JP5407858B2 - 腸内細菌科の細菌を用いたｌ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、微生物産業、特にアルコールデヒドロゲナーゼ活性が増大した細菌を用いた発酵によって、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−ロイシン等のＬ−アミノ酸を製造する方法に関する。

従来、Ｌ−アミノ酸は、天然資源から得られる微生物又はそれらの突然変異体の株を利用した発酵方法により工業的に生産されている。通常、微生物はＬ−アミノ酸の生産性を高めるように改変される。

組換えＤＮＡによる微生物の形質転換を含む、Ｌ−アミノ酸の生産性を高める多くの技法が報告されている（米国特許第4,278,765号）。生産性を高める他の技法は、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増大させること及び／又は得られるＬ−アミノ酸によるフィードバック阻害に対して標的酵素を脱感作させることを含む（米国特許第4,346,170号、同第5,661,012号及び同第6,040,160号）。

所望の化合物の主な生合成経路を最適化することによって、Ｌ−アミノ酸生産株のさらなる改良を達成することができる。通常、細菌に、例えばグルコースといった多量の糖などの炭素源を補充することによって、これが達成される。ＰＴＳによるグルコース輸送の効率にもかかわらず、高い生産性の株における炭素源を得る方法はまだ十分ではない。Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を増大し、標的Ｌ−アミノ酸のコストを低減させる別の方法は、例えばエタノールといったアルコール等の代替的な炭素源を使用することである。

エシェリヒア・コリのアルコールデヒドロゲナーゼ（エタノールオキシドレダクターゼ、ＡｄｈＥ）は、２つの連続的なアセチル−ＣｏＡのＮＡＤＨ依存的還元反応、及びピルビン酸をアセチル−ＣｏＡ及びギ酸に分解するピルビン酸ギ酸リアーゼの不活性化によって、エタノールの発酵生産を触媒する多機能酵素である。

ＡｄｈＥは、グルコースの存在下で好気増殖中に豊富に合成され（約３×１０⁴コピー／細胞）、長さが約０．２２μｍであり、４０〜６０個のＡｄｈＥ分子を含有するスピロソームと呼ばれるヘリックス構造を形成する（Kessler, D., Herth, W.,及びKnappe, J.,
J. Biol. Chem., 267, 18073-18079（1992））。エシェリヒア・コリ細胞培養が嫌気条件から好気条件に移ると、ａｄｈＥ遺伝子の転写が軽減され、嫌気生活下で見られる範囲の１０％以内で維持される（Chen, Y. M.,及びLin, E. C. C, J. Bacteriol. 173, 8009-8013（1991）；Leonardo, M. R., Cunningham, P. R.,及びClark, D. P., J. Bacteriol.
175, 870-878（1993）；Mikulskis, A., Aristarkhov, A.,及びLin, E. C. C., J. Bacteriol. 179, 7129-7134（1997）；Membrillo-Hernandez, J.,及びLin, E. C. C., J. Bacteriol. 181, 7571-7579（1999））。翻訳も調節され、RNaseIIIを必要とする（Membrillo-Hernandez, J.,及びLin, E. C. C., J. Bacteriol. 181, 7571-7579（1999）；Aristarkhov, A.他, J. Bacteriol. 178, 4327-4332（1996））。ＡｄｈＥは、エシェリヒア・コリ細胞が過酸化水素ストレスを受けるときの主要な標的の１つとして同定されている（Tamarit, J., Cabiscol, E.,及びRos, J., J. Biol. Chem. 273, 3027-3032（1998））。

ＡｄｈＥによって触媒される２つのＮＡＤＨ共役反応が可逆であるにもかかわらず、ａｄｈＥ遺伝子が好気的条件ではより低いレベルで転写され（Chen, Y. M.及びLin, E. C. C., J. Bacteriol. 73, 8009-8013（1991）；Leonardo, M. R., Cunningham, P. R. & Cl
ark, D. P., J. Bacteriol. 175 870-878（1993））、ＡｄｈＥタンパク質の半減期が、金属触媒酸化（ＭＣＯ）によって好気的条件では短くなるために、野生型エシェリヒア・コリは、エタノールを唯一の炭素及びエネルギー源として増殖することはできない。

エタノールを唯一の炭素及びエネルギー源として好気増殖可能なエシェリヒア・コリの突然変異体が単離され解析されている（Ａｌａ２６７Ｔｈｒ置換を有する突然変異体は、エタノールの存在下、２４０分の倍加時間で増殖し、Ａｌａ２６７Ｔｈｒ及びＧｌｕ５６８Ｌｙｓ置換を有する突然変異体の倍加時間は、３７℃で９０分であった）（Membrillo-Hernandez, J. 他, J. Biol. Chem., 275, 33869-33875 (2000）；Holland-Staley, C. A. 他, J. Bacteriol., 182, 6049-6054 (2000)）。明らかに、２つの連続反応が生理学的なものとは反対の方向に触媒される場合、アセチル−ＣｏＡの形成は、野生型ＡｄｈＥにとって律速である。ＡｄｈＥにおけるＡ２６７Ｔ置換によるＶ_maxを改善するための置換は、酵素の熱安定性を低減及びＭＣＯ損傷に対する感受性を増大させる。ＡｄｈＥ（Ａ２６７Ｔ／Ｅ５６８Ｋ）における第２のアミノ酸置換Ｅ５６８Ｋは基質酸化における触媒効率をさらに改善せずに、部分的にタンパク質安定性及びＭＣＯ損傷に対する耐性を回復した。

しかし、これまでに、エタノールを含有する培養培地における発酵によってＬ−アミノ酸の生産を増大するために、天然アルコールデヒドロゲナーゼ、又は好気的条件による不活性化に耐性がある変異型アルコールデヒドロゲナーゼのいずれかの活性が増大している腸内細菌科の細菌を用いた報告はない。

本発明の目的は、Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を高めること、及びこれらの株を使用して非芳香族又は芳香族のＬ−アミノ酸を製造する方法を提供することである。

好気的条件で機能するプロモーターの制御下で、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする野生型又は変異型ａｄｈＥ遺伝子のいずれかを発現することにより、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸、及び／又はＬ−ロイシンなどのＬ−アミノ酸の生産を高めることを見出し、この目的は達成された。

本発明の目的は、
Ａ）アルコールデヒドロゲナーゼを有する腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産菌を、エタノールを含有する培地で培養すること、及び
Ｂ）前記Ｌ−アミノ酸を前記培地から単離すること、
を含むＬ−アミノ酸の製造方法であって、
前記アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、好気的条件で機能する非野生型プロモーターの制御下で発現されることを特徴とする方法を提供することである。

本発明のさらなるの目的は、非野生型プロモーターが、Ｐ_tac、Ｐ_lac、Ｐ_trp、Ｐ_trc、Ｐ_R、及びＰ_Lからなる群から選択されるプロモーターである、前記方法を提供することである。

本発明のさらなるの目的は、アルコールデヒドロゲナーゼが好気的条件による不活性化に耐性である、前記方法を提供することである。

本発明のさらなるの目的は、アルコールデヒドロゲナーゼが、エシェリヒア・コリ、エ
ルビニア・カロトボーラ、サルモネラ・ティフィムリウム、シゲラ・フレキシネリ、エルシニア・ペスティス、パントエア・アナナティス、ラクトバチルス・プランタラム、及びラクトコッカス・ラクチスからなる群から選択される細菌に由来する、前記方法を提供することである。

本発明のさらなるの目的は、アルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、５６８番目のグルタミン酸残基がアスパラギン酸残基以外のアミノ酸残基に置換されていることを含む、前記方法を提供することである。

本発明のさらなるの目的は、アルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、５６８番目のグルタミン酸残基がリジン残基以外のアミノ酸残基に置換されていることを含む、前記方法を提供することである。

本発明のさらなるの目的は、アルコールデヒドロゲナーゼが、エタノールを唯一の炭素源として含有する液体培地で、細菌の増殖を向上させることができる少なくとも１つの付加的な変異を有する、前記方法を提供することである。

本発明のさらなるの目的は、付加的な変異が、
Ａ）配列番号２における５６０番目のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基への置換、
Ｂ）配列番号２における５６６番目のフェニルアラニン残基の他のアミノ酸残基への置換、
Ｃ）配列番号２における、２２番目のグルタミン酸残基、２３６番目のメチオニン残基、４６１番目のチロシン残基、５５４番目のイソロイシン残基、及び７８６番目のアラニン残基それぞれの他のアミノ酸残基への置換、並びに
Ｄ）これらの組合せ、
からなる群から選択される、前記方法を提供することである。

本発明のさらなるの目的は、付加的な変異が、
Ａ）配列番号２における５６０番目のグルタミン酸残基のリジン残基への置換、
Ｂ）配列番号２における５６６番目のフェニルアラニン残基のバリン残基への置換、
Ｃ）配列番号２における、２２番目のグルタミン酸残基のグリシン残基への置換、２３６番目のメチオニン残基のバリン残基への置換、４６１番目のチロシン残基のシステイン残基への置換、５５４番目のイソロイシン残基のセリン残基への置換、及び７８６番目のアラニン残基のバリン残基への置換、並びに
Ｄ）これらの組合せ、
からなる群から選択される、前記方法を提供することである。

本発明のさらなるの目的は、Ｌ−アミノ酸生産菌が、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラシア属、シゲラ属、及びモルガネラ属からなる群から選択される属に属する、前記方法を提供することである。

本発明のさらなるの目的は、Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸、及びＬ−ロイシンからなる群から選択される、前記方法を提供することである。

エシェリヒア・コリの染色体におけるａｄｈＥ遺伝子の上流領域の構造、及びcat遺伝子及びＰ_L-tacプロモーターを含有する組込みＤＮＡ断片の構造を示す図である。 図２Ａ〜図２Ｆは、エシェリヒア・コリ（ADHE_ECOLI、配列番号２）、シゲラ・フレキシネリ（Q83RN2_SHIFL、配列番号５３）、パントエア・アナナティス（ADHE PANAN、配列番号３０）、エルシニア・ペスティス（Q66AM7_YERPS、配列番号５４）、エルビニア・カロトボーラ（Q6D4R4_ERWCT、配列番号５５）、サルモネラ・ティフィムリウム（P74880_SALTY、配列番号５６）、ラクトバチルス・プランタラム（Q88RY9_LACPL、配列番号５７）及びラクトコッカス・ラクチス（O86282_9LACT、配列番号５８）由来のアルコールデヒドロゲナーゼの一次配列のアラインメントを示す図である。ＰＩＲ多重アラインメントプログラム（http://pir.georgetown.edu）を用いて、アラインメントを行った。同一のアミノ酸をアスタリスク（^*）で印を付け、類似のアミノ酸をコロン（：）で印を付ける。 図２Ａ〜図２Ｆは、エシェリヒア・コリ（ADHE_ECOLI、配列番号２）、シゲラ・フレキシネリ（Q83RN2_SHIFL、配列番号５３）、パントエア・アナナティス（ADHE PANAN、配列番号３０）、エルシニア・ペスティス（Q66AM7_YERPS、配列番号５４）、エルビニア・カロトボーラ（Q6D4R4_ERWCT、配列番号５５）、サルモネラ・ティフィムリウム（P74880_SALTY、配列番号５６）、ラクトバチルス・プランタラム（Q88RY9_LACPL、配列番号５７）及びラクトコッカス・ラクチス（O86282_9LACT、配列番号５８）由来のアルコールデヒドロゲナーゼの一次配列のアラインメントを示す図である。ＰＩＲ多重アラインメントプログラム（http://pir.georgetown.edu）を用いて、アラインメントを行った。同一のアミノ酸をアスタリスク（^*）で印を付け、類似のアミノ酸をコロン（：）で印を付ける。 図２Ａ〜図２Ｆは、エシェリヒア・コリ（ADHE_ECOLI、配列番号２）、シゲラ・フレキシネリ（Q83RN2_SHIFL、配列番号５３）、パントエア・アナナティス（ADHE PANAN、配列番号３０）、エルシニア・ペスティス（Q66AM7_YERPS、配列番号５４）、エルビニア・カロトボーラ（Q6D4R4_ERWCT、配列番号５５）、サルモネラ・ティフィムリウム（P74880_SALTY、配列番号５６）、ラクトバチルス・プランタラム（Q88RY9_LACPL、配列番号５７）及びラクトコッカス・ラクチス（O86282_9LACT、配列番号５８）由来のアルコールデヒドロゲナーゼの一次配列のアラインメントを示す図である。ＰＩＲ多重アラインメントプログラム（http://pir.georgetown.edu）を用いて、アラインメントを行った。同一のアミノ酸をアスタリスク（^*）で印を付け、類似のアミノ酸をコロン（：）で印を付ける。 図２Ａ〜図２Ｆは、エシェリヒア・コリ（ADHE_ECOLI、配列番号２）、シゲラ・フレキシネリ（Q83RN2_SHIFL、配列番号５３）、パントエア・アナナティス（ADHE PANAN、配列番号３０）、エルシニア・ペスティス（Q66AM7_YERPS、配列番号５４）、エルビニア・カロトボーラ（Q6D4R4_ERWCT、配列番号５５）、サルモネラ・ティフィムリウム（P74880_SALTY、配列番号５６）、ラクトバチルス・プランタラム（Q88RY9_LACPL、配列番号５７）及びラクトコッカス・ラクチス（O86282_9LACT、配列番号５８）由来のアルコールデヒドロゲナーゼの一次配列のアラインメントを示す図である。ＰＩＲ多重アラインメントプログラム（http://pir.georgetown.edu）を用いて、アラインメントを行った。同一のアミノ酸をアスタリスク（^*）で印を付け、類似のアミノ酸をコロン（：）で印を付ける。 図２Ａ〜図２Ｆは、エシェリヒア・コリ（ADHE_ECOLI、配列番号２）、シゲラ・フレキシネリ（Q83RN2_SHIFL、配列番号５３）、パントエア・アナナティス（ADHE PANAN、配列番号３０）、エルシニア・ペスティス（Q66AM7_YERPS、配列番号５４）、エルビニア・カロトボーラ（Q6D4R4_ERWCT、配列番号５５）、サルモネラ・ティフィムリウム（P74880_SALTY、配列番号５６）、ラクトバチルス・プランタラム（Q88RY9_LACPL、配列番号５７）及びラクトコッカス・ラクチス（O86282_9LACT、配列番号５８）由来のアルコールデヒドロゲナーゼの一次配列のアラインメントを示す図である。ＰＩＲ多重アラインメントプログラム（http://pir.georgetown.edu）を用いて、アラインメントを行った。同一のアミノ酸をアスタリスク（^*）で印を付け、類似のアミノ酸をコロン（：）で印を付ける。 図２Ａ〜図２Ｆは、エシェリヒア・コリ（ADHE_ECOLI、配列番号２）、シゲラ・フレキシネリ（Q83RN2_SHIFL、配列番号５３）、パントエア・アナナティス（ADHE PANAN、配列番号３０）、エルシニア・ペスティス（Q66AM7_YERPS、配列番号５４）、エルビニア・カロトボーラ（Q6D4R4_ERWCT、配列番号５５）、サルモネラ・ティフィムリウム（P74880_SALTY、配列番号５６）、ラクトバチルス・プランタラム（Q88RY9_LACPL、配列番号５７）及びラクトコッカス・ラクチス（O86282_9LACT、配列番号５８）由来のアルコールデヒドロゲナーゼの一次配列のアラインメントを示す図である。ＰＩＲ多重アラインメントプログラム（http://pir.georgetown.edu）を用いて、アラインメントを行った。同一のアミノ酸をアスタリスク（^*）で印を付け、類似のアミノ酸をコロン（：）で印を付ける。 唯一の炭素源としてエタノール（２％又は３％）を含有する最小Ｍ９培地で増殖した改変株の増殖曲線を示す図である。 グルコース（０．１重量％）とエタノール（０．１重量％）との混合物を含有する最小Ｍ９培地で増殖した改変株の増殖曲線を示す図である。 野生型プロモーター、又は唯一の炭素源としてエタノール（２％又は３％）を含有する最小Ｍ９培地で増殖したＰ_L-tacプロモーターの制御下での変異型ａｄｈＥ^*遺伝子を有する株の増殖曲線の比較を示す図である。

