JP3921866B2 - Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＬ−グルタミン酸生産菌及びそれを用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６３，８５７号）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（特開平５−２４４９７０号）等が知られている。
【０００３】
上記のような微生物の育種や製造法の改良により、Ｌ−グルタミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、高いＬ−グルタミン酸生産能を有する新規なＬ−グルタミン酸生産菌を見出し、安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発につなげることにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、従来の微生物とは異なった微生物であって、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物を広く検索、研究した結果、クレブシエラ属またはエルビニア属に属する微生物由来の誘導株が高いＬ−グルタミン酸生産能を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物。
（２）クレブシエラ・プランティコーラまたはパントエア・アグロメランスに属する（１）の微生物。
（３）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められた（１）または（２）の微生物。
（４）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素が、クエン酸シンターゼ（以下「ＣＳ」と略す）、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（以下「ＰＥＰＣ」と略す）、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下「ＧＤＨ」と略す）から選ばれる（３）の微生物。
（５）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素が、ＣＳ、ＰＥＰＣ、およびＧＤＨのすべてである（４）の微生物。
（６）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損した（１）〜（５）のいずれかの微生物。
（７）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素がα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下「αＫＧＤＨ」と略す）である（６）の微生物。
（８）前記（１）〜（７）のいずれかの微生物を液体培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用されるクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物には、以下のようなものがある。
【０００８】
クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）
クレブシエラ・テリゲナ（K. terrigena）
エルビニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）（現在は、パントエア・アグロメランスに分類されている）
エルビニア・アナナス（E. ananas）
エルビニア・カクティシダ（E. cacticida）
エルビニア・クリサンテミ（E. chrysanthemi）
エルビニア・マロティボラ（E. mallotivora）
エルビニア・ペルシシナス（E. persicinus）
エルビニア・プシディ（E. psidii）
エルビニア・ケルシナ（E. quercina）
エルビニア・ラポンティシ（E. rhapontici）
エルビニア・ルブリファシエンス（E. rubrifaciens）
エルビニア・サリシス（E. salicis）
エルビニア・ウレドボラ（E. uredovora）
パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）
パントエア・ディスペルサ（P. dispersa）
【０００９】
さらに好ましくは、以下に示す菌株が挙げられる。
クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９
エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５（パントエア・アグロメランスＡＪ２６６６）
【００１０】
クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４６として寄託され、平成１１年１月１１日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１６が付与されている。また、エルビニア・ヘルビコーラに分類されていた微生物は現在パントエア・アグロメランスに分類されている。そのため、エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５は、パントエア・アグロメランス ＡＪ２６６６と名付けられ、平成１１年２月２５日にブタペスト条約に基づく国際寄託として、通産省工業技術院生命工学技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６０が付与されている。
【００１１】
クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株は、北海道札幌市の土壌から分離された株である。
以下に、ＡＪ１３３９９の生理的性質を記す。
【００１２】
（１）細胞の形：桿菌
（２）運動性：なし
（３）胞子：なし
（４）ＬａｂＭ栄養寒天培地でのコロニー形態：円形、表面は平滑、クリーム色、なめらか、***状、光沢有り。
（５）グルコースＯＦテスト：発酵能ポジティブ
（６）グラム染色性：陰性
（７）酸素に対する挙動：通性嫌気性
（８）カタラーゼ：ポジティブ
（９）オキシダーゼ：ネガティブ
（１０）ウレアーゼ：ポジティブ
【００１３】
（１１）チトクロームオキシダーゼ：ネガティブ
（１２）β−ガラクトシダーゼ：ポジティブ
（１３）アルギニンデヒドラターゼ：ネガティブ
（１４）オルニチンデカルボキシラーゼ：ネガティブ
（１５）リジンデカルボキシラーゼ：ポジティブ
（１６）トリプトファンデアミナーゼ：ネガティブ
（１７）フォゲス−プロスカウエル試験：ポジティブ
（１８）インドール生成：ポジティブ
（１９）ＴＳＩ培地での硫化水素生成：ネガティブ
（２０）クエン酸資化性：ポジティブ
【００１４】
（２１）Ｍ−ハイドロキシベンゼン酸資化性：ネガティブ
（２２）ゼラチン液化能：ネガティブ
（２３）糖からの酸の生成
グルコース：ポジティブ
マンニトール：ポジティブ
ラムノース：ポジティブ
アラビノース：ポジティブ
シュークロース：ポジティブ
ソルビトール：ポジティブ
イノシトール：ポジティブ
メリビオース：ポジティブ
アミグダリン：ポジティブ
アドニトール−ペプトン−水：ポジティブ
セロビオース−ペプトン−水：ポジティブ
デュルシトール−ペプトン−水：ネガティブ
ラフィノース−ペプトン−水：ポジティブ
（２４）生育温度 ３７℃生育良好、４５℃生育不可
【００１５】
これらの菌学的性質からＡＪ１３３９９は、クレブシエラ・プランティコーラと判定された。
【００１６】
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology第９版には、エルビニア・ハルビコーラは存在せず、従来エルビニア・ハルビコーラに分類されていた微生物はパントエア・アグロメランスに分類されている。このようにエルビニア属細菌とパントエア属細菌は非常に近縁であり、本発明においてはエルビニア属細菌とパントエア属細菌のいずれも用いることができる。
【００１７】
上記したようなクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する細菌による糖の代謝はエムデン−マイヤーホフ経路を経て行われ、同経路で生成するピルビン酸は好気的条件下ではトリカルボン酸サイクルにて酸化される。Ｌ−グルタミン酸は、トリカルボン酸サイクルの中間体であるα−ケトグルタル酸より、ＧＤＨあるいはグルタミンシンセターゼ／グルタミン酸シンターゼによって生合成される。このように、これらの微生物ではＬ−グルタミン酸生合成経路は共通のものであり、本発明においては、クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物は単一の概念を形成する。従って、上記した種または菌株以外のクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物も本発明に含まれる。
【００１８】
本発明の微生物は、上記のようなクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物であって、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物である。ここで「Ｌ−グルタミン酸生産能を有する」とは、培養したときに培地中にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有することをいう。このＬ−グルタミン酸生産能は、野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物においてＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められた微生物、またはＬ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損した微生物が挙げられる。また、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められ、かつ、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損した微生物も含まれる。
【００１９】
Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素としては、ＧＤＨ、グルタミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、ＣＳ、ＰＥＰＣ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵素の中では、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種または２種もしくは３種が好ましい。さらに、本発明の微生物においては、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの３種の酵素の活性がともに高められていることが好ましい。細胞中の目的酵素の活性が増加していること、および活性の増加の程度は、微生物の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株または親株と比較することによって確認することができる。
【００２０】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属し、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められた微生物は、例えば、前記の微生物を出発親株に用い、これらの酵素をコードする遺伝子に変異を生じた変異株として、または遺伝子組換え株として取得することができる。
