BRPI0806790A2

BRPI0806790A2 - microorganismo, e, método para produzir um l-aminoácido

Info

Publication number: BRPI0806790A2
Application number: BRPI0806790-2A
Authority: BR
Inventors: Rie Takikawa; Yoshihiko Hara
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2007-01-22
Filing date: 2008-01-11
Publication date: 2011-09-13
Also published as: CN101627110B; EP2116595A4; CN101627110A; KR20090112719A; KR101730837B1; WO2008090770A1; EP2116595B1; ES2631360T3; US20100062496A1; BRPI0806790B1; JPWO2008090770A1; US7919284B2; JP5540504B2; EP2116595A1

Abstract

MICROORGANISMO, E, MéTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOáCIDO. Um L-aminoácido pode ser produzido por: cultivar, em um meio de cultura, um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae, a qual é capaz de produzir o L-aminoácido e é modificada de modo que o sistema kdp possa ser potencializado, por esse meio produzindo e acumulando o L-aminoácido no meio de cultura ou em uma célula do microorganismo; e coletando-se o L-aminoácido do meio de cultura ou da célula.

Description

"MICROORGANISMO, Ε, MÉTODO PARA PRODUZIR UM jl- AMINOÁCIDO"

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção diz respeito a um método para produzir um L-aminoácido com o uso de um microorganismo, em particular métodos para produzir um L-aminoácido em que dito L-aminoácido seja o ácido L- glutâmico, L-lisina, L-treonina, L-triptofano ou similar. Estes são L- aminoácidos industrialmente úteis, isto é, o ácido L-glutâmico serve como um aditivo para condimento, e a L-lisina, a L-treonina e o L-triptofano servem como aditivos para a alimentação animal, ingredientes alimentares para a saúde, infusões de aminoácidos, e assim por diante.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

Os L-aminoácidos são industrialmente produzidos por fermentação, com o uso de vários microorganismos. Por exemplo, o ácido L- glutâmico é produzido principalmente pela fermentação utilizando-se bactérias produtoras do ácido L-glutâmico das assim chamadas bactérias corineiforme pertencente aos gêneros Brevibacterium, Corynebacterium ou Microbacterium, ou suas cepas mutantes (ver, por exemplo, o documento não patente 1). Como métodos para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação com o uso de outras cepas bacterianas, métodos de uso de um microorganismo pertencente ao gênero Baeillus, Streptomyees, Penieillium ou similar (referir-se, por exemplo, ao documento de Patente 1), métodos de uso de um microorganismo pertencente ao gênero Pseudomonas, Arthrobaeter, Serratia, Candida ou similar (referir-se, por exemplo, ao documento de Patente 2), métodos de uso de um microorganismo pertencente ao gênero Baeillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobaeter aerogenes (correntemente referido como Enterobaeter aerogenes) ou similar (referir-se, por exemplo, ao documento de Patente 3), métodos de uso de uma cepa mutante de Eseheriehia eoli (referir-se, por exemplo, ao documento de Patente 1), e assim por diante, são conhecidos. Além disso, métodos para produzir o ácido L- glutâmico com o uso de um microorganismo pertencente aos gêneros Klebsiellai Erwinia, Pantoea ou Enterobacteri são também apresentados (referir-se, por exemplo, aos documentos de Patente 2 a 4).

Tais métodos para produzir substâncias alvo tais como os L- aminoácidos por fermentação com o uso de um microorganismo como descrito acima, incluem métodos que usam um microorganismo do tipo selvagem (cepa tipo selvagem), métodos de uso de uma cepa auxotrófica derivada de uma cepa do tipo selvagem, métodos de uso de uma cepa mutante de regulação metabólica derivada de uma cepa do tipo selvagem como uma cepa resistente a qualquer dos vários medicamentos, métodos de uso de uma cepa tendo propriedades tanto da cepa auxotrófica quanto da cepa mutante de regulação metabólica, e assim por diante.

Nos últimos anos, as técnicas de DNA recombinantes são usadas na produção de substâncias alvo mediante fermentação. Por exemplo, a produtividade do L-aminoácido de um microorganismo é melhorada pela intensificação da expressão de um gene codificando uma enzima biossintética do L-aminoácido (Documentos de Patentes 5 e 6), ou pela intensificação do influxo de uma fonte de carbono dentro de um sistema de biossíntese de L- aminoácido (Documento de Patente 7).

O sistema kdp é uma ATPase do tipo P que funciona para absorver íons de potássio (Documento não Patente 2). O sistema kdp é codificado pelo óperon kdp, e sua expressão é induzida quando a concentração dos íons de potássio em um meio é baixa, ou quando a cultura é realizada sob condições hiperosmótica (Documento não Patente 3). Além disso, sabe-se que a expressão é controlada por KdpD e KdpE que constituem um dos sistema de controle binário (Documento não Patente 4). Entretanto, a relação entre a intensificação do sistema kdp e a produção do L-aminoácido não foi até agora pesquisada . Documento de Patente 1: Patente Japonesa Aberta ao Público (KOKAI) n° 5-244970

Documento de Patente 2: Patente U.S. n° 3.563.857

Documento de Patente 3: Publicação da Patente Japonesa (KOKOKU) n° 32-9393

Documento de Patente 4: Patente Japonesa Aberta ao Público n° 2000-189175

Documento de Patente 5: Patente U.S. n° 5.168.056

Documento de Patente 6: Patente U.S. n° 5.776.736

Documento de Patente 7: Patente U.S. n° 5.906.925

Documento não Patente 1: Kunihiko Akashi et al., iiAmino acidfermentation", pp.195-215, 1986, Japan Scientific Societies Press

Documento não Patente 2: Laimonis A. Laimins5 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, julho de 1978, 75(7): 3216-3219

Documento não Patente 3: Laimonis A. Laimins, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, janeiro de 1981, 78(1): 464-468

Documento não Patente 4: Mark O. Walderhaug, J. Bacteriol., abril de 1992, 174 (7): 2152-2159

APRESENTAÇÃO DA INVENÇÃO OBJETO PARA SER ALCANÇADO PELA INVENÇÃO

Um objeto da presente invenção é prover um microorganismo que pertença à família Enterobaeteriaeeae e seja capaz de eficientemente produzir um L-aminoácido, e prover um método de produzir eficientemente um L-aminoácido com o uso de um tal microorganismo.

MEIOS PARA SE ALCANÇAR O OBJETO

Os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas a fim de alcançar o objeto acima mencionado e, como um resultado, observaram que os L-aminoácidos poderiam ser eficientemente produzidos mediante o uso de um microorganismo do qual o sistema kdp foi intensificado, e assim concluíram a presente invenção.

Isto é, a presente invenção provê os seguintes itens:

(1) um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae5 o qual tem a capacidade de produzir L-aminoácidos e foi modificado de modo que o sistema kdp seja intensificado.

(2) O microorganismo acima mencionado, em que o sistema kdp é intensificado pelo aumento da expressão do óperon de kdp ou um ou mais genes constituindo o óperon de kdp, e/ou aumentando a translação do óperon de kdp ou os genes.

(3) O microorganismo acima mencionado, em que o sistema kdp é intensificado pelo aumento do número de cópias do óperon de kdp ou um ou mais genes constituindo o óperon de kdp, ou modificando uma seqüência de controle da expressão do óperon.

(4) O microorganismo acima mencionado, em que o óperon de kdp contenha pelo menos os genes kdp A, kdpB e kdpC.

(5) O microorganismo acima mencionado, em que o gene kdpA é um gene codificando uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 ou 8 ou a subunidade A do sistema kdp tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 8 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos.

(6) O microorganismo acima mencionado, em que o gene kdpB é um gene codificando uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3 ou 9 ou a subunidade B do sistema kdp tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou 9 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos.

(7) O microorganismo acima mencionado, em que o gene kdpC é um gene codificando uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ BD NO: 4 ou 10 ou a subunidade C do sistema kdp tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 10 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos.

(8) O microorganismo acima mencionado, em que o óperon de kdp é um DNA definido em qualquer um dos seguintes itens (a) a (d):

(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos números 546 a 4871 da SEQ ID NO: 1,

(b) um DNA que hibridiza com a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos números 546 a 4871 da SEQ ED NO: 1 ou uma sonda preparada com a seqüência de nucleotídeos sob condições estringentes e codificando o sistema kdp,

(c) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos números 543 a 4853 da SEQ ID NO: 7,

(b) um DNA que hibridiza com a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos números 543 a 4853 da SEQ ID NO: 7 ou uma sonda preparada da seqüência de nucleotídeos sob condições estringentes e codificando o sistema kdp.

(9) O microorganismo acima mencionado, em que o L- aminoácido é uma ou mais espécies de L-aminoácidos selecionados do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-lisina, L-treonina, L-arginina, L- histidina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina, L-fenilalanina, L-tirosina, L- triptofano e L-cisteína.

(10) O microorganismo acima mencionado, em que o microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae é uma bactéria Escherichia, uma bactéria Enterobacter ou uma bactéria Pantoea.

(11) Um método para produzir um L-aminoácido, que compreende cultivar o microorganismo acima mencionado em um meio para produzir e acumular um L-aminoácido no meio ou nas células, e coletar o L- aminoácido do meio ou das células.

(12) O método supramencionado, em que o L-aminoácido constitui uma ou mais espécies de L-aminoácidos selecionados do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-lisina5 L-treonina, L-arginina, L- histidina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina, L-fenilalanina, L-tirosina, L- triptofano e L-cisteína.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um desenho que mostra a estrutura do plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER.

A Figura 2 é um desenho que mostra a construção do plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER.

A Figura 3 é um desenho que mostra a estrutura da região do cromossoma de P. ananatis localizando-se a montante do gene LacZ.

A Figura 4 é um gráfico que mostra o crescimento da cepa substituída pelo promotor do óperon de kdp na cultura sob condição acídica no tubo de teste.

A Figura 5 é um gráfico que mostra a produtividade do ácido L-glutâmico da cepa substituída pelo promotor do óperon de kdp.

A Figura 6 é um desenho que mostra o alinhamento das seqüências de aminoácidos do KdpA de Pantoea ananatis (SEQ ID NO: 8) e de Escherichia coli (SEQ ID NO: 2), e da seqüência de consenso delas (SEQ ID NO: 57).

A Figura 7 é um desenho que mostra o alinhamento das seqüências de aminoácidos do KdpB de Pantoea ananatis (SEQ ID NO: 9) e de Eseheriehia coli (SEQ ID NO: 3), e da seqüência de consenso delas (SEQ ID NO: 58).

A Figura 8 é um desenho que mostra o alinhamento das seqüências de aminoácidos do KdpC de Pantoea ananatis (SEQ ID NO: 10) e de Eseheriehia coli (SEQ ID NO: 4), e da seqüência de consenso delas (SEQ ID NO: 59).

MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO

Daqui por diante a presente invenção será explanada em detalhes.

<1> MICROORGANISMO DA PRESENTE INVENÇÃO

O microorganismo da presente invenção é um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae, a qual tem uma capacidade de produzir o L-aminoácido e foi modificado de modo que o sistema kdp seja intensificado. A capacidade de produzir o L-aminoácido aqui referida significa uma capacidade do microorganismo da presente invenção para produzir e acumular um L-aminoácido em um meio ou células em uma quantidade em que o L-aminoácido possa ser coletado do meio ou das células, quando o microorganismo seja cultivado no meio. O microorganismo da presente invenção pode ter uma capacidade de produzir duas ou mais espécies de L-aminoácidos. O microorganismo tendo capacidade de produzir L- aminoácidos pode ser um microorganismo inerentemente tendo uma capacidade de produzir L-aminoácidos, ou um microorganismo obtido pela modificação de tais microorganismos como descrito abaixo, de modo a ter uma capacidade de produzir L-aminoácidos com o uso de um método de mutação ou de técnicas de DNA recombinantes.

O tipo do L-aminoácido não é particularmente limitado, e os exemplos incluem aminoácidos básicos tais como L-lisina, L-ornitina, L- arginina, L-histidina e L-citrulina, aminoácidos alifáticos tais como a L- isoleucina, L-alanina, L-valina, L-Ieucina e L-glicina, aminoácidos que sejam ácidos hidroximonoaminocarboxílicos tais como a L-treonina e a L-serina, aminoácidos cíclicos tais como a L-prolina, aminoácidos aromáticos tais como a L-fenilalanina, L-tirosina e L-triptofano, aminoácidos contendo enxofre tais como a L-cisteína, L-cistina e L-metionina, e aminoácidos acídicos tais como o ácido L-glutâmico, o ácido L-aspártico, a L-glutamina e a L-asparagina. O ácido L-glutâmico, a L-lisina, a L-treonina e o L-triptofano são especialmente preferidos. O microorganismo da presente invenção pode ter uma capacidade de produzir duas ou mais espécies de aminoácidos. <1-1> TRANSMISSÃO DA CAPACIDADE DE PRODUZIR L-AMINOÁCLDOS

Exemplos dos métodos para transmitir a capacidade de produzir L-aminoácidos e microorganismos utilizáveis na presente invenção, aos quais a capacidade de produzir L-aminoácidos é comunicada, serão descritos abaixo. Entretanto, o microorganismo não fica limitado a estes, contanto que um microorganismo tendo a capacidade de produzir L- aminoácidos seja usado.

Microorganismos usados para a presente invenção incluem opcionalmente substituído microorganismos pertencentes aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella, Morganella, ou similar, contanto que eles pertençam à família Enterobacteriaceae e tenham uma capacidade de produzir L-aminoácido. Em particular as bactérias classificadas dentro da família Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada pela base de dados da NCBI (National Center for Biotechnology Information)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347) podem ser usadas. Como cepas precursoras das Enterobaeteriaeeae que devam ser modificadas, as bactérias pertencentes aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Erwinia, Enterobacter ou Klebsiella são preferivelmente usadas.

A cepa precursora das bactérias de Escherichia usadas de modo a se obter uma bactéria de Escherichia da presente invenção, não é particularmente limitada. Aquelas descritas no trabalho de Neidhardt et ai. (Backmann, B. J., 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, pp. 2460-2488, Tabela 1, em F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Segunda Edição, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.) podem ser utilizadas. Entre elas, por exemplo, a Escherichia coli é exemplificada. Exemplos de Eseheriehia eoli incluem a cepa W3110 (ATCC na 27325), a cepa MG1655 (ATCC na 47076), e assim por diante, as quais são derivadas de uma cepa protótipo do tipo selvagem, a cepa Kl 2.

Estas cepas acham-se disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection (ATCC) (Endereço: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América) Isto é, cada cepa recebe um único número de registro (http://www.atcc.org/). As cepas podem ser ordenadas pelo uso deste número de registro. O número de registro de cada cepa acha-se listado no catálogo da ATCC.

Exemplos das bactérias Enterobaeter incluem, Enterobaeter agglomerans, Enterobaeter aerogenes e assim por diante. Exemplos das bactérias Pantoea incluem a Pantoea ananatis. Nos últimos anos, algumas bactérias de Enterobaeter agglomerans foram reclassificadas como Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis ou Pantoea stewartii, com base na análise da seqüência de nucleotídeos dos rRNA 16S etc. Na presente invenção, o microorganismo pode pertencer ou ao gênero Enterobaeter ou ao Pantoea, contanto que o microorganismo seja classificado dentro da família Enterobaeteriaeeae .

Em particular, as bactérias Pantoea, as bactérias Erwinia e as bactérias Enterobaeter são classificadas como γ-proteobactérias, e elas se acham taxonomicamente muito próximas uma da outra (J. Gen. Appl. Microbiol9 1997, 43, 355-361; Int. J. Syst. Bacteriol9 1997, 43, 1061-1067). Nos últimos anos, algumas bactérias pertencentes ao gênero Enterobaeter foram reclassificadas como Pantoea agglomerans, Pantoea dispersa, ou similar, com base nas experiências de hibridização de DNA-DNA etc. {International Journal of Systematie Bacteriology9 julho de 1989, 39: 337- 345). Além disso, algumas bactérias pertencentes ao gênero Erwinia foram reclassificadas como Pantoea ananas ou Pantoea stewartii (referir-se ao Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 162-173).

Exemplos das bactérias de Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, e assim por diante. Especificamente, as cepas exemplificadas na Patente Européia Aberta ao Público n° 952221 podem ser usadas.

Uma cepa típica do gênero Enterobaeter é a cepa Enterobaeter agglomeranses ATCC 12287.

Cepas típicas das bactérias Pantoea incluem as Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans e Pantoea eitrea. Exemplos específicos incluem as seguintes cepas:

Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614, Patente Européia Aberta ao Público ne 0952221)

Pantoea ananatis AJl3356 (FERM BP-6615, Patente Européia Aberta ao Público ne 0952221)

Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207, Patente Européia Aberta ao Público ns 0952221)

Não obstante estas cepas terem sido identificadas e depositadas como Enterobacter agglomerans quando foram isoladas, elas são correntemente classificadas como Pantoea ananatis com base na análise da seqüência de nucleotídeos do rRNA 16S etc., como descrito acima.

Exemplos das bactérias Erwinia incluem as Erwinia amylovora e as Erwinia earotovora, e exemplos das bactérias Klebsiella incluem a Klebsiella plantieola. Exemplos específicos incluem as seguintes cepas:

Erwinia amylovora ATCC 15580 Erwinia earotovora ATCC 15713

Klebsiella plantieola AJ13399 (FERM BP-6600, Patente Européia Aberta ao Público n° 955368) Klebsiella planticola AJ13410 (FERM BP-6617, Patente Européia Aberta ao Público n2 955368).

Daqui por diante, os métodos para comunicar uma capacidade de produção de L-aminoácidos às bactérias de Enterobacteriaceae, ou métodos para intensificar uma capacidade de produção de L-aminoácidos de tais bactérias, são descritos.

Para comunicar uma capacidade de produzir um L- aminoácido, os métodos convencionalmente empregados na reprodução das bactérias corineformes ou das bactérias do gênero Escherichia (ver iiAmino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1- Edição, publicada em 30 de maio de 1986, pp. 77-100) podem ser usados. Tais métodos incluem a aquisição de um mutante auxotrófico, uma cepa resistente analógica, ou um mutante de regulação metabólica, a construção de uma cepa recombinante em que a expressão de uma biossíntese de L-aminoácido seja intensificada, e assim por diante. Aqui, na reprodução de uma bactéria produtora de L- aminoácidos, as propriedades transmitidas, tais como uma mutação auxotrófica, a resistência analógica, ou a mutação de regulação metabólica, podem ser uma ou mais. A expressão da(s) enzima(s) de biossíntese de L- aminoácidos pode ser intensificada isoladamente ou em combinações de duas ou mais. Além disso, os métodos de comunicar propriedades tais como uma mutação auxotrófica, resistência analógica, ou mutação de regulação metabólica, podem ser combinados com os métodos de intensificar as enzimas de biossíntese.

Uma cepa mutante auxotrófica, a cepa resistente analógica de L-aminoácido, ou a cepa mutante de regulação metabólica com uma capacidade de produzir um L-aminoácido, podem ser obtidas submetendo-se uma cepa precursora ou uma cepa do tipo selvagem a mutagênese convencional, tal como a exposição dos raios-X ou a irradiação de UV, ou o tratamento com um mutágeno tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), metanossulfonato de etila (EMS), etc., depois selecionando-se aqueles que apresentem autotrofismo, resistência analógica, ou uma mutação de regulação metabólica, e que também tenham uma capacidade de produzir um L-aminoácido.

As bactérias produtoras de L-aminoácido ou os métodos de construção para tal, são exemplificados abaixo.

BACTÉRIAS PRODUTORAS DE ÁCIDO L-GLUTÂMICO

Primeiramente, as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico são explanadas como bactérias produtoras de L-aminoácido.

Exemplos das cepas precursoras para originar bactérias produtoras de ácido L-glutâmico da presente invenção, incluem, sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tais como E. coli VL334thrC+ (Patente Européia n2 1172433). E. coli VL334 (VKPM B-1641) é uma cepa auxotrófica de L-isoleucina e L-treonina tendo mutações nos genes thrC e ilvA (Patente U.S. n2 4.278.765). Um alelo do tipo selvagem do gene thrC foi transferido pelo método de transdução geral com o uso de um bacteriófago Pl crescido nas células da cepa Kl2 de E. coli do tipo selvagem (VKPM B-7). Como resultado, uma cepa auxotrófica de L-isoleucina VL334thrC+ (VKPM B-8961) foi obtida.

Exemplos dos métodos para comunicar a capacidade de produzir o ácido L-glutâmico a uma bactéria, ou intensificar a capacidade de uma bactéria, incluem, por exemplo, modificar uma bactéria de modo que a expressão de um gene codificando uma enzima envolvida na biossíntese do ácido L-glutâmico seja intensificada.

Exemplos de enzimas envolvidas na biossíntese do ácido L- glutâmico incluem a glutamato desidrogenase (doravante também referida como "GDH") (gdh), a glutamina sintetase (glnA), a glutamato sintetase (gltAB), a isocitrato desidrogenase (icdA), a aconitato hidratase (acnA, acnB), a citrato sintase (daqui por diante também referida como "CS" (gltA), metilcitrato sintase (daqui por diante também referida como "PRPC" (prpC), fosfoenolpiruvato carboxilase (daqui por diante também referida como "PEPC" (ppc), a piruvato carboxilase (pyc), a piruvato desidrogenase (aceEF\ IpdÁ), piruvato cinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgml), fosfoglicerato cinase (pgk), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (ípiA), frutose bisfosfato aldolase ifbp), fosfofrutocinase (pfkA, pfkB) e glicose fosfato isomerase (pgi), e assim por diante. As abreviaturas entre parênteses são os nomes dos genes que correspondem às enzimas, e esta convenção é usada na totalidade deste relatório descritivo. Entre estas enzimas, um ou mais dentre CS ou PRPC, PEPC e GDH são preferidas, e todas as três enzimas são mais preferidas (referir-se à WO 2006/051660).

Métodos para modificar uma bactéria para aumentar a expressão dos genes alvo serão elucidados abaixo.

O primeiro método é um método de aumentar o número de cópias de um gene alvo. Por exemplo, o número de cópias de um gene alvo pode ser aumentado pela clonagem do gene alvo em um plasmídeo apropriado e transformando-se uma bactéria hospedeira com o plasmídeo obtido. Por exemplo, quando o gene alvo é o gene que codifica CS (gene gltA), o gene que codifica PRPC (gene prpC), o gene que codifica PEPC (gene ppc) ou o gene que codifica GDH (gene gdhA), as seqüências de nucleotídeos destes genes das bactérias Escherichia e das bactérias Corynebacterium já terão sido elucidadas (Bioehemistry, vol. 22, pp. 5243-5249, 1983; J. Biochem., vol. 95, pp. 909-916, 1984; Gene, vol. 27, pp. 193-199, 1984; Mierobiology, vol. 140, pp. 1817-1828, 1994; Mol Gen. Genet., volume 218, pp. 330-339, 1989; Molecular Mierobiology, volume 6, pp. 317-326, 1992) e, portanto, elas poderão ser obtidas pela sintetização de iniciadores com base nas respectivas seqüências de nucleotídeos, e realizando-se a PCR com o uso de DNA cromossômico de uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae como o padrão.

Exemplos do plasmídeo usado para a transformação incluem um plasmídeo que autonomamente replica na bactéria hospedeira pertencente à família Enterobacteriaceae, tal como pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29 (pHSG e pSTV acham-se disponíveis da Takara Bio Inc.), pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (os vetores pMW acham-se disponíveis da Nippon Gene Co., Ltd.), e assim por diante. Além disso, um DNA de fago pode também ser usado como o vetor, ao invés de um plasmídeo. Exemplos de plasmídeo para simultaneamente intensificar as atividades de CS ou PRPC, PEPC e CDH descritos acima, incluem RSFCPG incorporados com o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA (referir-se à Patente Européia Aberta ao Público n2 0952221), e RSFPPG correspondendo a RSFCPG, em que o gene gltA é substituído pelo gene prpC (referir-se aos exemplos).

Exemplos de métodos de transformação incluem o tratamento de células receptoras com cloreto de cálcio de modo a aumentar a permeabilidade do DNA, o que foi relatado quanto a Eseherichia eoli K-12 (Mandei, M. e Higa, A., 1970, J. Mol. Biol., 53: 159-162), e preparando-se as células competentes a partir das células que se achem na fase de crescimento, seguido pela transformação com DNA, o que foi relatado quanto ao BaciUus subtilis (Duncan, C. H., Wilson, G. A. e Young, F. E. 1977, Gene, 1: 153- 167). Alternativamente, um método de produzir células receptoras de DNA em protoplastos ou esferoplastos, que podem facilmente absorver DNA recombinante, seguido pela introdução do DNA recombinante nas células, o que é conhecido como sendo aplicável a Baeillus subtilis, actinomicetos e leveduras (Chang, S. e Choen, S. N., 1979, Mol Gen. Genet., 168: 111-115; Bibb, M. J. et ai, 1978, Naturet 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. e Fink, G. R. 1978, Proe. Natl. Sei., USA, 75: 1929-1933), pode também ser empregado. Além disso, os microorganismos podem também ser transformados pelo método do pulso elétrico (Patente Japonesa Aberta ao Público n2 2-207791).

O número de cópias de um gene pode também ser aumentado pela introdução de cópias múltiplas do gene no DNA cromossômico do microorganismo, o que pode ser realizado por recombinação homóloga (MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory) com o uso de cópias múltiplas de uma seqüência como alvos no DNA cromossômico. As seqüências presentes nas cópias múltiplas no DNA cromossômico incluem os DNAs respectivos, e as repetições invertidas presentes na extremidade de um elemento transponível. Igualmente, como apresentado na Patente Japonesa Aberta ao Público n2 2-109985, é possível incorporar o gene alvo em um transpóson, e possibilitar que ele seja transferido para introduzir cópias múltiplas do gene para o DNA cromossômico. O gene alvo pode também ser introduzido no cromossoma bacteriano por fago Mu (Patente Japonesa Aberta ao Público n2 2-109985), ou similar.

O segundo método é aumentar a expressão do gene alvo pela substituição de uma seqüência reguladora da expressão do gene alvo, tal como um promotor, sobre o DNA cromossômico ou plasmídeo com um promotor mais forte. Por exemplo, o promotor lac, o promotor trp, o promotor trc, o promotor PR, o promotor lacUV, etc., são conhecidos como promotores fortes. Além disso, é também possível substituir vários nucleotídeos na região do promotor de um gene, de modo que o promotor seja modificado para ser mais forte, como apresentado na Publicação da Patente Internacional WO 00/18935. Exemplos de promotores fortes e de métodos para avaliar a intensidade dos promotores, são descritos em um artigo de Goldstein et ai. {Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128), etc.

A substituição de uma seqüência reguladora da expressão pode ser realizada, por exemplo, da mesma maneira como na substituição do gene com o uso de um plasmídeo sensível à temperatura. Exemplos de vetores que tenham uma origem de replicação sensível à temperatura e utilizável para a bactéria da presente invenção pertencente à família Enterobacteriaceae incluem por exemplo, o plasmídeo pMAN997 descrito na Publicação Internacional WO 99/03988, e assim por diante.

Além disso, sabe-se que as substituições de vários nucleotídeos em um espaçador entre o sítio de ligação ribossômica (RMS) e o códon de partida, em particular uma seqüência imediatamente a montante do códon de partida, afetam grandemente a eficiência da translação do mRNA. Pela modificação destas, a quantidade de translação pode ser melhorada.

A modificação de uma seqüência de controle da expressão pode ser combinada com o método de aumentar o número de cópias de um gene descrito acima.

Exemplos dos métodos para a substituição de genes conforme descrito acima, incluem os métodos que empregam DNA linear, tais como o "Red-driven integration" [Datsenko, K. A. e Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 97: 6640-6645 (2000)], e o Red-driven integration em combinação com o sistema de excisão de fago λ (Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. 20 2002, J. Bacteriol., 184: 5200-5203) (WO 2005/010175), e assim por diante, métodos que usam um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura, métodos que usam um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, métodos que utilizam um vetor suicida que não tenha uma origem de replicação utilizável no hospedeiro escolhido (Patente U.S. n° 6.303.383, Patente Japonesa Aberta ao Público na 05-007491) etc.

Como mostrado no Exemplo de Referência 1, uma cepa resistente ao produto de gene Red λ, por exemplo a cepa de Pantoea ananatis SC17 (0), pode ser adequadamente usada para a integração conduzida de Red. A cepa SC17 (0) foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika (Rússia, 117545 Moscou 1, Dorozhny proezd. 1) em 21 de setembro de 2005, sob o número de acesso da VKPM B-9246.

Exemplos de microorganismos modificados pelo método descrito acima, de modo que a expressão do gene da citrato sintase, do gene da citrato de metila sintase, do gene da fosfoenolpiruvato carboxilase e/ou do gene de glutamato desidrogenase seja intensificada, incluem os microorganismos descritos nas Patentes Japonesas Abertas ao Público n^os 2001-333769, 2000-106869, 2000-189169 2000-333769, 2006-129840, WO 2006/051660, e assim por diante.

Além disso, a capacidade de produzir o ácido L-glutâmico pode também ser transmitida pela intensificação da atividade da 6- fosfogliconato desidratase, da atividade da 2-ceto-3-desóxi-6-fosfogliconato aldolase, ou de ambas estas atividades. Exemplos do microorganismo do qual a atividade da 6-fosfogliconato desidratase e a atividade da 2-ceto-3-desóxi-6- fosfogliconato aldolase são aumentadas, incluem o microorganismo apresentado na Patente Japonesa Aberta ao Público n2 2003-274988.

A modificação para transmitir a capacidade de produzir o ácido L-glutâmico ou de intensificá-la, pode também ser alcançada pela redução ou eliminação da atividade de uma enzima que catalise uma reação que se ramifique da via da biossíntese do ácido L-glutâmico, e produção de um composto outro que não o ácido L-glutâmico. Exemplos de uma tal enzima que catalise uma reação que se ramifique da via de biossíntese do ácido L-glutâmico e produza um composto outro que não o ácido L- glutâmico, incluem 2-oxoglutarato desidrogenase [α-cetoglutarato desidrogenase (sucA)], isocitrato liase (aceA), fosfato acetiltransferase (pta), acetatocinase (ack), ácido acetoidróxi sintase (ilvG), acetolactato sintase (ilvI), formiato acetiltransferase (pf7), lactato desidrogenase (Idh), glutamato descarboxilase (gadAB), 1-pirrolina-5-carboxilato desidrogenase (putA), e assim por diante. É particularmente preferível reduzir ou eliminar a atividade da 2-oxoglutarato desidrogenase entre estas enzimas.

A fim de reduzir ou eliminar as atividades das enzimas acima mencionadas, as mutações para reduzir ou eliminar as atividades intracelulares das enzimas podem ser introduzidas nos genes das enzimas supramencionadas mediante um tratamento usual de mutagênese ou uma técnica de engenharia genética. Exemplos do tratamento de mutagênese incluem, por exemplo, métodos que utilizam a irradiação de raio-x ou o raio ultravioleta, métodos que utilizam o tratamento com um mutágeno tal como a N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, e assim por diante. O local do gene em que a mutação é introduzida pode ser uma região codificadora codificando uma proteína enzimática ou uma região para regular a expressão tal como um promotor. Exemplos das técnicas de engenharia genética incluem métodos que usam recombinação genética, transdução, fusão celular, e assim por diante.