アルコールデヒドロゲナーゼは、Ｎ末端側でアセトアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を、Ｃ末端側で鉄依存性アルコールデヒドロゲナーゼ活性を、さらに、ピルビン酸ギ酸リアーゼ不活性化活性を有するＦｅ²⁺依存性多機能タンパク質である。同義語としては、B1241、AdhC、及びAnaが挙げられる。好気的条件では、金属触媒酸化により、好気的代謝中に、活性ＡｄｈＥタンパク質の半減期が短くなる。

本発明において、「アルコールデヒドロゲナーゼ活性」という語句は、アルコールからアルデヒド又はケトンへのＮＡＤ依存性酸化反応を触媒する活性を意味する。アルコールデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.1）は、エタノール、ｎ−プロパノール、及びｎ−ブタノールに対して良好に働く。アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、例えばMembrillo-Hernandez, J. 他 （J. Biol. Chem., 275, 33869-33875 (2000)） によって記載された方法で検出及び測定することができる。

アルコールデヒドロゲナーゼは、ａｄｈＥ遺伝子によってコードされ、エシェリヒア属、エルビニア属、クレブシエラ属、サルモネラ属、シゲラ属、エルシニア属、パントエア属、ラクトバチルス属、及びラクトコッカス属に属する細菌に由来する任意のａｄｈＥ遺伝子が、本発明におけるアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子として使用され得る。ａｄｈＥ遺伝子源の具体例としては、エシェリヒア・コリ、エルビニア・カロトボーラ、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・ティフィムリウム、シゲラ・フレキシネリ、エルシニア・シュードツベルクローシス、パントエア・アナナティス、ラクトバチルス・プランタラム及びラクトコッカス・ラクチス等の細菌株が挙げられる。エシェリヒア・コリ由来のアルコールデヒドロゲナーゼをコードする野生型ａｄｈＥ遺伝子が明らかにされている（GenBankアクセッション番号NC_000913.2、gi:49175990の配列における塩基番号1294669〜1297344に相補的な塩基配列）。ａｄｈＥ遺伝子は、エシェリヒア・コリＫ−１２の染色体上のychGのORFとychEのORFとの間に位置している。アルコールデヒドロゲナーゼをコードする他のａｄｈＥ遺伝子も明らかにされている：エルビニア・カロトボーラ由来のａｄｈＥ遺伝子（GenBankアクセッション番号NC_004547.2;gi:50121254の配列における塩基番号2634501〜2637176）；サルモネラ・エンテリカ由来のａｄｈＥ遺伝子（GenBankアクセッション番号NC_004631.1;gi:29142095の配列における塩基番号1718612〜1721290）；サルモネラ・ティフィムリウム由来のａｄｈＥ遺伝子（GenBankアクセッション番号U68173.1;gi:1519723の配列における塩基番号1〜2637）；シゲラ・フレキシネリ由来のａｄｈＥ遺伝子（GenBankアクセッション番号NC_004741.1;gi:30062760の配列における塩基番号1290
816〜1293491に相補的な塩基配列）；エルシニア・シュードツベルクローシス由来のａｄｈＥ遺伝子（GenBankアクセッション番号NC_006155.1;gi:51596429の配列における塩基番号2478099〜2480774に相補的な塩基配列）、パントエア・アナナティス由来のａｄｈＥ遺伝子（配列番号２９）、ラクトバチルス・プランタラム由来のａｄｈＥ遺伝子（UniProtKBエントリー：Q88RY9_LACPL）、ラクトコッカス・ラクチスMG1363由来のａｄｈＥ遺伝子（EMBLアクセッション番号AJ001007）等が挙げられる（図２を参照されたい）。エシェリヒア・コリ由来のａｄｈＥ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１で表される。このａｄｈＥ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号２で表される。

したがって、エシェリヒア・コリ染色体由来の遺伝子の既知のヌクレオチド配列に基づき調製したプライマーを用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T.J.他, Trends Genet., 5, 185（1989）を参照のこと）によって、ａｄｈＥ遺伝子を得ることができる。他の微生物由来のアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子も同様の方法で得ることができる。

エシェリヒア・コリ由来のａｄｈＥ遺伝子を以下のタンパク質（Ａ）又はタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡにより例示する：
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の変異体タンパク質であって、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。

パントエア・アナナティス由来のａｄｈＥ遺伝子を以下のタンパク質（Ａ）又はタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡにより例示する：
（Ａ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列の変異体タンパク質であって、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。

シゲラ・フレキシネリ由来のａｄｈＥ遺伝子を以下のタンパク質（Ａ）又はタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡにより例示する：
（Ａ）配列番号５３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号５３で示されるアミノ酸配列の変異体タンパク質であって、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。

エルシニア・ペスティス由来のａｄｈＥ遺伝子を以下のタンパク質（Ａ）又はタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡにより例示する：
（Ａ）配列番号５４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号５４で示されるアミノ酸配列の変異体タンパク質であって、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。

エルビニア・カロトボーラ由来のａｄｈＥ遺伝子を以下のタンパク質（Ａ）又はタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡにより例示する：
（Ａ）配列番号５５で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号５５で示されるアミノ酸配列の変異体タンパク質であって、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。

サルモネラ・ティフィムリウム由来のａｄｈＥ遺伝子を以下のタンパク質（Ａ）又はタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡにより例示する：
（Ａ）配列番号５６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号５６で示されるアミノ酸配列の変異体タンパク質であって、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。

ラクトバチルス・プランタラム由来のａｄｈＥ遺伝子を以下のタンパク質（Ａ）又はタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡにより例示する：
（Ａ）配列番号５７で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号５７で示されるアミノ酸配列の変異体タンパク質であって、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。

ラクトコッカス・ラクチス由来のａｄｈＥ遺伝子を以下のタンパク質（Ａ）又はタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡにより例示する：
（Ａ）配列番号５８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号５８で示されるアミノ酸配列の変異体タンパク質であって、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。

本発明で使用される「変異体タンパク質」という語句は、配列の変化を有するタンパク質であって、これらの変化がアミノ酸の欠失、挿入、付加、又は置換があるにもかかわらず、依然として有用なレベルでアルコールデヒドロゲナーゼ活性を維持するタンパク質を意味する。変異体タンパク質の変化の数は、タンパク質の三次元構造におけるアミノ酸残基の位置又は種類によって異なる。変化の数は、タンパク質（Ａ）では、１〜３０、好ましくは１〜１５、及びより好ましくは１〜５である。変異体のこれらの変化は、タンパク質の機能を保護する保存的突然変異である。言い換えると、タンパク質の機能に必須ではないタンパク質の領域でこれらの変異体の変化が起こり得る。これは、幾つかのアミノ酸が互いに高い相同性を有するため、三次元構造又は活性がこのような変化による影響を受けないからである。したがって、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を維持している限り、変異体タンパク質（Ｂ）は、配列番号２で示されるアルコールデヒドロゲナーゼの全アミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するものである。

既知の方法、例えば、３つのパラメーター：スコア、同一性、及び類似性を算出する、コンピュータープログラムBLAST2.0を使用して、２つのアミノ酸配列間の相同性を計算することができる。

１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加は、活性が維持されるような保存的突然変異であるべきである。代表的な保存的突然変異は保存的置換である。保存的置換の例としては、ＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇのＧｌｎ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｕ、又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕのＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙのＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅのＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕのＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔのＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅのＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒのＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐのＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＨｉｓ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐへの置換、及びＶａｌのＭｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへの置換が挙げられる。

エシェリヒア・コリ、シゲラ・フレキシネリ、パントエア・アナナティス、エルシニア・ペスティス、エルビニア・カロトボーラ、サルモネラ・ティフィムリウム（グラム陰性細菌）、及びラクトバチルス・プランタラム、ラクトコッカス・ラクチス（グラム陽性細菌）由来のアルコールデヒドロゲナーゼの一次配列を比較するデータは、これらのタンパ
ク質間の高いレベルの相同性を示す（図２を参照されたい）。この点から、全ての上述のタンパク質で同一性がある（アスタリスクで示される）アミノ酸残基の置換又は欠失が、これらの機能に重要であると考えられる。タンパク質の活性を低下させずに、類似の（コロンで示される）アミノ酸残基を類似のアミノ酸残基に置換することが可能である。しかし、他の非保存的アミノ酸残基の改変では、アルコールデヒドロゲナーゼ活性は変化しないであろう。

上記のアルコールデヒドロゲナーゼと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、特定部位での１つ又は複数のアミノ酸残基に関与するヌクレオチド配列が、欠失、置換、挿入又は付加を包含するように、部位特異的突然変異誘発法を用いて、アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を改変することにより得ることができる。上記のような改変ＤＮＡは、従来から知られている突然変異処理により得ることができる。このような処理としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヒドロキシルアミン処理、或いはＵＶ照射又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン若しくは亜硝酸等の試薬による上記ＤＮＡを含有する細菌の処理が挙げられる。

アルコールデヒドロゲナーゼと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、適切な細胞において上記のような変異を有するＤＮＡを発現させ、任意の発現産物の活性を試験することにより得ることができる。アルコールデヒドロゲナーゼと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡはまた、例えば、ストリンジェントな条件で配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含有するヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることができ、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得ることができる。本明細書中で言及される「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、且つ非特異的ハイブリッドが形成されない条件である。例えば、ストリンジェントな条件は、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズすることが可能であるが、上記未満の同一性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズすることができない条件により例示することが出来る。あるいは、サザンハイブリダイゼーションでの通常の洗浄条件に相当する塩濃度、すなわち、６０℃で１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで、ＤＮＡがハイブリダイズすることができる条件により、ストリンジェントな条件が例示することができる。洗浄時間は、ブロット法に使用される膜のタイプによって異なり、これは一般的には製造業者によって推奨されるものである。例えば、ストリンジェントな条件でのＨｙｂｏｎｄ（商標）Ｎ＋ナイロン膜（Amersham社）の推奨される洗浄時間は１５分である。好ましくは、洗浄は２、３回行われる。

配列番号１のヌクレオチド配列の部分配列をプローブとして使用することもできる。プローブは、配列番号１のヌクレオチド配列に基づいたプライマー、及び鋳型として配列番号１のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ断片を用いるＰＣＲにより調製することができる。約３００ｂｐの長さを有するＤＮＡ断片をプローブとして使用する場合、洗浄するためのハイブリダイゼーション条件は、例えば５０℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳである。

上記のようなヌクレオチドの置換、欠失、挿入、又は付加は、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼを含有する細菌の種又は属の多様性に起因して自然に発生する変異（突然変異体又は変異体）も含む。

野生型アルコールデヒドロゲナーゼは金属触媒酸化を受けることがある。このような野
生型アルコールデヒドロゲナーゼを使用することができるが、好気条件での不活性化に耐性がある変異型アルコールデヒドロゲナーゼが本発明においては好ましい。「好気条件での不活性化に耐性がある変異型アルコールデヒドロゲナーゼ」という語句は、変異型アルコールデヒドロゲナーゼが好気条件でその活性を維持するか、又は野生型アルコールデヒドロゲナーゼに比べて、活性がごく少量しか低減しないことを意味する。

エシェリヒア・コリのａｄｈＥ遺伝子の場合、野生型アルコールデヒドロゲナーゼは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。好気条件下での不活性化に耐性があるタンパク質をもたらす、配列番号２のアルコールデヒドロゲナーゼにおける変異の例は、５６８番目のグルタミン酸残基のリジン残基への置換である。しかし、例えば配列番号２の５６８番目での変異型のａｄｈＥ遺伝子への導入によって、炭素源としてエタノールを含有する液体培地中で増殖が遅延する可能性があり、このような場合、変異型アルコールデヒドロゲナーゼが、エタノールを唯一の炭素源として含有する液体培地中で細菌の増殖を向上させることができる少なくとも１つの付加的な変異を有することが好ましい。例えば、配列番号２のアルコールデヒドロゲナーゼにおける５６８番目のグルタミン酸残基が他のアミノ酸残基に置換する場合、
Ａ）配列番号２における５６０番目のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基、例えばリジン残基への置換、
Ｂ）配列番号２における５６６番目のフェニルアラニン残基の他のアミノ酸残基、例えばバリン残基への置換、
Ｃ）配列番号２における、２２番目のグルタミン酸残基、２３６番目のメチオニン残基、４６１番目のチロシン残基、５５４番目のイソロイシン残基、及び７８６番目のアラニン残基の他のアミノ酸残基、例えばそれぞれ、グリシン残基、バリン残基、システイン残基、セリン残基及びバリン残基への置換、並びに
Ｄ）これらの組合せ、
からなる群から選択される付加的な変異を導入することによってエシェリヒア・コリの増殖が向上する。

配列の位置番号に対する言及、例えば「２２番目、２３６番目、５５４番目、５６０番目、５６６番目、５６８番目及び７８６番目のアミノ酸残基」という語句は、エシェリヒア・コリ由来の野生型ＡｄｈＥのアミノ酸配列におけるこれらの残基の位置を表す。しかし、アミノ酸残基の位置は変わる可能性がある。例えば、１アミノ酸残基がＮ末端部位に挿入される場合、本来２２番目に位置するアミノ酸残基が２３番目になる。このような場合、元の２２番目のアミノ酸残基が、本発明における２２番目のアミノ酸残基である。

変異型ＡｄｈＥは、ＡｄｈＥ活性が喪失又は低減しなければ、上記のＡ）〜Ｃ）で特定された位置以外の１つ又は複数の位置での１つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を含んでもよい。

本発明による変異型ＡｄｈＥ及び変異型ａｄｈＥ遺伝子は、例えば、遺伝子のヌクレオチド配列に基づき調製したプライマーを利用する、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T.J. 他, Trends Genet., 5, 185 (1989））のような通常の方法を用いた部位特異的突然変異誘発法によって、野生型のａｄｈＥ遺伝子から得ることができる。

野生型のエシェリヒア・コリにおけるａｄｈＥ遺伝子の転写は、主として還元されたＮＡＤＨレベルの上昇に応じて、嫌気条件でのみ誘導される（Leonardo, M. R., Cunningham, P. R. & Clark, D. P., J. Bacteriol., 175 870-878 (1993））。

