen:.C 57,54; H 7,74; N 0,0.

Bei Verwendung von KH-PO„ (pH 4,5) und K₂HPO₄-PUffer, mit

2417 94 1

1n -Kalilauge auf 9,0 eingestellt, bei der obigen Arbeitsweise wird das Kaliumsalz der antibiotischen Verbindung 53 607 in analoger Weise erhalten.

Ähnlich wird das Ammoniumsalz durch Verwendung von (NH.)H^PO, und (NH₄J₇HPO. bei der obigen Arbeitsweise erhalten.

B e :i s ρ i el 3

Ein Teil des obigen Natriumsalzes der antibiotischen Verbindung 53 607 wurde in Äthylacetat gelöst, Wasser zugesetzt und die wässrige Phase mit 85 %iger Phosphorsäure auf pH 4,5 eingestellt. Die organische Schicht wurde abgetrennt (über Na^SO.) getrocknet und im Vakuum eingeengt, um die freie Säure der Verbindung 53 607 zu erhalten, Schmp. 84-94^cC Die Elementaranalyse wurde mit einer über Nacht unter Hochvakuum bei Raumtemperatur getrockneten Probe erhalten: C 64,69; H 8,91; N 0,0.

Die Säure erwies sich als in Wasser unlöslich, als löslich in Chloroform, Äthylacetat, Methanol und Methylisobuty!keton.

/~c^_7_D + 74,5° (c - 1, Chloroform) /~^_7_D + 49,7° (c = 1, Methanol)

UV-Spektrum: λ 233 nm (Methanol)- e]^% = 198. ^ max 1 cm

IR-Spektrum (KBr-Preßling), pm: 2,95, 3,45, 6,00, 6,85, 7,28, 8-,13, 9,05, 9,67, 10,20, 1.0,55, 11,15, 11,48

Das Spektrum ist in Fig.. 2 wiedergegeben.

Das Bariumsalz wird durch Schütteln von 2,0 g der freien,

241794 1

in 80 ml Äthylacetat gelösten Säure mit einem gleichen Volumen Wasser, das 2,4 g Bariumhydroxid-Octahydrat enthält, hergestellt. Die Schichten werden getrennt, die organische Phase mit frischer Ba(OH) .8H„0-Lösung gewaschen, (über Na₇SO₄) getrocknet und im Vakuum zum gewünschten Salz der antibiotische. Verbindung 53 607 eingeengt.

Das Calciumsalz wird nach der obigen Arbeitsweise unter Verwendung von Calciumhydroxid anstelle von Bariumhydroxid-Octahydrat, hergestellt.

Beispiel4

Die Arbeitsweise des Beispiels 1 wird durchgeführt, aber unter Verwendung von 4 Vol./Vol.-% Inokulum in 4 1-Fermentatoren, die jeweils 2 1 des folgenden sterilen Mediums enthalten:

Bestandteil g/l

Cerelose 10

Maisstärke _ 10

Sojabohnenmehl 10 Calciumcarbonat 1

fermentierbare Maisfeststoffe 5 Natriumchlorid 5

pH 7,0

Die Fermentation erfolgte 2 Tage bei 36°C unter Rühren mit 1700 UpM und Luftspülen mit 2 Vol./Vol. Brühe pro min. Die ganze Brühe wurde mit Chloroform extrahiert und aufgearbeitet ,' wie in Beispiel 1 beschrieben, um die antibiotische Verbindung 53 607 als Gemisch des Natrium-, Kalium- und Calciumsalzes zu erhalten.

2417S4 1

Wenn die obige Arbeitsweise wiederholt wird, aber unter Verwendung eines Fermentationsmediums, das Glycerin anstelle von Xylose, Fischmehl oder Baumwollsamenmehl anstelle von fermentierbaren Maisfeststoffen enthält, und unter Fermentation bei einem pH von 8,0 bei 28°C für 6 Tage, sind die Ergebnisse praktisch unverändert.

Claims

Erfi.ndungsanspruch

gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus Streptomyces halstedii ATCC 31812 in wässrigen Kulturmedien, die eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthalten, unter aeroben Fermentations-Submers-Bedingungen kultiviert wird, bis eine wesentliche Menge des Antibiotikums erhalten wird.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Antibiotikum vom Fermentationsmedium aboetrennt wird.
3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Fermentationsmedium zur Trockne gebracht wird.