O decréscimo ou a deficiência da atividade intracelular de uma enzima alvo e o grau de decréscimo na atividade podem ser confirmados pela medição da atividade enzimática em um extrato celular ou uma sua fração purificada obtida de uma cepa candidata e comparando-a com aquela de uma cepa do tipo selvagem. Por exemplo, a atividade da 2-oxoglutarato desidrogenase pode ser medida pelo método de Reed et ai. [L. J. Reed e Β. B. Mukherjee, Methods in Enzymology, 13, pp. 55-61 (1969)].

As bactérias pertencentes ao gênero Escherichia deficientes na atividade de 2-oxiglutarato desidrogenase ou tendo um atividade reduzida de 2-oxiglutarato desidrogenase, incluem as seguintes cepas (Patentes U.S. n~ 5.378.616 e 5.573.945):

E. coli W3110sucA::Kmr

E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)

E. coli AJ12628 (FERM BP-3854) Ε. coli AJ12949 (FERM ΒΡ-4881)

Ε. coli W311 OsucA: :Kmr é uma cepa obtida pelo rompimento do gene de 2-oxoglutarato desidrogenase (gene sue A) de E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente na α-cetoglutarato desidrogenase.

Especificamente, os exemplos de bactéria em que a atividade da 2-oxoglutarato desidrogenase é deletada ou reduzida, incluem as seguintes cepas

Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207, Patente Européia Aberta ao Público n2 1078989)

Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615, Patente dos Estados Unidos nfi 6.331.419)

Pantoea ananatis SC17sucA (FERM BP-8646, WO 2005/

085419)

Klebsiella planticola cepa AJ13410 (FERM BP-6617, Patente dos Estados Unidos n° 6.197.559)

A cepa SC17sucA é uma cepa obtida pela seleção de uma cepa mutante (SC17) de baixa produção de phlegm da cepa AJ13355, que foi isolada da natureza como uma cepa que poderia proliferar em um meio contendo o ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono em baixo pH, e rompendo o gene da 2-oxoglutarato desidrogenase (sucA) da cepa mutante. A cepa AJ13601 foi obtida pela introdução de um plasmídeo RSFCPG contendo os genes gltA, ppc e gdhA derivados de Escherichia coli e um plasmídeo pSTVCB contendo o gene gltA derivado da Brevibacterium lactofermentum dentro da cepa SC17sucA para se obter a cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, e pela seleção de uma cepa resistente ao ácido L-glutâmico de alta concentração em baixo pH, e uma cepa apresentando um elevado grau de proliferação e uma elevada capacidade de produzir o ácido L-glutâmico da cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB (Patente Européia Aberta ao Público n° 0952221). A cepa AJ13356 foi obtida pela eliminação do gene da subunidade aKGDH-El {sueA) da cepa AJl3355. Além disso, a cepa NP106 descrita nos exemplos corresponde à cepa AJ13 601, da qual o plasmídeo RSFCPG+pSTVCB é eliminado.

As cepas Pantoea ananatis AJ13355 e AJ13356 foram depositadas em 19 de fevereiro de 1998 no National Institute of Bioscience and Human Technology da Agency of Industrial Science and Technology (correntemente agência administrativa independente, o National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, 305-8566, Japão), com os números de depósito FERM P-16644 e FERM P-16645 respectivamente, e transferidas do depósito original para o depósito internacional com base no Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999, e foi depositados sob os números de acesso FERM BP-6644 e FERM BP-6615, respectivamente. À cepa SC17sucA foi atribuído um número individual AJ417, e foi depositado no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, código postal: 305-8566) em 26 de fevereiro de 2004, tendo sido atribuído um número de acesso FERM BP-08646. A cepa de Pantoea ananatis AJ13601 foi depositada em 18 de agosto de 1999 no National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (correntemente uma agência administrativa independente, o National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba- shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão), com o número de depósito FERM P- 17156, e transferida do depósito original para o depósito internacional com base no Tratado de Budapeste em 6 de julho de 2000, e foi depositada sob o número de acesso FERM BP-7207.

As cepas de Pantoea ananatis AJ13355, AJ13356eAJ13601 e a cepa de Klebsiella planticola AJl 3399 têm uma capacidade de acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade que excede a quantidade que fornece a concentração de saturação do ácido L-glutâmico em um meio líquido quando é cultivado sob condições acídicas.

Além disso, de modo a melhorar a capacidade de produzir ácido L-glutâmico das bactérias de Enterobacteriaceae, o método de eliminar o gene arcA (Patente U.S. ns 7.090.998), e o método de amplificar o gene yhflC, que é um gene de secreção do ácido glutâmico (WO 2005/085419 panfleto), também pode ser usado.

O método acima mencionado de intensificar ou eliminar a atividade enzimática, é de forma semelhante aplicável a outros aminoácidos produtores das bactérias, descritos abaixo.

BACTÉRIAS PRODUTORES DA L-TREONINA

Exemplos de cepas precursoras para originar as bactérias produtoras da L-treonina da presente invenção incluem, porém sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tais como E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (Patentes U.S. n- 5.175.107, Patentes U.S. n~ 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (Patente U.S. n2 5.631.157), E. coli NRRL-21593 (Patente U.S. n2 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (Patente U.S. n2 5.474.918), E. coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (Patente U.S. no 5.376.538), E. coli MG442 [Gusyatiner et ai., Genetika (em Russo), 14, 947-956 (1978)], E. coli VL643 e VL2055 (Patente Européia Aberta ao Público η2 1149911), e outras.

A cepa TDH-6 é deficiente no gene thrC, bem como assimilativa a sacarose, e o seu gene ilvA tem uma mutação permeável. Esta cepa também tem uma mutação no gene rhtA, que comunica resistência às altas concentrações de treonina ou de homosserina. A cepa B-3996 contém o plasmídeo pVIC40, que foi obtido pela inserção de um óperon thrA *BC que inclui um gene mutante thrA em um vetor originado de RSFl010. Este gene mutante thrA codifica a homosserina aspartocinase desidrogenase I que substancialmente dessensibilizou a inibição da retroalimentação pela treonina. A cepa B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 no All-Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105, Moscou, Federação Russa) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa também foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rússia, 117545 Moscou, 1 Dorozhny proezd. 1) em 7 de abril de 1987, sob o número de acesso VKPM B-3996.

A E. coli VKPM B-5318 (Publicação da Patente Européia rr 0593792) também pode ser usada como uma cepa precursora para originar as bactérias produtoras da L-treonina da presente invenção. A cepa B-5318 é prototrófica com respeito à isoleucina, e um repressor de λ-fago Cl sensível à temperatura e o promotor PR substituem a região reguladora do óperon da treonina no plasmídeo pVIC40. A cepa VKPM B-5318 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) em 3 de maio de 1990, sob o número de acesso VKPM B-5318.

Preferivelmente a bactéria da presente invenção é adicionalmente modificada para intensificar a expressão de um ou mais dos seguintes genes:

- gene mutante thrA que codifica a homosserina aspartocinase desidrogenase I resistente à inibição da retroalimentação pela treonina;

- gene thrB que codifica a homosserina cinase;

- o gene thrC que codifica a treonina sintase;

- o gene rhtA que codifica uma proteína putativa da transmembrana;

- o gene asd gene que codifica a aspartato^-semialdeído desidrogenase; e

- o gene aspC que codifica a aspartato aminotransferase (aspartato transaminase). O gene thrA que codifica a homosserina aspartocinase desidrogenase I de Escherichia coli foi elucidado (posições dos nucleotídeos 337 a 2799, acesso do GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrA se localiza entre os genes thrL e thrB no cromossoma de E. coli K-12. O gene thrB que codifica a homosserina cinase de Eseheriehia coli foi esclarecido (posições dos nucleotídeos 2801 a 3733, acesso do GenBank NC 000913.2, gi: 49175990). O gene thrB se localiza entre os genes thrA e thrC no cromossoma de E. coli K-12. O gene thrC que codifica a treonina sintase de Escherichia coli foi esclarecido (posições dos nucleotídeos 3734 a 5020, acesso do GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrC se localiza entre o gene thrB e a matriz de leitura aberta yaaX no cromossoma de E. coli K-12. Todos os três genes funcionam como um óperon de treonina único. Para intensificar a expressão do óperon da treonina, a região atenuadora que afeta a transcrição é desejavelmente removida do óperon (WO 2005/049808, WO 2003/097839).

Um gene mutante thrA, que codifica a homosserina aspartocinase desidrogenase um resistente à inibição da retroalimentação pela treonina, bem como os genes thrB e thrC, podem ser obtidos como um óperon do bem conhecido plasmídeo pVIC40 que se acha presente na cepa VKPM B- 3996 de E. coli produtora da treonina. O plasmídeo pVIC40 é descrito em detalhes na Patente U.S. nfi 5.705.371.

O gene rhtA existe em 18 min sobre o cromossoma de E. coli perto do óperon glnHPQ, o qual codifica os componentes do sistema de transporte da glutamina. O gene rhtA é idêntico ao ORFl (genQybiF, posições dos nucleotídeos 764 a 1651, número de acesso do GenBank AAA218541, gi:440181) e se localiza entre os genes pexB e ompX. A unidade expressando uma proteína codificada pelo ORFl foi designada como o gene rhtA ( rht: resistência às homosserina e treonina). Igualmente, foi revelado que a mutação de rhtA23 é uma substituição G-por-A na posição -1 em relação ao códon de partida ATG (EXTRATOS do 172 Congresso Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular em combinação com o Encontro Anual da American Society for Biochemistry and Molecular Biology, São Francisco, Califórnia, em 24 a 29 de agosto de 1997, extrato n2 457, Patente Européia Aberta ao Público nfi 1013765).

O gene asd de E. coli já foi esclarecido (posições dos nucleotídeos 3572511 a 3571408, acesso do GenBank NC_000913.1, gi: 16131307), e pode ser obtido por PCR [reação em cadeia da polimerase; referir-se a White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)] utilizando os iniciadores preparados com base na seqüência de nucleotídeos do gene. Os genes asd de outros microorganismos podem ser obtidos de uma maneira semelhante.

Igualmente, o gene aspC de E. coli já foi elucidado (posições dos nucleotídeos 983742 a 984932, acesso do GenBank NC_000913.1, gi: 16128895), e pode ser obtido por PCR. Os genes aspC de outros microorganismos podem ser obtidos de uma maneira semelhante.

BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-LISINA

Exemplos de bactérias produtoras da L-lisina, pertencentes ao gênero Escherichia, incluem mutantes tendo resistência a um análogo da L- lisina. O análogo da L-lisina inibe o crescimento de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, porém esta inibição é completa ou parcialmente dessensibilizada quando a L-lisina coexiste em um meio. Exemplos do análogo da L-lisina incluem, porém sem limitar, a oxalisina, o hidroxamato de lisina, a S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), a γ-metil-lisina, a a- clorocaprolactama, e assim por diante. Os mutantes que têm resistência a estes análogos da lisina podem ser obtidos submetendo-se as bactérias pertencentes ao gênero Escherichia a um tratamento de mutagênese artificial convencional. Exemplos específicos de cepas bacterianas úteis para produzir a L-lisina incluem a Escherichia coli AJl 1442 (FERM BP-1543, NRRL B- 12185; ver a Patente U.S. rr 4.346.170) e Escherichia coli VL611. Nestes microorganismos, a inibição de retroalimentação da aspartocinase pela L- lisina é dessensibilizada.

A cepa WC196 pode ser usada como uma bactéria de Eseheriehia coli produtora da L-lisina. Esta cepa bacteriana foi reproduzida conferindo-se resistência de AEC à cepa W3110, a qual foi derivada de Eseheriehia coli K-12. A cepa resultante foi designada de cepa de Escherichia coli AJl 3069 e foi depositada no National Institute of Bioscience and Human- Technology, Agency of Industrial Science and Technology (correntemente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1- Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 6 de dezembro de 1994, e recebeu um número de acesso de FERM P-14690. Posteriormente, o depósito foi transformado em um depósito internacional sob as disposições do Tratado de Budapeste, em 29 de setembro de 1995, e recebeu um número de acesso FERM BP-5252 (Patente U.S. n° 5.827.698)

Exemplos de cepas precursoras para originar bactérias produtoras de L-lisina da presente invenção também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de L- lisina é intensificada. Exemplos de tais genes incluem, porém sem limitar, os genes codificando a diidrodipicolinato sintase (dapA), a aspartocinase (IysC), a diidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelato descarboxilase (IysA), diaminopimelato desidrogenase (ddh) (Patente U.S. no 6.040.160), a fosfoenolpirvato carboxilase (ppc), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), e aspartase (aspA) (Patente Européia Aberta ao Público n° 1253195). Além disso, as cepas precursoras podem ter um nível aumentado de expressão do gene envolvido na eficiência de energia (cyo) (Patente Européia Aberta ao Público n° 1170376), do gene codificando a nucleotídeo nicotinamida transidrogenase (pntAB) (Patente U.S. n° 5.830.716), o gene ybjE (WO 2005/073390), ou combinações destes.

Exemplos de cepas precursoras para dar origem a bactérias gerar um composto outro que não a L-Iisina pela ramificação da via biossintética da L-lisina. Exemplos das enzimas que catalisam uma reação para gerar um composto outro que não a L-lisina mediante ramificação da via biossintética da L-lisina, incluem a homosserina desidrogenase, a lisina descarboxilase (Patente U.S. n2 5.827.698), e a enzima málica (WO 2005/010175).

BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-CISTEÍNA

Exemplos de cepas precursoras para originar bactérias produtoras da L-cisteína da presente invenção incluem, porém sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tal como E. coli JM15 que é transformado com diferentes alelos de cysE codificando as serina acetiltransferases resistentes à realimentação (Patente U.S. n2 6.218.168, Pedido de Patente Russa n~ 2003121601); E. coli W3110 tendo genes superexpressos que codificam proteínas adequadas para secretar substâncias tóxicas para as células (Patente U.S. n2 5.972.663); cepas de E. coli tendo atividade de cisteína dessulfidrase reduzida (JP 11155571A2); E. coli W3110 com atividade aumentada de um regulador transcricional positivo para regular a cisteína codificada pelo gene cysB (WO 0127307A1), etc.

BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-LEUCINA

Exemplos de cepas precursoras para originar bactérias produtoras da L-Ieucina da presente invenção incluem, sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tais como as cepas de E. coli resistentes à leucina [por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, Patente U.S. na 6.124.121)] ou análogos de leucina incluindo β-2-tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4- azaleucina, 5,5,5-trifluoroleucina (Publicação da Patente Japonesa n2 62- 34397 e a Patente Japonesa Aberta ao Público n2 8-70879); as cepas de E. coli obtidas pelo método de engenharia genética descrito na WO 96/06926; E. coli H-9068 (Patente Japonesa Aberta ao Público n2 8-70879), e outras.

A bactéria da presente invenção pode ser melhorada mediante a intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese da L-leucina. Exemplos de tais genes incluem os genes do óperon leuABCD, do qual o exemplo típico preferido é um gene mutante IeuA codificando a isopropilmalato sintase dessensibilizada para a inibição da retroalimentação pela L-leucina (Patente U.S. n° 6.403.342). Além disso, a bactéria da presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes codificando as proteínas que excretam o L-aminoácido da célula bacteriana. Exemplos de tais genes incluem os genes B2682 e b2683 (genes ygaZH) (Patente Européia Aberta ao Público n2 1239041 A2).

BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-fflSTIDINA

Exemplos de cepas precursoras para originar bactérias produtoras da L-histidina da presente invenção incluem, sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tais como a cepa de E. coli 24 (VKPM B- 5945, RU2003677); a cepa de E. coli 80 (VKPM B-7270, RU2119536); E. coli NRRL B-12116 a B12121 (Patente U.S. n2 4.388.405); E. coli H-9342 (FERM BP-6675) e H-9343 (FERM BP-6676) (Patente U.S. n2 6.344.347); E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (Patente Européia n2 1085087); E. coli AI80/pFM201 (Patente U.S. n2 6.258.554) etc.

Exemplos de cepas precursoras para originar bactérias produtoras da L-histidina da presente invenção também incluem as cepas em que a expressão de um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de L-histidina é intensificada. Exemplos de tais genes incluem os genes que codificam ATP fosforribosiltransferase (hisG), fosforribosil AMP cicloidrolase (hisl), fosforribosil-ATP pirofosfoidrolase (hisIE), fosforribosil- formimino-5-aminoimidazol carboxamida ribotídeo isomerase (hisA), amido- transferase (hisH), histidinol fosfato aminotransferase (hisC), histidinol fosfatase (hisB), histidinol desidrogenase (hisD), e assim por diante.

É conhecido o fato de que enzimas biossintéticas de L- histidina codificadas por hisG e hisBHAFI são inibidas pela L-histidina e, portanto, uma capacidade de produzir L-histidina pode também ser eficientemente intensificada pela introdução de uma mutação conferindo resistência à inibição da retroalimentação no gene de fosforribosiltransferase ATP (hisG) (Patentes Russas n~ 2003677 e 2119536).

Exemplos específicos das cepas que tenham uma capacidade de produzir L-histidina incluem E. coli FERM P-5038 e 5048 que tenham sido introduzidas com um vetor carregando um DNA codificando uma enzima biossintética de L-histidina (Patente Japonesa Aberta ao Público n2 56- 005099), as cepas de E. coli introduzidas com rht, um gene para uma exportação de aminoácido (Patente Européia Aberta ao Público n2 1016710), a cepa de 80 doada com sulfaguanidina, DL-l,2,4-triazol-3-alanina, e resistência à estreptomicina (VKPM B-7270, Patente Russa ns 2119536), e assim por diante.

BACTÉRIAS PRODUTORAS DE L-FENILALANINA

Exemplos de cepas precursoras para dar origem às bactérias produtoras da L-fenilalanina da presente invenção incluem, porém sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tais como a E. coli AJ12739 (tyrA::Tnl0, tyrR) (VKPM B-8197); E. coli HW1089 (ATCC 55371) abrigando um gene mutante pheA34 (Patente U.S. n° 5.354.672); E. coli MWEClOl-b (KR8903681); E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 e NRRL B-12147 (Patente U.S. n° 4.407.952). Igualmente, como uma cepa precursora, E. coli Kl2 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP- 12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] denominada como AJ12604 (FERM BP-3579), podem ser usadas (Publicação da Patente Européia n° 488424 BI). Além disso, as bactérias produtoras da L- fenilalanina pertencentes ao gênero Escherichia com uma atividade intensificada da proteína codificada pelo gene yedA ou pelo gene yddG, podem também ser usadas (Publicações dos Pedidos de Patentes U.S. n~ 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al, respectivamente).

BACTÉRIAS PRODUTORAS DO L-TRIPTOFANO

Exemplos de cepas precursoras para dar origem às bactérias produtoras do L-triptofano da presente invenção incluem, porém sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tais como as E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 (DSM10123) deficientes na triptofanil-tRNA sintetase codificada pelo gene mutante trpS (Patente U.S. n2 5.756.345); E. coli SV164 (pGH5) tendo um alelo serA codificando a fosfoglicerato desidrogenase livre da inibição da retroalimentação pela serina e um alelo trpE codificando a antranilato sintase livre da inibição da retroalimentação pelo triptofano (Patente U.S. n2 6.180.373); E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) deficiente na enzima triptofanase (Patente U.S. n2 4.371.614); E. coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps em que a capacidade de produzir fosfoenolpiruvato é intensificada (WO 97/08333, Patente U.S. n2 6.319.696), etc. As bactérias produtoras do L-triptofano pertencentes ao gênero Escherichia no qual a atividade da proteína codificada pelo gene yedA ou pelo gene yddG é aumentada, podem também ser usadas (Publicações dos Pedidos de Patentes U.S. n- 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al).

Exemplos de cepas precursoras para dar origem às bactérias produtoras do L-triptofano da presente invenção também incluem as cepas em que uma ou mais atividades das enzimas selecionadas da antranilato sintase (trpE), da fosfoglicerato desidrogenase (serA), e do triptofano sintase (trpAB), são intensificadas. A antranilato sintase e a fosfoglicerato desidrogenase acham-se, ambas, sujeitas à inibição da retroalimentação pelo L-triptofano e pela L-serina e, portanto, uma mutação dessensibilizando a inibição da retroalimentação pode ser introduzida nestas enzimas. Exemplos específicos das cepas tendo uma tal mutação incluem uma E. coli SVl64 que abriga a antranilato sintase dessensibilizada e uma cepa transformante obtida pela introdução, na E. coli SVl64, do plasmídeo pGH5 (WO 94/08031), que contém um gene serA mutante codificando a fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada pela inibição da retroalimentação.

Exemplos de cepas precursoras para originar as bactérias produtoras do L-triptofano da presente invenção também incluem as cepas dentro das quais o óperon de triptofano contendo um gene que codifica a antranilato sintase dessensibilizada, tenha sido introduzido (Patente Japonesa Aberta ao Público n- 57-71397, 62-244382, Patente U.S. n2 4.371.614). Além disso, a capacidade produtora do L-triptofano pode ser transmitida pela intensificação da expressão de um gene que codifique a triptofano sintase, entre os óperons de triptofano (<trpBA). A triptofano sintase consiste das subunidades a e β que são codificadas pelos genes trpA e trpB, respectivamente. Além disso, a capacidade produtora do L-triptofano pode ser melhorada pelo aumento da expressão do óperon da isocitrato liase-malato sintase (WO 2005/103275).

BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-PROLINA

Exemplos de cepas precursoras para dar origem às bactérias produtoras de L-prolina da presente invenção incluem, porém sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tal como E. coli 702ilvA (VKPM B-8012) que é deficiente no gene UvA e é capaz de produzir L-prolina (Patente Européia n° 1172433).

A bactéria da presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese da L-prolina. Exemplos de tais genes para as bactérias produtoras da L-prolina que são preferidos, incluem o gene proB codificando a glutamato cinase, da qual a inibição da retroalimentação pela L-prolina é dessensibilizada (Patente Alemã η° 3127361). Além disso, a bactéria da presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes codificando proteínas que excretam L-aminoácido da célula bacteriana. Exemplos de tais genes são os genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (Patente Européia Aberta ao Público n° 1239041 A2).

Exemplos de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, que tenham uma atividade para produzir L-prolina, incluem as seguintes cepas de E. coli: NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (Patente Britânica n° 2075056), VKPM B-8012 (Pedido de Patente Russa n2 2000124295), mutantes plasmídeos descritos na Patente Alemã n2 3127361, plasmídeos mutantes descritos por Bloom F. R. et al. (152 simpósio de inverno de Miami, 1983, p. 34), e outras.

BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-ARGININA

Exemplos de cepas precursoras para dar origem às bactérias produtoras da L-arginina da presente invenção incluem, porém sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Eseheriehia, tais como a cepa 237 de E. coli (VKPM B-7925) (Publicação do Pedido de Patente U.S. n° 2002/058315 Al) e suas cepas derivadas que abriguem a N-acetilglutamato sintase mutante (Pedido de Patente Russa n° 2001112869), a cepa 382 de E. coli (VKPM B- 7926) (Patente Européia Aberta ao Público n2 1170358 Al), uma cepa produtora da arginina em que o gene argA codificando a N-acetilglutamato sintetase é introduzido (Patente Européia Aberta ao Público n° 1170361 Al), e outras

Exemplos de cepas precursoras para originar as bactérias produtoras da L-arginina da presente invenção também incluem as cepas em que a expressão de um ou mais genes codificando uma enzima biossintética da L-arginina são intensificados. Exemplos de tais genes incluem opcionalmente substituído genes que codificam a N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), a ornitina acetil transferase {argJ), a N-acetilglutamato cinase (argB), a acetilornitina transaminase (argD), a ornitina carbamoil transferase (argF), a ácido argininossuccínico sintetase (argG), a ácido argininossuccínico liase {argH), e a carbamoil fosfato sintetase (carAB).

BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-VALINA

Exemplos de cepas precursoras para dar origem a bactérias produtoras da L-valina da presente invenção incluem, sem limitar, as cepas que tenham sido modificadas para superexpressar o óperon ilvGMEDA (Patente U.S. n2 5.998.178). É desejável remover a região do óperon ilvGMEDA, o que é necessário para a atenuação de modo que a expressão do óperon não seja atenuada pela L-valina que é produzida. Além disso, o gene ilvA no óperon é desejavelmente rompido de modo que a atividade da treonina desaminasa seja reduzida.

Exemplos de cepas precursoras para dar origem às bactérias produtoras da L-valina da presente invenção também incluem as cepas mutantes tendo uma mutação de aminoacil t-RNA sintetase (Patente U.S. ns 5.658.766). Por exemplo, E. coli VL1970, que tem uma mutação no gene ileS que codifica a isoleucina tRNA sintetase, pode ser usado. E. coli VL1970 foi depositado na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rússia, 113545 Moscou, 1 Dorozhny Proezd, 1) em 24 de junho de 1988, sob o número de acesso VKPM B-4411.

Além disso, os mutantes requerendo ácido lipóico para o crescimento e/ou carência de H+-ATPase, podem também ser usados nas cepas precursoras (WO 96/06926).

BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-ISOLEUCINA

Exemplos de cepas precursoras para dar origem às bactérias produtoras da L-isoleucina da presente invenção incluem, porém sem limitar, as cepas mutantes tendo resistência à 6-dimetilaminopurina (Patente Japonesa Aberta ao Público n° 5-304969), cepas mutantes tendo resistência a um análogo da isoleucina, tal como a tiaisoleucina e ao hidroxamato de isoleucina, e cepas mutantes adicionalmente tendo resistência à DL-etionina e/ou ao hidroxamato de arginina (Patente Japonesa Aberta ao Público n2 5- 130882). Além disso, as cepas recombinantes transformadas com um gene codificando uma proteína envolvida na biossíntese da L-isoleucina, tal como a treonina desaminase e a acetoidroxato sintase, podem também ser usadas como cepas precursoras (Patente Japonesa Aberta ao Público n2 2-458, Patente Francesa n2 0356739, e Patente U.S. n2 5.998.178).

<l-2> INTENSIFICAÇÃO DO SISTEMA kdp O microorganismo da presente invenção pode ser obtido pela modificação de um tal microorganismo pertencente à família da Enterobacteriaceae e tendo uma capacidade produtora do L-aminoácido como descrito acima, de modo que o sistema kdp seja intensificado. Entretanto, após um microorganismo ter sido modificado de modo que o sistema kdp seja intensificado, a capacidade produtora do L-aminoácido pode ser transmitida ao microorganismo.

O sistema kdp pode ser intensificado por modificação que aumente a expressão do óperon kdp ou um ou mais genes que constituam o óperon kdp, e tal aumento da expressão pode basear-se na intensificação da expressão de um gene endógeno mediante modificação de uma região de controle da expressão, tal como a modificação de um promotor ou similar, ou intensificação da expressão de um gene exógeno pela introdução de um plasmídeo contendo o óperon ou qualquer dos genes, ou similar. Estes métodos podem ser realizados em combinação. O sistema kdp pode também ser intensificado pelo aumento da translação do óperon kdp ou de qualquer dos genes que constituem o óperon kdp.

Na presente invenção, o "sistema kdp" significa uma ATPase do tipo P (ATPase do tipo P transportando potássio) que atua sobre o sistema de transporte de potássio de alta afinidade (EC 3.6.3.12).

A condição de "ser modificado de modo que o sistema kdp seja intensificado" significa uma condição de que o transporte de potássio, acima mencionado, pela ATPase tipo P é intensificado, mais especialmente uma condição de que o microorganismo seja modificado de modo que a sua atividade de ATPase do tipo P seja intensificada. Uma tal condição corresponde, por exemplo, à condição de que o número das moléculas da proteína de ATPase do tipo P por célula seja aumentado em comparação com aquele da cepa precursora ou de uma cepa selvagem, ou a condição de que a atividade da ATPase do tipo P por molécula seja aumentada em comparação com aquela da cepa precursora ou de uma cepa selvagem. A modificação é preferivelmente realizada de modo que a atividade da ATPase do tipo P por célula seja melhorada até 150 % ou mais, preferivelmente 200 % ou mais, mais preferível 300 % ou mais, da atividade da cepa precursora ou de uma cepa selvagem. O microorganismo do tipo selvagem pertencente à família Enterobacteriaceae usado como uma referência para a comparação é, por exemplo, o Escherichia eoli MGl 655 (ATCC 47076), Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6615), ou similar.

O aumento da expressão do óperon kdp pode ser confirmado pela comparação da quantidade do seu mRNA com aquela de uma cepa do tipo selvagem ou não modificada. Exemplos do método para confirmar a expressão incluem a hibridização Northern e RT-PCR {Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 2001). O grau do aumento na expressão não é particularmente limitado, contanto que ele aumente em comparação com aquele de uma cepa selvagem ou cepa não modificada. Entretanto, ela é desejavelmente aumentada, por exemplo, 1,5 vez ou mais, preferivelmente 2 vezes ou mais, mais preferível 3 vezes ou mais, em comparação com aquela de uma cepa selvagem ou cepa não modificada.

A atividade da ATPase do tipo P pode ser medida, por exemplo, pela extração do sistema kdp de um microorganismo que o possua, purificando-o [referir-se a Siebers, A. et al., Eur. J. Biochem., 178, 131 (1988)] e medindo-se a atividade da ATPase do tipo P do sistema kdp purificado [referir-se a Arnold, A. et al., Anal. Biochem., 71, 209 (1976)].

O sistema kdp consiste de três subunidades codificadas pelo óperon kdp, e, no que diz respeito a E. coli, as seguintes anotações são fornecidas para os genes da subunidade:

kdpA: ATPase do sistema de transporte de potássio de alta afinidade, cadeia A

kdpB: ATPase do sistema de transporte de potássio de alta afinidade, cadeia B

kdpC: ATPase do tipo P, sistema de transporte de potássio de alta afinidade, cadeia C

O "óperon kdp" referido na presente invenção é um aglomerado de genes codificando as subunidades A, B e C da ATPase do tipo P descrita acima, em que a subunidade A é codificada pelo gene kdp A, a subunidade B é codificada pelo gene kdpB, e a subunidade C é codificada pelo gene kdpC. Na presente invenção, o óperon kdp pode conter um gene que não os genes kdp A, kdpB e kdpC.

A seqüência de nucleotídeos do óperon kdp de Eseherichia coli é mostrada na SEQ ID NO: 1. Este óperon contém os seguintes seis genes, e as regiões codificadoras (incluindo o códon de parada) dos genes na SEQ ID NO: 1 são como segue. As seqüências de aminoácidos codificadas por kdpA, kdpB, kdpC, kdpD e kdpE são mostradas nas SEQ ID NOS: 2 a 6, respectivamente.

kdpF: 457 a 546

kdpA: 546 a 2219

kdpB: 2242 a 4290

kdpC: 4299 a 4871

kdpD: 4864 a 7548 kdpE: 7545 a 8222

A seqüência de nucleotídeos do óperon kdp de Pantoea ananatis é mostrada na SEQ ID NO: 7. Este óperon contém os seguintes quatro genes, e as regiões codificadoras (incluindo o códon de parada) dos genes na SEQ ID NO: 7 são como segue. As seqüências de aminoácidos codificadas por kdp A, kdpB, kdpC e kdpD são mostradas nas SEQ ID NOS: 8 ali, respectivamente.

kdpA: 543 a 2225 kdpB: 2228 a 4273 kdpC: 4284 a 4853 kdpD: 4867 a 7542

Além disso, a seqüência de nucleotídeos do gene kdpE de pantoea ananatis e a seqüência de aminoácidos codificada por este gene, são mostradas nas SEQ ID NOS: 12 e 13, respectivamente.