本発明において、非野生型プロモーター、すなわち野生型株においてａｄｈＥ遺伝子の発現を制御しないプロモーターによって、ａｄｈＥ遺伝子の発現が制御されるように、Ｌ
−アミノ酸を生産するのに用いられる細菌株が改変される。このような改変は、ａｄｈＥ遺伝子が非野生型プロモーターと発現可能に連結するように、染色体上のａｄｈＥ遺伝子の野生型プロモーターを好気条件で機能する非野生型プロモーターに置換することによって達成できる。好気条件で機能する非野生型プロモーターとして、好気条件で或る特定レベルを超えてａｄｈＥ遺伝子を発現することができる任意のプロモーターを用いることができる。本発明におけるＡｄｈＥタンパク質のレベルに関して、Clark及びCronan（J. Bacteriol., 141, 177-183 (1980））の方法によって測定された無細胞抽出物におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１．５ユニット以上、好ましくは５ユニット以上、及びより好ましくは１０ユニット以上である必要がある。好気条件は、振盪、通気及び撹拌等の方法によって酸素が供給される細菌の培養に通常用いられるものであり得る。具体的に、好気条件で遺伝子を発現することが知られている任意のプロモーターを用いることができる。例えば、解糖、ペントースリン酸経路、ＴＣＡサイクル、アミノ酸生合成経路等に関与する遺伝子のプロモーターを用いることができる。さらに、λファージのＰ_tacプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｐ_Rプロモーター、又はＰ_Lプロモーターは全て、好気条件で機能する強いプロモーターであることが知られており、これらを用いることが好ましい。

非野生型プロモーターの使用は、遺伝子の多コピー化と組み合わせることができる。例えば、非野生型プロモーターと発現可能に連結されたａｄｈＥ遺伝子を、腸内細菌科の細菌で機能することができるベクターに挿入し、該ベクターを細菌に導入することによって、細胞内の遺伝子のコピー数が増加する。好ましくは、低コピーベクターが用いられる。低コピーベクターの例としては、ｐＳＣ１０１、ｐＭＷ１１８、及びｐＭＷ１１９等が挙げられるが、これらに限定されない。「低コピーベクター」という用語はベクターに用いられ、そのコピー数は、１つの細胞当たり最大５コピーである。例えば、相同組換え及びＭｕ組込み等で複数コピーの遺伝子を細菌の染色体ＤＮＡに導入することによっても、ａｄｈＥ遺伝子のコピー数の増加を達成することができる。染色体ＤＮＡ上に標的として複数コピーで存在する配列を用いて、相同組換えを行うことができる。染色体ＤＮＡ上に複数コピーを有する配列としては、反復ＤＮＡ、又は転移因子の末端に存在するインバーティッドリピートが挙げられるが、これらに限定されない。また、米国特許第5,595,889号に開示されたように、ａｄｈＥ遺伝子をトランスポゾンに組込み、トランスポゾンを転移させて、複数コピーの遺伝子を染色体ＤＮＡに導入することも可能である。これらの例で、ａｄｈＥ遺伝子を好気条件で機能するプロモーターの制御下に置くことができる。代替的に、例えば、プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増大させるように変異をプロモーターに導入することによって、プロモーターの効果を高めることができる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドン、特に開始コドンのすぐ上流の配列との間のスペーサーにおける幾つかのヌクレオチドの置換は、ｍＲＮＡの翻訳能に顕著に影響を及ぼすことが知られている。例えば、開始コドンの上流の３つのヌクレオチドの性質に依存して、発現レベルの２０倍範囲があることが見出された（Gold 他, Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981、Hui 他, EMBO J., 3, 623-629, 1984）。これまでに、ｒｈｔＡ２３変異が、ＡＴＧ開始コドンに対して−１位置でのＧのＡへの置換であることが示されてきた（ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457）。したがって、ｒｈｔＡ２３変異は、ｒｈｔＡ遺伝子発現を高め、結果として、スレオニン、ホモセリン及び細胞から輸送される幾つかの他の物質に対する耐性を増大させることが示唆される。

さらに、細菌染色体上のａｄｈＥ遺伝子のプロモーター領域にヌクレオチド置換を導入することも可能であり、その結果、プロモーター機能が強くなる。発現制御配列の改変は、例えば、国際公開特許第WO00/18935号及び特開平1-215280号に開示されるように温度感
受性プラスミドを使用した遺伝子置換と同じように行うことができる。

本発明において「Ｌ−アミノ酸生産菌」とは、細菌を培地で培養したときに、培地中へのＬ−アミノ酸の生産及び分泌能がある細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸生産能は、育種によって付与するか又は高めることができる。本明細書中で使用される「Ｌ−アミノ酸生産菌」という用語は、培養培地で、例えばエシェリヒア・コリＫ１２等のエシェリヒア・コリのような細菌の野生型株又は親株よりも大量にＬ−アミノ酸を生産し且つ蓄積することのできる細菌も意味し、好ましくは細菌が培地中に０．５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の標的Ｌ−アミノ酸を蓄積させることができることを意味する。「Ｌ−アミノ酸」という用語には、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンが含まれる。Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−ロイシンが特に好ましい。

腸内細菌科としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、フォトラブズス属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、モルガネラ属、及びエルシニア属等に属する細菌が挙げられる。具体的には、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で使用される分類法に従って腸内細菌科に分類されるものを使用することができる。エシェリヒア属又はパントエア属に属する細菌が好ましい。「エシェリヒア属に属する細菌」という語句は、この細菌が、微生物学の分野の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属に分類されることを意味する。本発明で使用される場合のエシェリヒア属に属する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ（E. coli）が挙げられるが、これに限定されない。

本発明で使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に限定されないが、例えば、Neidhardt, F.C.他（Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American
Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1）により記載される細菌が本発明に包含される。

パントエア属に属する細菌は、微生物学の分野の当業者に既知の分類に従ってパントエア属に分類される細菌であることを意味する。エンテロバクター・アグロメランスの数種は最近、１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティ等に再分類されている（Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993））。

本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸の生産能を有し、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、好気条件で機能するプロモーターの制御下で発現するように改変された腸内細菌科の株を包含する。さらに、本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸の生産能を有し、アルコールデヒドロゲナーゼの野生型の活性を有しないが、アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片で形質転換された腸内細菌科の株を包含する。

本発明において、好気条件で機能するプロモーターの制御下でアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が発現した結果として、炭素源としてエタノールを含有する培養培地で、例えばＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸、又はＬ−ロイシンといったＬ−アミノ酸の蓄積量が有意に増大し得る。

Ｌ−アミノ酸生産菌
本発明の変異型アルコールデヒドロゲナーゼを有するように改変された本発明の細菌としては、芳香族Ｌ−アミノ酸または非芳香族Ｌ−アミノ酸を生産できる細菌を使用できる。

本発明の細菌は、もともとＬ−アミノ酸生産能を有している細菌に本発明の変異型アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入することにより得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、既に本発明の変異型アルコールデヒドロゲナーゼを有する細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与することによっても得ることができる。

Ｌ−スレオニン生産菌
本発明のＬ−スレオニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

TDH-6株はｔｈｒＣ遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのｉｌｖＡ遺伝子がリーキー変異を有する。この株はまた、ｒｈｔＡ遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異ｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡ^*BCオペロンを挿入して得られたプラスミドpVIC40を保持する。この変異ｔｈｒＡ遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-3996で寄託されている。

E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、本発明のＬ−スレオニン生産菌を誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、当該株が保持しているプラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)に、受託番号VKPM B-5318で寄託されている。

好ましくは、本発明の細菌は、さらに、下記の遺伝子の１種以上の発現が増大するように改変されたものである。
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロ
ゲナーゼＩをコードする変異ｔｈｒＡ遺伝子
ホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子
スレオニンシンターゼをコードするｔｈｒＣ遺伝子
推定トランスメンブランタンパク質をコードするｒｈｔＡ遺伝子
アスパルテート−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｓｄ遺伝子
アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコ
ードするａｓｐＣ遺伝子

E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank アクセッション番号 NC_000913.2, gi: 49175990)。ｔｈｒＡ遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とｔｈｒＢ遺伝子との間に位置する。E. coliのホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank アクセッション番号 NC_000913.2, gi: 49175990)。ｔｈｒＢ遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、ｔｈｒＡ遺伝子とｔｈｒＣ遺伝子との間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするｔｈｒＣ遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020,
GenBank アクセッション番号 NC_000913.2, gi: 49175990)。ｔｈｒＣ遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、ｔｈｒＢ遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。

スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異ｔｈｒＡ遺伝子、ならびに、ｔｈｒＢ遺伝子及びｔｈｒＣ遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。

ｒｈｔＡ遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQオペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。ｒｈｔＡ遺伝子は、ORF1(ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651, GenBank アクセッション番号 AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現する配列は、ｒｈｔＡ遺伝子と呼ばれている（rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性）。また、ｒｈｔＡ２３変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。以下、ｒｈｔＡ２３変異をｒｈｔＡ^*と記載する。

E. coliのａｓｄ遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank アクセッション番号 NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCR(ポリメラーゼ連鎖反応：White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)により得ることができる。他の微生物のａｓｄ遺伝子も同様に得ることができる。

また、E. coliのａｓｐＣ遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank アクセッション番号 NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のａｓｐＣ遺伝子も同様に得ることができる。

Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Es
cherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。

WC196株は、Escherichia coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、Escherichia coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。

本発明のＬ−リジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大している株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子（ｄａｐＡ）、アスパルトキナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子（ｄａｐＢ）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｌｙｓＡ）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｄｈ） (米国特許第6,040,160号)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｓｄ）及びアスルターゼ遺伝子（ａｓｐＡ） (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子（ｃｙｏ） (EP 1170376
A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｐｎｔＡＢ） (米国特許第5,830,716号)、ｙｂｊE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。

本発明のＬ−リジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。

Ｌ−リジン生産株の例としては、E. coli WC196ΔcadAΔldc/pCABD2 （WO2006/078039）が挙げられる。この株は、破壊されたcadA遺伝子及びリジンデカルボキシラーゼをコードするldcC遺伝子を有するWC196株に、米国特許第6,040,160に開示されるプラスミドpCABD2を導入して得ることができる。プラスミドpCABD2は、リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードするE. coliのdapA遺伝子、リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するアスパルトキナーゼＩＩＩをコードするE. coliのlysC遺伝子、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするE.coliのdapB遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするコリネバクテリウム・グルタミカムのddh遺伝子を含む。

Ｌ−システイン生産菌
本発明のＬ−システイン生産菌を誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする複数種のcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する
株が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｌ−ロイシン生産菌
本発明のＬ−ロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、５，５，５−トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。

Ｌ−ヒスチジン生産菌
本発明のＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116−B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ＡＴＰフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｉｓＧ）、フォスフォリボシルＡＭＰサイクロヒドロラーゼ遺伝子（ｈｉｓＩ）、フォスフォリボシル−ＡＴＰピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子（ｈｉｓＩＥ）、フォスフォリボシルフォルミミノ−５−アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子（ｈｉｓＡ）、アミドトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｉｓＨ）、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｉｓＣ）、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子（ｈｉｓＢ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｉｓＤ）などが挙げられる。

ｈｉｓＧ及びｈｉｓＢＨＡＦＩによりコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、これらの遺伝子によりコードされる酵素にフィードバック阻害に対する耐性を付与するような変異を、これらの遺伝子のいずれかに導入することにより効率的に増大させることができる。 (ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。

Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子であるｒｈｔを導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、ＤＬ−１，２，４−トリアゾール−３−アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。

Ｌ−グルタミン酸生産菌
本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、ｔｈｒＣ遺伝子及びｉｌｖＡ遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。ｔｈｒＣ遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC⁺ (VKPM B-8961) が得られた。

本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性欠損株、又はＬ−グルタミン酸生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大された株が挙げられるが、これらに限定されない。このような遺伝子の例としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｎＡ）、グルタミン酸シンターゼ（ｇｌｔＡＢ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄＡ）、アコニット酸ヒドラターゼ（ａｃｎＡ、ａｃｎＢ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ａｃｅＥＦ、ｌｐｄＡ）、ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡ，ｐｙｋＦ）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ｐｐｓＡ）、エノラーゼ（ｅｎｏ）、ホスホグリセルムターゼ（ｐｇｍＡ、ｐｇｍＩ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉＡ）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂｐ）、ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ）、グルコースリン酸イソメラーゼ（ｐｇｉ）などが挙げられる。

クエン酸シンターゼ遺伝子及び／又はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現が減少するように、及び／又はα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されているものが挙げられる。

本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、イソクエン酸リアーゼ（ａｃｅＡ）、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ｓｕｃＡ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ｉｌｖＧ）、アセト乳酸シンターゼ（ｉｌｖＩ）、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｆｌ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）、及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ｇａｄＡＢ）などが挙げられる。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及びそれらの入手方法は米国特許第5,378,616号及び第5,573,945号に記載されている。特に、これらの株としては、以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリW3110sucA::Km^R
エシェリヒア・コリAJ12624 (FERM BP-3853)
エシェリヒア・コリAJ12628 (FERM BP-3854)
エシェリヒア・コリAJ12949 (FERM BP-4881)
エシェリヒア・コリW3110sucA::Km^R は、エシェリヒア・コリW3110のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、ｓｕｃＡ遺伝子という）を破壊することにより得られた株である。この株は、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を完全に欠損している。

Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属しアスパラギン酸の代謝拮抗物質に対する耐性を有する細菌が挙げられる。これらの株はα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性も欠損していることがあり、例えばE. coli AJ13199（FERM BP-5807）（米国特許5,908,768）、Ｌ−グルタミン酸の分解能が低下したFERM P-12379（米国特許第5,393,671号）、AJ13138（FERM BP-5565）（米国特許第6,110,714号）などが挙げられる。

Ｌ−グルタミン酸生産菌の例としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損しているか、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下したパントエア属に属する変異株が挙げられ、上述した方法により入手できる。このような株としては、パントエア・アナナティス AJ13356株（米国特許第6,331,419号）が挙げられる。パントエア・アナナティス AJ13356株は、１９９８年２月１９日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号FERM P-16645として寄託され、平成１９９９年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6615が付与されている。パントエア・アナナティス AJ13356株は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）が破壊された結果α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損している。上記株は、エンテロバクター・アグロメランス AJ13356として単離及び寄託された際にエンテロバクター・アグロメランスと同定された。しかしながら、最近、16S rRNAの塩基配列などに基づいてパントエア・アナナティスと再分類された。AJ13356は前記寄託機関にエンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、本願明細書においてはパントエア・アナナティスと記載する。

Ｌ−フェニルアラニン生産菌
本発明のＬ−フェニルアラニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089
(ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。

Ｌ−トリプトファン生産菌
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、ホスホエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667
A1)。

本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。

本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソクエン酸リアーゼ-リンゴ酸シンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。