【００２１】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨをコードする遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて、宿主となる上記出発親株を形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨをコードする遺伝子（以下、おのおのをこの順に「ｇｌｔＡ遺伝子」、「ｐｐｃ遺伝子」、「ｇｄｈＡ遺伝子」と略する）のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められる。
【００２２】
クローニングされたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、単独または任意の２種または３種の組合わせで、上記出発親株に導入される。２種または３種の遺伝子を導入する場合には、一種類のプラスミド上に２種又は３種の遺伝子がクローン化されて宿主に導入されるか、あるいは共存可能な２種類または３種類のプラスミド上に別々にクローン化されて宿主に導入される。
【００２３】
上記プラスミドとしては、クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物の細胞中で自律複製可能なプラスミドであれば特に制限されないが、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００２４】
形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。
【００２５】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めることは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子を、宿主となる上記出発親株の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子を多コピーで導入するには、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピート等、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列が利用できる。あるいは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子をトランスポゾンに搭載して、これを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。形質転換株の細胞内のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められる。
【００２６】
コピー数を上昇させるｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子の供給源となる生物としては、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を有する生物ならいかなる生物でも良い。なかでも原核生物である細菌、たとえばエンテロバクター属、クレブシェラ属、エルビニア属、パントエア属、セラチア属、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属に属する細菌が好ましい。具体的な例としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、上記のような微生物の染色体ＤＮＡより得ることができる。
【００２７】
ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、おのおのＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を欠失した変異株を用いて、その栄養要求性を相補するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離することによって取得できる。またエシェリヒア属細菌のこれら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２年）、それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。
【００２８】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、上記の遺伝子増幅による以外にも、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子の発現が強化されることによって達成される。例えば、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターをそれよりも強力な他のプロモーターに置換することによって発現が強化される。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターが置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子は、プラスミド上にクローニングされて宿主微生物に導入されるか、またはレペッティブＤＮＡ、インバーティッド・リピート、またはトランスポゾン等を用いて宿主微生物の染色体ＤＮＡ上に導入される。
【００２９】
また、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、染色体上のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターを、それらよりも強力なプロモーターで置換する（ＷＯ８７／０３００６号、特開昭６１−２６８１８３号参照）か、またはそれぞれの遺伝子のコード配列の上流に、強力なプロモーターを挿入すること（Gene, 29, (1984) 231-241参照）によっても達成することができる。具体的には、強力なプロモーターに置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子もしくはｇｄｈＡ遺伝子またはそれらの一部を含むＤＮＡと、染色体上の対応する遺伝子との間で相同組換えを起こさせればよい。
【００３０】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められたクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物として具体的には、クレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９／ＲＳＦＣＰＧおよびエルビニア・ヘルビコーラＩＡＭ１５９５／ＲＳＦＣＰＧが挙げられる。
【００３１】
Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、αＫＧＤＨ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。これらの酵素の中では、αＫＧＤＨが好ましい。
【００３２】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物において、上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。
【００３３】
変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。
【００３４】
また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法がある。例えば、クローン化された目的遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入し、機能を失った遺伝子（欠陥遺伝子）を作製する。次いで、この欠陥遺伝子をクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物の細胞に導入し、相同組み換えを利用して染色体上の目的遺伝子を前記欠陥遺伝子に置換する（遺伝子破壊）。
【００３５】
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株または親株と比較することによって確認することができる。例えば、αＫＧＤＨ活性は、Reedらの方法（L.J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って酵素活性を測定することができる。
【００３６】
また、目的とする酵素によっては、変異株の表現型によって目的変異株を選択することができる。例えば、αＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株は、好気的培養条件ではグルコースを含む最少培地、あるいは、酢酸やＬ−グルタミン酸を唯一の炭素源として含む最少培地で生育できないか、または生育速度が著しく低下する。ところが、同一条件でもグルコースを含む最少培地にコハク酸またはリジン、メチオニン、及びジアミノピメリン酸を添加することによって通常の生育が可能となる。これらの現象を指標としてαＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の選抜が可能である。
【００３７】
相同組換えを利用したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのαＫＧＤＨ遺伝子欠損株の作製法は、ＷＯ９５／３４６７２号に詳述されており、クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物にも同様の方法を適用することができる。
【００３８】
その他、遺伝子のクローニング、ＤＮＡの切断、連結、形質転換法等の技術については、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)）等に詳述されている。
【００３９】
以上のようにして得られるαＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の具体例としては、クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３４１０が挙げられる。クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３４１０は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４７として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１７が付与されている。
【００４０】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属し、上記のようにしてαＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損した株、あるいはＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められた株は、後記実施例に示すように、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する。
【００４１】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属と同じ腸内細菌群に含まれるエシェリヒア属に属する微生物に関しては、αＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損した株がＬ−グルタミン酸を生成しうること（特開平５−２４４９７０号）、αＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損し、かつＰＥＰＣ活性とＧＤＨ活性が高められた株が更に著量のＬ−グルタミン酸を生成しうること（特開平７−２０３９８０号）、および、バリン感受性を示しＣＳ活性とＧＤＨ活性が高められた株がＬ−グルタミン酸を生成しうること（ＷＯ９７／０８２９４号）が知られている。