Neste relatório descritivo, as proteínas codificadas por kdp A, kdpB, kdpC, kdpD e kdpE podem ser indicadas como KdpA, KdpB, KdpC, KdpD e KdpE, respectivamente.

Os alinhamentos das seqüências de aminoácidos de KdpA, KdpB e KdpC de Pantoea ananatis e Escherichia eoli são mostrados nas Figuras 6 a 8. As seqüências de consenso das seqüências de Pantoea ananatis e Escheriehia eoli são mostradas nas linhas inferiores dos alinhamentos. Além disso, as seqüências de consenso de KdpA, KdpB e KdpC são mostradas nas SEQ ID NOS: 57 a 59, respectivamente.

As homologias de KdpA, KdpB e KdpC de Pantoea ananatis e Eseheriehia eoli são de 75,36 %, 81,35 % e 59,57 %, respectivamente.

No que diz respeito às bactérias de Eseheriehia, o gene kdpA é registrado no GenBank NP_415226.1 Reports potassium-transpo ... To [gi: 16128674], o gene kdpB em NP_415225. Reports potassium-transpo ... [gi:16128673], o gene kdpC em NP_415224. Reports potassium-transpo ... [gi: 16128672], o gene kdpD em NP_415223. Reports fused sensory his ... [gi:16128671], e o gene kdpE em NP_415222. Reports DNA-binding respo ... [gi:16128670].

Além disso, o óperon kdp pode ser um clonado de um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae tal como as bactérias Eseheriehia, Pantoea, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia e Yersinia à base das homologias aos genes exemplificados acima.

Como o óperon kdp utilizável para a presente invenção, o óperon kdp e as suas regiões de flanqueio, incluindo uma região de controle da expressão que se localize a montante do óperon, podem ser obtidos por PCR [reação em cadeia da polimerase; referir-se a White, T. J. et aL, Trends Genet., 5, 185 (1989)] usando iniciadores preparados com base em uma seqüência de nucleotídeos já elucidada de um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae, e DNA cromossômico de um microorganismo pertencente à família Enterobaeteriaeeae como o padrão. Os homólogos do óperon kdp de outros microorganismos também podem ser obtidos de uma maneira semelhante.

Um homólogo do óperon kdp significa um gene codificando uma ATPase do tipo P, que incorpore íons de potássio, derivada de outro microorganismo e apresentando uma alta homologia ao óperon kdp de Eseheriehia eoli ou de Pantoea ananatis. O gene kdp A, o gene kdpB e o gene kdpC derivados de outro microorganismo significa aqueles que apresentam homologias de 80 % ou mais, preferivelmente de 90 % ou mais, mais preferível de 95 % ou mais, particularmente preferível de 97 % ou mais, às seqüências totais de aminoácidos das SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 8, 9 e 10, e codificando as subunidades que constituem uma proteína tendo a atividade da ATPase do tipo P.

Cada um dos genes pode codificar variante conservativa tendo as seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 8, 9 ou 10 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos em uma ou em várias posições, contanto que a atividade da ATPase do tipo P constituída destas subunidades não seja degradada. Não obstante o número denotado pelo termo "várias" possa diferir dependendo da posição na estrutura tridimensional ou dos tipos de resíduos de aminoácidos das proteínas, ele é preferivelmente de 2 a 20, mais preferível de 2 a 10, particularmente preferível de 2 a 5. As substituições, deleções, inserções, adições, inversões etc. dos aminoácidos descritos acima incluem aquelas causadas pelas mutações de ocorrência natural, dependendo das diferenças individuais ou das diferenças nas espécies de microorganismos.

Estas substituições são de preferência substituições conservativas que são mutações neutras não proporcionando nenhuma mudança funcional. Uma mutação conservativa é uma mutação em que a substituição tem lugar mutuamente entre Phe, Trp, Tyr, se o sítio da substituição for um aminoácido aromático; entre Leu, lie, Vai, se o sítio da substituição for um aminoácido hidrofóbico; entre Gln, Asn, se ele for um aminoácido polar; entre Lys, Arg, His, se ele for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se ele for um aminoácido acídico; e entre Ser e Thr, se ele for um aminoácido tendo um grupo hidroxila. Exemplos específicos de substituições conservativas incluem: a substituição de Ala por Ser ou Thr; a substituição de Arg por Gln, His ou Lys; a substituição de Asn por Glu, Gln, Lys, His ou Asp; a substituição de Asp por Asn, Glu ou Gln; a substituição de Cys por Ser ou Ala; a substituição de Gln por Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg; a substituição de Glu por Gly, Asn, Gln, Lys ou Asp; a substituição de Gly por Pro; a substituição de His por Asn, Lys5 Gln, Arg ou Tyr; a substituição de Ile por Leu, Met, Val ou Phe; a substituição de Leu por lie, Met, Val ou Phe; a substituição de Lys por Asn, Glu, Gln, His ou Arg; a substituição de Met por lie, Leu, Val ou Phe; a substituição de Phe por Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu; a substituição de Ser por Thr ou Ala; a substituição de Thr por Ser ou Ala for Thr; a substituição de Trp por Phe ou Tyr; a substituição de Tyr por His, Phe ou Trp; e a substituição de Val por Met5 Ile ou Leu.

Além disso, o óperon kdp com o uso dos códons que possam ser facilmente usados em um microorganismo hospedeiro escolhido, no qual o gene seja introduzido, pode também ser usado, desde que a degeneração do gene varie dependendo do microorganismo hospedeiro. De forma semelhante, contanto que a produção do L-aminoácido possa ser melhorada pela amplificação do óperon kdp, o óperon kdp pode ser alongado ou encurtado ou no término N e/ou no término C de cada subunidade codificada pelo óperon, mediante, por exemplo, 50 ou menos, preferivelmente 20 ou menos, mais preferível 10 ou menos, particularmente preferível 5 ou menos, da quantidade de resíduos de aminoácidos. Mais especificamente, cada subunidade pode ter uma seqüência de aminoácidos que seja encurtada em 5 a 50 resíduos de aminoácidos ou no término N e/ou no término C na seqüência de aminoácidos das SEQID NOS: 2, 3, 4, 8, 9 ou 10.

Além disso, o óperon kdp pode ser um DNA que hibridize sob condições estringentes com a seqüência de nucleotídeos apresentada nas SEQ ID NOS: 1 ou 7, ou uma seqüência complementar a cada região codificadora na seqüência de nucleotídeos das SEQ ID NOS: 1 ou 7, ou uma sonda que possa ser preparada destas seqüências, e que codifique o sistema kdp, isto é, proteína tendo atividade de ATPase do tipo P para incorporar íons de potássio.

As "condições estringentes" aqui referida significam condições em que um assim chamado híbrido específico seja formado e um híbrido não específico não seja formado. É difícil definir claramente as condições com valores numéricos, mas exemplos destas incluem condições em que os DNAs tendo alta homologia, por exemplo homologia de 70 % ou mais, preferível de 80 % ou mais, mais preferível de 90 % ou mais, ainda mais preferível de 95 % ou mais, particularmente preferível de 97 % ou mais, hibridizam um com o outro e os DNAs tendo uma homologia menor do que o valor não hibridizam um com o outro; e especificamente incluem condições correspondentes à concentração de sal e à temperatura das condições de lavagem na hibridização Southern típica, por exemplo, 1 χ SSC, 0,1 % de SDA, preferivelmente 0,1 χ SSC, 0,1 % de SDS, em 60°C.

A sonda pode ser uma sonda tendo uma seqüência parcial do óperon kdp. Uma tal sonda pode ser preparada por PCR com o uso de oligonucleotídeos preparados com base na seqüência de nucleotídeos do gene de acordo com um método bem conhecido de uma pessoa habilitada na técnica, como iniciadores, e um fragmento de DNA contendo o gene como o padrão. Quando o fragmento de DNA de um comprimento de cerca de 300 pares de base seja usado como a sonda, a lavagem após a hibridização sob as condições acima mencionadas pode ser, por exemplo, a lavagem de uma vez ou duas vezes ou três vezes sob as condições de 50°C, 2 χ SSC, 0,1 % de SDS.

Um tal gene homólogo ao óperon kdp pode ser obtido, por exemplo, pela modificação da região codificadora na seqüência de nucleotídeos das SEQ ID NOS: 1 ou 7 pela mutagênese específica do sítio, de modo que a proteína codificada contenha substituições, deleções, inserções ou adições dos resíduos de aminoácidos de um sítio específico. Um tal gene pode também ser obtido pela seguinte mutagênese convencionalmente conhecida. No que diz respeito à mutagênese, um óperon codificando um sistema kdp altamente ativo pode ser obtido introduzindo-se artificialmente uma mutação no óperon kdp mediante o tratamento das seqüências de nucleotídeos das SEQ ID NOS: 1 ou 7, ou uma região codificadora nestas seqüências de nucleotídeos in vitro com hidroxilamina ou similar, ou tratando-se um microorganismo tendo o gene, por exemplo, um tal microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae, com irradiação ultravioleta ou um mutágeno usado para a mutagênese usual, tal como a N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina (NTG) ou metanossulfonato de etila (EMS), ou por recombinação de genes com base na PCR propensa a erro [Cadwell, R. C., PCR Meth Appl., 2, 28 (1992)], embaralhamento do DNA [Stemmer, W. P., Nature, 370, 389 (1994)], ou StEP-PCR [Zhao, H., Nature BiotechnoL9 16, 258 (1998)]. O fato de o homólogo do óperon kdp codificar a ATPase do tipo P pode ser confirmado, por exemplo, introduzindo-se o gene em um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae e tendo capacidade de produzir L-aminoácido, e determinando-se se a capacidade de produzir L- aminoácido é melhorada ou medindo-se a atividade da ATPase do tipo P pelo método acima mencionado.

As descrições acima concernentes às variantes e homólogos são também aplicadas ao gene kdpD e ao gene kdpE descrito mais abaixo.

Tal modificação de um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae, de acordo com a qual a expressão do óperon kdp ou de um ou mais genes constituindo o óperon é aumentada, pode ser alcançada pelo método acima mencionado de modificar uma bactéria de modo que a expressão de um gene alvo seja intensificada. A saber, pelo aumento do número de cópias do óperon kdp ou cada gene constituindo o óperon a ser expresso, e/ou substituindo-se a seqüência de controle da expressão do óperon por uma seqüência de controle da expressão mais forte, ou pelo controle de cada gene que constitui o óperon por uma seqüência de controle da expressão mais forte, a expressão do óperon ou de cada gene pode ser intensificada. Não obstante a intensificação da expressão dos genes que constituem o óperon kdp possa ser realizada quanto ao óperon inteiro ou a cada gene, a intensificação é preferivelmente realizada quanto ao óperon inteiro. Quando a expressão é intensificada para cada gene individual, o gene a ser intensificado pode ser qualquer um dos genes que constituem o óperon kdp, mas é preferível intensificar a expressão de pelo menos uma ou mais espécies de genes entre os genes kdp A, kdpB e kdpC, mais preferível todos os genes kdp A, kdpB e kdpC.

O sistema Mp pode também ser intensificado pela modificação de uma seqüência de espaçador entre o sítio de ligação ribossômica (RBS) e o códon de partida de cada gene, de modo que a translação de cada gene que constitua o óperon kdp seja aumentada.

Além disso, sabe-se que a expressão do óperon kdp é controlada pelo sistema de controle binário KdpDE codificado pelo gene MpD e pelo gene JcdpE (J. Bacteriol., abril de 1992, 174 (7): 2152-2159), e a expressão do óperon Mp pode também ser aumentada pelo aumento da expressão do gene MpD e do gene MpE.

<2> MÉTODO PARA PRODUZIR O L-AM1NOÁCIDO DA PRESENTE INVENÇÃO

Pelo cultivo do microorganismo da presente invenção em um meio para produzir e acumular um L-aminoácido no meio e coletar o L- aminoácido do meio, o L-aminoácido pode ser produzido.

Como o meio usado para o cultivo, um meio usual contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e sais minerais, assim como nutrientes orgânicos de traço como os aminoácidos e as vitaminas, quando necessário, podem ser usados. Qualquer espécie de fonte de carbono e de fonte de nitrogênio pode ser usada, contanto que elas possam ser utilizadas por uma cepa a ser cultivada.

Açúcares tais como glicose, glicerol, frutose, sacarose, maltose, manose, galactose, hidrolisados de amido e melaços podem ser usados como fontes de carbono. Além disso, ácidos orgânicos tais como o ácido acético e o ácido cítrico, e álcoois tais como o etanol, podem também ser usados, cada um isoladamente ou em combinação com outras fontes de carbono. A amônia, os sais de amônio tais como o sulfato de amônio, o carbonato de amônio, o cloreto de amônio, o fosfato de amônio e o acetato de amônio, sais de ácido nítrico, e assim por diante, podem ser usados como a fonte de nitrogênio. Aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucléico, esses contendo aquelas substâncias tais como peptona, casaminoácido, extrato de levedura e produto da decomposição da proteína de soja, e assim por diante, podem ser usados como os nutrientes orgânicos de traço. Quando é usada uma cepa mutante auxotrófica que requeira um aminoácido ou similar para seu crescimento, é preferível suplementar o nutriente requerido.

Em particular, quando um meio líquido preparado de modo a satisfazer uma condição para precipitar o ácido L-glutâmico é usado, a adição do ácido pantotênico ao meio provê precipitação mais eficiente do ácido L- glutâmico (WO 2004/111258). Como sais inorgânicos, os sais de ácido fosfórico, os sais de magnésio, os sais de cálcio, os sais de ferro, o sal de manganês, e assim por diante, podem ser usados.

A cultura é preferivelmente realizada como cultura aeróbica, enquanto a temperatura de fermentação é controlada para ser de 20 a 45°C, e o pH para ser de 3 a 9. Quando o pH é reduzido durante a cultura, carbonato de cálcio pode ser adicionado, ou a cultura é neutralizada com uma substância alcalina tal como gás amoníaco. O L-aminoácido alvo é acumulado no meio de cultura após preferivelmente 10 a 120 horas de cultura sob condições tais como descrito acima.

Além disso, a cultura pode ser realizada com a precipitação de ácido L-glutâmico em um meio, pelo uso, como o meio, de um meio líquido ajustado para satisfazer a uma condição sob a qual o ácido L-gutâmico é precipitado. Os exemplos da condição sob a qual o ácido L-glutâmico é precipitado incluem o pH de 5,0 a 4,0, preferivelmente de 4,5 a 4,0, mais preferível de 4,3 a 4,0, particularmente preferível de 4,0.

Quando o ácido L-glutâmico é precipitado no meio, a adição preliminar dos cristais de ácido L-glutâmico ou de L-Iisina como cristais sementes podem proporcionar cristalização mais eficiente (Patente Européia na 1233069, Patente Européia Aberta ao Público na 1624069). A coleta do L-aminoácido do caldo de cultura após a cultura pode ser realizada por um método de coleta conhecido. Por exemplo, após as células terem sido removidas do meio de cultura, o L-aminoácido pode ser coletado mediante concentração do meio para cristalizar o L-aminoácido, por cromatografia de troca de íons, ou similar. Quando a cultura é realizada sob uma condição sob a qual o ácido L-glutâmico é precipitado, o ácido L- glutâmico precipitado no meio pode ser coletado por centrifugação ou por filtração. Neste caso, o ácido L-glutâmico dissolvendo-se no meio pode ser precipitado e depois separado junto com o ácido L-glutâmico já precipitado.

Quando um aminoácido básico é produzido, a produção pode ser realizada por um método no qual a fermentação seja realizada mediante o controle do pH do meio durante a cultura de modo a ser de 6,5 a 9,0, e do pH do meio após a conclusão da cultura de modo a ser de 7,2 a 9,0, e o controle da pressão no tanque de fermentação durante a fermentação para que seja positiva, ou provendo dióxido de carbono ou um gás misto contendo dióxido de carbono ao meio de modo que exista um período em que os íons de bicarbonato e/ou os íons de carbonato estejam presentes em uma quantidade de pelo menos 2 g/litro no meio de cultura durante a cultura, e estes íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato sirvam como contra-íons de cátions principalmente consistindo do aminoácido básico, e o aminoácido básico alvo seja coletado (referir-se à Patente Japonesa Aberta ao Público no 2002- 065287, Publicação do Pedido de Patente U.S. n° 2002025564).

EXEMPLOS

Daqui por diante, a presente invenção será descrita em mais detalhes mediante referência aos exemplos.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1

Construção da cepa de Pantoea ananatis resistente ao produto

do gene λ Red

Para amplificar o óperon kdp em Pantoea ananatis, foi construída uma cepa receptora que realiza o método denominado "integração conduzida por Red" ou "integração mediada por Red" [Proc. Natl. Acad,. Sei. USA, 97, 6640-6645 (2000)].

Primeiramente, o novo plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER, que expressa os genes gam, bet e exo de λ (doravante referidos como "genes λ Red") foi construído (Figura 1). Os detalhes destes serão descritos no Exemplo de Referência 2.

Este plasmídeo pode ser usado em uma ampla faixa de hospedeiros tendo diferentes fundamentos genéticos. Isto é porque 1) este plasmídeo tem o réplicon do plasmídeo RSF1010 de amplo espectro de hospedeiros (Scholz et aL, 1989; Buchanan-Wollaston et ai., 1987), o qual pode ser estavelmente mantido por muitos tipos de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, e ainda células de plantas, 2) os genes λ Red, gam, bet e exo, se acham sob o controle do promotor PlacUV5, o qual é reconhecido pelas RNA polimerases de muitos tipos de bactérias [por exemplo, Brunschwig, E. e Darzins, A., Gene, 111, 1, 35-41 (1992); Dehio, M. et al, Gene, 215, 2, 223-229 (1998)], e 3) o fator de autorregulação Piacuv5-IacI e o terminador da transcrição não dependente de ρ (TrrnB) do óperon rrnB de Escherichia eoli inferior ao nível de expressão basal dos genes λ Red [Skorokhodova, A. Yu et al, Biotekhnologiya (Rus.), 5, 3-21 (2004)]. Além disso, o plasmídeo RSF-Red-TER contém o gene levansacarase e, mediante o uso deste gene, o plasmídeo pode ser coletado das células em um meio contendo sacarose.

Em Escherichia eoli, a freqüência de integração de um fragmento de DNA gerado por PCR junto com a região de flanqueio curta provida pelo plasmídeo RSF-Red-TER, é tão elevada quanto a freqüência obtenível com o uso do plasmídeo auxiliar pKD46 [Datsenko, Κ. A., Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97, 6640-6645 (2000)]. Entretanto, a expressão dos genes λ Red é tóxica à Pantoea ananatis. As células transformadas com o plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER crescem de forma extremamente lenta no meio LB contendo EPTG (isopropil-β-D- tiogalactopiranosídeo, 1 mM) e um antibiótico apropriado (25 μg/ml de cloranfenicol ou 40 μg/ml de canamicina), e a eficiência da recombinação mediada por λ Red é extremamente lenta (10-8), se observada sob qualquer condição.

Uma cepa variante de Pantoea ananatis, que seja resistente à expressão de todos os três genes λ Red, foi selecionada. Para este fim, o plasmídeo RSF-Red-TER foi introduzido na cepa SC17 de Pantoea ananatis (Patente U.S. nfi 6.596.517) por eletroporação. Após uma cultura de 18 horas, cerca de IO6 transformantes foram obtidos e, entre estes, 10 clones formaram colônias de grande dimensão, e todo o remanescente formaram colônias extremamente pequenas. Após uma cultura de 18 horas, as grandes colônias tinham um tamanho de cerca de 0,2 mm, ao passo que as pequenas colônias não cresceram nada, mesmo que a cultura fosse estendida por outras 24 horas, as grandes colônias continuaram a crescer. Uma das cepas mutantes de Pantoea ananatis das grandes colônias e resistentes à expressão de todos os três genes λ Red (gam, bet e exo), foi usada para a outra análise.

O DNA plasmídeo RSF-Red-TER foi isolado de um clone dos clones das grandes colônias, e de vários clones das colônias pequenas, e transformado novamente no Escherichia coli MG165 5 para se examinar a capacidade do plasmídeo para sintetizar um produto ativo do gene Red. Por uma experiência de controle para integração dependente de Red nos transformantes obtidos, foi demonstrado que apenas o plasmídeo isolado do clone de grandes colônias induziu a expressão dos genes λ Red requeridos para a integração dependente de Red. De modo a pesquisar se a integração mediada por Red ocorrera no clone selecionado de grandes colônias, a eletroporação foi realizada com o uso de um fragmento linear de DNA produzido por PCR. Este fragmento foi projetado de modo contivesse um marcador KmR e uma região de flanqueio de 40 pares de base homóloga ao gene hisD. Este fragmento é integrado no gene hisD de Pantoea ananatis no sítio de reconhecimento SmaL Dois clones de colônias pequenas foram usados como controle. A seqüência de nucleotídeos do gene hisD de Pantoea ananatis é mostrada na SEQ ID NO: 14. Para a PCR, os oligonucleotídeos das SEQ ID NOS: 15 e 16 foram usados como iniciadores, e o plasmídeo pMWl 18-(Àatt-Kmr-Xatt) foi usado como o padrão. Os dois clones de colônias pequenas que não foram resistentes aos genes λ Red foram usados como um controle. A construção do plasmídeo pMWl 18-(ÀattL-Rmr-XattR) será explicada em detalhes no Exemplo de Referência 3.

O plasmídeo RSF-Red-TER pode induzir a expressão dos genes Red pelo gene IacI exercida no plasmídeo. Duas espécies de condições de indução foram pesquisadas. No primeiro grupo, IPTG (1 mM) foi adicionado 1 hora antes da eletroporação, e no segundo grupo, IPTG foi adicionado no início da cultura para a preparação das células das quais a eletroporação é possível. O índice de crescimento das células abrigando o RSF-Red-TER derivado do clone das grandes colônias, não foi significativamente inferior àquele de uma cepa não tendo o plasmídeo SC17. A adição de IPTG apenas levemente reduzir o índice de crescimento destas culturas. Por outro lado, a progênie dos clones das pequenas colônias cresceu de forma extremamente lenta, mesmo sem a adição de IPTG, e, após a indução, o crescimento foi substancialmente interrompido. Após a eletroporação das células da progênie do clone de grandes colônias, muitos clones KmR cresceram (18 clones após um curto tempo de indução, e cerca de 100 clones após um período de indução prolongado). Todos os 100 clones que foram pesquisados tinham um fenótipo His", e cerca de 20 clones foram confirmados por PCR como tendo a estrutura de cromossoma esperada nas células. Por outro lado, mesmo quando a eletroporação foi realizada com a progênie dos clones de pequenas colônias, uma cepa integrada não foi obtida. O clone de grandes colônias obtido foi cultivado sobre uma placa contendo 7 % de sacarose para eliminar o plasmídeo, e transformado novamente com RSF-Red-TER. A cepa sem o plasmídeo foi designada de SC17 (0). Esta cepa foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms [VKPM5 GNII Genetica (1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Rússia) em 21 de setembro de 2005, e recebeu um número de acesso de VKPM B-9246.

Todos os clones que cresceram após a retransformação acima mencionada apresentaram grandes tamanhos de colônia como o clone SC17 (0) da cepa precursora. A experiência de integração mediada por Red foi realizada na cepa SC17 (0) retransformada com o plasmídeo RSF-Red-TER. Três dos transformantes independentes foram pesquisados com o uso do mesmo fragmento de DNA como aquele usado para a experiência anterior. O tempo curto de indução (1 hora antes da eletroporação) foi empregado. Os clones KmR que excederam dez clones, cresceram em cada experiência. Todos os clones examinados. Todos os clones examinados tinham o fenótipo His". Desta maneira, uma cepa mutante designada SC17 (0) resistente à expressão dos genes λ Red foi selecionada. Esta cepa pôde ser usada como uma cepa receptora adequada para a integração dependente de Red no cromossoma de Pantoea ananatis.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2

CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO AUXILIAR RSF-Red-TER

O esquema de construção do plasmídeo auxiliar RSF-Red- TER é mostrado na Figura 2.

Como uma primeira etapa da construção, um vetor RSFsacBPlacMCS foi projetado. Para este fim, os fragmentos de DNA contendo o gene cat do plasmídeo pACYC184 e a região de gene estrutural do gene sacB de Bacillus subtilis foram amplificados por PCR com o uso dos oligonucleotídeos das SEQ ID NOS: 17 e 18, e 19 e 20, respectivamente. Estes oligonucleotídeos continham os sítios de enzimas de restrição BgHI, Saci, XbaI e BarnHI, necessários e convenientes para outra clonagem, nas regiões de extremidade 5', respectivamente. O fragmento sacB obtido de 1,5 kb foi clonado no vetor pMW119-PJaclacI previamente obtido no sítio XbaI- BamHL Este vetor foi construído da mesma maneira daquele descrito quanto ao vetor pMW118-P1ac1acI [Skorokhodova, A. Yu et al., Biotekhnologiya (Rus.), 5, 3-21 (2004)]. Entretanto, este vetor continha um componente poliligador derivado de pMW219 ao invés do plasmídeo pMW218.

Então, o fragmento cat acima mencionado de 1,0 kb foi tratado com BgIII e Saci, e clonado no plasmídeo RSF-PlaclacIsacB obtido na etapa anterior no sítio BamHI-SacI. O plasmídeo obtido pMW-PiaclacIsacBcat continha o fragmento PlacUV5-lacI-sacB-cat. A fim de subclonar este fragmento no vetor RSF1010, pMW-PiaclacIsacBcat foi digerido com BgIII, a extremidade embotada com o fragmento Klenow da DNA polimerase I, e sucessivamente digerido com Saci. Um fragmento BgHI-SacI de 3,8 kb do plasmídeo pMWPiaclacIsacBcat foi eluído de 1 % de gel de agarose, e ligado com o vetor RFS1010 que havia sido tratado com PstI e Saci. Escherichia coli TG1 foi transformado com a mistura de ligação, e plaqueado sobre o meio LB contendo cloranfenicol (50 mg/litro). Os plasmídeos isolados dos clones desenvolvidos foram analisados com enzimas de restrição para se obter um plasmídeo RSFsacB. De modo a construir um vetor RSFsacBPiacMCS, um fragmento de DNA contendo o promotor Piacuv5 foi amplificado por PCR com o uso dos oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 21 e 22 como iniciadores e o plasmídeo pMWl 19-P]aclacI como o padrão. O fragmento obtido de 146 pares de base foi digerido com Sacl e Notl, e ligado com o fragmento grande SacI- Notl do plasmídeo RSFsacB. Depois, por PCR com o uso dos oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 23 e 24 como iniciadores, e o plasmídeo pKD46 [Datsenko, Κ. A., Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97, 6640-6645 (2000)] como padrão, um fragmento de DNA de 2,3 kb contendo os genes λRedαβγ e o terminador de transcrição tL3, foi amplificado. O fragmento obtido foi clonado no vetor RSFsacBPlacMCS no sítio PvuI-NotI. Deste modo, o plasmídeo RSFRed foi projetado.

De modo a eliminar a leitura através da transcrição dos genes Red, um terminador da transcrição dependente de ρ do óperon rrnB de Escherichia coli foi introduzido em uma posição entre o gene cat e o promotor Placuv5· Para esta finalidade, um fragmento de DNA contendo o promotor Placuv5 e o terminador TrrnB foi amplificado por PCR com o uso dos oligonucleotídeos das SEQ ID NOS: 25 e 22 como iniciadores e o cromossoma de Eseheriehia coli BW3350 como um padrão. Estes fragmentos obtidos foram tratados com KpnI e ligados. Depois, o fragmento de 0,5 kb contendo tanto Piacuv5 quanto TrrnB foi amplificado por PCR com o uso dos oligonucleotídeos das SEQ ID NOS: 22 e 26 como iniciadores. O fragmento de DNA obtido foi digerido com EcoRI, a extremidade embotada por um tratamento com o fragmento Klenow da DNA polimerase I, digerido com BamHI, e ligado com o grande fragmento Ecll36II-BamHI do vetor RSFsacBPlacMC S. O plasmídeo obtido foi designado RSF-Red-TER.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3

CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO pMWl 18-(XattL-Kmr-

λattR)

O plasmídeo pMWl 18-(λattL-Kmr-λattR) foi construído do plasmídeo pMW118-attL-Tc-attR (WO 2005/010175) mediante substituição do gene marcador de resistência à tetraciclina com o gene de resistência à canamicina do plasmídeo pUC4K. Com essa finalidade, o fragmento grande EcoRI-HindIII do plasmídeo pMW118-attL-Tc-attR foi ligado a dois fragmentos do plasmídeo pUC4K: o fragmento HindIII-PstI (676 pares de base) e o fragmento EcoRI-HindIII (585 pares de base). O pMWl 18-attL-Tc- attR básico foi obtido pela ligação dos seguintes quatro fragmentos: 1) O fragmento BglII-EcoRI (114 pares de base) incluindo attL (SEQ ID NO: 29) que foi obtido por amplificação de PCR da região correspondente ao attL do cromossoma de Escherichia coli W3350 (contendo o profago λ) com o uso dos iniciadores Pl e P2 (SEQ ID NOS: 27 e 28) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para BglII e EcóRI).

2) O fragmento PstI-HindIII (182 pares de base) incluindo attR (SEQ ID NO: 32) que foi obtido por amplificação de PCR da região correspondente ao attR do cromossoma de Escherichia coli W3350 (contendo o profago λ) com o uso dos iniciadores P3 e P4 (SEQ ID NOS: 30 e 31) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para Pstl e Hindlll).

3) O grande fragmento Bgni-Hindlll (3916 pares de base) do pMW118-ter_rrnB. O plasmídeo pMW118-ter_rrnB foi obtido pela ligação dos seguintes três fragmentos de DNA:

- O grande fragmento de DNA (2359 pares de base) incluindo o fragmento AatII-EeoRI de pMW118 que foi obtido pela digestão do pMW118 com EcoKl, tratamento com o fragmento Klenow de DNA polimerase I, e depois digestão com AatlV,

- O pequeno fragmento AatII-BglII (1194 pares de base) de pUC19 incluindo o gene bla para resistência à ampicilina (ApR), que foi obtido por amplificação de PCR da região correspondente do plasmídeo pUC19 com o uso dos iniciadores P5 e P6 (SEQ ID NOS: 33 e 34) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para Pstli AatII e BglII);

- O pequeno fragmento BglII-PstIpol (363 pares de base) do terminador da transcrição terjrrnB, que foi obtido por amplificação de PCR da região correspondente do cromossoma de Eseheriehia coli MG1655 com o uso dos iniciadores P7 e P8 (SEQ ID NOS: 35 e 36) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para Pstl, BglII e Pstl).