Ｌ−プロリン生産菌
本発明のＬ−プロリン生産菌を誘導するための親株の例としては、ｉｌｖＡ遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタミン酸キナーゼをコードするｐｒｏＢ遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現を増大させることにより改良してもよい。このような遺伝子としては、ｂ２６８２遺伝子及びｂ２６８３遺伝子(ｙｇａＺＨ遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。

Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。

Ｌ−アルギニン生産菌
本発明のＬ−アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のＬ−アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような
遺伝子の例としては、Ｎ−アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。

Ｌ−バリン生産菌
本発明のＬ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのｉｌｖＡ遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。

本発明のＬ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、アミノアシルｔ−ＲＮＡシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H⁺-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。

Ｌ−イソロイシン生産菌
本発明のＬ−イソロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにＤＬ−エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株（特開平5-130882号）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。

本発明のＬ−アミノ酸の生産法は、本発明の細菌を培地において培養する工程、Ｌ−アミノ酸を培地に蓄積させる工程、Ｌ−アミノ酸を培地から回収する工程を含む。また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地において培養する工程、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸またはＬ−ロイシンを培地に蓄積させる工程、及びＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸またはＬ−ロイシンを培地から回収する工程を含む、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸またはＬ−ロイシンの生産法を含む。

本発明において、Ｌ−アミノ酸の培養、回収及び培地からの精製等は、細菌を用いてＬ−アミノ酸を生産する従来の発酵法に従って行うことができる。

培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じて細菌の生育に必要な適量の栄養素を含有する通常の培地であれば、合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。炭素源としては、グルコース及びスクロース等の炭化水素、種々の有機酸
及びエタノール等のアルコールが挙げられる。本発明においては、エタノールを単独あるいはグルコース及びスクロース等の他の炭化水素と併せて用いることができる。窒素源としては、アンモニア及び硫酸アンモニウム等の種々のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆炭化水素及び消化発酵微生物等の天然窒素源を用いることができる。無機塩類としては、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等を用いることができる。ビタミンとしては、チアミン、酵母抽出液等を用いることができる。必要に応じて更なる栄養素を加えることもできる。たとえば、細菌の生育のためにＬ−アミノ酸が必要な時は（Ｌ−アミノ酸要求性）、十分な量のＬ−アミノ酸を培養培地に添加してもよい。

培養は、温度２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃で通気をし、培地を攪拌混合するといった通気条件下において行うのが好ましい。培地のｐＨは通常５〜７、好ましくは６．５〜７．２である。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基及びバッファーによって調整することができる。通常、１−５日間の培養によって、培養液中に目的Ｌ−アミノ酸が蓄積される。

培養終了後、遠心分離または膜ろ過により培養液から細胞等の固形物を除去し、目的Ｌ−アミノ酸を回収し、イオン交換、濃縮及び／または結晶法により精製することができる。

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、以下でより具体的に説明される。

実施例１
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*の調製
cat遺伝子を用いて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ７００９２６）でスレオニンデヒドロゲナーゼをコードする野生型tdh遺伝子の不活性化を行った後に、高濃度のスレオニン（４０ｍｇ／ｍｌ超）及びホモセリン（５ｍｇ／ｍｌ超）に対する耐性を与えるｒｈｔＡ２３変異（ｒｈｔＡ^*）を導入することによって、Ｌ−スレオニン生産エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*（ｐＶＩＣ４０）株を構築した。それから、得られた株をエシェリヒア・コリＶＫＰＭ Ｂ−３９９６由来のプラスミドｐＶＩＣ４０で形質転換した。プラスミドｐＶＩＣ４０は、米国特許第５，７０５，３７１号に詳細に記載されている。

野生型tdh遺伝子を置換するために、“Red-mediated integration”及び／又は“Red-driven integration”とも呼ばれるDatsenko K.A.及びWanner B.L.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645）で記載された方法によって、野生型遺伝子の代わりに、cat遺伝子でコードされるクロラムフェニコール耐性マーカー（Ｃｍ^R）を保有するＤＮＡ断片をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５の染色体に組込んだ。温度感受性レプリコンを有する組換えプラスミドｐＫＤ４６（Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645）を、Red-mediated recombinationシステムに関与するλファージ由来の遺伝子のドナーとして用いた。組換えｐＫＤ４６を含有するエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３は、エシェリヒア・コリ遺伝子ストックセンター（Genetic Stock Center）（米国ニューヘーブン、エール大学）から得ることができ、そのアクセッション番号はＣＧＳＣ７６３０である。

鋳型として市販のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（GenBank/EMBLアクセッション番号X06403、「Fermentas」、リトアニア）、並びにプライマーＰ１（配列番号３）及びプライマーＰ２（配列番号４）を用いるＰＣＲによって、cat遺伝子でコードされるＣｍ^Rマーカーを含有するＤＮＡ断片を得た。プライマーＰ１は、細菌染色体へのさらなる組込みのため
に導入されたtdh遺伝子の５’領域と相同性がある３５ヌクレオチドを含有する。プライマーＰ２は、細菌染色体へのさらなる組込みのために導入されたtdh遺伝子の３’領域と相同性がある３２ヌクレオチドを含有する。

「Gene Amp PCR System 2700」増幅装置（Applied Biosystems）を利用してＰＣＲを行った。反応混合物（全量５０μｌ）を、２５ｍＭのＭｇＣｌ₂（「Fermentas」、リトアニア）、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、それぞれ２５ｐｍｏｌの設計されたプライマー、及び１ＵのＴａｑポリメラーゼ（「Fermentas」、リトアニア）、および１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌから構成した。ＰＣＲ増幅のために、プラスミドＤＮＡ約５ｎｇを鋳型ＤＮＡとして反応混合物中に添加した。温度プロファイルは、最初のＤＮＡ変性（９５℃で５分間）；その後２５サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒間）、伸長（７２℃で４０秒間）；並びに最後の伸長（７２℃で５分間）であった。次に、増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、「GenElute Spin Columns」（Sigma、米国）を用いて抽出し、エタノールで沈澱させた。

得られたＤＮＡ断片は、エレクトロポレーション及びエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６の細菌染色体へのRed-mediated integrationに用いた。

アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した液体ＬＢ培地中で、３０℃で一晩、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６細胞を増殖させた後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びＬ−アラビノース（１０ｍＭ）（アラビノースはＲｅｄシステムの遺伝子を含有するプラスミドを誘導するのに使用する）を添加したＳＯＢ培地（５ｇ／ｌの酵母エキス、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２０ｇ／ｌのトリプトン、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂）で１００倍に希釈して、細菌培養物の光学密度がＯＤ₆₀₀＝０．４〜０．７に達するまで３０℃で増殖させた。細菌培養物１０ｍｌに由来する増殖細胞を氷冷した脱イオン水で３回洗浄した後、水１００μｌで懸濁した。脱イオン水に溶解したＤＮＡ断片１０μｌ（１００ｎｇ）を細胞懸濁液に添加した。製造業者の指示書に従って、「Bio-Rad」のエレクトロポレーター（米国）（Ｎｏ．１６５〜２０９８、バージョン２〜８９）で、エレクトロポレーションを行った。刺激された細胞をＳＯＣ培地（Sambrook他著「分子クローニング実験マニュアル、第２版（Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））１ｍｌに添加し、３７℃で２時間インキュベートした後、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬ寒天上に広げた。プライマーＰ３（配列番号５）及びプライマーＰ４（配列番号６）を用いるＰＣＲにより、野生型tdh遺伝子を置換するＣｍ^Rマーカーの存在に関して、２４時間以内に増殖したコロニーを試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを水２０μｌに懸濁した後、得られた懸濁液のうち１μｌをＰＣＲに用いた。温度プロファイルは、最初のＤＮＡ変性（９５℃で５分間）；その後３０サイクルの変性（９５℃で３０秒間）；アニーリング（５５℃で３０秒間）、及び伸長（７２℃で３０秒間）；並びに最後の伸長（７２℃で５分間）であった。幾つかの試験したＣｍ^Rコロニーは、所望の１１０４ｂｐのＤＮＡ断片を含有し、tdh遺伝子の１２４２ｂｐの断片の代わりに、Ｃｍ^RマーカーＤＮＡの存在が確認された。３７℃で培養することによって、得られた株の１つが熱感受性のプラスミドｐＫＤ４６を回復し、この株をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈと称した。

その後、ＶＬ６１４ｒｈｔＡ２３株（Livshits V.A.他, 2003, Res. Microbiol., 154:123-135）由来のｒｈｔＡ２３変異を、得られたＭＧ１６５５Δｔｄｈ株に導入し、それによってＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*株を得た。ｒｈｔＡ２３は、高濃度のスレオニン（４０ｍｇ／ｍｌ超）及びホモセリン（５ｍｇ／ｍｌ超）に対する耐性を与える変異である。この目的で、ＭＧ１６５５Δｔｄｈ株をＶＬ６１４ｒｈｔＡ２３ドナー株で増殖したファージＰ１_virに感染させた。８ｍｇ／ｍｌのホモセリン及び唯一の炭素源として
０．４％グルコースを含有するＭ９最小培地で形質導入体を選択した。

実施例２
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥの構築
ＭＧ１６５５株におけるａｄｈＥ遺伝子の野生型プロモーター領域のＰ_L-tacプロモーターへの置換によって、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈを得た。

ａｄｈＥ遺伝子の野生型プロモーター領域を置換するために、“Red-mediated integration”及び／又は“Red-driven integration”とも呼ばれるDatsenko K.A.及びWanner B.L.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645）で記載された方法によって、野生型プロモーター領域の代わりに、Ｐ_L-tacプロモーター及びcat遺伝子でコードされるクロラムフェニコール耐性マーカー（Ｃｍ^R）を保有するＤＮＡ断片をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５の染色体に組込んだ。

鋳型としてエシェリヒア・コリＭＧ１６５５Ｐ_L-tacｘｙｌＥ（国際公開第ＷＯ２００６／０４３７３０号）の染色体ＤＮＡを用いるＰＣＲによって、Ｐ_L-tacプロモーター及びcat遺伝子を含有する断片を得た。Ｐ_L-tacプロモーターのヌクレオチド配列は配列表で表される（配列番号７）。プライマーＰ５（配列番号８）及びプライマーＰ６（配列番号９）をＰＣＲ増幅に用いた。プライマーＰ５は、細菌染色体へのさらなる組込みのために導入されたａｄｈＥ遺伝子の開始コドンの３１８ｂｐ上流に位置する領域に相補的な４０ヌクレオチドを含有し、プライマーＰ６はａｄｈＥ遺伝子の５’配列と同一性がある３９ヌクレオチドを含有する。

「GeneAmp PCR System 2700」増幅装置（Applied Biosystems）を利用してＰＣＲを行った。反応混合物（全量５０μｌ）を、１５ｍＭのＭｇＣｌ₂（「Fermentas」、リトアニア）、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、それぞれ２５ｐｍｏｌの設計されたプライマー、及び１ＵのＴａｑポリメラーゼ（「Fermentas」、リトアニア）、および１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌから構成した。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Ｐ_L-tacｘｙｌＥ株のゲノムＤＮＡ約２０ｎｇをPCRの鋳型として反応混合物中に添加した。

温度プロファイルは、最初のＤＮＡ変性（９５℃で５分間）；その後３５サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５４℃で３０秒間）、伸長（７２℃で１．５分間）；並びに最後の伸長（７２℃で５分間）であった。次に、増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、「GenElute Spin Columns」（「Sigma」、米国）を用いて抽出し、エタノールで沈澱させた。得られたＤＮＡ断片は、エレクトロポレーション及びエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６の細菌染色体へのRed-mediated integrationに用いた。

アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した液体ＬＢ培地中で、３０℃で一晩、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６細胞を増殖させた後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びＬ−アラビノース（１０ｍＭ）（アラビノースはＲｅｄシステムのプラスミドをコードする遺伝子の誘導に使用する）を添加したＳＯＢ培地（５ｇ／ｌの酵母エキス、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２０ｇ／ｌのトリプトン、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂）で１００倍に希釈して、細菌培養物の光学密度がＯＤ₆₀₀＝０．４〜０．７に達するまで３０℃で増殖した。細菌培養物１０ｍｌに由来する細胞を氷冷した脱イオン水で３回洗浄した後、水１００μｌで懸濁した。脱イオン水に溶解したＤＮＡ断片１０μｌ（１００ｎｇ）を細胞懸濁液に添加した。製造業者の指示書に従って、「Bio-Rad」のエレクトロポレーター（米国）（Ｎｏ．１６５〜２０９８、バージョン２〜８９）で、エレクトロポレーションを行った。

通電された細胞をＳＯＣ培地（Sambrook他著「分子クローニング実験マニュアル、第２版（Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition）」, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））１ｍｌに添加し、３７℃で２時間インキュベートした後、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬ寒天上に広げた。

唯一の炭素源として２％エタノールを有するＭ９プレートで、得られたクローンを約１００個選択した。３６時間、２％エタノールを有するＭ９プレートで増殖させたクローンを幾つか選択し、プライマーＰ７（配列番号１０）及びプライマーＰ８（配列番号１１）を用いるＰＣＲによって、ａｄｈＥ遺伝子の野生型プロモーター領域を置換するＣｍ^Rマーカーの存在に関して試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを水２０μｌに懸濁した後、得られた懸濁液のうち１μｌをＰＣＲに用いた。温度プロファイルは、最初のＤＮＡ変性（９５℃で１０分間）；その後３０サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５４℃で３０秒間）、及び伸長（７２℃で１．５分間）；最後の伸長（７２℃で１分間）である。幾つかの試験したＣｍ^Rコロニーは、所望の約１８００ｂｐのＤＮＡ断片を含有し、ａｄｈＥ遺伝子の５２０ｂｐの野生型プロモーター領域の代わりに、Ｃｍ^RマーカーＤＮＡの存在が確認された。３７℃で培養することによって、得られた株の１つが熱感受性のプラスミドｐＫＤ４６を回復し、この株をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥと称した（図１を参照されたい）。

実施例３
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥの構築
ＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥ株からＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*株へのＰ_L-tacプロモーターの形質導入によって、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥを得た。

ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*株を、ＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥドナー株で増殖させたＰ１_virファージに感染させ、ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ株を得た。この株で、唯一の炭素源として２％エタノールを有するＭ９プレートでの増殖を調べた。増殖速度は、ＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥ株と同じであった。

実施例４
Ｌ−スレオニン生産に対するａｄｈＥ遺伝子発現増大の影響
Ｌ−スレオニン生産に対するａｄｈＥ遺伝子の発現促進の影響を評価するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ株及びＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*株の両方を、プラスミドｐＶＩＣ４０で形質転換した。

ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ（ｐＶＩＣ４０）株及び親株ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*（ｐＶＩＣ４０）をそれぞれ、栄養ブイヨン中で、３７℃で１８時間培養し、それぞれ得られた培養物０．３ｍｌを、２０ｍｍ×２００ｍｍ試験管中の以下の組成を有する発酵培地３ｍｌに接種し、回転式振盪培養機を用いて３４℃で４８時間培養した。表１及び表２に、少なくとも１０個の独立した実験からのデータを示す。
発酵培地組成（ｇ／ｌ）：
エタノール ２４又は１６
グルコース ０（表１）又は３（表２）
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １６
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．７
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．０
ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．０１
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０１
チアミン塩酸塩 ０．００２
酵母エキス １．０
Ｌ−イソロイシン ０．０１
ＣａＣＯ₃ ３３
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ及びＣａＣＯ₃はそれぞれ別々に滅菌した。