【００４２】
また、同じく腸内細菌群に含まれるエンテロバクター属に属する微生物に関しては、αＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損した株、あるいはＰＥＰＣ活性、ＧＤＨ活性、及びＣＳ活性が高められた株がＬ−グルタミン酸を生成しうることを発明者らは発見した（特願平１０−６９０６８号）。
【００４３】
さらに、セラチア属に属する微生物に関しても、ＰＥＰＣ活性、ＧＤＨ活性、及びＣＳ活性が高められた株がＬ−グルタミン酸を生成しうることを発明者らは発見した（特願平１０−６９０６８号）。
【００４４】
これらの事実より、実施例に示した菌株に限られず、クレブシエラ属、エルビニア属、パントエア属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、またはセラチア属の他の微生物に関しても、αＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損した株、あるいはＰＥＰＣ活性、ＧＤＨ活性、及びＣＳ活性が増幅された株がＬ−グルタミン酸を生成しうることは、容易に推察される。また、実施例に示すように、αＫＧＤＨを欠損させることにより、クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株へＬ−グルタミン酸生産能を付与できることは、他のクレブシエラ属細菌、エルビニア属またはパントエア属の細菌にも適用できることが強く支持される。
【００４５】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物を液体培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することにより、Ｌ−グルタミン酸を製造することができる。前記培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は、培養する菌株の利用可能なものならばよい。
【００４６】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【００４７】
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【００４８】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
【００４９】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養方法は、発酵温度２０ないし４２℃、ｐＨを４ないし８に制御しつつ通気培養を行う。かくして１０時間ないし４日間程度培養することにより培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
【００５０】
培養終了後、培養液中に蓄積されたＬ−グルタミン酸を単離する方法としては公知の方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。
【００５１】
【実施例】
次に、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。
【００５２】
（１）ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの作製
ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの作成の手順を、図１、２及び３に基づいて説明する。
【００５３】
エシェリヒア・コリ由来のｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＢＲＧＤＨ（特開平７−２０３９８０号）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理で両末端を平滑末端にした後、ｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収した。一方、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子およびｐｐｃ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰ（ＷＯ９７／０８２９４号）をＸｂａＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで両末端を平滑末端にした。これに、上で精製したｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ｐＭＷＣＰに更にｇｄｈＡ遺伝子を搭載したプラスミドｐＭＷＣＰＧを得た（図１）。
【００５４】
また、ｐＢＲＧＤＨをＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ消化して得られたｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収後、プラスミドｐＭＷ２１９（ニッポンジーン（株）より購入）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩサイトに導入することによって、プラスミドｐＭＷＧを得た（図２）。さらに、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＴＷＶＣ（ＷＯ９７／０８２９４号）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化して得られたｇｌｔＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収後、プラスミドｐＭＷ２１９のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに導入することによって、プラスミドｐＭＷＣを得た（図３）。
【００５５】
同時に、広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点を有するプラスミドｐＶＩＣ４０（特開平８−０４７３９７号）をＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものと、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＴ１４１消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものとを混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ１０１０の複製起点及びテトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドＲＳＦ−Ｔｅｔを得た（図４）。
【００５６】
次に、ｐＭＷＣＰＧをＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収し、ＲＳＦ−Ｔｅｔを同様にＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ＲＳＦ１０１０の複製起点を有するＤＮＡ断片を精製回収したものと混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ−Ｔｅｔ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を搭載したプラスミドＲＳＦＣＰＧを得た（図５）。得られたプラスミドＲＳＦＣＰＧが、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を発現していることは、エシェリヒア・コリのｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、あるいはｇｄｈＡ遺伝子欠損株の栄養要求性の相補と各酵素活性の測定によって確認した。同様に、ｐＭＷＧまたはｐＭＷＣが、ｇｄｈＡ遺伝子またはｇｌｔＡ遺伝子を発現していることは、エシェリヒア・コリのｇｄｈＡ遺伝子またはｇｌｔＡ遺伝子欠損株の栄養要求性の相補と各酵素活性の測定によって確認した。
【００５７】
（２）クレブシエラ属細菌およびエルビニア属（パントエア属）細菌へのＲＳＦＣＰＧ、ｐＭＷＣ及びｐＭＷＧの導入とＬ−グルタミン酸生産性の評価
ＲＳＦＣＰＧ、ｐＭＷＣ及びｐＭＷＧを用い、エルビニア・ヘルビコーラＩＡＭ１５９５（パントエア・アグロメランスＡＪ２６６６）またはクレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株を、エレクトロポレーション（Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook" Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1992）によって形質転換し、テトラサイクリン耐性を示す形質転換株を取得した。
【００５８】
得られた形質転換株あるいは各々の親株を、グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌを含有する培地５ｍｌを注入した５０ｍｌ容大型試験管に接種して、３７℃で培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。形質転換体の培養については、テトラサイクリン２５ｍｇ／Ｌを添加した。培養終了後、培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸を測定した結果を表１に示した。
【００５９】
【表１】
【００６０】
エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５あるいはクレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株はＬ−グルタミン酸を蓄積しなかったが、ＲＳＦＣＰＧを導入することによってＣＳ、ＰＥＰＣ、およびＧＤＨ活性を増幅した株では、それぞれ５．０ｇ／Ｌ、３．１ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸を蓄積した。また、ＡＪ１３３９９株のＣＳ活性のみを増幅することによって２．５ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸を、ＧＤＨ活性のみを増幅することによって０．８ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸を、それぞれ蓄積した。
【００６１】
（３）クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株のαＫＧＤＨ遺伝子の一部を有する断片のクローニング
クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株のαＫＧＤＨ遺伝子の一部を有する断片は、既にその塩基配列が報告されているアゾトバクター・ビネランディ、バチルス・ズブチリス、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカム、ハエモフィラス・インフルエンザ、ヒト、及びサッカロマイセス・セレビシエの各生物のαＫＧＤＨ遺伝子（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１８７巻、２３５〜２３９頁、１９９０年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２３４巻、２８５〜２９６頁、１９９２年；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４１巻、３５１〜３５９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４２巻、３３４７〜３３５４頁、１９９６年；Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６９巻、４９６〜５１２頁、１９９５年；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８９巻、１９６３〜１９６７頁、１９９２年；Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．、第９巻、２６９５〜２７０５頁、１９８９年）の相同部位の塩基配列及びＥｃｏＲＩサイトを有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによって、そのクローニングを実施した。
プライマーとしては、具体的には以下のものを使用した。
【００６２】
（プライマー１）
５’CCGGGAATTCGGTGACGTNAARTAYCA３’（配列番号１）
（プライマー２）
５’GGCGAATTCGGGAACGGGTASAGYTGYTC3’（配列番号２）
【００６３】
ＰＣＲのテンプレートとして用いたクレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株の染色体ＤＮＡは、エシェリヒア・コリにおいて通常染色体ＤＮＡを抽出するのに使用されるのと同様の方法（生物工学実験書、日本生物工学会偏、９７−９８頁、培風館、１９９２年）で単離した。
【００６４】
ＰＣＲの条件は、９４℃１分、５０℃１分、７３℃３分、３０サイクルとし、得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ消化後、ＥｃｏＲＩ消化したベクタープラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅに挿入し、組み換えプラスミドｐＴ７ＫＰを得た。ベクタープラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ（アンピシリン耐性）はノバゲン社製の市販品を用いた。
【００６５】
クローニングされた断片のＤＮＡ塩基配列及びこの配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号３に示す。また、同アミノ酸配列のみを配列番号４に示す。同配列は、エシェリヒア・コリのαＫＧＤＨ−Ｅ１サブユニット遺伝子（以下「ｓｕｃＡ遺伝子」という）と８２．３％の相同性を示しており、明らかにクレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株のｓｕｃＡ遺伝子の一部と考えられる。尚、配列番号３に示される塩基配列において、塩基番号１８〜１６５９がｓｕｃＡ遺伝子に由来し、塩基番号０〜１７及び１６６０〜１６７９はプライマーに由来する。
【００６６】
（４）クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株由来のαＫＧＤＨ欠損株の取得
上記のようにして取得されたクレブシエラ・プランティコーラのｓｕｃＡ遺伝子の一部を有する断片を用い、相同組換えによりクレブシエラ・プランティコーラのαＫＧＤＨ欠損株の取得を行った。
【００６７】
まず、ｐＴ７ＫＰをＢｓｔＥＩＩにて切断し、そこにプラスミドｐＮＥＯ（ファルマシア社より購入）よりＰＣＲによりクローニングすると共に両端にＢｓｔＥＩＩサイトを導入したカナマイシン耐性遺伝子断片を導入し、クレブシエラ・プランティコーラのｓｕｃＡ遺伝子中央部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたプラスミドｐＴ７ＫＰＫｍを得た。
カナマイシン耐性遺伝子のクローニングに使用したプライマーは以下の通りである。
【００６８】
（プライマー３）
５’TACTGGGTCACCTGACAGCTTATCATCGAT３’（配列番号５）
（プライマー４）
５’CGTTCGGTGACCACCAAAGCGGCCATCGTG３’（配列番号６）
【００６９】
次にｐＴ７ＫＰＫｍをＫｐｎＩにて切断し、そこにプラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造（株）より購入）よりＰＣＲによりクローニングすると共に両端にＫｐｎＩサイトを導入したテトラサイクリン耐性遺伝子断片を導入し、クレブシエラ・プランティコーラのｓｕｃＡ遺伝子中央部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたと共にその隣にテトラサイクリン耐性遺伝子が挿入されたプラスミドｐＴ７ＫＰＫｍＴｃを得た。
テトラサイクリン耐性遺伝子のクローニングに使用したプライマーは以下の通りである。
【００７０】
（プライマー５）
５’GGGGTACCCAAATAGGCGTATCACGAG３’（配列番号７）
（プライマー６）
５’GGGGTACCCGCGATGGATATGTTCTG３’（配列番号８）
【００７１】
続いてプラスミドｐＴ７ＫＰＫｍＴｃをＳａｃＩ、ＸｂａＩで消化することによって、クレブシエラ・プランティコーラのｓｕｃＡ遺伝子中央部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたと共にその隣にテトラサイクリン耐性遺伝子を有するＤＮＡ断片を切り出し、これを、ＳａｃＩ、ＸｂａＩで消化したグラム陰性細菌用染色体挿入プラスミドベクターｐＧＰ７０４（Marta Herrero et al., Journal of Bacteriology, 1990, 172, p.6557-6567）に挿入し、プラスミドｐＵＴＯＮＯＴＫを得た。
【００７２】
こうしてできたプラスミドｐＵＴＯＮＯＴＫを用いて、クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株を、エレクトロポレーションによって形質転換し、テトラサイクリン耐性かつカナマイシン耐性を指標として、プラスミドｐＵＴＯＮＯＴＫがｓｕｃＡ遺伝子断片の相同組み換えによって染色体上に挿入された株を取得した。さらにこの株より、テトラサイクリン感受性かつカナマイシン耐性を指標として、染色体上のｓｕｃＡ遺伝子が中央部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたｓｕｃＡ遺伝子に置換されたと考えられるｓｕｃＡ欠損株クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３４１０株を取得した。
【００７３】
以上のようにして得られたＡＪ１３４１０株がαＫＧＤＨ活性を欠損していることを確認するためにReedらの方法（L.J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って酵素活性を測定した。その結果、表２に示すようにＡＪ１３４１０株ではαＫＧＤＨ活性を検出できず、目的通りｓｕｃＡが欠損していることが確かめられた。
【００７４】
【表２】
【００７５】
（５）クレブシエラ・プランティコーラ αＫＧＤＨ欠損株のＬ−グルタミン酸生産性の評価
ＡＪ１３３９９、ＡＪ１３４１０の両株を、グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸塩２００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン２００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−α，ε−ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）２００ｍｇ／Ｌを含有する培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ容フラスコに接種して、３７℃で培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。培養終了後、培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸及びα−ケトグルタール酸（以下「αＫＧ」と略す）を測定した結果を表３に示した。
【００７６】
【表３】
【００７７】
αＫＧＤＨ活性が欠損したＡＪ１３４１０株は、Ｌ−グルタミン酸を１２．８ｇ／Ｌ蓄積した。また同時に１．５ｇ／ＬのαＫＧを蓄積した。
【００７８】
（６）クレブシエラ・プランティコーラαＫＧＤＨ欠損株へのＲＳＦＣＰＧの導入とＬ−グルタミン酸生産性の評価
ＡＪ１３４１０株をＲＳＦＣＰＧを用いて形質転換し、得られたＲＳＦＣＰＧ導入株ＡＪ１３４１０／ＲＳＦＣＰＧを、グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、テトラサイクリン２５ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸塩２００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン２００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−α，ε−ＤＡＰ２００ｍｇ／Ｌを含有する培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ容フラスコに接種して、３７℃で培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。培養終了後、培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸及びαＫＧを測定した結果を表４に示した。
【００７９】
【表４】
【００８０】
ＲＳＦＣＰＧを導入してＣＳ、ＰＥＰＣ、およびＧＤＨ活性を増幅した株では、αＫＧ蓄積量が減少し、Ｌ−グルタミン酸蓄積が更に向上した。
【００８１】
【発明の効果】
本発明の微生物は、高いＬ−グルタミン酸生産能を有することから、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌で従来知られている育種手法等を用いてさらに高い生産能を付与できると考えられ、また培養条件等の検討により、安価で、効率の良いＬ−グルタミン酸製造法の開発につながるものと期待される。
【００８２】
【配列表】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰＧの構築を示す図。
【図２】 ｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＧの構築を示す図。
【図３】 ｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣの構築を示す図。
【図４】 広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点とテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドＲＳＦ−Ｔｅｔの構築を示す図。
【図５】 広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点、テトラサイクリン耐性遺伝子、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドＲＳＦＣＰＧの構築を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＬ−グルタミン酸生産菌及びそれを用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６３，８５７号）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（特開平５−２４４９７０号）等が知られている。