4) O pequeno fragmento E1CoRI-PiiI (1388 pares de base) (SEQ ID NO: 37) de pML-Tc-ter_thrL incluindo o gene de resistência à tetraciclina e o terminador da transcrição ter_thrL; o plasmídeo pML-Tc- ter_thrL foi obtido pelas seguintes duas etapas:

- o plasmídeo pML-ter thrL foi obtido pela digestão do plasmídeo pML-MCS [Mashko, S. V. et al., Biotekhnologiya (em Russo), 2001, n2 5, 3-20) com Xbal e BamYR, seguido pela ligação do grande fragmento (3342 pares de base) com o fragmento Xbal-BamHl (68 pares de base) carregando o terminador ter_thrL obtido por amplificação de PCR da região correspondente do cromossoma de Escherichia eoli MG1655 com o uso dos iniciadores P9 e PIO (SEQ ID NOS: 38 e 39) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários Pstl, Xbal e BamHiy,

- o plasmídeo pML-Tc-ter_thrL foi obtido pela digestão do plasmídeo pML-ter_thrL com Kpnl e Xbal, seguida pelo tratamento com o fragmento Klenow da DNA polimerase I, e ligado com o pequeno fragmento EcoRl-Van91I (1317 pares de base) de pBR322 incluindo o gene de resistência à tetraciclina (pBR322 foi digerido com EcoRI e Van91I e depois tratado com o fragmento Klenow da DNA polimerase I).

EXEMPLO 1

AQUISIÇÃO DA CEPA SUBSTITUÍDA PELO PROMOTOR DO ÓPERON kdp

(1) CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO RSFPPG PRODUTOR DO ÁCIDO GLUTÂMICO

Um plasmídeo RSFPPG foi construído, no qual os genes do sistema da biossíntese do ácido L-glutâmico, o gene prpC (Publicação da Patente Internacional WO 2006/051660), o gene ppc e o gene gdhA (EP 0999282A), foram amplificados.

O iniciador 1 (SEQ ID NO: 40) e o iniciador 2 (SEQ ID NO: 41) para amplificar uma parte do RSFCPG (EP 123 3068A) outro que não ORF do gene gltA, foram projetados. Mediante o uso destes iniciadores e RSFCPG como o padrão, a PCR foi realizada para se obter um fragmento de cerca de 14,9 kb. No que diz respeito ao prpC, a PCR foi realizada com o uso do iniciador 3 (SEQ ID NO: 42) e do iniciador 4 (SEQ ID NO: 43) e do DNA cromossomico da cepa W3110 de E. coli como o padrão, para se obter um fragmento de cerca de 1,2 kb. Ambos os produtos de PCR foram tratados com BglII e Kpnl, ligados, e depois usados para transformar a cepa JMl09 de E. coli. Todas as colônias formadas foram coletadas e os plasmídeos foram extraídos das colônias como uma mistura. A cepa ME8330 de E. coli, que é uma cepa deficiente de citrato sintase (CS), foi transformada com a mistura de plasmídeos, e a suspensão celular foi aplicada no meio mínimo M9 (contendo 5 g de glicose, sulfato de magnésio 2 mM, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio e 6 g de fosfato dissódico, em 1 litro de água pura) contendo 50 mg/litro de uracila e 5 mg/litro de HCl de tiamina. Das cepas formadas, um plasmídeo foi extraído e designado RSFPPG. Este plasmídeo RSFPPG foi introduzido na cepa NP106 de Pantoea ananatis, a qual é uma cepa produtora de ácido L-glutâmico, para construir uma cepa produtora de ácido L-glutâmico, NP106/RSFPPG (esta cepa é referida como a "cepa NA1").

A cepa NP106 foi obtida como segue. A cepa AJ13601 de Pantoea ananatis descrita acima foi cultivada durante a noite em 34°C no meio líquido LBGM9 com agitação, e depois o meio foi diluído de modo que 100 a 200 colônias aparecessem por placa e foram aplicadas a uma placa de LBGM9 contendo 12,5 mg/litro de tetraciclina. As colônias que apareceram foram replicadas em uma placa de LBGM9 contendo 12,5 mg/litro de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol, e uma cepa que foi sensível ao cloranfenicol foi selecionada para se obter uma cepa da qual o pSTVCB fosse eliminado, a qual foi designada G106S. A cepa G106S foi ainda cultivada durante a noite em 34°C no meio líquido de LBGM9 com agitação, e o meio foi diluído de modo que 100 a 200 colônias aparecessem por placa, e aplicado a uma placa de LBGM9 sem medicamentos. As colônias que apareceram foram replicadas em uma placa LBGM9 contendo 12,5 mg/litro de tetraciclina, e uma placa de LBGM9 sem medicamentos, e uma cepa que resultou sensível à tetraciclina foi selecionada para se obter uma cepa da qual o RSFCPG fosse eliminado, a qual foi designada NP106. A NP106 obtida como descrito acima é uma cepa não contendo nenhum dos dois plasmídeos RSFCPG e pSTVCB, os quais são abrigados pela cepa AJl3601.

(2) AQUISIÇÃO DA CEPA NA QUAL O PROMOTOR DO ÓPERON kdp FOI SUBSTITUÍDO PELO PROMOTOR tac

i) A construção da cepa SC17 (0) de P. ananatis na qual a seqüência contendo XattL-Kmr-AattR e o promotor Ptac ligado a jusante (AattL-Kmr-XattR-Ptac) foi integrada a montante do gene IacZ

O promotor Ptac foi integrado no cromossoma da cepa SC17 (0) de P. ananatis em uma posição a montante do gene IacZ. A estrutura da região do cromossoma de P. ananatis a montante do gene LacZ é mostrada na Figura 3. As seqüências de nucleotídeos dos genes yghU, serK e IaeZ de Pantoea ananatis são apresentadas nas SEQ ID NOS: 44, 45 e 46. A seqüência da região -35 do promotor Ptac é ttgaca.

O fragmento do promotor Ptac foi amplificado por PCR com o uso do iniciador 1 de 5' (SEQ ID NO: 47) e iniciador 2 de 3' (SEQ ID NO: 48) correspondente ao promotor Ptac, e o plasmídeo pDR540 (Pharmacia, Suécia) como um padrão. Ambos os iniciadores continham uma seqüência de reconhecimento BglII na extremidade 5'. O iniciador 2 continha 46 nucleotídeos da parte de extremidade 3' de Ptac, seqüência SD, e uma parte de início da região codificadora do gene IacZ.

Um fragmento de DNA contendo um gene de resistência Km removível flanqueando os sítios attL e attR de λ foi também amplificado por PCR com o uso de pMWl 18-(XattL-Kjnr-XattR) como um padrão, e o iniciador 3 (SEQ ID NO: 49) e o iniciador 4 (SEQ ID NO: 50). O fragmento obtido tinha um sítio de reconhecimento Bglll para ligação com o Jfragmento do promotor tac em uma extremidade, e um sítio correspondente a uma seqüência homóloga ao cromossoma de Pantoea ananatis e localizando-se a montante do gene scrK para integração no genoma bacteriano na outra extremidade (Figura 3). Dois dos fragmentos do produto de PCR foram tratados com BgRl, e ligados in vitro com a DNA T4 ligase.

A mistura de reação da ligação foi usada para a integração dependente de λ no cromossoma de Pantoea ananatis. O plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER foi usado como um portador dos genes Red de fago λ. De modo a obter-se células eletrocompetentes da Pantoea ananatis, a cepa SC17 (0) foi transformada com o plasmídeo RSF-Red-Ter, e cultivada durante a noite em 34°C em meio LB contendo 50 μg/ml de cloranfenicol. Depois, o caldo de cultura foi diluído 100 vezes com meio LB recente contendo 50 μg/ml de cloranfenicol, e o crescimento das células foi deixado em 34°C sob aeração até que a OD6OO se tornasse de 0,3. Então, IPTG 1 mM foi acrescentado e a cultura prosseguiu até que a OD600 se tornasse de 0,7. Uma amostra de 10 mM foi lavada por 3 vezes com um volume igual de água deionizada, e as células foram colocadas em suspensão em 40 μΐ de glicerol frio a 10 %. Imediatamente antes da eletroporação, 100 a 200 ng de fragmento de DNA amplificado in vitro dissolvido em 5 μl de água deionizada, foram adicionados à suspensão celular. A eletroporação foi feita pelo uso de um aparelho de eletroporação de bactérias (BioRad, Estados Unidos, Catálogo número 165-2089, Versão 2-89). Os parâmetros do pulso usado foram de uma intensidade de campo de 20 kV/cm, e um tempo de pulso de 5 milissegundos.

Após a eletroporação, 1 ml de meio LB suplementado com glicose (0,5 %) foi imediatamente adicionado à suspensão celular. Depois, as células foram deixadas crescer em 34°C por 2 horas sob aeração, plaqueadas em meio sólido de mLB contendo 40 μ§/πι1 de cloranfenicol, e incubadas durante a noite em 34°C. O integrante KmR selecionado foi estriado sobre placa de meio LB a qual IPTG (1 mM) e sacarose (5 g/litro) foram adicionados, e cultivado em 34°C para possibilitar a formação de colônias isoladas. De modo a remover o plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER do integrante, as variantes KmR e CmS foram isoladas.

As estruturas cromossômicas das colônias selecionadas KmR e Cm foram confirmadas por sequenciação de nucleotídeos.

ii) SUBSTITUIÇÃO DO PROMOTOR DO ÓPERON kdp

PELO PROMOTOR tac

Dois iniciadores sintéticos de DNA apresentados nas SEQ ED NOS: 51 e 52 foram sintetizados de uma maneira convencional. O iniciador mostrado na SEQ ID NO: 51 tinha uma estrutura que uma seqüência homóloga da região de montante do óperon kdp de Pantoea ananatis foi seguida por uma seqüência homóloga da extremidade 5' de XattL-Kmr-XattR- Ptac. O iniciador da SEQ ID NO: 52 tinha uma estrutura que uma seqüência complementar de extremidade 5' contendo o primeiro códon de partida do óperon kdp de Pantoea ananatis foi seguida por uma seqüência complementar de extremidade 3' de λ attL-Kmr-XattR-Ptac. Pela realização da PCR com o uso destes iniciadores e o DNA cromossômico da cepa selecionada em i) como o padrão, um fragmento de 1,6 quilopares de base da seqüência XattL- Kmr-XattR-Ptac tendo a seqüência homóloga da região a montante do óperon kdp na extremidade 5' e a seqüência homóloga na extremidade 5' contendo o primeiro códon de partida do óperon kdp na extremidade 3', foi amplificado.

O fragmento de PCR acima mencionado foi purificado e introduzido no SC 17(0)/RSF-Red-TER por eletroporação de uma maneira convencional.

A cepa SC17(0)/RSF-Red-TER, na qual o fragmento de PCR foi introduzido, foi selecionada sobre meio L (meio contendo 10 g de Bactotriptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl5 e 15 g de ágar, em 1 litro de água purificada, pH 7,0) contendo 40 mg/litro de canamicina para se obter cerca de 20 colônias como transformantes. A introdução do fragmento acima mencionado na região de montante do óperon kdp, foi confirmada por PCR com o uso de dois iniciadores sintéticos de DNA apresentados nas SEQ ID NOS: 53 e 54, e uma cepa para a qual a inserção do fragmento pôde ser confirmada foi designada SC17(0)::Ptac-kdp. O DNA genômico foi extraído desta cepa, e usado para transformar a cepa NAl/pSTV-yhfK por eletroporação. A cepa NAl/pSTV-yhfK foi obtida da cepa AJ13601 (referir- se à Patente Japonesa Aberta ao Público n° 2001-333769) pela eliminação de dois plasmídeos, o RSFCPG e o pSTVCB, e introdução de dois plasmídeos, o plasmídeo para a produção do ácido L-glutâmico, RSFPPG, e pSTV-yhfK (referir-se à Patente Japonesa Aberta ao Público n° 2005-278643).

Ambos os plasmídeos RSFCPG e pSTVCB são apresentados na Patente Japonesa Aberta ao Público no 2001-333769. O RSFCPG é um plasmídeo contendo os genes gltA,ppc e gdhA derivados de Escherichia coli. O pSTVCB é um plasmídeo obtido pela introdução do gene gltA derivado de Brevibaeterium laetofermentum no pSTV29 (Takara Shuzo). O pSTV-yhfk é um plasmídeo obtido pela introdução do gene yhfk derivado de Pantoea ananatis no pSTV29 (Takara Shuzo).

A cepa NAl/pSTV-yhfK, dentro da qual o DNA genômico de SC17(0)::Ptac-kdp foi introduzido, foi selecionada em uma placa do meio L (meio contendo 10 g de Bactotriptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar, em 1 litro de água purificada, pH 7,0) que foi suplementado com ingredientes de meio mínimo (meio contendo 0,5 g de glicose, sulfato de magnésio 2 mM, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio e 6 g de fosfato dissódico, em 1 litro de água purificada), 40 mg/litro de canamicina, 12,5 mg/litro de cloridreto de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol. Como resultado, cerca de 20 colônias foram obtidas como transformantes. Em todas estas cepas, o fragmento de AattL-Kmr-XattR-Ptac foi introduzido a montante do óperon kdp, e um clone entre elas foi selecionado e designado NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK.

(3) AVALIAÇÃO DA CULTURA DA CEPA SUBSTITUÍDA PELO PROMOTOR DO ÓPERON kdp NO TUBO DE TESTE

Em seguida, de modo a examinar-se o efeito da intensificação do óperon kdp no crescimento, a cultura foi realizada nos tubos de teste. A cepa NAl:Ptac-kdp/pSTV-yhfK e a cepa NAl/pSTV-yhfK como um controle foram usadas, e o crescimento delas sob uma condição acídica foi examinado.

[Composição do meio para a cultura do tubo de teste]

D-glicose 0,5 %

Na2HPO4 6,0 g/litro

KH2PO4 3,0 g/litro

NaCl 0,5 g/litro

NH4Cl 1,0 g/litro

MgS04-7H20 2,0 mM

Ácido ε-diaminopimélico 200 mg/litro

Cloridreto de L-Iisina 200 mg/litro

DL-Metionina 200 mg/litro

Ácido L-glutâmico 30 g/litro

Cloridreto de tetraciclina 12,5 mg/litro

Cloranfenicol 25 mg/litro

O meio foi ajustado a pH 4,5 ou pH 4,9 com amônia aquosa, e depois foi filtrado.

As cepas NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK e NAl/pSTV-yhfK foram, cada uma, pré-cultivadas no meio L (meio contendo 10 g de Bactotriptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar, em 1 litro de água purificada, pH 7,0) que foi suplementado com ingredientes de meio mínimo (meio contendo 0,5 g de glicose, sulfato de magnésio 2 mM, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio e 6 g de fosfato dissódico, em 1 litro de água purificada), 12,5 mg/litro de cloridreto de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol, e as células correspondentes a 1/8 da placa foram raspadas, lavadas duas vezes com solução salina fisiológica, e finalmente colocadas em suspensão em 1 ml de solução salina fisiológica. A suspensão, em um volume de 20 μΐ, foi inoculada em 5 ml do meio para cultura no tubo de teste contida em um tubo de teste, e cultivada em 34°C com agitação. Durante a cultura, a OD (660 nm) foi medida a cada 30 minutos com o uso de um medidor de OD automático (TN1506 BIO PHOTORECORDER, ADVANTEC). Os resultados são mostrados na Figura 4.

Em comparação com a cepa NAl/pSTV-yhfK como um controle, a cepa intensificada por kdp, a cepa NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK, apresentaram melhoramento do crescimento sob condições acídicas de pH 4,5 ou pH 4,9. Assim, o efeito da intensificação do óperon kdp para melhorar o crescimento e o índice de produção de ácido L-glutâmico, foi demonstrado por estes resultados.

(4) AVALIAÇÃO DA CULTURA DA CEPA SUBSTITUÍDA PELO PROMOTOR DO ÓPERON KDP EM S-jar

Então, de modo a examinar o efeito da intensificação do óperon kdp sobre a produção do ácido L-glutâmico, a cultura de produção do ácido L-glutâmico foi realizada pelo uso da cepa NAl:Ptac-kdp/pSTV-yhfK e da cepa NAl/pSTV-yhfK.

A cultura foi realizada por duas etapas de cultura de sementes para permitir a formação das células e a cultura principal para produzir ácido L-glutâmico.

A cultura das sementes foi realizada com a seguinte composição de meio. [Composição do meio de cultura das sementes] Sacarose 50 g/litro MgSO4TH2O 0,4 g/litro GDl 13 (antiespuma) 0,1 ml/litro (NH4)2SO4 4,0 g/litro KH2PO4 2,0 g/litro Extrato de levedura 4,0 g/litro FeSO4-7H20 0,01 g/litro MnS04-5H20 0,01 g/litro Acido cítrico 0,02 g/litro Cloridreto de L-Iisina 0,4 g/litro DL-Metionina 0.4 g/litro Ácido ε-diaminopimélico 0,4 g/litro Pantotenato de cálcio 18 mg/litro Cloridreto de tetraciclina 12,5 mg/litro Cloranfenicol 25 mg/litro

O meio foi esterilizado com vapor em 120°C por 20 minutos.

As cepas NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK e NA1 /pSTV-yhfK foram, cada uma, pré-cultivadas no meio L (meio contendo 10 g de Bactotriptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar, em 1 litro de água purificada, pH 7,0) que foi suplementado com ingredientes de meio mínimo (meio contendo 0,5 g de glicose, sulfato de magnésio 2 mM, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio e 6 g de fosfato dissódico, em 1 litro de água purificada), 12,5 mg/litro de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol, e as células correspondentes a uma placa foram inoculadas em 300 ml do meio da composição acima mencionada contida em uma minijarra de 1 litro de volume, e a agitação foi controlada em 34°C e pH de 6,0 por cerca de 12 horas de modo que a aeração de 1/1 vvm e uma concentração de oxigênio de 3 % ou mais fosse obtida. Durante a cultura, ο pΗ foi controlado de modo a ser de 6,0 com a adição de gás amoníaco. A cultura das sementes terminou no momento da depleção do sacarídeo no meio observado como um índice.

A composição do meio de cultura principal é mostrada abaixo. [Composição do meio de cultura] (As concentrações são aquelas após a inoculação de 20 % do meio de cultura das sementes)

Sacarose 100 g/litro MgS04-7H20 0,4 g/litro GDl 13 0,1 ml/litro (NH4)2SO4 5,0 g/litro KH2PO4 6,0 g/litro Extrato de levedura 6,0 g/litro FeS04-7H20 0,02 g/litro MnSO4SH2O 0,02 g/litro r Acido cítrico 0,02 g/litro Betai na* 2,0 g/litro Cloridreto de L-Iisina 0,8 g/litro DL-Metionina 0,6 g/litro r Acido 8-diaminopimélico 0,6 g/litro Pantotenato de cálcio 18 mg/litro Cloridreto de tetraciclina 25 mg/litro Cloranfenicol 25 mg/litro

* Ν,Ν,Ν-trimetilglicina

As células obtidas pela cultura das sementes em um volume de 60 ml foram inoculadas em 240 ml de meio tendo a composição acima mencionada contida em um minijarro de 1 litro de volume, e cultivadas em pH 4,7. A cultura foi terminada 16 horas após o início da cultura principal. A densidade celular e a concentração de ácido L-glutâmico no meio de cultura foram medidas através do tempo. A densidade celular foi examinada pela medição da turbidez do meio de cultura diluído 101 vezes com água em 620 nm com o uso de um espectrofotômetro (U-2000A, Hitachi). A concentração do ácido L-glutâmico foi medida quanto ao sobrenadante da cultura apropriadamente diluído com água mediante o uso do Biotech Analyzer (AS- 210, Sakura SI).

Os resultados são apresentados na Tabela 1 e na Figura 5. Ficou claro que o crescimento, bem como o acúmulo do ácido L-glutâmico e o índice de produção do ácido L-glutâmico da cepa intensificada pelo óperon kdp, a cepa NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK, foram melhorados em comparação com a cepa comparativa, a cepa NA1/pSTV-yhfK.

TABELA 1

<table>table see original document page 63</column></row><table>

EXEMPLO 2

AMPLIFICAÇÃO DO ÓPERON kdp NO Escherichia coli DE ACUMULAÇÃO DA L-TREONINA

(1) CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO PARA AMPLIFICAÇÃO DO ÓPERON kdp

De modo a introduzir o óperon kdp em uma bactéria de Eseheriehiai um plasmídeo para amplificação do óperon kdp é construído mediante o uso de um plasmídeo conhecido pMW218 (Takara Shuzo).

O pMW218 é primeiro digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI, e a reação é terminada pela adição de uma solução de fenol/clorofórmio e misturando-os. A mistura de reação é centrifugada, depois a camada superior é coletada, e os DNAs são coletados pela precipitação de etanol. O óperon kdp é separadamente amplificado por PCR com o uso do cromossoma extraído do Eseheriehia coli MGl655 como o padrão e os iniciadores de DNA apresentados nas SEQ ID NOS: 55 e 56 (desnaturação em 94°C por 10 segundos, recozendo-se em 60°C por 30 segundos, e extensão em 12°C por 120 segundos). Para a PCR5 Pyrobest DNA polimerase (Takara Shuzo) é usado. O fragmento de óperon kdp obtido é digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI, e a reação é terminada pela adição de uma solução de fenol/clorofórmio, e misturando-os.

O digerido pMW218 e o fragmento da região do gene kdpABC preparados como descrito acima, são ligados pelo uso do Kit de Ligação de DNA Versão 2 (Takara Shuzo). Escherichia coli (células competentes JMl 09 de E. coli, Takara Shuzo) é transformado com a solução de ligação, aplicada ao meio de ágar de LB contendo 50 mg/litro de canamicina, e incubada durante a noite em 37°C. As colônias que apareceram sobre o meio de ágar são inoculadas no meio líquido de LB contendo 50 mg/litro de canamicina, e cultivadas em 37°C por 8 horas com agitação. O DNA plasmídeo é extraído de cada meio de cultura pelo método de SDS alcalino, e sua estrutura é confirmada pela digestão com as enzimas de restrição para se obter pMW218kdp.

(2) INTRODUÇÃO DE pMW218kdp NO Escherichia coli B- 3996 DE ACÚMULO DA TREONINA E PRODUÇÃO DE AMINOÁCIDO.

O pMW218kdp obtido como descrito acima é introduzido na cepa VKlPM B-3996 pelo método de eletroporação [Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)].

O transformante obtido (esta cepa é denominada "B- 3996/pMW218kdp") e a cepa em que pMW218 é introduzido como um controle (esta cepa é denominada "B-3996/pMW218") são cultivados como segue, e as concentrações de L-treonina nos sobrenadantes da cultura são examinados.

Cada transformante é inoculado em 3 ml do meio líquido de LB contendo 50 mg/litro de canamicina e 20 mg/litro de estreptomicina, e cultivado durante a noite em 37°C em um tubo de teste, depois 200 μl do meio de cultura são inoculados em um meio de produção de treonina (20 ml) contendo 50 mg/litro de canamicina e 20 mg/litro de estreptomicina, e a cultura é realizada em 37°C por 24 horas com agitação. Após conclusão da cultura, as células são removidas por centrifugação, e a concentração da L- treonina no sobrenadante da cultura é medida pelo uso de um analisador de aminoácido (L-8500, Hitachi). Pode-se observar que a quantidade de acúmulo da treonina no meio é melhorada na cepa amplificada pelo óperon kdp, B- 3996/pMW218kdp em comparação com a cepa B-3996/pMW218 como um controle.

[MEIO DE PRODUÇÃO DA TREONINA]

D-glicose 40 g/litro (NH4)2SO4 16 g/litro KH2PO4 1,0 g/litro MgS04-7H20 1,0 g/litro FeSO4-7H20 0,01 g/litro MnS04-7H20 0,01 g/litro L-Isoleucina 50 mg/litro DL-Metionina 500 mg/litro Carbonato de cálcio 0,6 g/litro Estreptomicina 20 mg/litro Canamicina 50 mg/litro

O meio é ajustado a pH 7,5 com hidróxido de potássio.

O meio é esterilizado com vapor em 115°C por 10 minutos.

EXPLANAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

SEQ ID NO: 1: Seqüência de nucleotídeos de óperon kdp de Escherichia coli (seqüências de aminoácidos de kdpA, kdpB e kdpC são também mostradas)

kdpF: 457 a 546

kdpA: 546 a 2219 kdpB: 2242 a 4290 kdpC: 4299 a 4871 kdpD: 4864 a 7548 kdpE: 7545 a 8222 SEQID NO: 2: Seqüência de aminoácidos de KdpA SEQID NO: 3: Seqüência de aminoácidos de KdpB SEQID NO: 4: Seqüência de aminoácidos de KdpC SEQ ID NO: 5: Seqüência de aminoácidos de KdpD SEQ ED NO: 6: Seqüência de aminoácidos de KdpE SEQ ID NO: 5: Seqüência de nucleotídeos do óperon KdpD (a

seqüência de aminoácidos de SDHC é também mostrada)

SEQ ID NO: 7: Seqüência de nucleotídeos de óperon kdp de Pantoea ananatis (as seqüências de aminoácidos de kdp A, kdpB, kdpC e kdpD são também mostradas)

kdpA: 543 a 2225 kdpB: 2228 a 4273 kdpC: 4284 a 4853 kdpD: 4867 a 7542

SEQ ID NO: 8: Seqüência de aminoácidos de KdpA SEQID NO: 9: Seqüência de aminoácidos de KdpB SEQID NO: 10: Seqüência de aminoácidos de KdpC SEQID NO: 11: Seqüência de aminoácidos de KdpD SEQ ID NO: 12: Seqüência de nucleotídeos de gene kdpE de

Pantoea ananatis

SEQID NO: 13: Seqüência de aminoácidos de KdpE SEQ ID NO: 14: Seqüência de nucleotídeos de do gene hisD

de Pantoea ananatis

SEQ ID NO: 15: Iniciador para amplificação do fragmento para integração do gene Kmr no gene hosD SEQ ID NO: 16: Iniciador para amplificação do fragmento para integração do gene Kmr no gene hosD

SEQ ED NO: 17: Iniciador para amplificação do gene cat SEQID NO: 18: Iniciador para amplificação do gene cat SEQID NO: 19: Iniciador para amplificação do gene sacB SEQID NO: 20: Iniciador para amplificação do gene sacB SEQ ID NO: 21: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo o promotor PlacUV5

SEQ ID NO: 22: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo o promotor PlacUV5

SEQ ID NO: 23: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo os genes XRedaPy e tL3

SEQ ID NO: 24: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo os genes XRedaPy e tL3

SEQ ID NO: 25: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo o promotor PlacUV5 e TrrnB

SEQ ID NO: 26: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo o promotor PlacUV5 e TrrnB

SEQ ID NO: 27: Iniciador para amplificação de attL SEQ ID NO: 28: Iniciador para amplificação de attL SEQ ID NO: 29: Seqüência de nucleotídeos de attL SEQ ID NO: 30: Iniciador para amplificação de attR SEQ ID NO: 31: Iniciador para amplificação de attR SEQ ID NO: 32: Seqüência de nucleotídeos de attR SEQ ID NO: 33: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo o gene bla

SEQ ID NO: 34: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo o gene bla

SEQ ID NO: 35: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo ter_rrnB

SEQ ID NO: 36: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo ter_rrnB

SEQ ID NO: 37: Seqüência de nucleotídeos de fragmento de DNA contendo o terminador ter_thrL

SEQ ID NO: 38: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo o terminador ter_thrL

SEQ ID NO: 39: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo o terminador ter_thrL SEQ ID NO: 40: Iniciador para amplificar parte do gene gltA

outro que não ORF

SEQ ID NO: 41: Iniciador para amplificar parte do gene gltA outro que não ORF

SEQID NO: 42: Iniciador para amplificação do gene prpC SEQ ID NO: 43: Iniciador para amplificação do gene prpC

SEQ ID NO: 44: Seqüência de nucleotídeos do genQyghU de Pantoea ananatis

SEQ ID NO: 45: Seqüência de nucleotídeos do gene scrK de Pantoea ananatis

SEQ ID NO: 46: Seqüência de nucleotídeos do gene IacZ de

Pantoea ananatis

SEQ ED NO: 47: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo o promotor Ptac

SEQ ID NO: 48: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo o promotor Ptac

SEQ ID NO: 49: Inieiador para amplificação do fragmento de DNA contendo o gene de resistência Km

SEQ ID NO: 50: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo o gene de resistência Km SEQ ID NO: 51: Iniciador para amplificação da seqüência de montante do óperon kdp ligada ao promotor tac

SEQ ID NO: 52: Iniciador para amplificação da seqüência de montante do óperon kdp ligado ao promotor tac

SEQ ID NO: 53: Iniciador para confirmar a estrutura de montante do óperon kdp

SEQ ID NO: 54: Iniciador para confirmar a estrutura de montante do óperon kdp

SEQ ID NO: 55: Iniciador para amplificação do óperon kdp

SEQ ID NO: 56: Iniciador para amplificação do óperon kdp

SEQ ID NO: 57: Seqüência de consenso das seqüências de aminoácidos KdpA de Pantoea ananatis e Escherichia coli

SEQ ID NO: 58: Seqüência de consenso das seqüências de aminoácidos KdpB de Pantoea ananatis e Eseheriehia coli

SEQ ID NO: 59: Seqüência de consenso das seqüências de aminoácidos KdpC de Pantoea ananatis e Eseheriehia coli

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

Mediante o uso do microorganismo da presente invenção, um L-aminoácido tal como o ácido L-glutâmico, L-lisina5 L-treonina, L-arginina, L-histidina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina, L-treonina, L-fenilalanina, L- tirosina, L-triptofano ou L-cisteína, ácido L-glutâmico, ou similar, pode ser eficientemente produzido por fermentação. Em uma forma de realização preferida, o microorganismo da presente invenção apresenta tanto uma quantidade de produção de L-aminoácido quanto o índice de produção, superiores. TABELA DE MICROORGANISMOS

<table>table see original document page 70</column></row><table> Apêndice 3 Página 14

Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microorganismos para os fins de procedimento de patente

Para FORMULÁRIO INTERNACIONAL

Ajonomoto recibo no caso de um depósito original

Expedido de acordo com a Regra 7.1 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada no final desta página. 1-15-1 Kyobashi, Chuo-ku Tóquio 104-8315 Japão

nome e endereço do depositante

<table>table see original document page 71</column></row><table> FORMA INTERNACIONAL

RECIBO NO CASO DE UM DEPÓSITO ORIGINAL

expedido de acordo com a Regra 7.1 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada no final desta página.

NOME DO DEPOSITANTE: Ajinomoto Co. Inc.

Presidente, Kunio, EGASHIRA ENDEREÇO: 15-1, Kyobashi 1-chome, Chuo-ku, Tóquio, Japão

<table>table see original document page 72</column></row><table> LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Ajinomoto Co., Inc.