表１及び表２から、ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥは、ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*に比べて、多量のＬ−スレオニンの蓄積をもたらすことができたことがわかる。さらに、唯一の炭素源としてエタノールを含有する培地で、ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥを増殖させ、Ｌ−スレオニンを蓄積させることができたのに対し、ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*は、唯一の炭素源としてエタノールを含有する培地で非常に低い増殖及び生産性を示した。

実施例５
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔａｄｈＥの構築
kan遺伝子によるエシェリヒア・コリＭＧ１６５５における野生型ａｄｈＥ遺伝子の不活性化によって構築した。

野生型ａｄｈＥ遺伝子を不活性化（又は破壊）するために、“Red-mediated integration”及び／又は“Red-driven integration”とも呼ばれるDatsenko K.A.及びWanner B.L.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645）で記載された方法によって、野生型遺伝子の代わりに、kan遺伝子でコードされるカナマイシン耐性マーカー（Ｋｍ^R）を保有するＤＮＡ断片をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ７００９２６）の染色体に組込んだ。

鋳型として市販のプラスミドｐＡＣＹＣ１７７（GenBank/EMBLアクセッション番号X06402、「Fermentas」、リトアニア）、並びにプライマーＰ９（配列番号１２）及びプライマーＰ１０（配列番号１３）を用いるＰＣＲによって、Ｋｍ^Rマーカー（kan遺伝子）を含有するＤＮＡ断片を得た。プライマーＰ９は、細菌染色体へのさらなる組込みのために導入されたａｄｈＥ遺伝子の開始コドンの３１８ｂｐ上流に位置する領域と相同性がある４０ヌクレオチドを含有する。プライマーＰ１０は、細菌染色体へのさらなる組込みのために導入されたａｄｈＥ遺伝子の３’領域と相同性がある４１ヌクレオチドを含有する。

「Gene Amp PCR System 2700」増幅装置（Applied Biosystems）を利用してＰＣＲを行った。反応混合物（全量５０μｌ）を、２５ｍＭのＭｇＣｌ₂（「Fermentas」、リトアニア）、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、それぞれ２５ｐｍｏｌの設計されたプライマー、及び１ＵのＴａｑポリメラーゼ（「Fermentas」、リトアニア）、および１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌから構成した。ＰＣＲ増幅のために、プラスミドＤＮＡ約５ｎｇを鋳型ＤＮＡとして反応混合物中に添加した。温度プロファイルは、最初のＤＮＡ変性（９５℃で５分間）；その後２５サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒間）、及び伸長（７２℃で４０秒間）；並びに最後に伸長（７２℃で５分間）であった。次に、増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、「GenElute Spin Columns」（「Sigma」、米国）を用いて抽出し、エタノールで沈澱させた。

得られたＤＮＡ断片は、エレクトロポレーション及びエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６の細菌染色体へのRed-mediated integrationに用いた。

アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した液体ＬＢ培地中で、３０℃で一晩、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６細胞を増殖した後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びＬ−アラビノース（１０ｍＭ）（アラビノースはＲｅｄシステムのプラスミドをコードする遺伝
子の誘導に使用する）を添加したＳＯＢ培地（５ｇ／ｌの酵母エキス、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２０ｇ／ｌのトリプトン、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂）で１００倍に希釈して、細菌培養物の光学密度がＯＤ₆₀₀＝０．４〜０．７に達するまで３０℃で増殖させた。細菌培養物１０ｍｌに由来する細胞を氷冷した脱イオン水で３回洗浄した後、水１００μｌで懸濁した。脱イオン水に溶解したＤＮＡ断片１０μｌ（１００ｎｇ）を細胞懸濁液に添加した。製造業者の指示書に従って、「Bio-Rad」のエレクトロポレーター（米国）（Ｎｏ．１６５〜２０９８、バージョン２〜８９）で、エレクトロポレーションを行った。通電された細胞をＳＯＣ培地（Sambrook他著「分子クローニング実験マニュアル、第２版（Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））１ｍｌに添加し、３７℃で２時間インキュベートした後、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬ寒天上に広げた。２４時間以内に増殖したコロニーを、プライマーＰ１１（配列番号１４）及びプライマーＰ１２（配列番号１５）を用いるＰＣＲによって、野生型ａｄｈＥ遺伝子を置換するＫｍ^Rマーカーの存在に関して試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを水２０μｌに懸濁した後、得られた懸濁液のうち１μｌをＰＣＲに用いた。温度プロファイルは、初期ＤＮＡ変性（９５℃で５分間）；その後３０サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒間）、及び伸長（７２℃で３０秒間）；並びに最終伸長（７２℃で５分間）である。幾つかの試験したＫｍ^Rコロニーは、所望の約１０３０ｂｐのＤＮＡ断片を含有し、ａｄｈＥ遺伝子の３１３５ｂｐの断片の代わりに、Ｋｍ^RマーカーＤＮＡの存在が確認された。３７℃で培養することによって、得られた株の１つが熱感受性のプラスミドｐＫＤ４６を回復し、この株をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔａｄｈＥと称した。

実施例６
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*の構築
Ｇｌｕ５６８Ｌｙｓ（Ｅ５６８Ｋ）変異型のａｄｈＥ遺伝子への導入によって、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*を得た。初めに、鋳型としてエシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡ、並びにプライマーＰ１３（配列番号１６）及びプライマーＰ１２（配列番号１５）を用いるＰＣＲによって、Ｅ５６８Ｋ変異を保有するａｄｈＥ遺伝子の１．０５ｋｂｐの断片を得た。プライマーＰ１５は、ａｄｈＥ遺伝子の１６６２ｂｐ〜１７０１ｂｐ及び１７０３ｂｐ〜１７３０ｂｐの領域に対して相同性があり、太字で示される（１７０２ｂｐ位の）ｇ／ａ置換を含み、プライマーＰ１２は、ａｄｈＥ遺伝子の３’末端に対して相同性がある。「Gene Amp PCR System 2700」増幅装置（Applied Biosystems）を利用してＰＣＲを行った。反応混合物（全量５０μｌ）を、ＭｇＣｌ₂（タカラバイオ株式会社、日本）、それぞれ２５０μＭのｄＮＴＰ、それぞれ２５ｐｍｏｌの設計されたプライマー、及び２．５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社、日本）、および１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌから構成した。ＰＣＲのために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡ約２０ｎｇを鋳型として反応混合物中に添加した。温度プロファイルは、最初のＤＮＡ変性（９５℃で５分間）；その後３５サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５４℃で３０秒間）、及び伸長（７２℃で１分間）；並びに最後の伸長（７２℃で５分間）であった。得られた断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、「GenElute Spin Columns」（「Sigma」、米国）を用いて抽出し、エタノールで沈澱させた。

第２の工程では、鋳型として、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥのゲノムＤＮＡ（実施例２を参照されたい）、プライマーＰ１１（配列番号１４）、及び第２のプライマーとして、変異配列を保有する１．０５ｋｂｐの断片（上記を参照されたい）を用いるＰＣＲによって、変異型ａｄｈＥ遺伝子とＰ_L-tacプロモーター、およびクロラムフェニコール耐性を与えるcat遺伝子マーカーを含む断片を得た。プライマーＰ１１は、ａｄｈＥ遺伝子の開始コドンの４０２ｂｐ〜４２５ｂｐ上流に位置する領域に対し
て相同性がある。「Gene Amp PCR System 2700」増幅装置（Applied Biosystems）を利用してＰＣＲを行った。反応混合物（全量５０μｌ）を、１０×ＰＣＲ緩衝液（タカラバイオ株式会社、日本）５μｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ₂、それぞれ２５０μＭのｄＮＴＰ、プライマーＰ１１ １０ｎｇ、第２のプライマーとして１．０５ｋｂｐの断片１μｇ及び２．５Ｕのタカラバイオ株式会社のＬＡ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社、日本）から構成した。ＰＣＲのために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥのゲノムＤＮＡ約２０ｎｇを鋳型として反応混合物中に添加した。温度プロファイルは、初期ＤＮＡ変性（９５℃で５分間）；その後３５サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５４℃で３０秒間）、及び伸長（７２℃で３．５分間）；並びに最終伸長（７２℃で７分間）であった。得られた断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、「GenElute Spin Columns」（「Sigma」、米国）を用いて抽出し、エタノールで沈澱させた。

ａｄｈＥ遺伝子の野生型領域を置換するために、“Red-mediated integration”及び／又は“Red-driven integration”とも呼ばれるDatsenko K.A.及びWanner B.L.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645）で記載された方法によって、変異型ａｄｈＥを有するＰ_L-tacプロモーター及びcat遺伝子（ｃａｔ−Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*、４．７ｋｂｐ）でコードされるクロラムフェニコール耐性マーカー（Ｃｍ^R）を含むＤＮＡ断片をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔａｄｈＥの染色体に組込んだ。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した液体ＬＢ培地中で、３０℃で一晩、ＭＧ１６５５ΔａｄｈＥ／ｐＫＤ４６細胞を増殖させた後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びＬ−アラビノース（１０ｍＭ）（アラビノースはＲｅｄシステムのプラスミドをコードする遺伝子の誘導に使用する）を添加したＳＯＢ培地（５ｇ／ｌの酵母エキス、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２０ｇ／ｌのトリプトン、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂）で１００倍に希釈して、細菌培養物の光学密度がＯＤ₆₀₀＝０．４〜０．７に達するまで３０℃で増殖した。細菌培養物１０ｍｌに由来する細胞を氷冷した脱イオン水で３回洗浄した後、水１００μｌで懸濁した。脱イオン水に溶解したＤＮＡ断片１０μｌ（３００ｎｇ）を細胞懸濁液に添加した。製造業者の指示書に従って、「Bio-Rad」のエレクトロポレーター（米国）（Ｎｏ．１６５〜２０９８、バージョン２〜８９）で、エレクトロポレーションを行った。

刺激された細胞をＳＯＣ培地（Sambrook他著「Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））１ｍｌに添加し、３７℃で２時間インキュベートした後、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬ寒天上に広げた。

唯一の炭素源として２％エタノールを有するＭ９プレートで、得られたクローンを選択した。

生育したクローンを選択し、全遺伝子配列を確認した。変異は以下のとおりであった：Ｇｌｕ５６８Ｌｙｓ（ｇａｇ−ａａｇ）、Ｉｌｅ５５４Ｓｅｒ（ａｔｃ−ａｇｃ）、Ｇｌｕ２２Ｇｌｙ（ｇａａ−ｇｇａ）、Ｍｅｔ２３６Ｖａｌ（ａｔｇ−ｇｔｇ）、Ｔｙｒ４６１Ｃｙｓ（ｔａｃ−ｔｇｃ）、Ａｌａ７８６Ｖａｌ（ｇｃａ−ｇｔａ）。このクローンは、ＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*と称された。

実施例７
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*の構築
ＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*株からのＰ_L-tacａｄｈＥ^*変異の形質導入によって、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*を得た。

ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*株を、ＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*ドナー株
で増殖させたＰ１_virファージに感染させ、ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*株を得た。この株で、唯一の炭素源として２％エタノールを有するＭ９プレートでの増殖を調べた。増殖速度は、ＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*株と同じであった。

実施例８
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８の構築
Ｇｌｕ５６８Ｌｙｓ変異を有する単一変異型ａｄｈＥを得る第２の試みを行った。この目的のために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−ｗｔΔ３４株を構築した。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−ｗｔ（ｗｔは野生型を意味する）における３４ｂｐ断片のａｄｈＥ遺伝子（Ｇｌｕ５６８をコードするトリプレットを含む１６６８ｂｐ〜１７０２ｂｐの領域）のkan遺伝子への置換によって、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−ｗｔΔ３４を得た。“Red-mediated integration”及び／又は“Red-driven integration”とも呼ばれるDatsenko K.A.及びWanner B.L.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645）で記載された方法によって、kan遺伝子をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−ｗｔの染色体に組込んだ。

鋳型として市販のプラスミドｐＡＣＹＣ１７７（GenBank/EMBLアクセッション番号Ｘ06402、「Fermentas」、リトアニア）、並びにプライマーＰ１４（配列番号１７）及びプライマーＰ１５（配列番号１８）を用いるＰＣＲによって、kan遺伝子でコードされるＫｍ^Rマーカーを含有するＤＮＡ断片を得た。プライマーＰ１４は、ａｄｈＥ遺伝子の１６２７ｂｐ〜１６６８ｂｐの領域と同一性がある４１ヌクレオチドを含有し、プライマーＰ１５は、細菌染色体へのさらなる組込みのためにプライマーに導入されるａｄｈＥ遺伝子の１７０２ｂｐ〜１７４０ｂｐの領域と相補的である３９ヌクレオチドを含有する。

「Gene Amp PCR System 2700」増幅装置（Applied Biosystems）を利用してＰＣＲを行った。反応混合物（全量５０μｌ）を、２５ｍＭのＭｇＣｌ₂（Fermentas、リトアニア）、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、それぞれ２５ｐｍｏｌの設計されたプライマー、及び１ＵのＴａｑポリメラーゼ（Fermentas、リトアニア）、および１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌから構成した。ＰＣＲ増幅のために、プラスミドＤＮＡ約５ｎｇを鋳型ＤＮＡとして反応混合物中に添加した。温度プロファイルは、最初のＤＮＡ変性（９５℃で５分間）、その後２５サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒間）、及び伸長（７２℃で５０秒間）；並びに最後の伸長（７２℃で５分間）であった。次に、増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、「GenElute Spin Columns」（Sigma、米国）を用いて抽出し、エタノールで沈澱させた。

プライマーＰ１６（配列番号１９）及びプライマーＰ１７（配列番号２０）を用いるＰＣＲにより、Ｋｍ^Rマーカーの存在に関して、得られたコロニーを試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを水２０μｌに懸濁した後、得られた懸濁液のうち１μｌをＰＣＲに用いた。温度プロファイルは、最初のＤＮＡ変性（９５℃で５分間）；その後３０サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒間）、及び伸長（７２℃で４５秒間）；並びに最後の伸長（７２℃で５分間）である。幾つかの試験したＫｍ^Rコロニーは、所望の１２００ｂｐのＤＮＡ断片を含有し、ａｄｈＥ遺伝子の２３０ｂｐの断片の代わりに、Ｋｍ^RマーカーＤＮＡの存在が確認された。３７℃で培養することによって、得られた株の１つが熱感受性のプラスミドｐＫＤ４６を回復し、この株をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−ｗｔΔ３４
と称した。