【０００３】
上記のような微生物の育種や製造法の改良により、Ｌ−グルタミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、高いＬ−グルタミン酸生産能を有する新規なＬ−グルタミン酸生産菌を見出し、安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発につなげることにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、従来の微生物とは異なった微生物であって、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物を広く検索、研究した結果、クレブシエラ属またはエルビニア属に属する微生物由来の誘導株が高いＬ−グルタミン酸生産能を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物。
（２）クレブシエラ・プランティコーラまたはパントエア・アグロメランスに属する（１）の微生物。
（３）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められた（１）または（２）の微生物。
（４）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素が、クエン酸シンターゼ（以下「ＣＳ」と略す）、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（以下「ＰＥＰＣ」と略す）、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下「ＧＤＨ」と略す）から選ばれる（３）の微生物。
（５）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素が、ＣＳ、ＰＥＰＣ、およびＧＤＨのすべてである（４）の微生物。
（６）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損した（１）〜（５）のいずれかの微生物。
（７）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素がα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下「αＫＧＤＨ」と略す）である（６）の微生物。
（８）前記（１）〜（７）のいずれかの微生物を液体培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用されるクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物には、以下のようなものがある。
【０００８】
クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）
クレブシエラ・テリゲナ（K. terrigena）
エルビニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）（現在は、パントエア・アグロメランスに分類されている）
エルビニア・アナナス（E. ananas）
エルビニア・カクティシダ（E. cacticida）
エルビニア・クリサンテミ（E. chrysanthemi）
エルビニア・マロティボラ（E. mallotivora）
エルビニア・ペルシシナス（E. persicinus）
エルビニア・プシディ（E. psidii）
エルビニア・ケルシナ（E. quercina）
エルビニア・ラポンティシ（E. rhapontici）
エルビニア・ルブリファシエンス（E. rubrifaciens）
エルビニア・サリシス（E. salicis）
エルビニア・ウレドボラ（E. uredovora）
パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）
パントエア・ディスペルサ（P. dispersa）
【０００９】
さらに好ましくは、以下に示す菌株が挙げられる。
クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９
エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５（パントエア・アグロメランスＡＪ２６６６）
【００１０】
クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４６として寄託され、平成１１年１月１１日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１６が付与されている。また、エルビニア・ヘルビコーラに分類されていた微生物は現在パントエア・アグロメランスに分類されている。そのため、エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５は、パントエア・アグロメランス ＡＪ２６６６と名付けられ、平成１１年２月２５日にブタペスト条約に基づく国際寄託として、通産省工業技術院生命工学技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６０が付与されている。
【００１１】
クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株は、北海道札幌市の土壌から分離された株である。
以下に、ＡＪ１３３９９の生理的性質を記す。
【００１２】
（１）細胞の形：桿菌
（２）運動性：なし
（３）胞子：なし
（４）ＬａｂＭ栄養寒天培地でのコロニー形態：円形、表面は平滑、クリーム色、なめらか、***状、光沢有り。
（５）グルコースＯＦテスト：発酵能ポジティブ
（６）グラム染色性：陰性
（７）酸素に対する挙動：通性嫌気性
（８）カタラーゼ：ポジティブ
（９）オキシダーゼ：ネガティブ
（１０）ウレアーゼ：ポジティブ
【００１３】
（１１）チトクロームオキシダーゼ：ネガティブ
（１２）β−ガラクトシダーゼ：ポジティブ
（１３）アルギニンデヒドラターゼ：ネガティブ
（１４）オルニチンデカルボキシラーゼ：ネガティブ
（１５）リジンデカルボキシラーゼ：ポジティブ
（１６）トリプトファンデアミナーゼ：ネガティブ
（１７）フォゲス−プロスカウエル試験：ポジティブ
（１８）インドール生成：ポジティブ
（１９）ＴＳＩ培地での硫化水素生成：ネガティブ
（２０）クエン酸資化性：ポジティブ
【００１４】
（２１）Ｍ−ハイドロキシベンゼン酸資化性：ネガティブ
（２２）ゼラチン液化能：ネガティブ
（２３）糖からの酸の生成
グルコース：ポジティブ
マンニトール：ポジティブ
ラムノース：ポジティブ
アラビノース：ポジティブ
シュークロース：ポジティブ
ソルビトール：ポジティブ
イノシトール：ポジティブ
メリビオース：ポジティブ
アミグダリン：ポジティブ
アドニトール−ペプトン−水：ポジティブ
セロビオース−ペプトン−水：ポジティブ
デュルシトール−ペプトン−水：ネガティブ
ラフィノース−ペプトン−水：ポジティブ
（２４）生育温度 ３７℃生育良好、４５℃生育不可
【００１５】
これらの菌学的性質からＡＪ１３３９９は、クレブシエラ・プランティコーラと判定された。
【００１６】
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology第９版には、エルビニア・ハルビコーラは存在せず、従来エルビニア・ハルビコーラに分類されていた微生物はパントエア・アグロメランスに分類されている。このようにエルビニア属細菌とパントエア属細菌は非常に近縁であり、本発明においてはエルビニア属細菌とパントエア属細菌のいずれも用いることができる。
【００１７】
上記したようなクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する細菌による糖の代謝はエムデン−マイヤーホフ経路を経て行われ、同経路で生成するピルビン酸は好気的条件下ではトリカルボン酸サイクルにて酸化される。Ｌ−グルタミン酸は、トリカルボン酸サイクルの中間体であるα−ケトグルタル酸より、ＧＤＨあるいはグルタミンシンセターゼ／グルタミン酸シンターゼによって生合成される。このように、これらの微生物ではＬ−グルタミン酸生合成経路は共通のものであり、本発明においては、クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物は単一の概念を形成する。従って、上記した種または菌株以外のクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物も本発明に含まれる。
【００１８】
本発明の微生物は、上記のようなクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物であって、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物である。ここで「Ｌ−グルタミン酸生産能を有する」とは、培養したときに培地中にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有することをいう。このＬ−グルタミン酸生産能は、野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物においてＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められた微生物、またはＬ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損した微生物が挙げられる。また、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められ、かつ、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損した微生物も含まれる。
【００１９】
Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素としては、ＧＤＨ、グルタミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、ＣＳ、ＰＥＰＣ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵素の中では、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種または２種もしくは３種が好ましい。さらに、本発明の微生物においては、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの３種の酵素の活性がともに高められていることが好ましい。細胞中の目的酵素の活性が増加していること、および活性の増加の程度は、微生物の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株または親株と比較することによって確認することができる。
【００２０】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属し、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められた微生物は、例えば、前記の微生物を出発親株に用い、これらの酵素をコードする遺伝子に変異を生じた変異株として、または遺伝子組換え株として取得することができる。
【００２１】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨをコードする遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて、宿主となる上記出発親株を形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨをコードする遺伝子（以下、おのおのをこの順に「ｇｌｔＡ遺伝子」、「ｐｐｃ遺伝子」、「ｇｄｈＡ遺伝子」と略する）のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められる。