<120> Uma Bactéria que produz L-Aminoácido e um Método para Produzir um L-Aminoácido

<130> C874-C7269

<150> JP2007-011392 <151> 2007-01-22

<150> JP2007-1317 63 <151> 2007-05-17

<160> 59

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211> 8501 <212> DNA

<213> Escherichia coli <220>

<221> CDS

<222> (546)..(2219) <220>

<221> CDS

<222> (2242) .. (4290) <220>

<221> CDS

<222> (4299)..(4871) <400> 1

cgaccagacg cgatgcaggt agctgtaaaa gcgggcgcgg tctttccaga aaagcatgaa 60

aggcagcgcc agaacgcccg ctgcaaccgc ataagtacgg cgtaaaaaga taagccatgc 120 aggatattct ctgtagagtt ccatactttt ctcccccttt tgtatctacc cggtgaatgg 180 caccggaaaa atgaatttgt ttatctgatg aaaatagtac cgccttttgt gtaattttac 240 tactcatccg accacttatt tttgcttatt gatggtttat ttacattcat cctgtaatta 300 agttacacaa aagttaaatt aatactaaac attagttaaa tcatggcttt tgccattttt 360 atactttttt tacaccccgc ccgcagattt ttgcgaaatc tttgcagcca gaattctacc 420 cttccggtat cacttttagg ccactggagg tgcactgtga gtgcaggcgt gataaccggc 480 gtattgctgg tgtttttatt actgggttat ctggtttatg ccctgatcaa tgcggaggcg 540 ttctg atg gct gcg caa ggg ttc tta ctg ate gcc acg ttt tta ctg gtg 590 Met Ala Ala Gln Gly Phe Leu Leu Ile Ala Thr Phe Leu Leu Val

1 5 10 15 tta atg gtg ctg gcg cgt cct tta ggc age ggg ctg gcg cgg ctg att 638 Leu Met Val Leu Ala Arg Pro Leu Gly Ser Gly Leu Ala Arg Leu Ile 20 25 30 aat gac att cct Ctt CCC ggt aca acg ggc gtt gag cgc gta Ctt ttt 686 Asn Asp Ile Pro Leu Pro Gly Thr Thr Gly Val Glu Arg Val Leu Phe 35 40 45 cgc gea Ctt ggc gtc tct gac cgt gag atg aac tgg aag caa tat Ctt 734 Arg Ala Leu Gly Val Ser Asp Arg Glu Met Asn Trp Lys Gln Tyr Leu 50 55 60 tgt gcc att CtC ggc ctg aac atg ctg ggg ctg gcg gtg ctg ttt ttt 782 Cys Ala Ile Leu Gly Leu Asn Met Leu Gly Leu Ala Val Leu Phe Phe 65 70 75 atg ttg ctc ggt cag cac tat ctg ccg ctt aat cca cag cag ttg cca 830

Met Leu Leu Gly Gln His Tyr Leu Pro Leu Asn Pro Gln Gln Leu Pro

80 85 90 95

ggg ctg tcg tgg gat ctg gcg ctg aat acc gcc gtc age ttt gtc acc 878

Gly Leu Ser Trp Asp Leu Ala Leu Asn Thr Ala Val Ser Phe Val Thr

100 105 110

aat acc aac tgg caa tet tat age ggt gaa acc acg ttg age tat ttc 926

Asn Thr Asn Trp Gln Ser Tyr Ser Gly Glu Thr Thr Leu Ser Tyr Phe

115 120 125

age cag atg gcg ggc tta acg gtg caa aac ttt ctt tet gcc gcc age 974

Ser Gln Met Ala Gly Leu Thr Val Gln Asn Phe Leu Ser Ala Ala Ser

130 135 140

ggg att gcg gtg att ttt gcc ctc ate cgt gcg ttt acc cgc cag age 1022

Gly Ile Ala Val Ile Phe Ala Leu Ile Arg Ala Phe Thr Arg Gln Ser

145 150 155

atg age acg ctc ggg aat gcc tgg gtc gat ctg cta cgc ate acg tta 1070

Met Ser Thr Leu Gly Asn Ala Trp Val Asp Leu Leu Arg Ile Thr Leu 160 165 170 175

tgg gtg cta gtc cct gtg gcg ttg ttg att gea ctg ttt ttt att caa 1118

Trp Val Leu Val Pro Val Ala Leu Leu Ile Ala Leu Phe Phe Ile Gln

180 185 190

caa ggt gcg ctg caa aac ttt ctg cct tat cag gct gtg aat acc gtt 1166

Gln Gly Ala Leu Gln Asn Phe Leu Pro Tyr Gln Ala Val Asn Thr Val

195 200 205

gaa gga gcg caa cag ctg tta ccc atg ggg cct gta gct tet cag gaa 1214

Glu Gly Ala Gln Gln Leu Leu Pro Met Gly Pro Val Ala Ser Gln Glu

210 215 220

gcg ate aag atg ctc ggt act aac ggc ggt ggc ttc ttt aat gcc aac 1262

Ala Ile Lys Met Leu Gly Thr Asn Gly Gly Gly Phe Phe Asn Ala Asn

225 230 235

tcg tcg cat ccg ttt gaa aac cca acc gea ctg acc aac ttc gtg cag 1310

Ser Ser His Pro Phe Glu Asn Pro Thr Ala Leu Thr Asn Phe Val Gln 240 245 250 255

atg ctg gcg ate ttc ttg ate cca acg gcg ctg tgc ttt gcc ttt ggt 1358

Met Leu Ala Ile Phe Leu Ile Pro Thr Ala Leu Cys Phe Ala Phe Gly

260 265 270

gaa gtg atg ggc gat cgc cgc cag ggg cgc atg ttg ctg tgg gcg atg 1406

Glu Val Met Gly Asp Arg Arg Gln Gly Arg Met Leu Leu Trp Ala Met

275 280 285

tca gtg att ttt gtc ate tgc gta ggc gtg gtg atg tgg gea gaa gtt 1454

Ser Val Ile Phe Val Ile Cys Val Gly Val Val Met Trp Ala Glu Val

290 295 300

cag ggt aat cct cat ctg ctg gea ctg ggc acg gac age age ate aat 1502

Gln Gly Asn Pro His Leu Leu Ala Leu Gly Thr Asp Ser Ser Ile Asn

305 310 315

atg gaa ggt aaa gag age cgt ttc ggc gtg ctg gtc agt age ctg ttt 1550

Met Glu Gly Lys Glu Ser Arg Phe Gly Val Leu Val Ser Ser Leu Phe 320 325 330 335

gcg gtc gtg acg acg gcg gct tcc tgt ggc gcg gtg att gcg atg cat 1598

Ala Val Val Thr Thr Ala Ala Ser Cys Gly Ala Val Ile Ala Met His

340 345 350

gat tcg ttt acc gct ctc ggt ggc atg gtg ccg atg tgg ctg atg caa 164 6

Asp Ser Phe Thr Ala Leu Gly Gly Met Val Pro Met Trp Leu Met Gln

355 360 365

att ggt gaa gtg gtg ttc ggc ggt gtc ggt tet ggt ctt tac ggc atg 1694

Ile Gly Glu Val Val Phe Gly Gly Val Gly Ser Gly Leu Tyr Gly Met

370 375 380

atg ctg ttt gtc ctg ctg gcg gtg ttt att gcc ggg ctg atg att ggt 1742

Met Leu Phe Val Leu Leu Ala Val Phe Ile Ala Gly Leu Met Ile Gly

385 390 395

cgt aca ccg gaa tat ctg ggt aaa aaa ate gac gta cgc gag atg aaa 1790

Arg Thr Pro Glu Tyr Leu Gly Lys Lys Ile Asp Val Arg Glu Met Lys 400 405 410 415 ctg act gca ctg gca att ctg gtt acc ccg acg ctg gtg ctg atg ggc 1838

Leu Thr Ala Leu Ala Ile Leu Val Thr Pro Thr Leu Val Leu Met Gly

420 425 430

gcg gcg ttg gcg atg atg acc gac gcc gga cgt age gcc atg ctc aac 1886

Ala Ala Leu Ala Met Met Thr Asp Ala Gly Arg Ser Ala Met Leu Asn

435 440 445

cct ggc ccg cat ggt ttt age gaa gtg ctg tac gcc gtg tca tcc gcc 1934

Pro Gly Pro His Gly Phe Ser Glu Val Leu Tyr Ala Val Ser Ser Ala

450 455 460

gct aac aac aac ggc age gcc ttt gcc gga tta age gcc aac tet ccg 1982

Ala Asn Asn Asn Gly Ser Ala Phe Ala Gly Leu Ser Ala Asn Ser Pro

465 470 475

ttc tgg aac tgt tta ctg gcg ttc tgc atg ttt gtc ggt cgc ttc ggg 2030

Phe Trp Asn Cys Leu Leu Ala Phe Cys Met Phe Val Gly Arg Phe Gly 480 485 490 495

gtg att ate ccg gtg atg gca att gcc ggt tcg ctg gtg agt aaa aag 2078

Val Ile Ile Pro Val Met Ala Ile Ala Gly Ser Leu Val Ser Lys Lys

500 505 510

age caa gcc gcc age tcc ggc acg ctg cca acg cac ggc ccg ctg ttt 2126

Ser Gln Ala Ala Ser Ser Gly Thr Leu Pro Thr His Gly Pro Leu Phe

515 520 525

gtt ggc ctg tta ate ggc acc gtg ttg ctg gtt ggc gca ctg acc ttt 2174

Val Gly Leu Leu Ile Gly Thr Val Leu Leu Val Gly Ala Leu Thr Phe

530 535 540

ate cct gcc ctg gcg ctt ggt ccg gtg gcg gaa tat ctc tcc tga 2219

Ile Pro Ala Leu Ala Leu Gly Pro Val Ala Glu Tyr Leu Ser

545 550 555

tgatattgag tgagcactga at atg agt cgt aaa caa ctg gcg cta ttc gaa 2271

Met Ser Arg Lys Gln Leu Ala Leu Phe Glu 560 565

cca aca ctt gtc gtt cag gcg ctg aaa gaa gcg gtg aaa aaa tta aac 2319

Pro Thr Leu Val Val Gln Ala Leu Lys Glu Ala Val Lys Lys Leu Asn

570 575 580

ccg cag gcg caa tgg cgc aat ccg gtg atg ttt ate gtc tgg ate ggc 2367

Pro Gln Ala Gln Trp Arg Asn Pro Val Met Phe Ile Val Trp Ile Gly

585 590 595

agt ctg ctg acc acc tgt att age ate gcg atg gca age ggt gcg atg 2415

Ser Leu Leu Thr Thr Cys Ile Ser Ile Ala Met Ala Ser Gly Ala Met 600 605 610 615

ccc ggc aat gcg ctg ttt age gcg gcc att age ggt tgg ctg tgg ate 24 63

Pro Gly Asn Ala Leu Phe Ser Ala Ala Ile Ser Gly Trp Leu Trp Ile

620 625 630

acc gta ctg ttc gct aat ttc gcc gag gcg ctg gca gaa ggc cgc agt 2511

Thr Val Leu Phe Ala Asn Phe Ala Glu Ala Leu Ala Glu Gly Arg Ser

635 640 645

aaa gcg cag gcc aac agt ctg aaa ggg gtg aaa aaa act gcc ttt gcc 2559

Lys Ala Gln Ala Asn Ser Leu Lys Gly Val Lys Lys Thr Ala Phe Ala

650 655 660

cgc aag ctg cgt gag ccg aaa tat ggc gct gcg gcg gac aaa gtt cct 2607

Arg Lys Leu Arg Glu Pro Lys Tyr Gly Ala Ala Ala Asp Lys Val Pro

665 670 675

gcc gac caa ctt cgt aaa ggc gat ate gta ctg gta gaa gct ggc gat 2655

Ala Asp Gln Leu Arg Lys Gly Asp Ile Val Leu Val Glu Ala Gly Asp 680 685 690 695

att ate ccc tgc gat ggt gaa gtt att gaa ggg ggt gca tcg gtc gat 2703

Ile Ile Pro Cys Asp Gly Glu Val Ile Glu Gly Gly Ala Ser Val Asp

700 705 710

gaa age gcc ate acc ggg gaa tcg gca ccg gtg ate cgt gaa tcc ggc 2751

Glu Ser Ala Ile Thr Gly Glu Ser Ala Pro Val Ile Arg Glu Ser Gly

715 720 725

ggc gat ttt gcc tcc gtc acc ggc ggc acg cgt att ctt tet gac tgg 2799

Gly Asp Phe Ala Ser Val Thr Gly Gly Thr Arg Ile Leu Ser Asp Trp 730 735 740 ctg gtg att gag tgt age gtt aac CCC ggc gag aca ttt ctg gat cgg 2847 Leu Val 745 Ile Glu Cys Ser Val 750 Asn Pro Gly Glu Thr 755 Phe Leu Asp Arg atg ate gcg atg gtg gaa ggc gea cag cga cgc aaa acg ccg aac gaa 2895 Met Ile Ala Met Val Glu Gly Ala Gln Arg Arg Lys Thr Pro Asn Glu 760 765 770 775 att gcc ctg a cc att ctg ctg att gcc ctg act ate gtc ttt tta ctg 2943 Ile Ala Leu Thr Ile 780 Leu Leu Ile Ala Leu 785 Thr Ile Val Phe Leu 790 Leu gea acc gcc acg ctg tgg ccg ttt tcc gcg tgg ggc ggt aat gea gtc 2991 Ala Thr Ala Thr 795 Leu Trp Pro Phe Ser 800 Ala Trp Gly Gly Asn 805 Ala Val age gta acg Cjt a ctg gtg gcg ^■hrr v-v-íí ctg /Tt- W W tgt ctg ate cca acc act 3039 Ser Val Thr 810 Val Leu Val Ala Leu 815 Leu Val Cys Leu Ile 820 Pro Thr Thr att ggc ggc ctg ttg tca gcg ate ggc gtc gcc ggg atg age cgg atg 3087 Ile Gly Gly Leu Leu Ser Ala Ile Gly Val Ala Gly Met Ser Arg Met 825 830 835 cta ggc gcg aat gtg att gcc acc age gga cgt gea gtt gaa gcg gea 3135 Leu Gly Ala Asn Val Ile Ala Thr Ser Gly Arg Ala Val Glu Ala Ala 840 845 850 855 ggt gac gtt gac gtt ctg cta ctg gat aaa acc ggc acc ate aca ctc 3183 Gly Asp Val Asp Val 860 Leu Leu Leu Asp Lys 865 Thr Gly Thr Ile Thr 870 Leu ggt aac cgt cag gcg tcg gag ttt ate CCC gcg cag ggc gtg gat gaa 3231 Gly Asn Arg Gln 875 Ala Ser Glu Phe Ile 880 Pro Ala Gln Gly Val 885 Asp Glu aaa acg ctg gct gac gcc gea caa ctg gct tcg ctg gct gat gaa acg 3279 Lys Thr Leu 890 Ala Asp Ala Ala Gln 895 Leu Ala Ser Leu Ala 900 Asp Glu Thr ccg gaa ggc cgc agt att gtg ate ctc gee aag cag cgt ttt aac ctg 3327 Pro Glu 905 Gly Arg Ser Ile Val 910 Ile Leu Ala Lys Gln 915 Arg Phe Asn Leu cgc gag cgc gat gtg cag tcg ctc cat gcc acc ttt gta ccg ttt act 3375 Arg Glu Arg Asp Val Gln Ser Leu His Ala Thr Phe Val Pro Phe Thr 920 925 930 935 gcg caa age cgg atg age ggg ate aac ate gac aac cgc atg ate cgt 3423 Ala Gln Ser Arg Met 940 Ser Gly Ile Asn Ile 945 Asp Asn Arg Met Ile 950 Arg aaa ggt tet gtc gat gcc att cgt cgc cat gtt gag gct aac ggt ggt 3471 Lys Gly Ser Val 955 Asp Ala Xle Arg Arg 960 His Val Glu Ala Asn 965 Gly Gly cac ttc CCt acc gat gtt gat caa aaa gtc gat cag gtt gcg cgt cag 3519 His Phe Pro 970 Thr Asp Val Asp Gln 975 Lys Val Asp Gln Val 980 Ala Arg Gln gga gcc acg ccg ctg gtg gtg gtg gaa ggt tet cgt gtg ctg ggc gtt 3567 Gly Ala 985 Thr Pro Leu Val Val 990 Val Glu Gly Ser Arg 995 Val Leu Gly Val

att gcg ctg aaa gat ate gtc aaa ggc ggt att aaa gag cgc ttc 3612

Ile Ala Leu Lys Asp Ile Val Lys Gly Gly Ile Lys Glu Arg Phe 1000 1005 1010

gcc cag ctg cgc aaa atg ggc att aaa acg gtg atg att acc ggc 3657

Ala Gln Leu Arg Lys Met Gly Ile Lys Thr Val Met Ile Thr Gly 1015 1020 1025

gat aac cgt ctg act gcc gcc gcg att gct gcg gaa gcg ggt gtc 3702

Asp Asn Arg Leu Thr Ala Ala Ala Ile Ala Ala Glu Ala Gly Val 1030 1035 1040

gat gat ttt ctc gcc gaa gcg aca ccg gag gcc aag ctg gea ttg 3747

Asp Asp Phe Leu Ala Glu Ala Thr Pro Glu Ala Lys Leu Ala Leu 1045 1050 1055

ate cgt cag tat cag gcg gaa ggt cgt ttg gta gcg atg acc ggc 37 92

Ile Arg Gln Tyr Gln Ala Glu Gly Arg Leu Val Ala Met Thr Gly 1060 1065 1070 gac ggc acc Asp Gly Thr 1075

gtg gcg atg Val Ala Met 1090

atg gtc gat Met Val Asp 1105

cac att ggc His Ile Gly 1120

ttc age att Phe Ser Ile 1135

gcg gea ttc Ala Ala Phe 1150

atg tgc ctg Met Cys Leu 1165

ttc aac gcc Phe Asn Ala 1180

ggc gtg agt Gly Val Ser 1195

aac tta tgg Asn Leu Trp 1210

ggt ate aaa Gly Ile Lys 1225

tga ggtttacc

ttt ctg tta Phe Leu Leu

gta ctg ggg Val Leu Gly

att cgt gaa Ile Arg Glu

aat ttt acc Asn Phe Thr

gea gaa atg Ala Glu Met

gcg gtc agt Ala Val Ser

gct gea tta Ala Ala Leu

gtt gaa ctg Val Glu Leu

acc ccg caa Thr Pro Gln

aac gat gct Asn Asp Ala 1080 aac tcc ggc Asn Ser Gly

1095 ctc gac tet Leu Asp Ser 1110 aaa cag atg Lys Gln Met

1125 gcc aac gat Ala Asn Asp

1140 gcg gea acg Ala Ala Thr

1155 cat tcg ccc His Ser Pro

1170 ttg att ate Leu Ile Ile

1185 tat aaa ccg Tyr Lys Pro 1200 att tac ggt Ile Tyr Gly

1215 gtc att gat Val Ile Asp 1230

atg agt gga Met Ser Gly 1240 ttg att act Leu Ile Thr 1255

caa tgg tgg Gln Trp Trp 1270

ggt gat acg Gly Asp Thr 1285

ggc aac ggc Gly Asn Gly 1300

ccc tat aat Pro Tyr Asn 1315

aac cct gag Asn Pro Glu 1330

cgg gcc gct Arg Ala Ala 1345

gtg acg gea Val Thr Ala 1360

gcg gcg gcc Ala Ala Ala 1375

ccg gcg ctg gcg cag gea Pro Ala Leu Ala Gln Ala 1085

acc cag Thr Gln

aac ccg Asn Pro

ctg atg Leu Met

gcg gcg Ala Ala

acc aag Thr Lys

acc cgt Thr Arg

aaa Lys 1100 ttg Leu 1115 ggc Gly 1130

aaa ta

t a r +- ι-1-

gag Glu

ate Ile

tcg Ser

Ala

Val Ala Lys Tyr Phe 1145

tat ccg cag tta aat gcg Tyr Pro Gln Leu Asn Ala 1160

gac tcc gea ate ctc agt Asp Ser Ala Ile Leu Ser 1175

gtc ttt ttg att ccc ctg Val Phe Leu Ile Pro Leu 1190

ctt acc gct tet gcc atg Leu Thr Ala Ser Ala Met 1205

ctg ggt ggg ctg ctg gtg Leu Gly Gly Leu Leu Val 1220

tta ctg ctg acc gtt tgc Leu Leu Leu Thr Val Cys 1235

tta cgt ccg gea tta tca Leu Arg Pro Ala Leu Ser 1245

ggc ggc gtt tac ccg ctg Gly Gly Val Tyr Pro Leu 1260 ttt ccc tgg Phe Pro Trp

1275 gtg cgc ggt Val Arg Gly

1290 tat ttt cat Tyr Phe His

1305 cca cag gct Pro Gln Ala

1320 ctg gat aaa Leu Asp Lys

1335 aac ccg gat Asn Pro Asp

1350 tcg gea age Ser Ala Ser

1365 tgg caa ate Trp Gln Ile 1380

cag gcc aat Gln Ala Asn

tcg gea tta Ser Ala Leu

ggt cgc ccg Gly Arg Pro

tet ggc ggg Ser Gly Gly

cta ata gcc Leu Ile Ala

gcc age gcg Ala Ser Ala

ggg ctg gac Gly Leu Asp

cca cgc gtg Pro Arg Val

gat gtc gcg 3837

Asp Val Ala

gcg ggc aat 3882

Ala Gly Asn

gag gtg gtg 3927

Glu Val Val

ctg acc acc 3972

Leu Thr Thr

att att ccg 4017

Ile Ile Pro

ctg aac ate 4062

Leu Asn Ile

gcg gtg att 4107

Ala Val Ile

gcg tta aaa 4152

Ala Leu Lys

ttg cgc cgt 4197

Leu Arg Arg

ccg ttt ate 4242

Pro Phe Ile

ggt ctg gtg 4287

Gly Leu Val

aca ttt ate 4334

Thr Phe Ile 1250

ctg acc acc 4379

Leu Thr Thr 1265

ggt tcg ttg 4424

Gly Ser Leu 1280

ate ggg cag 4469

Ile Gly Gln 1295

tcg gea acg 4514

Ser Ala Thr 1310

age aat ctg 4559

Ser Asn Leu 1325

gea cgc gtt 4604

Ala Arg Val 1340

age gtt ccg 4 64 9

Ser Val Pro 1355

aat aat ate 4694

Asn Asn Ile 1370

gcg aaa gcg 4739

Ala Lys Ala 1385 cgt aat ctc age gtt gaa cag ctc acg caa ctg ate gea aaa tac 4784 Arg Asn Leu Ser Val Glu Gln Leu Thr Gln Leu Ile Ala Lys Tyr

1390 1395 1400

age caa caa ccg ctg gtg aaa tat ate ggc cag ccg gtt gtc aac 4829 Ser Gln Gln Pro Leu Val Lys Tyr Ile Gly Gln Pro Val Val Asn

1405 1410 1415

att gtt gaa ctc aat ctg gcg ctg gat aaa ctt gat gaa taa 4871 Ile Val Glu Leu Asn Leu Ala Leu Asp Lys Leu Asp Glu

1420 1425

cgaaccctta cgtcccgacc ccgatcgtct gctggaacaa actgccgcgc cgcatcgggg 4 931

gaagctgaaa gttttcttcg gtgcctgtgc aggcgtcggg aagacctggg cgatgctggc 4991

agaagcccag cgactgcggg cgcaagggct ggatattgtg gttggcgtgg tagaaaccca 5051

cgggcgaaaa gataccgccg ccatgctgga agggctggct gttctgccgt taaaacgcca 5111

ggcgtaccgt gggcggcata tcagcgagtt tgatctcgat gccgccctcg cccgccgccc 5171

ggcgctgatc ttaatggacg aactggcgca cagtaatgcg ccaggttccc gtcatcccaa 5231

acgctggcag gatatcgaag aactgctgga agctggcatt gatgttttca ctaccgtcaa 5291

cgttcagcat ctggaaagtc tgaatgatgt ggtcagcggc gtcaccggaa ttcaggtacg 5351

ggaaaccgtg cccgatcctt ttttcgatgc cgccgacgac gtggtgctgg tggacttgcc 5411

cccggacgat ctgcgccagc ggctgaaaga aggcaaagtc tatattgccg ggcaggcgga 5471

gcgcgccatt gaacattttt tccgcaaagg taatctgatc gccctgcgcg aactggcact 5531

gcgccgtact gccgatcgcg ttgatgagca aatgcgcgcc tggcgggggc atcctggcga 5591

agagaaagtg tggcacacgc gcgacgcgat ccttttatgc atcggccata acaccggcag 5651

cgaaaaactg gtccgcgcag cggcgcggct ggcgtcacgg ctgggtagcg tctggcacgc 5711

ggtgtatgtt gaaacccctg ccctgcaccg cttaccggaa aaaaaacgtc gggcaattct 5771

cagcgcctta cgtctggcgc aggaactggg cgcggagacg gcaacacttt ctgatccagc 5831

ggaagagaaa gcggtagtgc gttatgcccg tgaacataat ctcggcaaga ttattctcgg 5891

tcgcccggcc tcgcgccgct ggtggcgtcg ggaaacgttt gctgaccgac tggcgcgcat 5951

cgcccccgat ctcgatcagg tgctggtcgc gcttgatgaa ccacccgccc gcacgattaa 6011

caacgcgccg gataaccgct cttttaaaga caagtggcgt gtacaaattc agggatgcgt 6071

ggttgccgcc gcgttatgcg ccgttatcac cttaattgcc atgcagtggc tgatggcgtt 6131

tgatgccgcc aacctggtga tgctgtatct gcttggcgtg gtggtggtgg cgctatttta 6191

tggacgctgg ccttcagtgg ttgccaccgt cattaatgta gtgagtttcg atctcttttt 6251

tatcgcccca cgcggcacgc tcgccgtctc tgatgtgcaa tatctgctga ccttcgcggt 6311

gatgttaacc gtcgggctgg tgatcgggaa ccttactgct ggcgtgcgtt atcaggcgcg 6371

ggtagcccgt taccgcgagc aacgcacacg gcacttatat gaaatgtcga aagctctggc 6431

ggtgggccgc agtccgcagg atatcgctgc caccagcgaa caatttattg cctccacgtt 64 91

tcatgcccgc agtcaggtgt tgttgcccga tgacaacggt aaattgcagc cgttaacaca 6551

tccgcaagga atgacgccgt gggacgatgc catcgcgcag tggagttttg ataaaggcct 6611

gcctgcgggc gcgggcaccg acacgttacc cggtgtaccg taccagattt tgccgctaaa 6671

aagcggcgag aaaacctacg ggctggtggt ggtggagccg gggaatctgc gccagttgat 6731

gatcccggaa cagcagcgcc tgctggagac gtttacgctg ttagtcgcca atgcccttga 6791

gcggctgacg ctaaccgcca gcgaagaaca ggcgcggatg gcaagcgaac gtgaacagat 6851

ccgcaacgcc ctgctggcgg cgctttcgca tgatttacgc acgccgctta cggtgctgtt 6911

tggtcaggca gaaatcttaa cgctcgatct ggcaagcgaa ggatcacccc acgcccgcca 6971

ggccagcgag atccgtcagc atgtgctgaa cactacccga ctggtgaata atctactgga 7031

tatggcgcga attcagtccg gcggctttaa tttgaagaaa gagtggttaa cgctggaaga 7091

agtagtcggc agcgcgctgc aaatgctgga accgggttta tcgtcgccca tcaatctttc 7151

tctgccagaa ccgctgacct taatccacgt tgacgggcca ctctttgaac gggtgctgat 7211

taatctgctg gagaacgcgg tgaaatatgc gggtgcgcag gccgaaattg gtatcgatgc 7271

ccacgttgag ggcgaaaatc tacaactgga tgtctgggat aacggccccg gtcttccgcc 7331

aggccaggag cagacgatat ttgataagtt tgctcgcggg aataaagagt cggcagtacc 7391

gggggtaggg cttggactgg caatttgtcg ggcgatagtg gatgtacacg ggggcactat 7451

taccgcgttc aaccgaccgg aaggtggtgc ctgttttcgt gttacacttc cccagcaaac 7511

tgcccctgaa cttgaagaat ttcatgagga tatgtgacaa acgttctgat tgttgaagat 7571

gaacaggcta ttcgtcgctt tctgcgcacg gcgctggagg gcgacgggat gcgcgtcttt 7 631

gaggccgaaa cgctgcaacg cggcttgctg gaagcggcaa cccgtaagcc agatttgatt 7 691

attetegate tcggcctgcc cgatggtgat gggattgagt ttatccgcga cctgcgccag 7751

tggagcgcgg tgccggtgat tgtgctttcc gcacgcagcg aagagagcga caaaatcgcc 7811

gcgctggatg ccggagcgga tgattatctg agtaagccgt ttggcattgg cgaattgcag 7871

gcccgtctgc gcgtcgcatt acgccgccac tctgccacca ccgcgcccga tccgctggta 7931

aaattttccg atgttaccgt cgatttagcc gcccgcgtga ttcaccgggg tgaggaagag 7991

gtgcatctca caccaattga gttccgcctg ctggcggtgc tgctcaacaa tgccggaaaa 8051

gtactcaccc agcgccagct ccttaaccag gtgtgggggc caaacgcggt cgaacacagt 8111 cactatttgc gtatttatat gggacatctg ccacgccatt tcattactga aaccggtatt ttaatacagc ctgcctttta ttaattaaag aacaacacac aaaaataaca attcaatatt aataaattaa gattgatcat tttttattga atagaatatc ttcaccttca ttcacatcag gcactatgcc ccatataagg cggacaactc

cgacaaaaac tggaacagga tcccgcccgc 8171

ggctatcggt ttatgctttg aatattaatt 8231

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tcaccttcac agttcaaccg tatttcctgg 8411

gaaaggtaaa ttaaatggaa aataacagcc 8471

8501

<210> 2

<211> 557

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 2

Met Ala Ala Gln Gly Phe Leu Leu Ile Ala Thr Phe Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Met Val Leu Ala Arg Pro Leu Gly Ser Gly Leu Ala Arg Leu Ile Asn 20 25 30 Asp Ile Pro Leu Pro Gly Thr Thr Gly Val Glu Arg Val Leu Phe Arg 35 40 45 Ala Leu Gly Val Ser Asp Arg Glu Met Asn Trp Lys Gln Tyr Leu Cys 50 55 60 Ala Ile Leu Gly Leu Asn Met Leu Gly Leu Ala Val Leu Phe Phe Met 65 70 75 80 Leu Leu Gly Gln His Tyr Leu Pro Leu Asn Pro Gln Gln Leu Pro Gly 85 90 95 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Leu Asn Thr Ala Val Ser Phe Val Thr Asn 100 105 110 Thr Asn Trp Gln Ser Tyr Ser Gly Glu Thr Thr Leu Ser Tyr Phe Ser 115 120 125 Gln Met Ala Gly Leu Thr Val Gln Asn Phe Leu Ser Ala Ala Ser Gly 130 135 140 Ile Ala Val Ile Phe Ala Leu Ile Arg Ala Phe Thr Arg Gln Ser Met 145 150 155 160 Ser Thr Leu Gly Asn Ala Trp Val Asp Leu Leu Arg Ile Thr Leu Trp 165 170 175 Val Leu Val Pro Val Ala Leu Leu Ile Ala Leu Phe Phe Ile Gln Gln 180 185 190 Gly Ala Leu Gln Asn Phe Leu Pro Tyr Gln Ala Val Asn Thr Val Glu 195 200 205 Gly Ala Gln Gln Leu Leu Pro Met Gly Pro Val Ala Ser Gln Glu Ala 210 215 220 Ile Lys Met Leu Gly Thr Asn Gly Gly Gly Phe Phe Asn Ala Asn Ser 225 230 235 240 Ser His Pro Phe Glu Asn Pro Thr Ala Leu Thr Asn Phe Val Gln Met 245 250 255 Leu Ala Ile Phe Leu Ile Pro Thr Ala Leu Cys Phe Ala Phe Gly Glu 260 265 270 Val Met Gly Asp Arg Arg Gln Gly Arg Met Leu Leu Trp Ala Met Ser 275 280 285 Val Ile Phe Val Ile Cys Val Gly Val Val Met Trp Ala Glu Val Gln 290 295 300 Gly Asn Pro His Leu Leu Ala Leu Gly Thr Asp Ser Ser Ile Asn Met 305 310 315 320 Glu Gly Lys Glu Ser Arg Phe Gly Val Leu Val Ser Ser Leu Phe Ala 325 330 335 Val Val Thr Thr Ala Ala Ser Cys Gly Ala Val Ile Ala Met His Asp 340 345 350 Ser Phe Thr Ala Leu Gly Gly Met Val Pro Met Trp Leu Met Gln Ile 355 360 365 Gly Glu Val Val Phe Gly Gly Val Gly Ser Gly Leu Tyr Gly Met Met 370 375 380 Leu Phe Val Leu Leu Ala Val Phe Ile 8 Ala Gly Leu Met Ile Gly Arg 385 390 395 400 Thr Pro Glu Tyr Leu 405 Gly Lys Lys Ile Asp 410 Val Arg Glu Met Lys 415 Leu Thr Ala Leu Ala Ile Leu Val Thr Pro Thr Leu Val Leu Met Gly Ala 420 425 430 Ala Leu Ala Met Met Thr Asp Ala Gly Arg Ser Ala Met Leu Asn Pro 435 440 445 Gly Pro 450 His Gly Phe Ser Glu 455 Val Leu Tyr Ala Val 460 Ser Ser Ala Ala Asn Asn Asn Gly Ser Ala Phe Ala Gly Leu Ser Ala Asn Ser Pro Phe 465 470 475 480 Trp TV Leu 485 Ala Phe Cys Met Phe 490 Val Gly Arg Phe Gly 495 Val Ile Ile Pro Val 500 Met Ala Ile Ala Gly 505 Ser Leu Val Ser Lys 510 Lys Ser Gln Ala Ala 515 Ser Ser Gly Thr Leu 520 Pro Thr His Gly Pro 525 Leu Phe Val Gly Leu Leu Ile Gly Thr Val Leu Leu Val Gly Ala Leu Thr Phe Ile 530 535 540 Pro Ala Leu Ala Leu Gly Pro Val Ala Glu Tyr Leu Ser 545 550 555