その後、kan遺伝子によってコードされるカナマイシン耐性マーカー（Ｋｍ^R）を、Ｇｌｕ５６８Ｌｙｓ変異をコードするａｄｈＥ遺伝子の断片に置換するために、“Red-mediated integration”及び／又は“Red-driven integration”方法（Yu D., Sawitzke J.他著, Recombineering with overlapping single-stranded DNA oligonucleotides: Testing of recombination intermediate, PNAS, 2003, 100（12）, 7207-7212）によって、適切な変異を保有するオリゴヌクレオチドＰ１８（配列番号２１）及びオリゴヌクレオチドＰ１９（配列番号２２）をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−ｗｔΔ３４の染色体に組込んだ。プライマーＰ１８は、ａｄｈＥ遺伝子の１６２７ｂｐ〜１７０２ｂｐの領域と同一性がある７５ヌクレオチドを含有し、プライマーＰ１９は、ａｄｈＥ遺伝子の１６６８ｂｐ〜１７４０ｂｐの領域と相補的な７５ヌクレオチドを含有し、両方のプライマーは、Ｇｌｕ５６８の代わりにＬｙｓ５６８をコードするトリプレットを含む。

炭素源として２％エタノール及び２５ｍｇ／ｍｌのコハク酸塩を含有するＭ９最小培地で、クローンを選択した。

プライマーＰ１６（配列番号１９）及びプライマーＰ１７（配列番号２０）を用いるＰＣＲによって、Ｋｍ^Rマーカーの非存在に関してクローンを試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを水２０μｌに懸濁した後、得られた懸濁液のうち１μｌをＰＣＲに用いた。温度プロファイルは、最初のＤＮＡ変性（９５℃で５分間）；その後３０サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒間）、及び伸長（７２℃で２５秒間）；並びに最後の伸長（７２℃で５分間）である。幾つかの試験したＫｍ^Sコロニーは、ａｄｈＥ遺伝子の所望の２３０ｂｐのＤＮＡ断片を含有し、１２００ｂｐの断片の代わりに、Ｋｍ^RマーカーＤＮＡの非存在が確認された。３７℃で培養することによって、得られた株の幾つかが熱感受性のプラスミドｐＫＤ４６を回復し、この株をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８と称した。

シークエンスによって、Ｇｌｕ５６８Ｌｙｓ変異の存在を確認した。例えば、ｃｌ．１８は単一の変異型Ｇｌｕ５６８Ｌｙｓを有する。さらに、幾つかのクローン（番号１、１３）がさらなる変異を含有していたことを見出した：ｃｌ．１−Ｇｌｕ５６８Ｌｙｓ、Ｐｈｅ５６６Ｖａｌ；ｃｌ．１３−Ｇｌｕ５６８Ｌｙｓ、Ｇｌｕ５６０Ｌｙｓ。

ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８株（ｃｌ．１８）、ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８，Ｖａｌ５６６株（ｃｌ．１）、ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８，Ｌｙｓ５６０株（ｃｌ．１３）及びＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*株に関して、増殖曲線を調べた（図３及び図４）。

唯一の炭素源としてエタノールを有するＭ９培地で、及びグルコース及びエタノールを有するＭ９培地で、株を増殖させた（モル比１：３）。

実施例９
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，ａｄｈＥ^*の構築
ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*株において野生型ａｄｈＥプロモーターを再構築することによって、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，ａｄｈＥ^*株を得た。Ｐ_L-tacプロモーター、及びＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*株の染色体中のcat遺伝子でコードされるクロラムフェニコール耐性
マーカー（Ｃｍ^R）を保有するＤＮＡ断片を、野生型ａｄｈＥプロモーター、及びkan遺伝子でコードされるカナマイシン耐性マーカー（Ｋｍ^R）を保有する断片で置換した。鋳型としてのＭＧ１６５５株のＤＮＡ、並びにプライマーＰ２０（配列番号２３）及びプライマーＰ２１（配列番号２４）を用いるＰＣＲによって野生型Ｐ_adhEを得た。プライマーＰ２０は、その５’末端にＥｃｏＲＩ認識部位を含有し、kan遺伝子とのさらなる連結に必要であり、プライマーＰ２１は、ａｄｈＥ遺伝子の５’領域と相同性がある３０ヌクレオチドを含有する（５０ｂｐ〜２０ｂｐ）。

鋳型としての市販のプラスミドｐＡＣＹＣ１７７（GenBank/EMBLアクセッション番号Ｘ06402、Fermentas、リトアニア）、並びにプライマーＰ２２（配列番号２５）及びプライマーＰ２３（配列番号２６）を用いるＰＣＲによって、kan遺伝子でコードされるＫｍ^Rマーカーを含有するＤＮＡ断片を得た。プライマーＰ２２は、細菌染色体へのさらなる組込みのためにプライマーに導入されるａｄｈＥ遺伝子の開始コドンの４２５ｂｐ上流に位置する領域と相同性がある４１ヌクレオチドを含有し、プライマーＰ２３は、その３’末端にＥｃｏＲＩ認識部位を含有し、Ｐ_adhΕプロモーターとのさらなる連結に必要である。

「Gene Amp PCR System 2700」増幅装置（Applied Biosystems）を利用してＰＣＲを行った。反応混合物（全量５０μｌ）を、２５ｍＭのＭｇＣｌ₂（Fermentas、リトアニア）、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、それぞれ２５ｐｍｏｌの設計されたプライマー、及び１ＵのＴａｑポリメラーゼ（Fermentas、リトアニア）、および１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌから構成した。ＰＣＲ増幅のために、ゲノムＤＮＡ約２０ｎｇ又はプラスミドＤＮＡ ５ｎｇを鋳型として反応混合物中に添加した。温度プロファイルは、初期ＤＮＡ変性（９５℃で５分間）、その後３５サイクル（Ｐ_adhE）又は２５サイクル（kan遺伝子）の変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒間）、伸長（７２℃で２０秒間（Ｐｔａｃプロモーターに関して）及び５０秒間（kan遺伝子に関して））；並びに最終伸長（７２℃で５分間）であった。次に、増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、「GenElute Spin Columns」（Sigma、米国）を用いて抽出し、エタノールで沈澱させた。

２つの上記ＤＮＡ断片をそれぞれ、ＥｃｏＲＩ制限酵素で処理し、ライゲートした。ライゲーション産物を、プライマーＰ２１及びプライマーＰ２２を利用してＰＣＲで増幅した。増幅したｋａｎ−Ｐ_adhE ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、「GenElute Spin Columns」（Sigma、米国）を用いて抽出し、エタノールで沈澱させた。得られたＤＮＡ断片は、エレクトロポレーション及びエシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ：：ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*／ｐＫＤ４６の細菌染色体へのRed-mediated integrationに用いた。

アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した液体ＬＢ培地中で３０℃で一晩、ＭＧ１６５５Δｔｄｈ：：ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*／ｐＫＤ４６細胞を増殖させた後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びＬ−アラビノース（１０ｍＭ）（アラビノースは、Ｒｅｄシステムのプラスミドをコードする遺伝子の誘導に用いた）を添加したＳＯＢ培地（５ｇ／ｌの酵母エキス、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２０ｇ／ｌのトリプトン、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂）で１００倍に希釈して、細菌培養物の光学密度がＯＤ₆₀₀＝０．４〜０．７に達するまで３０℃で増殖した。細菌培養物１０ｍｌに由来する増殖細胞を氷冷した脱イオン水で３回洗浄した後、水１００μｌで懸濁した。脱イオン水に溶解したＤＮＡ断片１０μｌ（１００ｎｇ）を細胞懸濁液に添加した。製造業者の指示書に従って、「Bio-Rad」のエレクトロポレーター（米国）（Ｎｏ．１６５〜２０９８、バージョン２〜８９）で、エレクトロポレーションを行った。

通電された細胞をＳＯＣ培地（Sambrook他著, Molecular Cloning A Laboratory Manua
l, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））１ｍＬに添加し、３７℃で２時間インキュベートした後、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬ寒天上に広げた。

プライマーＰ２４（配列番号２７）及びプライマーＰ２５（配列番号２８）を用いるＰＣＲによって、Ｐ_L-tac−Ｃｍ^Rマーカーを置換するＰ_adhE−Ｋｍ^Rマーカーの存在に関して、２４時間以内に増殖したコロニーを試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを水２０μｌに懸濁させた後、得られた懸濁液のうち１μｌをＰＣＲに用いた。温度プロファイルは、最初のＤＮＡ変性（９５℃で５分間）；その後３０サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５４℃で３０秒間）及び伸長（７２℃で１．０分間）；最後の伸長（７２℃で５分間）である。幾つかの試験したＫｍ^Rコロニーは、所望の１２００ｂｐのＤＮＡ断片を含有し、野生型Ｐ_adhEプロモーター及びＫｍ^RマーカーＤＮＡの存在が確認された。これらの断片のうちの幾つかをシークエンスし、野生型Ｐ_adhEプロモーターの構造を確認した。３７℃で培養することによって、野生型プロモーターの制御下で変異型ａｄｈＥ遺伝子を含有する株の１つが温度感受性プラスミドｐＫＤ４６を回復し、この株をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，ａｄｈＥ^*と称した。

唯一の炭素源としてエタノールを含有する最小培地Ｍ９上での、全ての得られた株、ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８（ｃｌ．１８）；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８，Ｖａｌ５６６（ｃｌ．１）；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，ａｄｈＥ^*、及び親株ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*の増殖能を調べた。親株ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*、及び野生型アルコールデヒドロゲナーゼの発現が促進された株は、唯一の炭素源としてエタノール（２％又は３％）を含有する培地上では増殖できないことが示された（図３、Ａ及びＢ）。以前に報告されたアルコールデヒドロゲナーゼに単一の変異を含有する株ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８（ｃｌ．１８）（Membrillo-Hernandez, J.他, J. Biol. Chem. 275, 33869-33875（2000））は、同一培地において、非常に増殖しにくいことが示されいた。しかし、Ｇｌｕ５６８Ｌｙｓ変異の他にアルコールデヒドロゲナーゼに幾つかの変異を含有する株は、良好に増殖することが示された（図３、Ａ及びＢ）。上記株は全て、グルコースとエタノールとの混合物を含有する最小培地Ｍ９上で増殖することができたが、Ｇｌｕ５６８Ｌｙｓ変異の他に幾つかの変異を含有する変異型アルコールデヒドロゲナーゼの発現が促進された株は、より良好に増殖することが示された（図４）。

野生型プロモーターの制御下で５つの変異を有するアルコールデヒドロゲナーゼを含有する株ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，ａｄｈＥ^*は、唯一の炭素源としてエタノール（２％又は３％）を含有する最小培地Ｍ９上で増殖することができないことも示された。良好な増殖には、当該アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現促進が必要とされる（図５）。

実施例１０
Ｌ−スレオニン生産に対する変異型ａｄｈＥ遺伝子発現増大の影響
スレオニン生産に対する変異型ａｄｈＥ遺伝子の発現促進の影響を評価するために、エシェリヒア・コリ株ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８（ｃｌ．１８）；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８，Ｖａｌ５６６（ｃｌ．１）；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，ａｄｈＥ^*、及び親株ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*を、プラスミドｐＶＩＣ４０で
形質転換した。

これらの株及び親株ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*（ｐＶＩＣ４０）を、栄養ブイヨン中で、３７℃で１８時間培養し、それぞれ得られた培養物０．３ｍｌを、２０ｍｍ×２００ｍｍ試験管中の発酵培地（実施例４参照）３ｍｌに接種し、回転式振盪培養機を用いて３４℃で４８時間培養した。表１及び表２に、少なくとも１０個の独立した実験からのデータを示す。

表１及び表２から、変異型アルコールデヒドロゲナーゼは、野生型アルコールデヒドロゲナーゼの発現も変異型アルコールデヒドロゲナーゼの発現も増大しなかったＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*、又はさらには、野生型アルコールデヒドロゲナーゼの発現が増大したＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*、又はＰ_L-tacａｄｈＥと比べて、多量のＬ−スレオニンの蓄積をもたらすことができたことがわかる。このような発酵中のＬ−スレオニンの高蓄積は、グルコースとエタノールとの混合物か、又は唯一の炭素源としてエタノールのみを含有する培地で観察された。

試験管発酵は、蒸発したエタノールを戻さずに行った。

実施例１１
Ｌ−リジン生産に対するａｄｈＥ遺伝子発現増大の影響
リジン生産に対するＰ_L-tacプロモーターの制御下でのａｄｈＥ遺伝子の発現促進の影響を試験するために、上記株ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８（ｃｌ．１８）；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８，Ｖａｌ５６６（ｃｌ．１）；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，ａｄｈＥ^*の染色体由来のＤＮＡ断片を、Ｐ１形質導入によって、リジン生産エシェリヒア・コリＷＣ１９６ΔｃａｄＡΔｌｄｃ（ｐＣＡＢＤ２）株に移入した（Miller, J.H.（1972）著, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press、ニューヨーク州プレーンビュー）。ｐＣＡＢＤ２は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を脱感作する変異を有するジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードするdapA遺伝子、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を脱感作する変異を有するアスパルトキナーゼＩＩＩをコードするlysC遺伝子、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含むプラスミドである（米国特許第6,040,160号）。

得られた株及び親株ＷＣ１９６ΔｃａｄＡΔｌｄｃ（ｐＣＡＢＤ２）を、３７℃で、２０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを含有するＬ培地プレート上に広げ、プレートの１／８に相当する細胞を、５００ｍｌフラスコ中に必要な薬物を含有する発酵培地２０ｍｌに接種した。往復振盪機を用いて、１１５ｒｐｍの撹拌速度で３７℃で４８時間、培養を行うことができる。培養後、培地中のＬ−リジン及び残存するエタノールの量を、既知の方法（バイオセンサＢＦ−５、王子計測機器株式会社製）で測定することができる。次に、消費したエタノールに対するＬ−リジンの生産量を各株に対して算出することができる。

発酵培地の組成（ｇ／ｌ）は、以下の通りであった：
エタノール ２０．０
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２４．０
Ｋ₂ＨＰＯ₄ １．０
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．０
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．０１
酵母エキス ２．０

ＫＯＨでｐＨを７．０に調整し、培地を１１５℃で１０分間オートクレーブした。エタノール及びＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを別個に滅菌した。ＣａＣＯ₃を１８０℃で２時間、乾熱滅菌し、最終濃度３０ｇ／ｌで培地に添加した。表３に、２つの平行実験からのデータを示す。

表３から、変異型アルコールデヒドロゲナーゼ及び野生型アルコールデヒドロゲナーゼは、野生型アルコールデヒドロゲナーゼの発現も変異型アルコールデヒドロゲナーゼの発現も増大しなかったＷＣ１９６ΔｃａｄＡΔｌｄｃ（ｐＣＡＢＤ２）と比べて、増殖促進、および多量のＬ−リジンの蓄積をもたらすことができたことがわかる。

実施例１２
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔａｒｇＲ，Ｐ_L-tacａｄｈΕ^*の構築
１．ＭＧ１６５５ΔａｒｇＲ株の構築
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５において、Ｌ−アルギニン生合成経路の抑制因子をコードする野生型argR遺伝子をkan遺伝子で不活性化することによって、この株を構築した。野生型argR遺伝子を置換するために、Red-driven integrationによって、野生型argR遺伝子の代わりに、kan遺伝子でコードされるカナマイシン耐性マーカー（Ｋｍ^R）を保有するＤＮＡ断片をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５の染色体（ＡＴＣＣ７００９２６）に組込んだ。