【００２２】
クローニングされたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、単独または任意の２種または３種の組合わせで、上記出発親株に導入される。２種または３種の遺伝子を導入する場合には、一種類のプラスミド上に２種又は３種の遺伝子がクローン化されて宿主に導入されるか、あるいは共存可能な２種類または３種類のプラスミド上に別々にクローン化されて宿主に導入される。
【００２３】
上記プラスミドとしては、クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物の細胞中で自律複製可能なプラスミドであれば特に制限されないが、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００２４】
形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。
【００２５】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めることは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子を、宿主となる上記出発親株の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子を多コピーで導入するには、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピート等、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列が利用できる。あるいは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子をトランスポゾンに搭載して、これを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。形質転換株の細胞内のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められる。
【００２６】
コピー数を上昇させるｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子の供給源となる生物としては、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を有する生物ならいかなる生物でも良い。なかでも原核生物である細菌、たとえばエンテロバクター属、クレブシェラ属、エルビニア属、パントエア属、セラチア属、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属に属する細菌が好ましい。具体的な例としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、上記のような微生物の染色体ＤＮＡより得ることができる。
【００２７】
ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、おのおのＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を欠失した変異株を用いて、その栄養要求性を相補するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離することによって取得できる。またエシェリヒア属細菌のこれら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２年）、それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。
【００２８】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、上記の遺伝子増幅による以外にも、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子の発現が強化されることによって達成される。例えば、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターをそれよりも強力な他のプロモーターに置換することによって発現が強化される。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターが置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子は、プラスミド上にクローニングされて宿主微生物に導入されるか、またはレペッティブＤＮＡ、インバーティッド・リピート、またはトランスポゾン等を用いて宿主微生物の染色体ＤＮＡ上に導入される。
【００２９】
また、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、染色体上のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターを、それらよりも強力なプロモーターで置換する（ＷＯ８７／０３００６号、特開昭６１−２６８１８３号参照）か、またはそれぞれの遺伝子のコード配列の上流に、強力なプロモーターを挿入すること（Gene, 29, (1984) 231-241参照）によっても達成することができる。具体的には、強力なプロモーターに置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子もしくはｇｄｈＡ遺伝子またはそれらの一部を含むＤＮＡと、染色体上の対応する遺伝子との間で相同組換えを起こさせればよい。
【００３０】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められたクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物として具体的には、クレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９／ＲＳＦＣＰＧおよびエルビニア・ヘルビコーラＩＡＭ１５９５／ＲＳＦＣＰＧが挙げられる。
【００３１】
Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、αＫＧＤＨ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。これらの酵素の中では、αＫＧＤＨが好ましい。
【００３２】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物において、上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。
【００３３】
変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。
【００３４】
また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法がある。例えば、クローン化された目的遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入し、機能を失った遺伝子（欠陥遺伝子）を作製する。次いで、この欠陥遺伝子をクレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物の細胞に導入し、相同組み換えを利用して染色体上の目的遺伝子を前記欠陥遺伝子に置換する（遺伝子破壊）。
【００３５】
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株または親株と比較することによって確認することができる。例えば、αＫＧＤＨ活性は、Reedらの方法（L.J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って酵素活性を測定することができる。
【００３６】
また、目的とする酵素によっては、変異株の表現型によって目的変異株を選択することができる。例えば、αＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株は、好気的培養条件ではグルコースを含む最少培地、あるいは、酢酸やＬ−グルタミン酸を唯一の炭素源として含む最少培地で生育できないか、または生育速度が著しく低下する。ところが、同一条件でもグルコースを含む最少培地にコハク酸またはリジン、メチオニン、及びジアミノピメリン酸を添加することによって通常の生育が可能となる。これらの現象を指標としてαＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の選抜が可能である。
【００３７】
相同組換えを利用したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのαＫＧＤＨ遺伝子欠損株の作製法は、ＷＯ９５／３４６７２号に詳述されており、クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属する微生物にも同様の方法を適用することができる。
【００３８】
その他、遺伝子のクローニング、ＤＮＡの切断、連結、形質転換法等の技術については、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)）等に詳述されている。
【００３９】
以上のようにして得られるαＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の具体例としては、クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３４１０が挙げられる。クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３４１０は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４７として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１７が付与されている。
【００４０】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属し、上記のようにしてαＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損した株、あるいはＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められた株は、後記実施例に示すように、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する。
【００４１】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属と同じ腸内細菌群に含まれるエシェリヒア属に属する微生物に関しては、αＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損した株がＬ−グルタミン酸を生成しうること（特開平５−２４４９７０号）、αＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損し、かつＰＥＰＣ活性とＧＤＨ活性が高められた株が更に著量のＬ−グルタミン酸を生成しうること（特開平７−２０３９８０号）、および、バリン感受性を示しＣＳ活性とＧＤＨ活性が高められた株がＬ−グルタミン酸を生成しうること（ＷＯ９７／０８２９４号）が知られている。
【００４２】