<210> 3 <211> 682 <212> PRT

<213> Escherichia coli <400> 3 Met Ser Arg Lys Gln Leu Ala Leu Phe Glu Pro Thr Leu Val Val Gln 1 5 10 15 Ala Leu Lys Glu Ala Val Lys Lys Leu Asn Pro Gln Ala Gln Trp Arg 20 25 30 Asn Pro Val Met Phe Ile Val Trp Ile Gly Ser Leu Leu Thr Thr Cys 35 40 45 Ile Ser Ile Ala Met Ala Ser Gly Ala Met Pro Gly Asn Ala Leu Phe 50 55 60 Ser Ala Ala Ile Ser Gly Trp Leu Trp Ile Thr Val Leu Phe Ala Asn 65 70 75 80 Phe Ala Glu Ala Leu Ala Glu Gly Arg Ser Lys Ala Gln Ala Asn Ser 85 90 95 Leu Lys Gly Val Lys Lys Thr Ala Phe Ala Arg Lys Leu Arg Glu Pro 100 105 110 Lys Tyr Gly Ala Ala Ala Asp Lys Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Lys 115 120 125 Gly Asp Ile Val Leu Val Glu Ala Gly Asp Ile Ile Pro Cys Asp Gly 130 135 140 Glu Val Ile Glu Gly Gly Ala Ser Val Asp Glu Ser Ala Ile Thr Gly 145 150 155 160 Glu Ser Ala Pro Val Ile Arg Glu Ser Gly Gly Asp Phe Ala Ser Val 165 170 175 Thr Gly Gly Thr Arg Ile Leu Ser Asp Trp Leu Val Ile Glu Cys Ser 180 185 190 Val Asn Pro Gly Glu Thr Phe Leu Asp Arg Met Ile Ala Met Val Glu 195 200 205 Gly Ala Gln Arg Arg Lys Thr Pro Asn Glu Ile Ala Leu Thr Ile Leu 210 215 220 Leu Ile Ala Leu Thr Ile Val Phe Leu Leu Ala Thr Ala Thr Leu Trp 225 230 235 240 Pro Phe Ser Ala Trp Gly Gly Asn Ala Val Ser Val Thr Val Leu Val 245 250 255 Ala Leu Leu Val Cys Leu Ile Pro Thr Thr Ile Gly Gly Leu Leu Ser 260 265 270

Ala Ile Gly Val Ala Gly Met Ser Arg Met Leu Gly Ala Asn Val Ile 275 280 285 Ala Thr Ser Gly Arg Ala Val Glu Ala Ala Gly Asp Val Asp Val Leu 290 295 300 Leu Leu Asp Lys Thr Gly Thr Ile Thr Leu Gly Asn Arg Gln Ala Ser 305 310 315 320 Glu Phe Ile Pro Ala Gln Gly Val Asp Glu Lys Thr Leu Ala Asp Ala 325 330 335 Ala Gln Leu Ala 340 Ser Leu Ala Asp Glu 345 Thr Pro Glu Gly Arg 350 Ser Ile Val Ile Leu -3 C C. ~J Ala Lys Gln Arg Phe 360 Asn Leu Arg Glu Arg 365 Asp Val Gln Ser Leu 370 His Ala Thr Phe Val 375 Pro Phe Thr Ala Gln 380 Ser Arg Met Ser Gly Ile Asn Ile Asp Asn Arg Met Ile Arg Lys Gly Ser Val Asp Ala 385 390 395 400 Ile Arg Arg His Val 405 Glu Ala Asn Gly Gly 410 His Phe Pro Thr Asp 415 Val Asp Gln Lys Val Asp Gln Val Ala Arg Gln Gly Ala Thr Pro Leu Val 420 425 430 Val Val Glu Gly Ser Arg Val Leu Gly Val Ile Ala Leu Lys Asp Ile 435 440 445 Val Lys 450 Gly Gly Ile Lys Glu 455 Arg Phe Ala Gln Leu 460 Arg Lys Met Gly Ile Lys Thr Val Met Ile Thr Gly Asp Asn Arg Leu Thr Ala Ala Ala 465 470 475 480 Ile Ala Ala Glu Ala 485 Gly Val Asp Asp Phe 490 Leu Ala Glu Ala Thr 495 Pro Glu Ala Lys Leu 500 Ala Leu Ile Arg Gln 505 Tyr Gln Ala Glu Gly 510 Arg Leu Val Ala Met Thr Gly Asp Gly Thr Asn Asp Ala Pro Ala Leu Ala Gln 515 520 525 Ala Asp 530 Val Ala Val Ala Met 535 Asn Ser Gly Thr Gln 540 Ala Ala Lys Glu Ala Gly Asn Met Val Asp Leu Asp Ser Asn Pro Thr Lys Leu Ile Glu 545 550 555 560 Val Val His Ile Gly 565 Lys Gln Met Leu Met 570 Thr Arg Gly Ser Leu 575 Thr Thr Phe Ser Ile 580 Ala Asn Asp Val Ala 585 Lys Tyr Phe Ala Ile 590 Ile Pro Ala Ala Phe 595 Ala Ala Thr Tyr Pro 600 Gln Leu Asn Ala Leu 605 Asn Ile Met Cys Leu 610 His Ser Pro Asp Ser 615 Ala Ile Leu Ser Ala 620 Val Ile Phe Asn Ala Leu Ile Ile Val Phe Leu Ile Pro Leu Ala Leu Lys Gly Val Ser 625 630 635 640 Tyr Lys Pro Leu Thr 645 Ala Ser Ala Met Leu 650 Arg Arg Asn Leu Trp 655 Ile Tyr Gly Leu Gly 660 Gly Leu Leu Val Pro 665 Phe Ile Gly Ile Lys 670 Val Ile Asp Leu Leu 675 Leu Thr Val Cys Gly 680 Leu Val

<210> 4

<211> 190

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 4

Met Ser Gly Leu Arg Pro Ala Leu Ser Thr Phe Ile Phe Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ile Thr Gly Gly Val Tyr Pro Leu Leu Thr Thr Val Leu Gly Gln Trp

20 25 30

Trp Phe Pro Trp Gln Ala Asn Gly Ser Leu Ile Arg Glu Gly Asp Thr

35 40 45

Val Arg Gly Ser Ala Leu Ile Gly Gln Asn Phe Thr Gly Asn Gly Tyr

50 55 60

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Ala Ser Gly Gly Ser Asn Leu Ala Val Ser Asn Pro Glu Leu Asp Lys

85 90 95

Leu Ile Ala Ala Arg Val Ala Ala Leu Arg Ala Ala Asn Pro Asp Ala

100 105 110

Ser Ala Ser Val Pro Val Glu Leu Val Thr Ala Ser Ala Ser Gly Leu

115 120 125

Asp Asn Asn Ile Thr Pro Gln Ala Ala Ala Trp Gln Ile Pro Arg Val

130 135 140

Ala Lys Ala Arg Asn Leu Ser Val Glu Gln Leu Thr Gln Leu Ile Ala 145 150 155 160

Lys Tyr Ser Gln Gln Pro Leu Val Lys Tyr Ile Gly Gln Pro Val Val

165 170 175

Asn Ile Val Glu Leu Asn Leu Ala Leu Asp Lys Leu Asp Glu 180 185 190

<210> 5

<211> 894

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 5 Met Asn Asn Glu Pro Leu Arg Pro Asp Pro Asp Arg Leu Leu Glu Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ala Pro His Arg Gly Lys Leu Lys Val Phe Phe Gly Ala Cys 20 25 30 Ala Gly Val Gly Lys Thr Trp Ala Met Leu Ala Glu Ala Gln Arg Leu 35 40 45 Arg Ala Gln Gly Leu Asp Ile Val Val Gly Val Val Glu Thr His Gly 50 55 60 Arg Lys Asp Thr Ala Ala Met Leu Glu Gly Leu Ala Val Leu Pro Leu 65 70 75 80 Lys Arg Gln Ala Tyr Arg Gly Arg His Ile Ser Glu Phe Asp Leu Asp 85 90 95 Ala Ala Leu Ala Arg Arg Pro Ala Leu Ile Leu Met Asp Glu Leu Ala 100 105 110 His Ser Asn Ala Pro Gly Ser Arg His Pro Lys Arg Trp Gln Asp Ile 115 120 125 Glu Glu Leu Leu Glu Ala Gly Ile Asp Val Phe Thr Thr Val Asn Val 130 135 140 Gln His Leu Glu Ser Leu Asn Asp Val Val Ser Gly Val Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gln Val Arg Glu Thr Val Pro Asp Pro Phe Phe Asp Ala Ala Asp Asp 165 170 175 Val Val Leu Val Asp Leu Pro Pro Asp Asp Leu Arg Gln Arg Leu Lys 180 185 190 Glu Gly Lys Val Tyr Ile Ala Gly Gln Ala Glu Arg Ala Ile Glu His 195 200 205 Phe Phe Arg Lys Gly Asn Leu Ile Ala Leu Arg Glu Leu Ala Leu Arg 210 215 220 Arg Thr Ala Asp Arg Val Asp Glu Gln Met Arg Ala Trp Arg Gly His 225 230 235 240 Pro Gly Glu Glu Lys Val Trp His Thr Arg Asp Ala Ile Leu Leu Cys 245 250 255 Ile Gly His Asn Thr Gly Ser Glu Lys Leu Val Arg Ala Ala Ala Arg 260

Leu Ala Ser Arg 275

Pro Ala Leu His 290

Ala Leu Arg Leu 305

Asp Pro Ala Glu

Leu Gly Lys Ile 340

Arg Glu Thr Phe 355

Gln Val Leu Val 370

Ala Pro Asp Asn 385

Gly Cys Val Val

Met Gln Trp Leu 420

Leu Leu Gly Val 435

Val Val Ala Thr 450

Ala Pro Arg Gly 4 65

Phe Ala Val Met

Gly Val Arg Tyr 500

Arg His Leu Tyr 515

Gln Asp Ile Ala 530

Ala Arg Ser Gln 545

Leu Thr His Pro

Trp Ser Phe Asp 580

Pro Gly Val Pro 595

Tyr Gly Leu Val 610

Pro Glu Gln Gln 625

Ala Leu Glu Arg

Ala Ser Glu Arg 660

His Asp Leu Arg 675

Leu Thr Leu Asp 690

Ser Glu Ile Arg 705

Leu Leu Asp Met

Glu Trp Leu Thr 740

Glu Pro Gly Leu 755

Leu Gly Ser Val 280

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Ala Gln Glu Leu 310

Glu Lys Ala Val 325

Ile Leu Gly Arg

Ala Asp Arg Leu 360

Ala Leu Asp Glu 375

Arg Ser Phe Lys 390

Ala Ala Ala Leu 405

Met Ala Phe Asp

Val Val Val Ala 440

Val Ile Asn Val 455

Thr Leu Ala Val 470

Leu Thr Val Gly 485

Gln Ala Arg Val

Glu Met Ser Lys 520

Ala Thr Ser Glu 535

Val Leu Leu Pro 550

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Lys Gly Leu Pro

Tyr Gln Ile Leu 600

Val Val Glu Pro 615

Arg Leu Leu Glu 630

Leu Thr Leu Thr 645

Glu Gln Ile Arg

Thr Pro Leu Thr 680

Leu Ala Ser Glu 695

Gln His Val Leu 710

Ala Arg Ile Gln 725

Leu Glu Glu Val

Ser Ser Pro Ile 760

265

Trp His Ala Val

Lys Lys Arg Arg 300

Gly Ala Glu Thr 315

Val Arg Tyr Ala 330

Pro Ala Ser Arg 345

Ala Arg Ile Ala

Pro Pro Ala Arg 380

Asp Lys Trp Arg 395

Cys Ala Val Ile 410

Ala Ala Asn Leu 425

Leu Phe Tyr Gly

Val Ser Phe Asp 460

Ser Asp Val Gln 475

Leu Val Ile Gly 490

Ala Arg Tyr Arg 505

Ala Leu Ala Val

Gln Phe Ile Ala 540

Asp Asp Asn Gly 555

Pro Trp Asp Asp 570

Ala Gly Ala Gly 585

Pro Leu Lys Ser

Gly Asn Leu Arg 620

Thr Phe Thr Leu 635

Ala Ser Glu Glu 650

Asn Ala Leu Leu 665

Val Leu Phe Gly

Gly Ser Pro His 700

Asn Thr Thr Arg 715

Ser Gly Gly Phe 730

Val Gly Ser Ala 745

Asn Leu Ser Leu

270

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Ala Ile Leu Ser

Ala Thr Leu Ser 320

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Arg Trp Trp Arg 350

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Thr Ile Asn Asn

Val Gln Ile Gln 400

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Arg Trp Pro Ser 445

Leu Phe Phe Ile

Tyr Leu Leu Thr 480

Asn Leu Thr Ala 495

Glu Gln Arg Thr 510

Gly Arg Ser Pro 525

Ser Thr Phe His

Lys Leu Gln Pro 560

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Thr Asp Thr Leu 590

Gly Glu Lys Thr 605

Gln Leu Met Ile

Leu Val Ala Asn 640

Gln Ala Arg Met 655

Ala Ala Leu Ser 670

Gln Ala Glu Ile 685

Ala Arg Gln Ala

Leu Val Asn Asn 720

Asn Leu Lys Lys 735

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Pro Glu Pro Leu 765 Thr Leu Ile His Val Asp Gly Pro Leu Phe Glu Arg Val Leu Ile Asn

770 775 780 Leu Leu Glu Asn Ala Val Lys Tyr Ala Gly Ala Gln Ala Glu Ile Gly 785 790 795 800 Ile Asp Ala His Val 805 Glu Gly Glu Asn Leu 810 Gln Leu Asp Val Trp 815 Asp Asn Gly Pro Gly 820 Leu Pro Pro Gly Gln 825 Glu Gln Thr Ile Phe 830 Asp Lys Phe Ala Arg Gly Asn Lys Glu Ser Ala Val Pro Gly Val Gly Leu Gly 835 840 845 Leu Ala 850 Ile Cys Arg Ala Ile 855 Val Asp Val His Gly 860 Gly Thr Ile Thr Ala Phe Asn Arg Pro Glu Gly Gly Ala a Phe 7\ -ν-/-τ ru- y Val Thr Leu Pro 865 870 875 880 Gln Gln Thr Ala Pro Glu Leu Glu Glu Phe His Glu Asp Met

885 890

<210> 6

<211> 225

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<4 00> 6 Val Thr- Asn Val Leu Ile Val Glu Asp Glu Gln Ala Ile Arg Arg Phe 1 5 10 15 Leu Arg Thr Ala 20 Leu Glu Gly Asp Gly 25 Met Arg Val Phe Glu 30 Ala Glu Thr Leu Gln 35 Arg Gly Leu Leu Glu 40 Ala Ala Thr Arg Lys 45 Pro Asp Leu Ile Ile Leu Asp Leu Gly Leu Pro Asp Gly Asp Gly Ile Glu Phe Ile 50 55 60 Arg Asp Leu Arg Gln Trp Ser Ala Val Pro Val Ile Val Leu Ser Ala 65 70 75 80 Arg Ser Glu Glu Ser 85 Asp Lys Ile Ala Ala 90 Leu Asp Ala Gly Ala 95 Asp Asp Tyr Leu Ser 100 Lys Pro Phe Gly Ile 105 Gly Glu Leu Gln Ala 110 Arg Leu Arg Val Ala 115 Leu Arg Arg His Ser 120 Ala Thr Thr Ala Pro 125 Asp Pro Leu Val Lys 130 Phe Ser Asp Val Thr 135 Val Asp Leu Ala Ala 140 Arg Val Ile His Arg Gly Glu Glu Glu Val His Leu Thr Pro Ile Glu Phe Arg Leu Leu 145 150 155 160 Ala Val Leu Leu Asn 165 Asn Ala Gly Lys Val 170 Leu Thr Gln Arg Gln 175 Leu Leu Asn Gln Val 180 Trp Gly Pro Asn Ala 185 Val Glu His Ser His 190 Tyr Leu Arg Ile Tyr 195 Met Gly His Leu Arg 200 Gln Lys Leu Glu Gln 205 Asp Pro Ala Arg Pro Arg His Phe Ile Thr Glu Thr Gly Ile Gly Tyr Arg Phe Met

210 215 220

Leu 225

<210> 7

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<212> DNA

<213> Pantoea ananatis

<220>

<221> CDS <222> (543)..(2225)

<220> <221> CDS <222> (2228)..(4273)

<220> <221> CDS <222> (4284)..(4853)

<220> <221> CDS <222> (4867)..(7542)

<400> 7

aggctggacc ccagccaaaa ccctgcaaat gatgttgagc tggccggggc atttcgacag 60

taccttactg cacgctttcg tcagtacgat agggatgtat cccgtcggtt ccctggttcg 120

cctggcgtct ggacgcattg cgctggtggt gaagggcggc gataagtcat tacagcgacc 180

tacggtgcat gtcttctggt cactgcacgc gcagcgggaa atcaaacccg aggtgctgga 240

tctgggcgac agtttttgta ctgacagcat tgtgtgtgcc gaagataacg gccgttggga 300

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ctactcagca aatccaatcc tctggaggtt gctgtgagtg caggcgtaat aaccggcatt 480

gtgctggtag tgttgttgct gggctatctg atctatgccc tgttaaatgc ggaggccttc 540

tg atg gcg gcc aat gcg ttt tta ctg ate gcg gtt tat ctg ctg ttg 587

Met Ala Ala Asn Ala Phe Leu Leu Ile Ala Val Tyr Leu Leu Leu 1 5 10 15

ctg atg gtg atg gcg caa ccg ctg ggg cgt ggg ctg gcc gcg ctg gtt 635 Leu Met Val Met Ala Gln Pro Leu Gly Arg Gly Leu Ala Ala Leu Val 20 25 30

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att ttg gtg ttc aac ctg ctt ggc ttc gtg gtg ctg ctc gcc ate cta 779 Ile Leu Val Phe Asn Leu Leu Gly Phe Val Val Leu Leu Ala Ile Leu 65 70 75

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Ala Gln Gln Thr Leu Ala Met Gly Pro Val Ala Ser Gln Glu Ala Ile

210 215 220

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Lys Met Leu Gly Thr Asn Gly Gly Gly Phe Phe Asn Val Asn Ser Ala

225 230 235

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Ser Ile Phe Leu Ile Pro Ala Ala Leu Cys Phe Ala Phe Gly Glu Ser

260 265 270

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Val Lys Asp Arg Arg Gln Gly Ser Met Leu Leu Trp Ser Met Thr Leu

275 280 285

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Met Phe Val Val Ala Ala Ala Leu Val Met Trp Ala Glu Leu Arg Gly

290 295 300

aac ccg cac ttt ctg acg cta ggg gct gac age gcc ate aat atg gaa 1499

Asn Pro His Phe Leu Thr Leu Gly Ala Asp Ser Ala Ile Asn Met Glu

305 310 315

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Gly Lys Glu Thr Arg Phe Gly Ile Leu Asn Ser Ser Leu Phe Ala Val 320 325 330 335

att acg acg gcg gcg tcc tgc ggt gcg gta aac gcg atg cat gac tcg 1595

Ile Thr Thr Ala Ala Ser Cys Gly Ala Val Asn Ala Met His Asp Ser

340 345 350

ttt acg gcg ctg ggc ggt atg gtg ccg atg ctg ctg atg caa ctg ggc 1643

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355 360 365

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Glu Val Val Phe Gly Gly Val Gly Ala Gly Leu Tyr Gly Met Leu Leu

370 375 380

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Phe Val Leu Leu Ala Val Phe Ile Ala Gly Leu Met Ile Gly Arg Thr

385 390 395

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Pro Glu Phe Leu Gly Lys Lys Ile Asp Val Trp Glu Met Lys Met Thr 400 405 410 415

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Ala Leu Ala Ile Leu Val Thr Pro Ala Leu Val Leu Ile Gly Thr Ala

420 425 430

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Ile Ala Met Met Thr Asp Ala Gly Arg Ala Gly Met Ala Asn Pro Gly

435 440 445

acg cat ggc ttt agt gaa gtc ctg tat gcc gtt tcg tcg gcc gcc aat 1931

Thr His Gly Phe Ser Glu Val Leu Tyr Ala Val Ser Ser Ala Ala Asn

450 455 460

aac aat ggc age gcc ttt gcg ggc ctg aac gcc aat acg ccg ttc tgg 1979

Asn Asn Gly Ser Ala Phe Ala Gly Leu Asn Ala Asn Thr Pro Phe Trp

465 470 475

aac ctg ctg ctg gcg gtg tgt atg ttc gta ggt cgc ttc ggc ate att 2027

Asn Leu Leu Leu Ala Val Cys Met Phe Val Gly Arg Phe Gly Ile Ile 480 485 490 495

att ccg gtc atg gcg att gcg ggg gca atg gcg gtg aaa aaa gtg cag 2075

Ile Pro Val Met Ala Ile Ala Gly Ala Met Ala Val Lys Lys Val Gln

500 505 510

ccg gta ggt aac ggc acg ctc cct acg cac ggt ccg ctg ttt ate gca 2123

Pro Val Gly Asn Gly Thr Leu Pro Thr His Gly Pro Leu Phe Ile Ala

515 520 525

ctg ctg gtc ggt acc gtc ttg ttg gtc ggc gcg ctg acc ttt att cct 2171

Leu Leu Val Gly Thr Val Leu Leu Val Gly Ala Leu Thr Phe Ile Pro 530 535 540 gct ctg gcg ctg ggt ccg gtc gcc gag cac ctg caa ctt att cag gga 2219

Ala Leu Ala Leu Gly Pro Val Ala Glu His Leu Gln Leu Ile Gln Gly

545 550 555

caa taa tc atg agt cgt caa caa cag gtg ttt gac gca gcg ctg tta 2266

Gln Met Ser Arg Gln Gln Gln Val Phe Asp Ala Ala Leu Leu

560 565 570

cgt acc tca gcg ate gat gcg gta aaa aaa ctc gat cct cgc gtg cag 2314

Arg Thr Ser Ala Ile Asp Ala Val Lys Lys Leu Asp Pro Arg Val Gln

575 580 585

ttt cgc aat ccg gtc atg ttt gtg gtt tac ctg ggc agt ate ctg acc 2362

Phe Arg Asn Pro Val Met Phe Val Val Tyr Leu Gly Ser Ile Leu Thr 590 595 600 605

tcg att ctg gcc ata atg atg ttt acc gga cac cag age ggc age gcc 2410

Ser Ile Leu Ala Ile Met Met Phe Thr Gly His Gln Ser Gly Ser Ala

610 615 620

age ttt acc ggc gcg att gcc ctg tgg tta tgg ttc acc gtg ctg ttt 2458

Ser Phe Thr Gly Ala Ile Ala Leu Trp Leu Trp Phe Thr Val Leu Phe

625 630 635

gcc aac atg gca gaa gcc ctg gcg gaa ggg cgc agt aaa gcc cag gca 2506

Ala Asn Met Ala Glu Ala Leu Ala Glu Gly Arg Ser Lys Ala Gln Ala

640 645 650

aac age ctg aaa ggc gtt aaa aag acc age ttc gcc aaa aaa ctg tcg 2554

Asn Ser Leu Lys Gly Val Lys Lys Thr Ser Phe Ala Lys Lys Leu Ser

655 660 665

gcg gcg cac tac ggt gca gcg tgg cag cag gtg gcg gcc gat gcg ctg 2602

Ala Ala His Tyr Gly Ala Ala Trp Gln Gln Val Ala Ala Asp Ala Leu 670 675 680 685

cgt aaa ggg gat gcc gtg ctg gta gag gcc ggt gat gtg ate ccc tgc 2650

Arg Lys Gly Asp Ala Val Leu Val Glu Ala Gly Asp Val Ile Pro Cys

690 695 700

gac ggt gaa gtc gtg gaa ggg ggc gca tcg gta gac gag age gcg ate 2698

Asp Gly Glu Val Val Glu Gly Gly Ala Ser Val Asp Glu Ser Ala Ile

705 710 715

acc ggt gaa tcg gca ccg gtg ate cgt gaa tcg ggc ggg gat ttc gcc 27 4 6

Thr Gly Glu Ser Ala Pro Val Ile Arg Glu Ser Gly Gly Asp Phe Ala

720 725 730

tcg gtg acc ggc ggg aca cgc att ctg tet gac tgg ctg gtc att acc 2794

Ser Val Thr Gly Gly Thr Arg Ile Leu Ser Asp Trp Leu Val Ile Thr

735 740 745

tgc age gcc aac cca ggc gaa acc ttc ctg gac cgg atg ate gcc atg 2842

Cys Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Phe Leu Asp Arg Met Ile Ala Met 750 755 760 765

gtc gaa ggc gca cag cgt cgt aaa acc ccg aat gag att gcc ctg acc 2890

Val Glu Gly Ala Gln Arg Arg Lys Thr Pro Asn Glu Ile Ala Leu Thr

770 775 780

att ctg ctg gtg tcg ctc acc att gtg ttt ctg tta gcc acc gtc acg 2938

Ile Leu Leu Val Ser Leu Thr Ile Val Phe Leu Leu Ala Thr Val Thr

785 790 795

ctg tgg cct ttt tca gcc tgg ggc ggc acg ccg gtc acc ate acc gta 2986

Leu Trp Pro Phe Ser Ala Trp Gly Gly Thr Pro Val Thr Ile Thr Val

800 805 810

ctg gtg gcg ctg ctg gta tgc ctg ate ccg acc acc att ggc ggt ctg 3034

Leu Val Ala Leu Leu Val Cys Leu Ile Pro Thr Thr Ile Gly Gly Leu

815 820 825

ctg tcc gct ate ggc gtg gcc ggg atg age cgg atg ctg ggc gct aac 3082

Leu Ser Ala Ile Gly Val Ala Gly Met Ser Arg Met Leu Gly Ala Asn 830 835 840 845

gtc att gcc acc agt ggc cgc gct gtt gaa gcc gct ggc gac gtg gat 3130

Val Ile Ala Thr Ser Gly Arg Ala Val Glu Ala Ala Gly Asp Val Asp

850 855 860

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Val Leu Met Leu Asp Lys Thr Gly Thr Ile Thr Leu Gly Asn Arg Gln 865 870 875 gca acg Ala Thr

gat gcg Asp Ala 895 age ate Ser Ile 910

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gtg Val

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gat gcg gtg Asp Ala Val 960

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gat ate gtt Asp Ile Val

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acc gcc gcc Thr Ala Ala

tca gaa gcg Ser Glu Ala

cag gcg gag Gln Ala Glu

gac gcg cca Asp Ala Pro

tcg ggt act Ser Gly Thr

gac tcg aac Asp Ser Asn

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tcg ccc gca Ser Pro Ala

gtg att gta Val Ile Val

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gtg Val

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Pro

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ctg gcg tcc ctg gcg gat Leu Ala Ser Leu Ala Asp 900

ctg gcg aag caa aag ttt Leu Ala Lys Gln Lys Phe 915

ggc gcc age ttt att ccc Gly Ala Ser Phe Ile Pro 930 935

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aac ctg cgt Asn Leu Arg 920

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cag ctg gcg Gln Leu Ala

gaa ggg cgc Glu Gly Arg

gaa cgt gac Glu Arg Asp 925

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950 955

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965 970

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980 985

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995 1000 1005

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Gly 1010 aaa Lys 1025 ate Ile 1040 ccg Pro 1055 cgc Arg 1070 ttg Leu 1085 gcg Ala 1100 acc Thr 1115 acg Thr 1130 aag Lys 1145 cag Gln 1160 gcc Ala 1175 ctg Leu 1190

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gcg gca Ala Ala

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gaa gcg Glu Ala

Gly Ile Lys Glu Arg 1015 acc Thr 1030

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gtg gat gac ttt ctg Val Asp Asp Phe Leu 1050

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ggt gac ggc acc aat Gly Asp Gly Thr Asn 1080

gcg gtc gcc atg Ala Val Ala Met

gcg aaa Ala Lys

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3226

3274

3322

3370

3418

3466

3514

3562

3607

3652

3697

3742

3787

3832

3877

3922

3967

4012

4057

4102

4147 cgc Arg

tat Tyr

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ctg Leu

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CCC

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1320 gcg ctg Ala Leu

1335 gcg aat Ala Asn

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1365 ctg tgg Leu Trp

1380 gcg aaa Ala Lys

1395 ctg ccc Leu Pro

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1425 ccg ctg Pro 1435 age Ser 1450 gta Val 1465