鋳型としての市販のプラスミドｐＡＣＹＣ１７７（GenBank/EMBLアクセッション番号Ｘ06402、Fermentas、リトアニア）、並びにプライマーＰ２６（配列番号３１）及びプライマーＰ２７（配列番号３２）を用いるＰＣＲによって、kan遺伝子でコードされるＫｍ^Rマーカーを含有するＤＮＡ断片を得た。プライマーＰ２６は、細菌染色体へのさらなる組込みのためにプライマーに導入されるargR遺伝子の５’領域と相同性がある４０ヌクレオチドを含有する。プライマーＰ２７は、細菌染色体へのさらなる組込みのためにプライマーに導入されるargR遺伝子の３’領域と相同性がある４１ヌクレオチドを含有する。温度プロファイルは、初期ＤＮＡ変性（９５℃で５分間）、その後の２５サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒間）、伸長（７２℃で４０秒間）；及び最終伸長（７２℃で５分間）であった。次に、増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、「GenElute Spin Columns」（Sigma、米国）を用いて抽出し、エタノールで沈澱させた。

得られたＤＮＡ断片は、エレクトロポレーション及びエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６の細菌染色体へのRed-mediated integrationに用いた。

アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した液体ＬＢ培地中で、３０℃で一晩ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６細胞を増殖させた後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びＬ−アラビノース（１０ｍＭ）（アラビノースは、Ｒｅｄシステムのプラスミドをコードする遺伝子の誘導に用いられる）を添加したＳＯＢ培地（５ｇ／ｌの酵母エキス、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２０ｇ／ｌのトリプトン、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂）で
１００倍に希釈して、細菌培養物の光学密度がＯＤ₆₀₀＝０．４〜０．７に達するまで３０℃で増殖した。細菌培養物１０ｍｌに由来する増殖細胞を氷冷した脱イオン水で３回洗浄した後、水１００μｌで懸濁した。脱イオン水に溶解したＤＮＡ断片１０μｌ（１００ｎｇ）を細胞懸濁液に添加した。製造業者の指示書に従って、「Bio-Rad」のエレクトロポレーター（米国）（Ｎｏ．１６５〜２０９８、バージョン２〜８９）で、エレクトロポレーションを行った。刺激された細胞をＳＯＣ培地１ｍＬに添加し、３７℃で２時間インキュベートした後、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬ寒天上に広げた。プライマーＰ２８（配列番号３３）及びプライマーＰ２９（配列番号３４）を用いるＰＣＲによって、野生型argR遺伝子を置換するＫｍ^Rマーカーの存在に関して、２４時間以内に増殖したコロニーを試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを水２０μｌに懸濁させた後、得られた懸濁液のうち１μｌをＰＣＲに用いた。温度プロファイルは、初期ＤＮＡ変性（９５℃で５分間）；その後３０サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５５℃で３０秒間）、及び伸長（７２℃で３０秒間）；最終伸長（７２℃で５分間）である。幾つかの試験したＫｍ^Rコロニーは、所望の１１１０ｂｐのＤＮＡ断片を含有し、argR遺伝子の６６０ｂｐの断片の代わりにＫｍ^RマーカーＤＮＡの存在が確認された。３７℃で培養することによって、得られた株の１つが熱感受性プラスミドｐＫＤ４６を回復し、この株をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔａｒｇＲと称した。

２．エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔａｒｇＲ，Ｐ_L-tacａｄｈΕ^*の構築
ＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*株からＰ_L-tacａｄｈＥ^*変異を形質導入することによって、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔａｒｇＲ，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*を得た。

ＭＧ１６５５ΔａｒｇＲ株に、ドナー株ＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*で増殖したファージＰ１_virを感染させ、ＭＧ１６５５ΔａｒｇＲ，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*株を得た。唯一の炭素源として２％のエタノールを含むＭ９プレート上での増殖に関して、この株を検査した。増殖速度は、ＭＧ１６５５：：Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*株（３６時間）と同一であった。

実施例１３
ｐＭＷ１１９−ＡｒｇＡ４プラスミドの構築
単一変異を有するArgA遺伝子は、ｆｂｒ（フィードバック耐性）表現型を与え（特開2002-253268、欧州特許第1170361号）、それ自身のプロモーターの制御下、ｐＭＷ１１９ベクターにクローニングされた。

鋳型としてのプラスミドｐＫＫＡｒｇＡ−ｒ４（特開2002-253268、欧州特許第1170361号）、並びにプライマーＰ３０（配列番号３５）及びプライマーＰ３１（配列番号３６）を用いるＰＣＲによって、argA遺伝子を得た。プライマーＰ３０の配列は、argA遺伝子の開始コドンの２０ｂｐ上流及び１９ｂｐ下流に位置するargA遺伝子の５’領域と相同性がある。プライマーＰ３１は、argA遺伝子の３’領域と相同性がある２４ヌクレオチド、及びｐＭＷ１１９／ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクターへのさらなるクローニングのために導入されたＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有する。

鋳型としてのエシェリヒア・コリＭＧ１６５５、並びにプライマーＰ３２（配列番号３７）及びプライマーＰ３３（配列番号３８）を用いるＰＣＲによって、Ｐ_argAプロモーターの配列を得た。プライマーＰ３２は、開始コドンの２４５ｂｐ上流に位置するargA遺伝子の５’−非翻訳領域と相同性がある３０ヌクレオチドを含有し、さらにこの配列は、ＢａｍＨＩ認識部位を含む。プライマーＰ３３は、開始コドンの２０ｂｐ上流に位置するargA遺伝子の５’領域、及び開始コドン自体と相同性がある２４ヌクレオチドを含有する。温度プロファイルは、初期ＤＮＡ変性（９５℃で５分間）、その後２５サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５４℃で３０秒間）、伸長（７２℃で１分２０秒間
（ArgA遺伝子に関して）又は２０秒間（Ｐ_argAプロモーターに関して））、及び最終伸長（７２℃で５分間）であった。次に、増幅したＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動で精製し、「GenElute Spin Columns」（Sigma、米国）を用いて抽出し、エタノールで沈澱させた。

上記ＤＮＡ断片：Ｐ_argAプロモーター及びArgA遺伝子の両方を用いるＰＣＲによって、Ｐ_argAＡｒｇＡ断片を得た。最初に、反応混合物（全量１００μｌ）を、２５ｍＭのＭｇＣｌ₂（Sigma、米国）、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、及び１ＵのＡｃｃｕ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Sigma、米国）を含む１０×ＰＣＲ緩衝液１０μｌから構成した。ａｒｇＡ断片（２５ｎｇ）及びＰ_argA（５ｎｇ）を、鋳型ＤＮＡ及びプライマーとして同時に用いた。次に、プライマーＰ３１及びプライマーＰ３２を反応混合物中に添加した。温度プロファイルは、第１工程−初期ＤＮＡ変性（９５℃で５分間）、その後１０サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、アニーリング（５３℃で３０秒間）、伸長（７２℃で１分間）、第２工程−１５サイクルの変性（９５℃）、アニーリング（５４℃で３０秒間）、伸長（７２℃で１分３０秒間）であった。増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、「GenElute Spin Columns」（Sigma、米国）を用いて抽出し、エタノールで沈澱させ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐＭＷ１１９／ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクターを用いてライゲートした。結果として、プラスミドｐＭＷ１１９−ＡｒｇＡ４が得られた。

実施例１４
Ｌ−アルギニン生産に対するａｄｈＥ遺伝子発現増大の影響
Ｌ−アルギニン生産に対する変異型ａｄｈＥ遺伝子の発現促進の影響を評価するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔａｒｇＲ Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*株及びＭＧ１６５５ΔａｒｇＲ株をそれぞれ、プラスミドｐＭＷ１１９−ＡｒｇＡ４で形質転換した。各種形質転換体の１０個の得られたコロニーを、１５０ｍｇ／ｌのＡｐを補充した栄養ブイヨン中で、３７℃で１８時間培養し、それぞれ得られた培養物０．１ｍｌを、２０ｍｍ×２００ｍｍの試験管中の発酵培地２ｍｌに接種し、回転式振盪培養機を用いて３２℃で９６時間培養した。培養後、培地中に蓄積するＬ−アルギニンの量を、以下の移動相（ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ））を用いるペーパークロマトグラフィによって求めた。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として用いた。Ｌ−アルギニンを含有するスポットを切り出し、Ｌ−アルギニンをＣｄＣｌ₂の０．５％水溶液中で溶出し、Ｌ−アルギニンの量を５４０ｎｍで分光光度法により推定した。表４に、１０個の独立した試験管発酵の結果を示す。以下の表４の通り、ＭＧ１６５５ΔａｒｇＲ Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*の方が、ＭＧ１６５５ΔａｒｇＲ Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*と比べて、グルコースを補充した培地及びグルコースを含まない培地の両方で、多量のＬ−アルギニンを生産した。

発酵培地の組成は以下の通りであった（ｇ／ｌ）：
エタノール ２０
グルコース ０／５
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２５
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．０
塩酸チアミン ０．００２
酵母エキス ５．０
ＣａＣＯ₃ ３３
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、エタノール及びＣａＣＯ₃はそれぞれ、別個に滅菌した。

実施例１５
Ｌ−ロイシン生産エシェリヒア・コリＮＳ１３９１株の構築
ＮＳ１３９１株は、以下のようにして得た。

最初に、不活性化アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ΔｉｌｖＩＨ及びΔｉｌｖＧＭの欠失の組合せ）を有する株を構築した。Ｐ１形質導入によって、ilvIH遺伝子（ΔｉｌｖＩＨ：：ｃａｔ）を野生型エシェリヒア・コリＫ１２株（ＶＫＰＭ Ｂ−７）から欠失させた（Sambrook他著, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ ΔｉｌｖＩＨ：：ｃａｔをドナー株として用いた。Red-driven integrationを用いて、ＭＧ１６５５株においてｉｌｖＩＨオペロンを欠失させた。この手順に従って、鋳型プラスミドにおいてilvIHオペロン及びクロラムフェニコール耐性を与える遺伝子と隣接する両方の領域と相同性がある、ＰＣＲプライマーＰ３４（配列番号３９）及びＰＣＲプライマーＰ３５（配列番号４０）を構築した。プラスミドｐＭＷ−ａｔｔＬ−Ｃｍ−ａｔｔＲ（ＰＣＴ国際出願第WO05/010175号）を、ＰＣＲ反応における鋳型として用いた。ＰＣＲ条件は、変性工程（９５℃で３分間）；最初の２回のサイクルのプロファイル（９５℃で１分間、３４℃で３０秒間、７２℃で４０秒間）；最後の３０サイクルのプロファイル（９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で４０秒間）；最終工程（７２℃で５分間）であった。得られた１７１３ｂｐのＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６のエレクトロポレーションに用いた。エレクトロポレーション後にクロラムフェニコール耐性組換え株を選択し、遺伝子座特異的プライマーＰ３６（配列番号４１）及びプライマーＰ３７（配列番号４２）によるＰＣＲを用いて検定した。ＰＣＲ検定の条件は、変性工程（９４℃で３分間）；３０サイクルのプロファイル（９４℃で３０秒間、５３℃で３０秒間、７２℃で１分２０秒間）；最終工程（７２℃で７分間）であった。鋳型としての親株ＩｌｖＩＨ⁺ＭＧ１６５５由来の染色体ＤＮＡとの反応で得られたＰＣＲ産物は２４９１ｎｔ長であった。鋳型としての変異型ＭＧ１６５５ ΔｉｌｖＩＨ：：ｃａｔ株由来の染色体ＤＮＡとの反応で得られたＰＣＲ産物は１８２３ｎｔ長であった。結果として、ＭＧ１６５５ ΔｉｌｖＩＨ：：ｃａｔ株が得られた。Ｐ１形質導入によってエシェリヒア・コリＫ１２（ＶＫＰＭ Ｂ−７）からilvIH遺伝子（ΔｉｌｖＩＨ：：ｃａｔ）を欠失させた後、Ｃｍ^R形質導入体を選択した。結果として、Ｂ−７ ΔｉｌｖＩＨ：：ｃａｔ株が得られた。Ｂ−７ ΔｉｌｖＩＨ：：ｃａｔからクロラムフェニコール耐性マーカーを除去するために、細胞を、プラスミドｐＭＷ１１８−ｉｎｔ−ｘｉｓ（Ａｐ^R）で形質転換した（国際公開第WO2005/010175号）。Ａｐ^Rクローンを、１５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で３０℃で増殖させた。数十のＡｐ^Rクローンを選抜し、クロラムフェニコール感受性について試験した。ＬＢ寒天プレート上で、４２℃でインキュベートすることによって、プラスミドｐＭＷ１１８−ｉｎｔ−ｘｉｓをＣｍ^s細胞から除去した。結果として、Ｂ−７ ΔｉｌｖＩＨ株が得られた。

Ｐ１形質導入によって、ilvGM遺伝子（ΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔ）をエシェリヒア・コリＢ−７ ΔｉｌｖＩＨから欠失させた。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ ΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔをドナー株として用いた。Red-driven integrationによって、ｉｌｖＧＭオペロンをＭＧ１６５５株から欠失させた。この手順に従って、鋳型プラスミドにおいてｉｌｖＧＭオペロン及びクロラムフェニコール耐性を与える遺伝子に隣接する両方の領域と相同性がある、ＰＣＲプライマーＰ３８（配列番号４３）及びＰＣＲプライマーＰ３９（配列番号４４）を構築した。プラスミドｐＭＷ−ａｔｔＬ−Ｃｍ−ａｔｔＲ（ＰＣＴ国際出願第WO05/010175号）を、ＰＣＲ反応における鋳型として用いた。ＰＣＲ条件は、変性工程（９５℃で３分間）；２回の最初のサイクルのプロファイル（９５℃で１分間、３４℃で３０秒間、７２℃で４０秒間）；最後の３０サイクルのプロファイル（９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で４０秒間）；最終工程（７２℃で５分間）であった。

得られた１７１３ｂｐのＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６のエレクトロポレーションに用いた。エレクトロポレーション後にクロラムフェニコール耐性組換え株を選択し、遺伝子座特異的プライマーＰ４０（配列番号４５）及びプライマーＰ４１（配列番号４６）によるＰＣＲを用いて検定した。ＰＣＲ検定の条件は、変性工程（９４℃で３分間）；３０サイクルのプロファイル（９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間）；最終工程（７２℃で７分間）であった。鋳型としての親株ＭＧ１６５５由来の染色体ＤＮＡとの反応で得られたＰＣＲ産物は２２０９ｎｔ長であった。鋳型としての変異型ＭＧ１６５５ ΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔ株由来の染色体ＤＮＡとの反応で得られたＰＣＲ産物は１９４１ｎｔ長であった。結果として、ＭＧ１６５５ ΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔ株が得られた。Ｐ１形質導入によってエシェリヒア・コリＢ−７からilvGM遺伝子（ΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔ）を欠失させた後、Ｃｍ^R形質導入体を選択した。結果として、Ｂ−７ ΔｉｌｖＩＨ ΔｉｌｖＢＮ ΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔ株が得られた。上記のように、Ｂ−７ ΔｉｌｖＩＨ ΔｉｌｖＢＮ
ΔｉｌｖＧＭ：：ｃａｔからクロラムフェニコール耐性マーカーを除去した。結果として、Ｂ−７ ΔｉｌｖＩＨ ΔｉｌｖＧＭ株が得られた。