また、同じく腸内細菌群に含まれるエンテロバクター属に属する微生物に関しては、αＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損した株、あるいはＰＥＰＣ活性、ＧＤＨ活性、及びＣＳ活性が高められた株がＬ−グルタミン酸を生成しうることを発明者らは発見した（特願平１０−６９０６８号）。
【００４３】
さらに、セラチア属に属する微生物に関しても、ＰＥＰＣ活性、ＧＤＨ活性、及びＣＳ活性が高められた株がＬ−グルタミン酸を生成しうることを発明者らは発見した（特願平１０−６９０６８号）。
【００４４】
これらの事実より、実施例に示した菌株に限られず、クレブシエラ属、エルビニア属、パントエア属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、またはセラチア属の他の微生物に関しても、αＫＧＤＨ活性が低下あるいは欠損した株、あるいはＰＥＰＣ活性、ＧＤＨ活性、及びＣＳ活性が増幅された株がＬ−グルタミン酸を生成しうることは、容易に推察される。また、実施例に示すように、αＫＧＤＨを欠損させることにより、クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株へＬ−グルタミン酸生産能を付与できることは、他のクレブシエラ属細菌、エルビニア属またはパントエア属の細菌にも適用できることが強く支持される。
【００４５】
クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物を液体培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することにより、Ｌ−グルタミン酸を製造することができる。前記培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は、培養する菌株の利用可能なものならばよい。
【００４６】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【００４７】
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【００４８】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
【００４９】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養方法は、発酵温度２０ないし４２℃、ｐＨを４ないし８に制御しつつ通気培養を行う。かくして１０時間ないし４日間程度培養することにより培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
【００５０】
培養終了後、培養液中に蓄積されたＬ−グルタミン酸を単離する方法としては公知の方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。
【００５１】
【実施例】
次に、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。
【００５２】
（１）ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの作製
ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの作成の手順を、図１、２及び３に基づいて説明する。
【００５３】
エシェリヒア・コリ由来のｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＢＲＧＤＨ（特開平７−２０３９８０号）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理で両末端を平滑末端にした後、ｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収した。一方、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子およびｐｐｃ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰ（ＷＯ９７／０８２９４号）をＸｂａＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで両末端を平滑末端にした。これに、上で精製したｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ｐＭＷＣＰに更にｇｄｈＡ遺伝子を搭載したプラスミドｐＭＷＣＰＧを得た（図１）。
【００５４】
また、ｐＢＲＧＤＨをＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ消化して得られたｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収後、プラスミドｐＭＷ２１９（ニッポンジーン（株）より購入）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩサイトに導入することによって、プラスミドｐＭＷＧを得た（図２）。さらに、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＴＷＶＣ（ＷＯ９７／０８２９４号）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化して得られたｇｌｔＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収後、プラスミドｐＭＷ２１９のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに導入することによって、プラスミドｐＭＷＣを得た（図３）。
【００５５】
同時に、広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点を有するプラスミドｐＶＩＣ４０（特開平８−０４７３９７号）をＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものと、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＴ１４１消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものとを混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ１０１０の複製起点及びテトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドＲＳＦ−Ｔｅｔを得た（図４）。
【００５６】
次に、ｐＭＷＣＰＧをＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収し、ＲＳＦ−Ｔｅｔを同様にＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ＲＳＦ１０１０の複製起点を有するＤＮＡ断片を精製回収したものと混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ−Ｔｅｔ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を搭載したプラスミドＲＳＦＣＰＧを得た（図５）。得られたプラスミドＲＳＦＣＰＧが、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を発現していることは、エシェリヒア・コリのｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、あるいはｇｄｈＡ遺伝子欠損株の栄養要求性の相補と各酵素活性の測定によって確認した。同様に、ｐＭＷＧまたはｐＭＷＣが、ｇｄｈＡ遺伝子またはｇｌｔＡ遺伝子を発現していることは、エシェリヒア・コリのｇｄｈＡ遺伝子またはｇｌｔＡ遺伝子欠損株の栄養要求性の相補と各酵素活性の測定によって確認した。
【００５７】
（２）クレブシエラ属細菌およびエルビニア属（パントエア属）細菌へのＲＳＦＣＰＧ、ｐＭＷＣ及びｐＭＷＧの導入とＬ−グルタミン酸生産性の評価
ＲＳＦＣＰＧ、ｐＭＷＣ及びｐＭＷＧを用い、エルビニア・ヘルビコーラＩＡＭ１５９５（パントエア・アグロメランスＡＪ２６６６）またはクレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株を、エレクトロポレーション（Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook" Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1992）によって形質転換し、テトラサイクリン耐性を示す形質転換株を取得した。
【００５８】
得られた形質転換株あるいは各々の親株を、グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌを含有する培地５ｍｌを注入した５０ｍｌ容大型試験管に接種して、３７℃で培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。形質転換体の培養については、テトラサイクリン２５ｍｇ／Ｌを添加した。培養終了後、培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸を測定した結果を表１に示した。
【００５９】
【表１】
エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５あるいはクレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株はＬ−グルタミン酸を蓄積しなかったが、ＲＳＦＣＰＧを導入することによってＣＳ、ＰＥＰＣ、およびＧＤＨ活性を増幅した株では、それぞれ５．０ｇ／Ｌ、３．１ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸を蓄積した。また、ＡＪ１３３９９株のＣＳ活性のみを増幅することによって２．５ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸を、ＧＤＨ活性のみを増幅することによって０．８ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸を、それぞれ蓄積した。
【００６１】
（３）クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株のαＫＧＤＨ遺伝子の一部を有する断片のクローニング
クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株のαＫＧＤＨ遺伝子の一部を有する断片は、既にその塩基配列が報告されているアゾトバクター・ビネランディ、バチルス・ズブチリス、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカム、ハエモフィラス・インフルエンザ、ヒト、及びサッカロマイセス・セレビシエの各生物のαＫＧＤＨ遺伝子（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１８７巻、２３５〜２３９頁、１９９０年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２３４巻、２８５〜２９６頁、１９９２年；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４１巻、３５１〜３５９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４２巻、３３４７〜３３５４頁、１９９６年；Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６９巻、４９６〜５１２頁、１９９５年；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８９巻、１９６３〜１９６７頁、１９９２年；Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．、第９巻、２６９５〜２７０５頁、１９８９年）の相同部位の塩基配列及びＥｃｏＲＩサイトを有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによって、そのクローニングを実施した。