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ctg Leu

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gga Gly

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ctg gtg ccc ttt gtc Leu Val Pro Phe Val 1225

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ctg cta acg gtt Leu Leu Thr Val 1255

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1340 aac ggg Asn Gly

1355 ctg gac Leu Asp

1370 cgt ate Arg Ile

1385 ctg gta Leu Val

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4237

4286

4331

4376

4421

4466

4511

4556

4601

4646

4691

4736

4781

4826

4875

4920

4965

5010

5055

5100 ccg Pro

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ctg Leu

cag Gln

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gat Asp

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ctg Leu

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gcg Ala

cac His

att Ile

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cgc Arg

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cac His

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ttg Leu

tta Leu

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1515 gcg cgc cat Ala Arg His

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1545 gaa ctg ctg Glu Leu Leu

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1635 gag ctg gcg Glu Leu Ala

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1715 cgg gcc att Arg Ala Ile 1730

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1755 gtg aca Val Thr

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gcg Ala 1745 gcg Ala 1760 gcg Ala 1775 ttg Leu 1790 ate Ile 1805 gac Asp 1820

ttc gac ctt 5145

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aaa cgc tgg 5235

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gtc ctg acg 5280

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gtg gtc ggt 5325

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ccg cct gac 5415

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att ggc gat 54 60

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Gly Asn Leu

gac cgg gtc 5550

Asp Arg Val

cgc gat cgg 5595

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Gly Asp Asp

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Leu Ala Ala

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tta cgc acg 5775

Leu Arg Thr

acg ctg tcc 5820

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cgg gaa cat 5865

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cgc cgc tgg 5910

Arg Arg Trp

ggt ccc gat 5955

Gly Pro Asp

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aaa tgg cgg 6045

Lys Trp Arg ctg cag ctg cgc ggc gtc Leu Gln Leu Arg Gly Val 1825

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att gcc ttt gac ctg ttt Ile Ala Phe Asp Leu Phe 1885

gtc tcg gat ttg caa tac Val Ser Asp Leu Gln Tyr 1900

gtc ggg gtc att gtt ggc Val Gly Val Ile Val Gly 1915

gcg cgg gtt gcc cgc tac Ala Arg Val Ala Arg Tyr 1930

gaa atg gcc aag tcg ctg Glu Met Ala Lys Ser Leu 1945

gcc gcg acc age cag cgg Ala Ala Thr Ser Gln Arg 1960

tgc ctg ctg ctg cta ccc Cys Leu Leu Leu Leu Pro 1975

ggc aac gcg ctg ccg ggc Gly Asn Ala Leu Pro Gly 1990

tgg age ttc age aag ggc Trp Ser Phe Ser Lys Gly 2005

tta ccg gcg gtg ccc tat Leu Pro Ala Val Pro Tyr 2020

ctg tgt cgc gga ttg ctg Leu Cys Arg Gly Leu Leu 2035

ctg atg gtg ccg gaa cag Leu Met Val Pro Glu Gln 2050

ctg att gcc aat gcc ctg Leu Ile Ala Asn Ala Leu 2065

gcg gct tcc cgg ctg tca Ala Ala Ser Arg Leu Ser 2080

ttg ctg tcg gcg ctc tcc Leu Leu Ser Ala Leu Ser 2095

ctg ttt ggt cag gca gaa Leu Phe Gly Gln Ala Glu 2110

aac tca aag tat gtg ccc Asn Ser Lys Tyr Val Pro 2125

19

ctg atg gcg ctg gtg Leu Met Ala Leu Val 1830

tcg gtg ctg ate age Ser Val Leu Ile Ser 1845

tta ctg gcg gtg gtg Leu Leu Ala Val Val 1860

tcc gtt ate gcc acc Ser Val Ile Ala Thr 1875

ttc gtc gca cct acc Phe Val Ala Pro Thr 1890

ctg gtg acc ttt ggg Leu Val Thr Phe Gly 1905

aac ctg acg gcc ggc Asn Leu Thr Ala Gly 1920

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gga age ggc ctg acg Gly Ser Gly Leu Thr 1950

gtg ttg gag gcg acc Val Leu Glu Ala Thr 1965

gat gag cag ggc gaa Asp Glu Gln Gly Glu 1980

aac gaa ccg gat tgg Asn Glu Pro Asp Trp 1995

cag cca gca ggc gca Gln Pro Ala Gly Ala 2010

cag att ctg ccg ctg Gln Ile Leu Pro Leu 2025

gtg gtt gaa ccg cag Val Val Glu Pro Gln 2040

caa cgg ctg ctg gaa Gln Arg Leu Leu Glu 2055

gag cgg atg gcg ctg Glu Arg Met Ala Leu 2070

gct gaa cgt gag cag Ala Glu Arg Glu Gln 2085

cat gat tta cgt acc His Asp Leu Arg Thr 2100

atg ctg atg ctg gac Met Leu Met Leu Asp 2115

cag gcc age cag att Gln Ala Ser Gln Ile 2130

ctg tgt att gtg 6090 Leu Cys Ile Val 1835 ttc gat ccg gcc 6135 Phe Asp Pro Ala 1850 ate gtc gcg ttg 6180 Ile Val Ala Leu 1865 gtc atg aac ate 6225 Val Met Asn Ile 1880 ggc acg gtc gcg 6270 Gly Thr Val Ala 1895 gtg atg ctg gcg 6315 Val Met Leu Ala 1910 gtt cgc tac cag 6360 Val Arg Tyr Gln 1925 cgg cag Ctt tac 6405 Arg Gln Leu Tyr 1940 CCt gaa gat ate 6450 Pro Glu Asp Ile 1955 tta cag gcg cga 6495 Leu Gln Ala Arg 1970 ctg cac acg ctg 6540 Leu His Thr Leu 1985 gct ate gcg aaa 6585 Ala Ile Ala Lys 2000 ggc acg gac acc 6630 Gly Thr Asp Thr 2015 aaa gtg ggc gat 6675 Lys Val Gly Asp 2030 aat gtg cgt cag 6720 Asn Val Arg Gln 2045 acc ttc acc gtg 6765 Thr Phe Thr Val 2060 tcc cag agt gag 6810 Ser Gln Ser Glu 2075 ctg cgt aat gct 6855 Leu Arg Asn Ala 2090 ccg ctg acg gtg 6900 Pro Leu Thr Val 2105 ctg gcc age gat 6945 Leu Ala Ser Asp 2120 cgt gaa caa acc 6990 Arg Glu Gln Thr 2135 ctg agt acc att cgt ctg gtc age aac atg ctg gat atg gcg cgt 7035

Leu Ser Thr Ile Arg Leu Val Ser Asn Met Leu Asp Met Ala Arg

2140 2145 2150

att cag tca ggc ggc ctg aat tta cgc gaa gag tgg ctg gcg ctg 7080

Ile Gln Ser Gly Gly Leu Asn Leu Arg Glu Glu Trp Leu Ala Leu

2155 2160 2165

gaa gag gtg att ggt ggc gcg ctc agt age atg gcg ccg tcg ctc 7125

Glu Glu Val Ile Gly Gly Ala Leu Ser Ser Met Ala Pro Ser Leu

2170 2175 2180

aag gga aga gag gtc gaa ctc gat ctg cct gaa gat att gtc ctg 7170

Lys Gly Arg Glu Val Glu Leu Asp Leu Pro Glu Asp Ile Val Leu

2185 2190 2195

ate aaa ggc gac agt acg ttg ctg gag cgg gta ttt acc aac ctg 7215

Ile Lys Gly Asp Ser Thr Leu Leu Glu Arg Val Phe Thr Asn Leu

2200 2205 2210

att gaa aac age ctg aag tac gct ggc aac tgt gcg ccc cgc ggc 7260

Ile Glu Asn Ser Leu Lys Tyr Ala Gly Asn Cys Ala Pro Arg Gly

2215 2220 2225

ata cgt gcc tgg tgt gaa aat acc cgg ctg gaa ate gcc ate tgg 7305

Ile Arg Ala Trp Cys Glu Asn Thr Arg Leu Glu Ile Ala Ile Trp

2230 2235 2240

gac ggc ggg ccg ggc ate gcc caa aac gac ctg acg cgg att ttc 7350

Asp Gly Gly Pro Gly Ile Ala Gln Asn Asp Leu Thr Arg Ile Phe

2245 2250 2255

gac aaa ttt tca cgc ggt gat aaa gaa tcg gcc gta ccg ggc gtt 7395

Asp Lys Phe Ser Arg Gly Asp Lys Glu Ser Ala Val Pro Gly Val

2260 2265 2270

ggg ctg gga ctg gcg att tgt aaa acg att ate gaa age cac ggc 7440

Gly Leu Gly Leu Ala Ile Cys Lys Thr Ile Ile Glu Ser His Gly

2275 2280 2285

ggt cag ate tgg gcg gaa aat cgt gct gaa ggc ggt gcc tgc ttt 7485

Gly Gln Ile Trp Ala Glu Asn Arg Ala Glu Gly Gly Ala Cys Phe

2290 2295 2300

cgt ctc tet tta cca ctt cca ccc gtt cct gaa att tet cct gaa 7530

Arg Leu Ser Leu Pro Leu Pro Pro Val Pro Glu Ile Ser Pro Glu

2305 2310 2315

ggc ttg aaa taa cttcacagat gatcggttat aatgcgcgac cttactgatt 7582

Gly Leu Lys 2320

atgattggga aattatggaa cgttttaccg aaaacctg 7620

<210> 8

<211> 560

<212> PRT

<213> Pantoea ananatis

<400> 8

Met Ala Ala Asn Ala Phe Leu Leu Ile Ala Val Tyr Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Met Val Met Ala Gln Pro Leu Gly Arg Gly Leu Ala Ala Leu Val Ala

20 25 30

Asp Lys Pro Leu Phe Ala Arg Ala Glu Ala Leu Leu Trp Arg Phe Ser

35 40 45

Gly Val Gln Glu Gly Gly Met Arg Trp Gln His Tyr Leu Leu Ala Ile

50 55 60

Leu Val Phe Asn Leu Leu Gly Phe Val Val Leu Leu Ala Ile Leu Met 65 70 75 80

Phe Gln Gly Ala Leu Pro Leu Asn Pro Gln His Leu Pro Gly Leu Ser

85 90 95

Trp Asp Leu Ala Leu Asn Thr Ala Ile Ser Phe Val Thr Asn Thr Asn

100 105 110

Trp Gln Ser Tyr Ala Gly Glu Ser Thr Leu Ser Tyr Phe Ser Gln Met 115 120 125 Val Gly Leu Thr Val Gln Asn Phe Val Ser Ala Ala Thr Gly Ile Ala 130 135 140 Val Ala Phe Ala Leu Ile Arg Gly Phe Ala Asn Arg Ser Val Ala Thr 145 150 155 160 Leu Gly Asn Ala Trp Arg Asp Leu Thr Arg Ile Thr Leu Tyr Val Leu 165 170 175 Leu Pro Ile Ser Leu Leu Met Ala Leu Phe Phe Val Ser Gln Gly Ser 180 185 190 Ile Gln Asn Phe Leu Pro Tyr His Asn Val Thr Ser Leu Glu Gly Ala 195 200 205 Gln Gln Thr Leu Ala Met Gly Pro Val Ala Ser Gln Glu Ala Ile Lys 210 215 220 Met Leu Gly Thr Asn Gly Gly Gly Phe Phe Asn Val Asn Ser Ala His 225 230 235 240 Pro Phe Glu Asn Pro Thr Ala Leu Ser Asn Phe Val Gln Met Leu Ser 245 250 255 Ile Phe Leu Ile Pro Ala Ala Leu Cys Phe Ala Phe Gly Glu Ser Val 260 265 270 Lys Asp Arg Arg Gln Gly Ser Met Leu Leu Trp Ser Met Thr Leu Met 275 280 285 Phe Val Val Ala Ala Ala Leu Val Met Trp Ala Glu Leu Arg Gly Asn 290 295 300 Pro His Phe Leu Thr Leu Gly Ala Asp Ser Ala Ile Asn Met Glu Gly 305 310 315 320 Lys Glu Thr Arg Phe Gly Ile Leu Asn Ser Ser Leu Phe Ala Val Ile 325 330 335 Thr Thr Ala Ala Ser Cys Gly Ala Val Asn Ala Met His Asp Ser Phe 340 345 350 Thr Ala Leu Gly Gly Met Val Pro Met Leu Leu Met Gln Leu Gly Glu 355 360 365 Val Val Phe Gly Gly Val Gly Ala Gly Leu Tyr Gly Met Leu Leu Phe 370 375 380 Val Leu Leu Ala Val Phe Ile Ala Gly Leu Met Ile Gly Arg Thr Pro 385 390 395 400 Glu Phe Leu Gly Lys Lys Ile Asp Val Trp Glu Met Lys Met Thr Ala 405 410 415 Leu Ala Ile Leu Val Thr Pro Ala Leu Val Leu Ile Gly Thr Ala Ile 420 425 430 Ala Met Met Thr Asp Ala Gly Arg Ala Gly Met Ala Asn Pro Gly Thr 435 440 445 His Gly Phe Ser Glu Val Leu Tyr Ala Val Ser Ser Ala Ala Asn Asn 450 455 460 Asn Gly Ser Ala Phe Ala Gly Leu Asn Ala Asn Thr Pro Phe Trp Asn 465 470 475 480 Leu Leu Leu Ala Val Cys Met Phe Val Gly Arg Phe Gly Ile Ile Ile 485 490 495 Pro Val Met Ala Ile Ala Gly Ala Met Ala Val Lys Lys Val Gln Pro 500 505 510 Val Gly Asn Gly Thr Leu Pro Thr His Gly Pro Leu Phe Ile Ala Leu 515 520 525 Leu Val Gly Thr Val Leu Leu Val Gly Ala Leu Thr Phe Ile Pro Ala 530 535 540 Leu Ala Leu Gly Pro Val Ala Glu His Leu Gln Leu Ile Gln Gly Gln 545 550 555 560 <210> 9

<211> 681

<212> PRT

<213> Pantoea ananatis

<400> 9 Met Ser Arg Gln Gln Gln Val Phe Asp Ala Ala Leu Leu Arg Thr Ser 1 5 10 15

Ala Ile Asp Ala Val Lys Lys Leu Asp Pro Arg Val Gln Phe Arg Asn

20 25 30

Pro Val Met Phe Val Val Tyr Leu Gly Ser Ile Leu Thr Ser Ile Leu

35 40 45

Ala Ile Met Met Phe Thr Gly His Gln Ser Gly Ser Ala Ser Phe Thr

50 55 60

Gly Ala Ile Ala Leu Trp Leu Trp Phe Thr Val Leu Phe Ala Asn Met 65 70 75 80

Ala Glu Ala Leu Ala Glu Gly Arg Ser Lys Ala Gln Ala Asn Ser Leu

85 90 95

Lys Gly Val Lys Lys Thr Ser Phe Ala Lvs Lvs Leu Ser Ala Ala His

100 105 110

Tyr Gly Ala Ala Trp Gln Gln Val Ala Ala Asp Ala Leu Arg Lys Gly

115 120 125

Asp Ala Val Leu Val Glu Ala Gly Asp Val Ile Pro Cys Asp Gly Glu

130 135 140

Val Val Glu Gly Gly Ala Ser Val Asp Glu Ser Ala Ile Thr Gly Glu 145 150 155 160

Ser Ala Pro Val Ile Arg Glu Ser Gly Gly Asp Phe Ala Ser Val Thr

165 170 175

Gly Gly Thr Arg Ile Leu Ser Asp Trp Leu Val Ile Thr Cys Ser Ala

180 185 190

Asn Pro Gly Glu Thr Phe Leu Asp Arg Met Ile Ala Met Val Glu Gly

195 200 205

Ala Gln Arg Arg Lys Thr Pro Asn Glu Ile Ala Leu Thr Ile Leu Leu

210 215 220

Val Ser Leu Thr Ile Val Phe Leu Leu Ala Thr Val Thr Leu Trp Pro 225 230 235 240

Phe Ser Ala Trp Gly Gly Thr Pro Val Thr Ile Thr Val Leu Val Ala

245 250 255

Leu Leu Val Cys Leu Ile Pro Thr Thr Ile Gly Gly Leu Leu Ser Ala

260 265 270

Ile Gly Val Ala Gly Met Ser Arg Met Leu Gly Ala Asn Val Ile Ala

275 280 285

Thr Ser Gly Arg Ala Val Glu Ala Ala Gly Asp Val Asp Val Leu Met

290 295 300

Leu Asp Lys Thr Gly Thr Ile Thr Leu Gly Asn Arg Gln Ala Thr Gln 305 310 315 320

Phe Leu Pro Ala Pro Gly Val Thr Glu Glu Gln Leu Ala Asp Ala Ala

325 330 335

Gln Leu Ala Ser Leu Ala Asp Glu Thr Pro Glu Gly Arg Ser Ile Val

340 345 350

Val Leu Ala Lys Gln Lys Phe Asn Leu Arg Glu Arg Asp Leu Ser Ser

355 360 365

Met Gly Ala Ser Phe Ile Pro Phe Ser Ala Gln Thr Arg Met Ser Gly

370 375 380

Val Asn Val Gln Asp Arg Leu Ile Arg Lys Gly Ala Val Asp Ala Val 385 390 395 400

Arg Arg His Ile Glu Ala Ser His Gly Ala Phe Pro Ala Glu Val Asn

405 410 415

Ala Arg Val Glu Glu Val Ala Arg Ala Gly Gly Thr Pro Leu Val Val

420 425 430

Ala Glu Gly Ala Lys Val Leu Gly Val Val Ala Leu Lys Asp Ile Val

435 440 445

Lys Gly Gly Ile Lys Glu Arg Phe Ala Glu Leu Arg Lys Met Gly Ile

450 455 460

Lys Thr Val Met Ile Thr Gly Asp Asn Pro Leu Thr Ala Ala Ala Ile 465 470 475 480

Ala Ala Glu Ala Gly Val Asp Asp Phe Leu Ser Glu Ala Thr Pro Glu

485 490 495

Ala Lys Leu Ala Leu Ile Arg Gln Tyr Gln Ala Glu Gly Arg Leu Val 500 505 510

Ala Met Thr Gly Asp Gly Thr Asn Asp Ala Pro Ala Leu Ala Gln Ala

515 520 525

Asp Val Ala Val Ala Met Asn Ser Gly Thr Gln Ala Ala Lys Glu Ala

530 535 540

Gly Asn Met Val Asp Leu Asp Ser Asn Pro Thr Lys Leu Leu Glu Val 545 550 555 560

Val His Ile Gly Lys Gln Met Leu Met Thr Arg Gly Ser Leu Thr Thr

565 570 575

Phe Ser Ile Ala Asn Asp Val Ala Lys Tyr Phe Ala Ile Ile Pro Ala

580 585 590

Ala Phe Ala Ala Thr Tyr Pro Gln Leu Asn Met Leu Asn Val Met Gln

595 600 605

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610 615 620

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645 650 655

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<210> 10 <211> 189 <212> PRT

<213> Pantoea ananatis <400> 10

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Val Cys Gly Val Val Tyr Pro Leu Leu Thr Thr Gly Leu Ser Gln Leu

20 25 30

Leu Phe Pro Trp Gln Ala Asn Gly Ser Val Leu Asn Val Asp Gly Glu

35 40 45

Glu Arg Gly Ser Ala Leu Ile Gly Gln Asn Phe Ser Gln Pro Gly Tyr

50 55 60

Phe Trp Gly Arg Pro Ser Ala Thr Gly Asp Lys Pro Tyr Asn Pro Leu 65 70 75 80

Ala Ser Ser Gly Ser Asn Leu Ala Ala Ser Asn Pro Ala Leu Asp Lys

85 90 95

Ala Val Ala Glu Arg Val Ala Ala Leu Arg Thr Ala Asn Pro Gln Ala

100 105 110

Asn Gly Ala Val Pro Val Glu Leu Val Thr Thr Ser Ala Ser Gly Leu

115 120 125

Asp Pro Glu Ile Ser Pro Glu Ala Ala Leu Trp Gln Ala Pro Arg Ile

130 135 140

Ala Ala Ala Arg Gln Leu Pro Leu Ala Lys Val Asp Ala Leu Val Asp 145 150 155 160

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165 170 175

Asn Val Leu Gln Leu Asn Leu Ala Leu Asn Asp Leu Lys 180 185

<210> 11 <211> 891 <212> PRT

<213> Pantoea ananatis <400> 11

Met Asn His Glu Pro Leu Arg Pro Asp Pro Asp Ala Leu Leu Gln Thr Ser Ser Asp

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Arg Ala Thr

Leu Ala Arg

Asn Val Lys 115

Leu Leu Glu

130 Leu Glu Ser 145

Arg Glu Thr

Leu Val Asp

Lys Val Tyr 195

Arg Lys Gly 210

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Arg Asp Arg

Asp Asp Thr

Ala Arg Leu 275

Leu Asn Arg

290 Lys Leu Ala 305

Asp Glu Ala

Lys Ile Val

Phe Ala Glu 355

Val Ala Leu

370 Asp Arg Val 385

Met Ala Leu

Leu Ile Ser

Val Val Ile 435

Thr Val Met

450 Gly Thr Val 465

Met Leu Ala Tyr Gln Ala

Ser His Arg 20

Gly Lys Thr

Gly Leu Asp

Thr Ala Gln 70

Gly Arg Ser 85

His Pro Ala 100

Gly Ser Arg

Ala Gly Ile

Leu Asn Asp 150

Val Pro Asp

165 Leu Pro Pro 180

Ile Gly Asp

Asn Leu Tyr

Val Asp Asp 230

Val Trp His

245 Gly Ser Glu 260

Gly Ser Glu

Leu Pro Glu

Gln Asp Met 310

Gln Ala Val

325 Thr Gly Arg 340

Arg Leu Gly

Asn Glu Pro

Asn Ser Asp 390

Val Leu Cys

405 Phe Asp Pro 420

Val Ala Leu

Asn Ile Ile

Ala Val Ser 470

Val Gly Val

485 Arg Val Ala 500

Gly Lys

Tyr Ala 40

Val Leu 55

Leu Leu

Arg His

Val Ile

His Pro 120 Asp Val 135

Val Val

Pro Phe

Asp Asp

Arg Ala 200 Ala Leu 215

Gln Met

Thr Arg

Lys Leu

Trp His 280 Ala Arg 295

Gly Ala

Leu Arg

Arg Pro

Gln Leu 360 Ile Gln 375

Lys Trp

Ile Val

Ala Asn

Arg Tyr 440 Ala Phe 455

Asp Leu Ile Val Arg Tyr

10 Leu Lys 25

Met Leu

Val Gly

Asn Gly

Ala Glu 90

Leu Met 105

Lys Arg

Leu Thr

Gly Gly

Phe Asp 170 Leu Arg 185

Glu Arg

Arg Glu

Arg Ala

Asp Ala 250 Val Arg 265

Ala Val

Arg Arg

Glu Thr

Tyr Ala 330 Ala Arg 345

Gly Pro

Asp Ala

Arg Leu

Val Thr 410 Cys Val 425

Gly Arg

Asp Leu

Gln Tyr

Gly Asn 490 Arg Glu 505

Ile Tyr Phe

Gln Glu Ala 45

Val Val Glu 60

Leu Val Leu 75

Phe Asp Leu

Asp Glu Leu

Trp Gln Asp 125

Thr Val Asn 140

Val Thr Gly 155

Ala Ala Asp

Gln Arg Leu

Ala Ile Glu 205

Leu Ala Leu 220 Trp Arg Asp 235

Ile Leu Leu

Thr Ala Ala

Tyr Val Glu 285

Ala Ile Leu 300

Ala Thr Leu 315

Arg Glu His

Arg Trp Arg

Asp Leu Asp 365

Pro His Pro

380 Gln Leu Arg 395

Ala Ala Gly

Met Ile Tyr

Trp Pro Ser 445

Phe Phe Val 460

Leu Val Thr 475

Leu Thr Ala Gln Arg Thr

15

Gly Ala Cys 30

Gln Arg Leu

Thr His Glu

Leu Pro Arg 80

Asp Ala Ala 95

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Ile Glu Glu

Val Gln His

Ile Gln Val 160

Glu Val Val

175 Lys Glu Gly 190

Asn Phe Phe

Arg Arg Thr

Ser Gln Gly 240

Cys Ile Gly

255 Arg Leu Ala 270

Thr Pro Arg

Arg Thr Leu

Ser Asp Pro 320

Asn Leu Gly

335 Arg Asp Ser 350

Leu Leu Val

Leu Ala Glu

Gly Val Leu 400

Gln Ser Val

415 Leu Leu Ala 430

Val Ile Ala

Ala Pro Thr

Phe Gly Val 480

Gly Val Arg

495 Arg Gln Leu 510 Tyr Glu Met Ala Lys Ser Leu Gly Ser Gly Leu Thr Pro Glu Asp Ile 515 520 525 Ala Ala Thr Ser Gln Arg Val Leu Glu Ala Thr Leu Gln Ala Arg Cys 530 535 540 Leu Leu Leu Leu Pro Asp Glu Gln Gly Glu Leu His Thr Leu Gly Asn 545 550 555 560 Ala Leu Pro Gly Asn Glu Pro Asp Trp Ala Ile Ala Lys Trp Ser Phe 565 570 575 Ser Lys Gly Gln Pro Ala Gly Ala Gly Thr Asp Thr Leu Pro Ala Val 580 585 590 Pro Tyr Gln Ile Leu Pro Leu Lys Val Gly Asp Leu Cys Arg Gly Leu 595 600 605 Leu Val Val Glu Pro Gln Asn Val Arg Gln Leu Met Val Pro Glu Gln 610 615 620 Gln Arg Leu Leu Glu Thr Phe Thr Val Leu Ile Ala Asn Ala Leu Glu 625 630 635 640 Arg Met Ala Leu Ser Gln Ser Glu Ala Ala Ser Arg Leu Ser Ala Glu 645 650 655 Arg Glu Gln Leu Arg Asn Ala Leu Leu Ser Ala Leu Ser His Asp Leu 660 665 670 Arg Thr Pro Leu Thr Val Leu Phe Gly Gln Ala Glu Met Leu Met Leu 675 680 685 Asp Leu Ala Ser Asp Asn Ser Lys Tyr Val Pro Gln Ala Ser Gln Ile 690 695 700 Arg Glu Gln Thr Leu Ser Thr Ile Arg Leu Val Ser Asn Met Leu Asp 705 710 715 720 Met Ala Arg Ile Gln Ser Gly Gly Leu Asn Leu Arg Glu Glu Trp Leu 725 730 735 Ala Leu Glu Glu Val Ile Gly Gly Ala Leu Ser Ser Met Ala Pro Ser 740 745 750 Leu Lys Gly Arg Glu Val Glu Leu Asp Leu Pro Glu Asp Ile Val Leu 755 760 765 Ile Lys Gly Asp Ser Thr Leu Leu Glu Arg Val Phe Thr Asn Leu Ile 770 775 780 Glu Asn Ser Leu Lys Tyr Ala Gly Asn Cys Ala Pro Arg Gly Ile Arg 785 790 795 800 Ala Trp Cys Glu Asn Thr Arg Leu Glu Ile Ala Ile Trp Asp Gly Gly 805 810 815 Pro Gly Ile Ala Gln Asn Asp Leu Thr Arg Ile Phe Asp Lys Phe Ser 820 825 830 Arg Gly Asp Lys Glu Ser Ala Val Pro Gly Val Gly Leu Gly Leu Ala 835 840 845 Ile Cys Lys Thr Ile Ile Glu Ser His Gly Gly Gln Ile Trp Ala Glu 850 855 860 Asn Arg Ala Glu Gly Gly Ala Cys Phe Arg Leu Ser Leu Pro Leu Pro 8 65 870 875 880 Pro Val Pro Glu Ile Ser Pro Glu Gly Leu Lys 885 890

<210> 12

<211> 1215

<212> DNA

<213> Pantoea ananatis <220>

<221> CDS

<222> (301) . . (975)

<4 00> 12

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tcatctgacc actaaatttg acgctttttt gtactgttaa tgacaatctg aaaattagtt 180 acattttggt taaataatgg ttttgacgat gatctttagc gcgattcgat ggcaacacgg 240 acgaaaggct gaaaagttga tacagtgtat tttccctttt caggcaatgg caggattggc 300 gtg acc acg gtt tta ate att gaa gat gag aaa gaa att cgc cgc ttc 348

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gtg cgc ate gcg ttg gaa age gaa ggc ctg aag gtt ttc gat gcc gaa 396

Val Arg Ile Ala Leu Glu Ser Glu Gly Leu Lys Val Phe Asp Ala Glu

20 25 30

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35 40 45

gtc att etc gat etc ggc ctg ccc gat ggc gat ggc aaa acc ttt att 4 92

Val Ile Leu Asp Leu Gly Leu Pro Asp Gly Asp Glv Lys Thr Phe Ile

50 55 6θ"

ggc gag ctg cgt cag tgg age acg ctg ccc gtg att gtg ctg tcg gcc 540

Gly Glu Leu Arg Gln Trp Ser Thr Leu Pro Val Ile Val Leu Ser Ala 65 70 75 80

cga ate gac gaa cag gat aaa att gac gcg ctg gat gea ggg gcc gac 588

Arg Ile Asp Glu Gln Asp Lys Ile Asp Ala Leu Asp Ala Gly Ala Asp

85 90 95

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Asp Tyr Leu Thr Lys Pro Phe Gly Ile Gly Glu Leu Leu Ala Arg Val

100 105 110

cgc gtc gcc ttg cgc cgt cat gcc gga caa cat acc gat ccc aag gtc 684

Arg Val Ala Leu Arg Arg His Ala Gly Gln His Thr Asp Pro Lys Val

115 120 125

age ttc gcc gac gtt acc gtg gat att gcg gcc cgc aga gtg ctg cgc 7 32

Ser Phe Ala Asp Val Thr Val Asp Ile Ala Ala Arg Arg Val Leu Arg

130 135 140

gct ggc gag gaa gtg cac ctt acg ccg ata gag ttt cgt ttg ctg acg 780

Ala Gly Glu Glu Val His Leu Thr Pro Ile Glu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160

acg ctg ctg aac aac gcg ggc aaa gtg ctg acc cag cgg cag ctg ttg 828

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165 170 175

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Ser Gln Val Trp Gly Pro Asn Ala Val Glu His Ser His Tyr Leu Arg

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

taa aaaaagcgcc acttaggcgc ttttttcatt taacaggcaa atcaggcgtt 1025

tttcagcact tcgctgacaa tctctaccgc ttctttttct atctgcgcgc ggtgttctgc 1085 gcccaggaaa ctttcacaat agattttgta tgcatcttcg gtgcctgaag gacgggccgc 1145 aaaccagccg ttttccgtca tcactttcag gccgccgata gacgcgccat tgcccggcgc 1205 agcggtcaga 1215