プライマーとしては、具体的には以下のものを使用した。
【００６２】
（プライマー１）
５’CCGGGAATTCGGTGACGTNAARTAYCA３’（配列番号１）
（プライマー２）
５’GGCGAATTCGGGAACGGGTASAGYTGYTC3’（配列番号２）
【００６３】
ＰＣＲのテンプレートとして用いたクレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株の染色体ＤＮＡは、エシェリヒア・コリにおいて通常染色体ＤＮＡを抽出するのに使用されるのと同様の方法（生物工学実験書、日本生物工学会偏、９７−９８頁、培風館、１９９２年）で単離した。
【００６４】
ＰＣＲの条件は、９４℃１分、５０℃１分、７３℃３分、３０サイクルとし、得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ消化後、ＥｃｏＲＩ消化したベクタープラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅに挿入し、組み換えプラスミドｐＴ７ＫＰを得た。ベクタープラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ（アンピシリン耐性）はノバゲン社製の市販品を用いた。
【００６５】
クローニングされた断片のＤＮＡ塩基配列及びこの配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号３に示す。また、同アミノ酸配列のみを配列番号４に示す。同配列は、エシェリヒア・コリのαＫＧＤＨ−Ｅ１サブユニット遺伝子（以下「ｓｕｃＡ遺伝子」という）と８２．３％の相同性を示しており、明らかにクレブシエラ・プランティコーラＡＪ１３３９９株のｓｕｃＡ遺伝子の一部と考えられる。尚、配列番号３に示される塩基配列において、塩基番号１８〜１６５９がｓｕｃＡ遺伝子に由来し、塩基番号０〜１７及び１６６０〜１６７９はプライマーに由来する。
【００６６】
（４）クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株由来のαＫＧＤＨ欠損株の取得
上記のようにして取得されたクレブシエラ・プランティコーラのｓｕｃＡ遺伝子の一部を有する断片を用い、相同組換えによりクレブシエラ・プランティコーラのαＫＧＤＨ欠損株の取得を行った。
【００６７】
まず、ｐＴ７ＫＰをＢｓｔＥＩＩにて切断し、そこにプラスミドｐＮＥＯ（ファルマシア社より購入）よりＰＣＲによりクローニングすると共に両端にＢｓｔＥＩＩサイトを導入したカナマイシン耐性遺伝子断片を導入し、クレブシエラ・プランティコーラのｓｕｃＡ遺伝子中央部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたプラスミドｐＴ７ＫＰＫｍを得た。
カナマイシン耐性遺伝子のクローニングに使用したプライマーは以下の通りである。
【００６８】
（プライマー３）
５’TACTGGGTCACCTGACAGCTTATCATCGAT３’（配列番号５）
（プライマー４）
５’CGTTCGGTGACCACCAAAGCGGCCATCGTG３’（配列番号６）
【００６９】
次にｐＴ７ＫＰＫｍをＫｐｎＩにて切断し、そこにプラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造（株）より購入）よりＰＣＲによりクローニングすると共に両端にＫｐｎＩサイトを導入したテトラサイクリン耐性遺伝子断片を導入し、クレブシエラ・プランティコーラのｓｕｃＡ遺伝子中央部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたと共にその隣にテトラサイクリン耐性遺伝子が挿入されたプラスミドｐＴ７ＫＰＫｍＴｃを得た。
テトラサイクリン耐性遺伝子のクローニングに使用したプライマーは以下の通りである。
【００７０】
（プライマー５）
５’GGGGTACCCAAATAGGCGTATCACGAG３’（配列番号７）
（プライマー６）
５’GGGGTACCCGCGATGGATATGTTCTG３’（配列番号８）
【００７１】
続いてプラスミドｐＴ７ＫＰＫｍＴｃをＳａｃＩ、ＸｂａＩで消化することによって、クレブシエラ・プランティコーラのｓｕｃＡ遺伝子中央部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたと共にその隣にテトラサイクリン耐性遺伝子を有するＤＮＡ断片を切り出し、これを、ＳａｃＩ、ＸｂａＩで消化したグラム陰性細菌用染色体挿入プラスミドベクターｐＧＰ７０４（Marta Herrero et al., Journal of Bacteriology, 1990, 172, p.6557-6567）に挿入し、プラスミドｐＵＴＯＮＯＴＫを得た。
【００７２】
こうしてできたプラスミドｐＵＴＯＮＯＴＫを用いて、クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株を、エレクトロポレーションによって形質転換し、テトラサイクリン耐性かつカナマイシン耐性を指標として、プラスミドｐＵＴＯＮＯＴＫがｓｕｃＡ遺伝子断片の相同組み換えによって染色体上に挿入された株を取得した。さらにこの株より、テトラサイクリン感受性かつカナマイシン耐性を指標として、染色体上のｓｕｃＡ遺伝子が中央部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたｓｕｃＡ遺伝子に置換されたと考えられるｓｕｃＡ欠損株クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３４１０株を取得した。
【００７３】
以上のようにして得られたＡＪ１３４１０株がαＫＧＤＨ活性を欠損していることを確認するためにReedらの方法（L.J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って酵素活性を測定した。その結果、表２に示すようにＡＪ１３４１０株ではαＫＧＤＨ活性を検出できず、目的通りｓｕｃＡが欠損していることが確かめられた。
【００７４】
【表２】
（５）クレブシエラ・プランティコーラ αＫＧＤＨ欠損株のＬ−グルタミン酸生産性の評価
ＡＪ１３３９９、ＡＪ１３４１０の両株を、グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸塩２００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン２００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−α，ε−ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）２００ｍｇ／Ｌを含有する培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ容フラスコに接種して、３７℃で培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。培養終了後、培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸及びα−ケトグルタール酸（以下「αＫＧ」と略す）を測定した結果を表３に示した。
【００７６】
【表３】
αＫＧＤＨ活性が欠損したＡＪ１３４１０株は、Ｌ−グルタミン酸を１２．８ｇ／Ｌ蓄積した。また同時に１．５ｇ／ＬのαＫＧを蓄積した。
【００７８】
（６）クレブシエラ・プランティコーラαＫＧＤＨ欠損株へのＲＳＦＣＰＧの導入とＬ−グルタミン酸生産性の評価
ＡＪ１３４１０株をＲＳＦＣＰＧを用いて形質転換し、得られたＲＳＦＣＰＧ導入株ＡＪ１３４１０／ＲＳＦＣＰＧを、グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、テトラサイクリン２５ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸塩２００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン２００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−α，ε−ＤＡＰ２００ｍｇ／Ｌを含有する培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ容フラスコに接種して、３７℃で培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。培養終了後、培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸及びαＫＧを測定した結果を表４に示した。
【００７９】
【表４】
ＲＳＦＣＰＧを導入してＣＳ、ＰＥＰＣ、およびＧＤＨ活性を増幅した株では、αＫＧ蓄積量が減少し、Ｌ−グルタミン酸蓄積が更に向上した。
【００８１】
【発明の効果】
本発明の微生物は、高いＬ−グルタミン酸生産能を有することから、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌で従来知られている育種手法等を用いてさらに高い生産能を付与できると考えられ、また培養条件等の検討により、安価で、効率の良いＬ−グルタミン酸製造法の開発につながるものと期待される。
【００８２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰＧの構築を示す図。
【図２】 ｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＧの構築を示す図。
【図３】 ｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣの構築を示す図。
【図４】 広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点とテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドＲＳＦ−Ｔｅｔの構築を示す図。
【図５】 広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点、テトラサイクリン耐性遺伝子、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドＲＳＦＣＰＧの構築を示す図。
Claims (4)
- クレブシエラ属、エルビニア属またはパントエア属に属し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物であって、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼのすべての酵素活性が遺伝子組み換えによって高められた微生物。
- クレブシエラ・プランティコーラまたはパントエア・アグロメランスに属する請求項１記載の微生物。
- さらに、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が低下あるいは欠損した請求項１または２に記載の微生物。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物を液体培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
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