<210> 13

<211> 224

<212> PRT

<213> Pantoea ananatis

<400> 13

Val Thr Thr Val Leu Ile Ile Glu Asp Glu Lys Glu Ile Arg Arg Phe 1 5 10 15 Val Arg Ile Ala 20 Leu Glu Ser Glu Gly 25 Leu Lys Val Phe Asp 30 Ala Glu Thr Leu Gln Arg Gly Leu Ile Glu Ala Ala Thr Arg Lys Pro Asp Leu

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<213> Pantoea ananatis <400> 14

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<213> Artificial

<220>

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<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 24

tcaaagcggc cgcttcttcg tctgtttcta ctggta

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 25

cctttggtac cgcgggcagt gagcgcaacg c

<210> 26

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> iniciador <400> 26

aacaggaatt ctttgcctgg cggcagtagc gcgg

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador Pl <400> 27

ctagtaagat cttgaagcct gcttttttat actaagttgg

<210> 28

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador Ρ2

<400> 28

atgatcgaat tcgaaatcaa ataatgattt tattttgact g

<210> 29

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> attL contendo fragmento de DNA <4 00> 29

agatcttgaa gcctgctttt ttatactaag ttggcattat aaaaaagc.at tgcttatcaa tttgttgcaa cgaacaggtc actatcagtc aaaataaaat cattatttga tttcgaattc

<210> 30

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador P3

<4 00> 30

atgccactgc agtctgttac aggtcactaa taccatctaa g

<210> 31

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial

<220> <223> iniciador Ρ4 <400> 31

accgttaagc tttctagacg ctcaagttag tataaaaaag ctgaac 46

<210> 32

<211> 184

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> attL contendo fragmento de DNA

<400> 32

ctgcagtctg ttacaggtca ctaataccat gttgtgtttt acagtattat gtagtctgtt tatttatatc attttacgtt tctcgttcag gctt

ctaagtagtt gattcatagt gactgcatat 60

ttttatgcaa aatctaattt aatatattga 120 cttttttata ctaacttgag cgtctagaaa 180

184

<210> 33

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador P5

<400> 33

ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgc 38

<210> 34

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador P6 <400> 34

taacagagat ctcgcgcaga aaaaaaggat ctcaaga 37

<210> 35

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador P7

<400> 35

aacagagatc taagcttaga tcctttgcct ggcggcagta gcgcgg 4 6

<210> 36

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220> <223> iniciador Ρ8 <400> 36

ataaactgca gcaaaaagag tttgtagaaa cgcaa 35

<210> 37 <211> 1388 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> ter thrL e gene Tc contendo fragmento de DNA <400> 37

gaattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt tatcacagtt 60

aaattgctaa cgcagtcagg caccgtgtat gaaatctaac aatgcgctca tcgtcatcct 120

cggcaccgtc accctggatg ctgtaggcat aggcttggtt atgccggtac tgccgggcct 180

cttgcgggat atcgtccatt ccgacagcat cgccagtcac tatggcgtgc tgctagcgct 24 0

atatgcgttg atgcaatttc tatgcgcacc cgttctcgga gcactgtccg accgctttgg 300

ccgccgccca gtcctgctcg cttcgctact tggagccact atcgactacg cgatcatggc 360

gaccacaccc gtcctgtgga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc 420

cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg 480

ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg 540

gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg 600

cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag agcgtcgacc 660

gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat 720

cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc 780

gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc 840

gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac 900

caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccgacg cgctgggcta 960

cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc cccattatga ttcttctcgc 1020

ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg tccaggcagg tagatgacga 1080

ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc agcctaactt cgatcactgg 1140

accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc acatggaacg ggttggcatg 1200

gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg ttgcgtcgcg gtgcatggag 1260

ccgggccacc tcgacctgaa tggaagccgg cggcacctcg ctaacggatt caccactcca 1320

actagaaagc ttaacacaga aaaaagcccg cacctgacag tgcgggcttt ttttttcgac 1380

cactgcag 1388

<210> 38

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador P9

<400> 38

agtaattcta gaaagcttaa cacagaaaaa agcccg

36

<210> 39

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220> <223>

iniciador P10

<400> 39

ctagtaggat ccctgcagtg gtcgaaaaaa aaagcccgca ctg

43 <210> 40

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador 1

<400> 40

ggaagatcta tttgccttcg cacatcaacc tgg 33

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador 2

<400> 41

cggggtacct tgtaaatatt ttaacccgcc 30

<210> 42

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador 3

<400> 42

ggaagatcta aggagacctt aaatgagcga cacaacgatc ctgcaaaaca gtaccc 56

<210> 43

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador 4 <400> 43

cggggtacct cgtagaggtt tactggcgct tatccagcg 39

<210> 44

<211> 864

<212> DNA

<213> Pantoea ananatis

<400> 44

atgtctgaac aacactatca gcccgctaaa gtctggaagt gggacccgga agcgaaaggt 60

aatggtgcca aaactaaccg ccctaccgct ggcccaaccc atgaaaaagc cctgccggtt 120

ggtaagcatc cgctgcagct ctactctctg ggcacgccta acggccagaa agtcactatt 180

ctgctggaag agttgctggc gctgaacgtg aacgatgcag agtacgatgc ctggttaatc 240

aatattggtg aaggcgacca gttcagcagc ggttttgttg agatcaaccc caactccaaa 300

atcccggcac tgtgcgatca ttcagccaca ccaccgattc gcgtatttga atccggtaac 360

atcctgctct atctggcgga aaaatacggt tatttcctgc cgaaagatcc ggccaaacgc 420 accgaaacgc tttggtcact ctggaagcca gcgggtgacg ctgtataacc cgctgggccg gtgatgggcg caaacccaag

tgaactggct tctatcatta aacgtcagtt attacaccat agtacaatgc aagagatcgc aacccgccga acaagcaagc

gttctggctg cgcgccagaa tgacgtgctg cgccgatatc ggcagaattc tctgcgtccg tcagctgcgc ctga

caaggctcag aagattgaat gaccgtcagc gccacctggc ctcgaccttc gccgttatgc gagcgccatg

ccccttacct acgccatcaa ttgccgataa cgtggtacgg agtcctacaa gcggccgcaa acgcatcgga

tggcggcggc ccgcttctca ccgttatctg cagcatggtg aaatgtggtg ggtgaaccgt ctttgatacg

480 540 600 660 720 780 840 864

<210> 45

<211> 918

<212> DNA

<213> Pantoea ananatis

<400> 45

atgtcagcac

gggcatttaa

ttacagggcc

cagcacacgc

cgcacctcaa

gtgcgcccca

gaatggcttc

tctgccatgc

cacgatctgt

gccgatgtgg

gctgacagca

ggcaaggcag

gtggtgagcg

ctggcggaaa

cagcagtgtg

caccaaattg

gagtctggtg tacagtgtgc gcagcgggtt tggcgactga cggtggtggt gtgcagatct actgctgctc agcagatcag ggcacgacga tcaagctgtc tgcaggcgct gagtgaaagt tggacaccac aggggatgcc gggcgctggc aaggatga

tctgggtgat aggcggggcg tattggccgg acaggttgat ggcgctggat gtttctggaa aattgccctg cgatgccggt tgcccaactg tgaggaagag ggcggaacgc ctggcatcag cggcgcaggg cgctaatgag gacgacggca

gccgtggtgg cccgccaatg gttggggacg acccgctata caggaaggtg caaggcgatc gcggcagaac ggctttgtga cgggactgtg ctggcttttc tttgcgatta ggtaaacatt gatgcgtttg gccgagctgg aaaggggcca

acctgcttcc tggcggtggg atccttttgg tgacgctgga agcggacttt tccccaggtt cttcgcgctc gctttgatcc tgaaccgggc tgactccggg gcctgctgat atcactatcc tcgccgggct cggcacgact tgaccgcgtt

ggacgggccg cattgcccgc tcactttatg cagcgcccag tacctttatg tgagcaaggt caccaccttt caatattcgt gttacagctg ggcgcaacac ggtcacccag cacgctgcct gctatggggg cagcagcgca gccttatcgt

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 918

<210> 46

<211> 3095

<212> DNA

<213> Pantoea ananatis

<400> 46

agactgccat

aaaaccccgg

gcagcgctga

aatggacgtt

atttgcaggc

ttccgattta

aaaatcctac

gacaaacccg

gctgggtggg

tgcgcgaagg

tggaagatca

agcctgccag

gtgcgcggct

gcgtgcagct

cgattattga

accctgcgct

ggacggacgg

tcgaaaatgg

acgagcatca

tgctgatgaa

tgtggtatag

cgcatggcat

gccagcgcgt

gaccctggac cgtcagcgaa ggcggcccat tgcctttttc ggcagcgacg caccaatgtt gggatgttat aattattttt ctacgggcag tgaaaatcgc ggatatgtgg ccatcttcgc ggaagctgag cttcgcgggt cgagcgcggc gtggagtgcg tacgctgatt cctgctgctg tcctgaacgc gcagaataac cctgtgtgac ggtgccgatg cacgcgcatg

agagattcat cataaccggc aacaacgcgc cctgcgcccg attaccgtgc acctatccca tcgctcacat gacggcgtga gacagccgct ctggcggtga cgcatgagtg gatctgcgca gtgcgggttg gacacgctaa gcgtggagcg gaaacgccgc gaggcggagg ctcaacggtc ggtcaggtga ttcaacgcgg cactacggct aatcgcctga gtgcagcgcg

tagcggccgt tggaagccca catcggcgca aggcggtgcc cgtcagtctg ttccggttga ttaatgtgga attcagcctt tgccgtctga tggtgttgcg gtattttccg ttcgtacgca ccggagcact ccggagaagc atcggacaac atctctaccg cctgcgacgt agccactgct tggatcgtga tgcgctgctc tgtacgtcgt gcgacgatcc atcgtaatca

actcgcccgg tccgccgttt gcgaaaaagc ggatagctgg gcaaatgcag tcccccgcgc tgcagactgg ctatctctgg atttgatctg ctggagcgat cgatgtttcc tttcaatgac ggatgacgat gacgtcgccc gctgtgcatc ggcggttgtg gggattccgg catccgcggc cactatggtg ccattaccct ggatgaagcc cgtctggctt cccctgcatt

cgcgactggg tacagctggc ctgagcggcg cgcacccagg ggctatgatg gttccggctg ctgcaacatg tgcaacggac agcgaatttc ggcagctatc ctgctgcata gatttcagtc ttacgggtca ttgggcagcg aacgttgcta cagttacacc cacgtcagca accaaccgcc caggatattt aacgatcccc aacatcgaaa cccgccatga attatctggt

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 cactgggtaa cgaatcgggc cacggtgcta accatgatgc gctctaccgc tggctgaaaa 1440

gtgaagatcc ttcccgcccg gtccagtacg aaggtggcgg ggccaatacc gcagcgaccg 1500

atattatctg tccgatgtat gcgcgggtcg atgaggatca acctttcccg gccgtgccga 1560

aatggtccat taaaaaatgg ctgtctatgc caggcgagca gcgtccgctt attctctgtg 1620

aatatgctca tgccatggga aacagccttg gtggctacgc aaaatactgg caggcatttc 1680

gtcagtatcc tcgcctgcag ggcggttttg tctgggactg ggtcgatcag tcgctcataa 1740

aatatgacga taacggcgaa ccctgggctg cctacggtgg cgactttggt gatacgccta 1800

atgatcgcca gttctgcatg aacgggctgg tctttgccga ccggacgccc catccctcgc 1860

tctacgaagc ccgccatgcg cagcagttct tccagttcag gctgctaccg ggcagcgagc 1920

gcacgctgga agtgaccagc gaatacctgt tccgccacag tgataatgaa atcctgcact 1980

ggtcggtggc tcaggatggc aacctgctgg ccgccggtga agtcacgctg gatatcgcgc 2040

cacagggccg ccagcagatc gcactcccgg aggtgccgct gcctcaatct gcgggccagc 2100

tctggctgac ggtgcgggtg gaacagcctc agccgacggc ctggtcagaa gccggtcata 2160

tcagcgcctg gcagcagtgg ccactggagg cgatcctgaa tgtggccctg ccgcctcagg 2220

cggcgagtgc gccacagctc agccgcggcg aagacacctt cagcgtggcg gtgaacaacc 2280

agcgctgggc attcagccgt cagcagggcg tgctcacgca gtactggatc gacgatcagc 2340

cgcagctcct gtcgccgctg cgcgatcagt ttacccgtgc gccgctggat aacgatatcg 2400

gcgtcagcga agtcacgcgc atcgacccta atgcctgggt cgagcgctgg aaagcggcgg 24 60

ggcactatca gtctgaggtc accaccctgc agtgcaccgc cgaagcgctc tccgacgccg 2520

tcgtgatcaa caccgttcat gcctggcagt tccagggcaa aacgctgttt attagccgta 2580

aagtgtaccg tattgatgga tttggcgaga tggcggtgac ggtgaacgta gagatcgcga 2 64 0

gcggcacgcc ttatccggca cgcatcggta tgagctgtca gctcacccag atcgtcgagc 2700

gagtgaactg gctaggcctg gggccgcatg aaaattaccc ggatcgcctg acctcggcct 2760

gctttgaccg ctgggattta ccgctgagtg aaatgtacac cccgtatgtt ttccccaccg 2820

aaaacggcct gcgctgcggc acgcgtgaac tcaactatgg tgcgcaccag tggcgtggcg 2880

atttccagtt caacatcagt cgctacagcc agacacagct gatggaaacc tgccatcgcc 2940

acctgttacg gcctgaggcg ggcacgtggc tcaatattga tggcttccac atgggcgtcg 3000

gcggtgacga ttcctggagc ccgtcggtat caccggaatt cctgctcagt gcaggacgtt 3060

acagctacca gtttatctgg gggcaacaaa aataa 3095

<210> 47

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 47

gcttaagatc tccctgttga caattaatca tcgg

34

<210> 48

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador <400> 48

agtacggccg ctaatgaatc tctgtccagg gtcatggcag tctccttgtg tgaaattgtt 60

atccgctcac 70

<210> 49

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador <400> 49

ccgttagatc tcgctcaagt tagtataaaa aagctgaac

<210> 50

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 50

tagcgggctg atagtgttgt tcagacatga tgaggttcgc cttgaagcct gcttttttat actaagttgg

<210> 51

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 00> 51

cgttgggaca acgtcgatct gcgccgaatc tggttgctgg acgccgcctg tgaagcctgc ttttttatac taagttgg

<210> 52

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 52

caacagcaga taaaccgcga tcagtaaaaa cgcattggcc gccatggcag tctccttgtg tgaaattgtt atccgctcac

<210> 53

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 53

catgtcttct ggtcact

<210> 54

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 54 caagcaggtt gaacac 16

<210> <211> <212>

55 32 DNA

<213> Artificial <220>

<223> iniciador

<400> 55

cccaagcttc cctgatcaat gaggaggcgt tc

32

<210> <211> <212>

56 33 DNA

<213> Artificial <220>

<223> iniciador

<4 00> 56

cgggatccga cgatcggggt cgggacgtaa ggg

33

<210> 57

<211> 557

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de consenso de KdpA . de P. anantis e E. coli <220> <221> variação <222> 4 , 5, 11 , 12, 15, 19, 21 , 25 . 29 , 31 , 32 , 34 , 37 , 38 , 39 40, 41, 42, 44, 45, 47, 49, 50, 53, 54, , 55, , 56 , 58 , 6C 1, 61 64, 6 , 69 , 71, 74, 75, 78, 79, 80, 82, 83, 85, 86 , 93 , 107, 119, 122, 131, 139, 143, 148, 154, 156 i, 157, 158, 1690, 161, 168, , 171, 176, 179, 182, 185, 190, 191, 194, 195, 202, 203, 205, 207, 213, 215, 238, 241, 251, 258, 264, 273, 274, 275, 281, 286, 288, 289, 290, 293, 294, 295, 296, 297, 303, 304, 309, 311 , 314, 317, 325, 329 ,331, 338, 348, 364, 368 , 378, 384, 404, 412, 416, 426, 430, 432, 434, 443, 446, 450, 475, 478, 483, 487, 496, 506, 512, 514 , 528, 532, 555, 557 <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente <4 00> 57 Met Ala Ala Xaa Xaa Phe Leu Leu Ile Ala Xaa Xaa Leu Leu Xaa Leu 1 5 10 15 Met Val Xaa Ala Xaa Pro Leu Gly Xaa Gly Leu Ala Xaa Leu Xaa Xaa 20 25 30 Asp Xaa Pro Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Leu Xaa Arg 35 40 45 Xaa Xaa Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Met Xaa Trp Xaa Xaa Tyr Leu Xaa 50 55 60 Ala Ile Leu Xaa Xaa Asn Xaa Leu Gly Xaa Xaa Val Leu Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Leu Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Leu Pro Leu Asn Pro Gln Xaa Leu Pro Gly 85 90 95 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Leu Asn Thr Ala Xaa Ser Phe Val Thr Asn 100 105 110 Thr Asn Trp Gln Ser Tyr Xaa Gly Glu Xaa Thr Leu Ser Tyr Phe Ser 115 120 125

Gln Met Xaa Gly Leu Thr Val Gln Asn Phe Xaa Ser Ala Ala Xaa Gly

130 135 140

Ile Ala Val Xaa Phe Ala Leu Ile Arg Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Ser Xaa 145 150 155 160

Xaa Thr Leu Gly Asn Ala Trp Xaa Asp Leu Xaa Arg Ile Thr Leu Xaa

165 170 175

Val Leu Xaa Pro Xaa Xaa Leu Leu Xaa Ala Leu Phe Phe Xaa Xaa Gln

180 185 190

Gly Xaa Xaa Gln Asn Phe Leu Pro Tyr Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Glu

195 200 205

Gly Ala Gln Gln Xaa Leu Xaa Met Gly Pro Val Ala Ser Gln Glu Ala

210 215 220

Ile Lys Met Leu Gly Thr Asn Gly Gly Gly Phe Phe Asn Xaa Asn Ser 225 230 235 240

Xaa His Pro Phe Glu Asn Pro Thr Ala Leu Xaa Asn Phe Val Gln Met

245 250 255

Leu Xaa Ile Phe Leu Ile Pro Xaa Ala Leu Cys Phe Ala Phe Gly Glu

260 265 270

Xaa Xaa Xaa Asp Arg Arg Gln Gly Xaa Met Leu Leu Trp Xaa Met Xaa

275 280 285

Xaa Xaa Phe Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Met Trp Ala Glu Xaa Xaa

290 295 300

Gly Asn Pro His Xaa Leu Xaa Leu Gly Xaa Asp Ser Xaa Ile Asn Met 305 310 315 320

Glu Gly Lys Glu Xaa Arg Phe Gly Xaa Leu Xaa Ser Ser Leu Phe Ala

325 330 335

Val Xaa Thr Thr Ala Ala Ser Cys Gly Ala Val Xaa Ala Met His Asp

340 345 350

Ser Phe Thr Ala Leu Gly Gly Met Val Pro Met Xaa Leu Met Gln Xaa

355 360 365

Gly Glu Val Val Phe Gly Gly Val Gly Xaa Gly Leu Tyr Gly Met Xaa

370 375 380

Leu Phe Val Leu Leu Ala Val Phe Ile Ala Gly Leu Met Ile Gly Arg 385 390 395 400

Thr Pro Glu Xaa Leu Gly Lys Lys Ile Asp Val Xaa Glu Met Lys Xaa

405 410 415

Thr Ala Leu Ala Ile Leu Val Thr Pro Xaa Leu Val Leu Xaa Gly Xaa

420 425 430

Ala Xaa Ala Met Met Thr Asp Ala Gly Arg Xaa Xaa Met Xaa Asn Pro

435 440 445

Gly Xaa His Gly Phe Ser Glu Val Leu Tyr Ala Val Ser Ser Ala Ala

450 455 460

Asn Asn Asn Gly Ser Ala Phe Ala Gly Leu Xaa Ala Asn Xaa Pro Phe 465 470 475 480

Trp Asn Xaa Leu Leu Ala Xaa Cys Met Phe Val Gly Arg Phe Gly Xaa

485 490 495

Ile Ile Pro Val Met Ala Ile Ala Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Lys Xaa

500 505 510

Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Thr Leu Pro Thr His Gly Pro Leu Phe Xaa

515 520 525

Xaa Leu Leu Xaa Gly Thr Val Leu Leu Val Gly Ala Leu Thr Phe Ile

530 535 540

Pro Ala Leu Ala Leu Gly Pro Val Ala Glu Xaa Leu Xaa 545 550 555

<210> 58

<211> 681

<212> PRT.

<213> Artificial

<220> <223> seqüência de consenso de KdpB de P. anantis e E. coli <220>

<221> variação

<222> 4, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 26, 28, 29, 31, 38, 40, 41, 44, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 66, 69, 70, 74, 81, 104, 107, 110, 111, 112, 113, 118, 119, 120, 122, 125, 131, 139, 147, 190, 193, 226, 227, 237, 248, 249, 251, 252, 305, 320, 321, 323, 326, 331, 332, 354, 359, 367, 368, 370, 371, 373, 375, 378, 381, 386, 388, 390, 392, 397, 401, 405, 408, 411, 414, 415, 417, 418, 419, 421, 422, 426, 426, 428, 434, 437, 438, 443, 459, 475, 492, 559, 604, 607, 609, 614, 627, 642, 645, 647, 648, 649, 655, 667, 671, 674, 677, 678, 679, 681

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente <400> 58

Met Ser Arg Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Val Lys Lys Leu Xaa Pro Xaa Xaa Gln Xaa Arg

20 25 30

Asn Pro Val Met Phe Xaa Val Xaa Xaa Gly Ser Xaa Leu Thr Xaa Xaa

35 40 45

Xaa Xaa Ile Xaa Met Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Ala Xaa Phe

50 55 60

Xaa Xaa Ala Ile Xaa Xaa Trp Leu Trp Xaa Thr Val Leu Phe Ala Asn 65 70 75 80

Xaa Ala Glu Ala Leu Ala Glu Gly Arg Ser Lys Ala Gln Ala Asn Ser

85 90 95

Leu Lys Gly Val Lys Lys Thr Xaa Phe Ala Xaa Lys Leu Xaa Xaa Xaa

100 105 110

Xaa Tyr Gly Ala Ala Xaa Xaa Xaa Val Xaa Ala Asp Xaa Leu Arg Lys

115 120 125

Gly Asp Xaa Val Leu Val Glu Ala Gly Asp Xaa Ile Pro Cys Asp Gly

130 135 140

Glu Val Xaa Glu Gly Gly Ala Ser Val Asp Glu Ser Ala Ile Thr Gly 145 150 155 160

Glu Ser Ala Pro Val Ile Arg Glu Ser Gly Gly Asp Phe Ala Ser Val

165 170 175

Thr Gly Gly Thr Arg Ile Leu Ser Asp Trp Leu Val Ile Xaa Cys Ser

180 185 190

Xaa Asn Pro Gly Glu Thr Phe Leu Asp Arg Met Ile Ala Met Val Glu

195 200 205

Gly Ala Gln Arg Arg Lys Thr Pro Asn Glu Ile Ala Leu Thr Ile Leu

210 215 220

Leu Xaa Xaa Leu Thr Ile Val Phe Leu Leu Ala Thr Xaa Thr Leu Trp 225 230 235 240

Pro Phe Ser Ala Trp Gly Gly Xaa Xaa Val Xaa Xaa Thr Val Leu Val

245 250 255

Ala Leu Leu Val Cys Leu Ile Pro Thr Thr Ile Gly Gly Leu Leu Ser

260 265 270

Ala Ile Gly Val Ala Gly Met Ser Arg Met Leu Gly Ala Asn Val Ile

275 280 285

Ala Thr Ser Gly Arg Ala Val Glu Ala Ala Gly Asp Val Asp Val Leu

290 295 300

Xaa Leu Asp Lys Thr Gly Thr Ile Thr Leu Gly Asn Arg Gln Ala Xaa 305 310 315 320

Xaa Phe Xaa Pro Ala Xaa Gly Val Xaa Glu Xaa Xaa Leu Ala Asp Ala

325 330 335

Ala Gln Leu Ala Ser Leu Ala Asp Glu Thr Pro Glu Gly Arg Ser Ile

340 345 350

Val Xaa Leu Ala Lys Gln Xaa Phe Asn Leu Arg Glu Arg Asp Xaa Xaa

355 360 365

Ser Xaa Xaa Ala Xaa Phe Xaa Pro Phe Xaa Ala Gln Xaa Arg Met Ser 370 375 380

Gly Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ile Arg Lys Gly Xaa Val Asp Ala 385 390 395 400

Xaa Arg Arg His Xaa Glu Ala Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Xaa Xaa Val

405 410 415

Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Val Ala Arg Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu Val

420 425 430

Val Xaa Glu Gly Xaa Xaa Val Leu Gly Val Xaa Ala Leu Lys Asp Ile

435 440 445

Val Lys Gly Gly Ile Lys Glu Arg Phe Ala Xaa Leu Arg Lys Met Gly

450 455 460

Ile Lys Thr Val Met Ile Thr Gly Asp Asn Xaa Leu Thr Ala Ala Ala 465 470 475 480

Ile Ala Ala Glu Ala Gly Val Asp Asp Phe Leu Xaa Glu Ala Thr Pro

485 490 495

Glu Ala Lys Leu Ala Leu Ile Arg Gln Tyr Gln Ala Glu Gly Arg Leu

500 505 510

Val Ala Met Thr Gly Asp Gly Thr Asn Asp Ala Pro Ala Leu Ala Gln

515 520 525

Ala Asp Val Ala Val Ala Met Asn Ser Gly Thr Gln Ala Ala Lys Glu

530 535 540

Ala Gly Asn Met Val Asp Leu Asp Ser Asn Pro Thr Lys Leu Xaa Glu 545 550 555 560

Val Val His Ile Gly Lys Gln Met Leu Met Thr Arg Gly Ser Leu Thr

565 570 575

Thr Phe Ser Ile Ala Asn Asp Val Ala Lys Tyr Phe Ala Ile Ile Pro

580 585 590

Ala Ala Phe Ala Ala Thr Tyr Pro Gln Leu Asn Xaa Leu Asn Xaa Met

595 600 605

Xaa Leu His Ser Pro Xaa Ser Ala Ile Leu Ser Ala Val Ile Phe Asn

610 615 620

Ala Leu Xaa Ile Val Phe Leu Ile Pro Leu Ala Leu Lys Gly Val Ser 625 630 635 640

Tyr Xaa Pro Leu Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Leu Arg Arg Asn Leu Xaa Ile

645 650 655

Tyr Gly Leu Gly Gly Leu Leu Val Pro Phe Xaa Gly Ile Lys Xaa Ile

660 665 670

Asp Xaa Leu Leu Xaa Xaa Xaa Gly Xaa 675 680

<210> 59

<211> 189

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de consenso de KdpC de P. anantis e E. coli <220>

<221> variação

<222> 3, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 28, 30, 32, 33, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 60, 61, 62, 66, 73, 74, 75, 80, 83, 89, 93, 97, 98, 100, 107, 111, 113, 114, 115, 123, 130, 131, 133, 135, 138, 141, 144, 146, 149, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 165, 168, 169, 170, 173, 175, 178, 178, 179, 180, 186, 187, 188, 189 <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente

<4 00> 59

Met Ser Xaa Leu Arg Pro Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Gly Xaa Val Tyr Pro Leu Leu Thr Thr Xaa Leu Xaa Gln Xaa 20 25 30 Xaa Phe Pro Trp Gln Ala Asn Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

35 40 45

Xaa Arg Gly Ser Ala Leu Ile Gly Gln Asn Phe Xaa Xaa Xaa Gly Tyr

50 55 60

Phe Xaa Gly Arg Pro Ser Ala Thr Xaa Xaa Xaa Pro Tyr Asn Pro Xaa 65 70 75 80

Ala Ser Xaa Gly Ser Asn Leu Ala Xaa Ser Asn Pro Xaa Leu Asp Lys

85 90 95

Xaa Xaa Ala Xaa Arg Val Ala Ala Leu Arg Xaa Ala Asn Pro Xaa Ala

100 105 110

Xaa Xaa Xaa Val Pro Val Glu Leu Val Thr Xaa Ser Ala Ser Gly Leu

115 120 125

Asp Xaa Xaa Ile Xaa Pro Xaa Ala Ala Xaa Trp Gln Xaa Pro Arg Xaa

130 135 140

Ala Xaa Ala Arg Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 145 150 155 160

Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Pro Leu Xaa Xaa Xaa Ile Gly Xaa Pro Xaa Val

165 170 175

Asn Xaa Xaa Xaa Leu Asn Leu Ala Leu Xaa Xaa Leu Xaa 180 185

Claims

1. Microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae, caracterizado pelo fato de que tem uma capacidade de produção de L- aminoácidos e foi modificado de modo que o sistema kdp fosse intensificado.

2. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sistema kdp é intensificado pelo aumento da expressão do óperon kdp ou de um ou mais genes que constituem o óperon kdp, e/ou pelo aumento da translação do óperon kdp ou dos genes.

3. Microorganismo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o sistema kdp é intensificado pelo aumento do número de cópias do óperon kdp ou de um ou mais genes que constituem o óperon kdp, ou pela modificação de uma seqüência de controle da expressão do óperon.

4. Microorganismo de acordo com as reivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o óperon kdp contém pelo menos os genes kdpA, kdpB e kdpC.

5. Microorganismo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o gene kdpA é um gene que codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOS: 2 ou -8, ou a subunidade A do sistema kdp tendo a seqüência de aminoácidos das SEQ ID NOS: 2 ou 8 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de μιη ou vários resíduos de aminoácidos.

6. Microorganismo de acordo com as reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o gene kdpB é um gene que codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOS: 3 ou -9, ou a subunidade B do sistema kdp tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 3 ou 9 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos.

7. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o gene kdpC é um gene que codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOS: 4 ou 10, ou a subunidade C do sistema kdp tendo uma seqüência de aminoácidos das SEQ ID NOS: 4 ou 10, incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos.

8. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que o óperon kdp é um DNA definido em qualquer um dos seguintes itens (a) a (d): (a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos números 546 a 4871 da SEQ ID NO: 1, (b) um DNA que hibridiza com a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos números 546 a 4871 da SEQ ID NO: 1 ou uma sonda preparada da seqüência de nucleotídeos sob condições estringentes e codificando o sistema kdp, (c) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos números 543 a 4853 da SEQ ID NO: 7, (b) um DNA que hibridiza com a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos números 543 a 4853 da SEQ ID NO: 7 ou uma sonda preparada da seqüência de nucleotídeos sob condições estringentes e codificando o sistema kdp.

9. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é uma ou mais espécies de L-aminoácidos selecionados do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-lisina, L-treonina, L-arginina, L-histidina, L-isoleucina, L- valina, L-leucina, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptofano e L-cisteína.

10. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae é uma bactéria Eseheriehia, uma bactéria Enterobaeter ou uma bactéria Pantoea.

11. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar o microorganismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 em um meio para produzir e acumular um L-aminoácido no meio ou nas células, e coletar o L-aminoácido do meio ou das células.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é uma ou mais espécies de L-aminoácidos selecionadas do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-lisina, L-treonina, L-arginina, L-histidina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina, L-fenilalanina, L- tirosina, L-triptofano e L-cisteína.