Red-driven integrationによって、ｉｌｖＢＮオペロンの野生型調節領域を、λファージのＰ_Lプロモーターで置換した。この目的のために、唯一のＡＨＡＳ Ｉを有するＢ７
ΔｉｌｖＩＨ ΔｉｌｖＧＭ株を、このような変更形態の元株として用いた。Red-driven integrationの手順に従って、ＰＣＲプライマーＰ４２（配列番号４７）及びＰＣＲプライマーＰ４３（配列番号４８）を構築した。オリゴヌクレオチドＰ４２（配列番号４７）は、ilvB遺伝子の上流領域、及びＢＷ２５１１３ ｃａｔ−Ｐ_L−ｙｄｄＧの染色体ＤＮＡに存在する抗生物質耐性を与える遺伝子に隣接する領域と相同である。オリゴヌクレオチドＰ４３（配列番号４８）は、ｉｌｖＢ領域、及びＢＷ２５１１３ ｃａｔ−Ｐ_L−ｙｄｄＧの染色体に存在するＰ_Lプロモーター下流領域の両方と相同である。ＢＷ２５１１３ ｃａｔ−Ｐ_L−ｙｄｄＧを得ることは以前に詳述されている（欧州特許第1449918号（Ａ１）、ロシア特許第２２２２５９６号）。ＢＷ２５１１３ ｃａｔ−Ｐ_L−ｙｄｄＧ株の染色体ＤＮＡをＰＣＲ用の鋳型として用いた。ＰＣＲ条件は、変性（９５℃で３分間）；２回の最初のサイクルのプロファイル（９５℃で１分間、３４℃で３０秒間、７２℃で４０秒間）；最後の３０サイクルのプロファイル（９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で４０秒間）；最終工程（７２℃で５分間）であった。結果として、ＰＣＲ産物が得られ（配列番号４９）、アガロースゲルで精製し、温度感受性反復を有するプラスミドｐＫＤ４６を含有するエシェリヒア・コリＢ−７ ΔｉｌｖＩＨ ΔｉｌｖＧＭのエレクトロポレーションに用いた。エレクトロコンピテントな細胞を以下の通り調製した：エシェリヒア・コリＢ−７ ΔｉｌｖＩＨ ΔｉｌｖＧＭ株を、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を含有するＬＢ培地中で、３０℃で一晩増殖させ、培養物を、アンピシリン及びＬ−アラビノース（１ｍＭ）を含むＳＯＢ培地（Sambrook他著, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））５
ｍｌで１００倍に希釈した。細胞を、３０℃で通気しながらＯＤ₆₀₀＝約０．６まで増殖させた後、１００倍に濃縮し、氷冷した脱イオンＨ₂Ｏで３回洗浄することによってエレクトロコンピテントにした。細胞７０μｌ及びＰＣＲ産物＝約１００ｎｇを用いてエレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーション後、細胞を、３７℃で２．５時間、ＳＯＣ培地（Sambrook他著, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））１ｍｌでインキュベートした後、Ｌ寒天上に平板培養し、３７℃で増殖させてＣｍ^R組換え株を選択した。次に、ｐＫＤ４６プラスミドを除去するために、４２℃で、Ｃｍを含むＬ寒天上で２回、継代培養を実施し、アンピシリンに対する感受性に関して、得られたコロニーを試験した。

得られたＢ７ ΔｉｌｖＩＨ ΔｉｌｖＧＭ ｃａｔ−Ｐ_L−ｉｌｖＢＮ株は、バリン感受性であった。この株から、ＡＨＡＳ Ｉの新たなバリン耐性自然突然変異体が得られた。１ｇ／ｌのバリンでより良好に増殖した株を特性化した。

イソロイシンに対して耐性のあるバリン耐性突然変異体も得られた。野生型を超える比活性を有する変異体が得られた。変異型ｉｌｖＢＮ４の変異型オペロンのヌクレオチド配列を求めた。ＩｌｖＢＮ４がＩｌｖＮ：Ｎ１７Ｋ Ａｓｎ−Ｌｙｓ内に点突然変異を１つ含有する（コドンａａｃがａａｇで置換された）ことが明らかとなった。得られたＢ７ ΔｉｌｖＩＨ ΔｉｌｖＧＭ ｃａｔ−Ｐ_L−ｉｌｖＢＮ４株は、以下の構築に用いた。

次に、Ｐ１形質導入によって、ｃａｔ−Ｐ_L−ｉｌｖＢＮ４ ＤＮＡ断片を、エシェリヒア・コリＢ７ ΔｉｌｖＩＨ ΔｉｌｖＧＭ ｃａｔ−Ｐ_L−ｉｌｖＢＮ４から、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ ｍｉｎｉ−Ｍｕ：：ｓｃｒＫＹＡＢＲ（欧州特許出願第1149911号）へ移入した。結果として、ＥＳＰ２１４株が得られた。上記のように、クロラムフェニコール耐性マーカーをＥＳＰ２１４株から除去した。結果として、ＥＳＰ２１５株が得られた。

次に、引き続く染色体への組込みのために、配列番号５０に示すＤＮＡ断片を、ＥＳＰ２１５／ｐＫＤ４６株のエレクトロポレーションに用いた。このＤＮＡ断片は、染色体への組込みに必要な、遺伝子ｂ１７０１の３’領域、及び遺伝子ｂ１７０３の５’領域（これらの遺伝子は、遺伝子ppsと隣接している）と相補的な領域を含有する。切除可能なクロラムフェニコール耐性マーカーｃａｔ、及び構成プロモーターＰ_Lの制御下の変異型ｉｌｖＢＮ４オペロンも含有する。上記のようにエレクトロポレーションを実施した。選択されたＣｍ^R組換え株は、染色体へのｃａｔ−Ｐ_L−ｉｌｖＢＮ４断片の組込みの結果、遺伝子ppsの欠失を含有した。こうして、ＥＳＰ２１６株が得られた。上記のように、クロラムフェニコール耐性マーカーをＥＳＰ２１６株から除去した。結果として、ＥＳＰ２１７株が得られた。

次の工程で、構成プロモーターＰ_Lの制御下の変異型leuA遺伝子（Ｇｌｙ４７９→Ｃｙｓ）をＥＳＰ２１７株に導入した。引き続く染色体への組込みのために、（配列番号５１）に示すＤＮＡ断片を、ＥＳＰ２１７／ｐＫＤ４６株のエレクトロポレーションに用いた。このＤＮＡ断片は、染色体への組込みに必要であり、且つ遺伝子leuAの上流領域と相同性がある３５ｎｔの領域を含有する。クロラムフェニコール耐性マーカーｃａｔの配列と相補的な切除可能な領域、及び構成プロモーターＰ_Lの制御下の変異型ｌｅｕＡ（Ｇｌｙ４７９→Ｃｙｓ）遺伝子も含有する。上記のようにエレクトロポレーションを実施した。選択されたＣｍ^R組換え株は、染色体に組込まれた構成プロモーターＰ_Lの制御下の変異型遺伝子leuA（Ｇｌｙ４７９→Ｃｙｓ）を含有した。こうして、ＥＳＰ２２０株が得られた。上記のように、クロラムフェニコール耐性マーカーをＥＳＰ２２０株から除去した。結果として、ＥＳＰ２２１株が得られた。

次に、引き続く染色体への組込みのために、配列番号５２に示すＤＮＡ断片を、ＥＳＰ２２１／ｐＫＤ４６株のエレクトロポレーションに用いた。このＤＮＡ断片は、遺伝子tyrBの上流領域と相同性があり、且つ染色体への組込みに必要な３５ｎｔの領域を含有する。クロラムフェニコール耐性マーカーｃａｔの配列と相補的な切除可能な領域、及び改変された調節（−３５）領域を有する遺伝子tyrBも含有する。上記のようにエレクトロポレーションを実施した。選択されたＣｍ^R組換え株は、改変された調節（−３５）領域を有する遺伝子tyrBを含有した。こうして、ＮＳ１３９０株が得られた。上記のように、クロラムフェニコール耐性マーカーをＮＳ１３９０株から除去した。結果として、ＮＳ１３９１株が得られた。ロイシン生産株ＮＳ１３９１はさらなる作業に用いた。

実施例１６
Ｌ−ロイシン生産に対する変異型adhE遺伝子発現増大の影響
Ｌ−ロイシン生産に対するＰ_L-tacプロモーター制御下でのａｄｈＥ遺伝子の発現促進の影響を試験するために、Ｐ１形質導入によって、上記ＭＧ１６５５ Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*株の染色体由来のＤＮＡ断片を、Ｌ−ロイシン生産エシェリヒア・コリＮＳ１３９１株に移入して（Miller, J.H.（1972）著, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring
Harbor Lab. Press、ニューヨーク州プレーンビュー）、ＮＳ１３９１ Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*株を得た。

エシェリヒア・コリＮＳ１３９１株及びＮＳ１３９１ Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*株の両方を、Ｌ寒天プレート上で、３７℃で１８時間〜２４時間培養した。種培養物を得るために、回転式振盪培養機（２５０ｒｐｍ）上で、４％のスクロースを補充したＬブイヨン２ｍｌを含有する２０ｍｍ×２００ｍｍの試験管中で３２℃で１８時間、株を増殖させた。次に、発酵培地に、種物質０．２１ｍｌ（１０％）を接種した。２０ｍｍ×２００ｍｍの試験管の最小発酵培地２ｍｌ中で、発酵を実施した。細胞を、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３２℃で４８時間〜７２時間増殖させた。Ｌ−ロイシンの量をペーパークロマトグラフィ（液相組成：ブタノール−酢酸−水＝４：１：１）で測定した。表５に、１０個の独立した試験管発酵の結果を示す。以下の表５の通り、ＮＳ１３９１ Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*はＮＳ１３９１に比べて、エタノール濃度が異なる培地中で、多量のＬ−ロイシンを生産した。

発酵培地の組成（ｇ／ｌ）（ｐＨ７．２）は以下の通りであった：
グルコース ６０．０
エタノール ０／１０．０／２０．０／３０．０
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２５．０
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２．０
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．０
チアミン ０．０１
ＣａＣＯ₃ ２５．０
グルコース、エタノール及びＣａＣＯ₃は、別個に滅菌した。

実施例１７
Ｌ−フェニルアラニン生産に対するａｄｈＥ遺伝子発現増大の影響
フェニルアラニン生産に対するＰ_L-tacプロモーター制御下でのａｄｈＥ遺伝子の発現促進の影響を試験するために、Ｐ１形質導入によって、上記株ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８（ｃｌ．１８）；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８，Ｖａｌ５６６（ｃｌ．１）；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，ａｄｈＥ^*の染色体由来のＤＮＡ断片を、フェニルアラニン生産エシェリヒア・コリＡＪ１２７３９株に移入することができる（Miller, J.H.（1972）著, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press、ニューヨーク州プレーンビュー）。AJ12739株は、２００１年１１月６日に、ロシア国立工業用微生物収集所（ＶＫＰＭ）（Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1）に、アクセッション番号VKPM B-8197で寄託された後、２００２年８月２３日に、ブダペスト条約に基づく寄託に移管されている。

得られた株及び親株ＡＪ１２７３９はそれぞれ、栄養ブイヨン中で、３７℃で１８時間、培養することができ、得られた培養物０．３ｍｌはそれぞれ、２０ｍｍ×２００ｍｍの試験管中の発酵培地３ｍｌに接種し、回転式振盪培養機を用いて、３７℃で４８時間、培養することができる。培養後、培地中に蓄積するフェニルアラニンの量を、ＴＬＣによって求めることができる。蛍光指示薬を含まない０．１１ｍｍのＳｏｒｂｆｉｌシリカゲル層（Stock Company Sorbpolymer、ロシア連邦クラスノダール）でコーティングした１０ｃｍ×１５ｃｍのＴＬＣプレートを用いることができる。Ｓｏｒｂｆｉｌプレートは、移動相（２−プロパノール：酢酸エチル：２５％アンモニア水：水＝４０：４０：７：１６（ｖ／ｖ））で展開することができる。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として用いることができる。

発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
エタノール ２０．０
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １６．０
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．０
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．０１
塩酸チアミン ０．０００２
酵母エキス ２．０
チロシン ０．１２５
ＣａＣＯ₃ ２０．０
エタノール及び硫酸マグネシウムは別個に滅菌する。ＣａＣＯ₃は、１８０℃で２時間、乾熱滅菌する。ｐＨは７．０に調整する。

実施例１８
Ｌ−トリプトファン生産に対するａｄｈＥ遺伝子発現増大の影響
トリプトファン生産に対するＰ_L-tacプロモーター制御下でのａｄｈＥ遺伝子の発現促進の影響を試験するために、Ｐ１形質導入によって、上記株ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８（ｃｌ．１８）；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８，Ｖａｌ５６６（ｃｌ．１）；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，ａｄｈＥ^*の染色体由来のＤＮＡ断片を、トリプトファン生産エシェリヒア・コリＳＶ１６４（ｐＧＨ５）株に移入することができる（Miller, J.H.著, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, （1972）, ニューヨーク州プレーンビュー）。ＳＶ１６４株は、トリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸シンターゼをコードするtrpE対立遺伝子を有する。プラスミドｐＧＨ５は、セリンによるフィードバック阻害を受けないホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を内部に有する。ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）株に関しては、米国特許第6,180,373号又は欧州特許第0662143号に詳述されている。

得られた株及び親株ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）はそれぞれ、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン（ｐＧＨ５プラスミドのマーカー）を補充した栄養ブイヨン３ｍｌ中で、３７℃で１８時間、浸盪しながら培養することができる。それぞれ得られた培養物０．３ｍｌを、２０ｍｍ×２００ｍｍの試験管中の、テトラサイクリン（２０ｍｇ／ｌ）を含有する発酵培地３ｍｌに接種し、２５０ｒｐｍの回転式振盪培養機を用いて、３７℃で４８時間、培養することができる。培養後、培地中に蓄積するトリプトファンの量を、実施例１７に記載したように、ＴＬＣによって求めることができる。表６に、発酵培地の構成成分を記載するが、示しているような、別個の群のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨで滅菌して、滅菌中の好ましくない相互作用を回避するべきである。

実施例１９
Ｌ−ヒスチジン生産に対するａｄｈＥ遺伝子発現増大の影響
ヒスチジン酸生産に対するＰ_L-tacプロモーター制御下でのａｄｈＥ遺伝子の発現促進の影響を試験するために、Ｐ１形質導入によって、上記株ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８（ｃｌ．１８）；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８，Ｖａｌ５６６（ｃｌ．１）；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，ａｄｈＥ^*の染色体由来のＤＮＡ断片を、ヒスチジン生産エシェリヒア・コリ８０株に移入することができる（Miller, J.H.著, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, （1972）, ニューヨーク州プレーンビュー）。８０株は、ロシア特許第２１１９５３６号に記載され、１９９９年１０月１５日に、ロシア国立工業用微生物収集所（Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1）に、アクセッション番号VKPM B-7270で寄託された後、２００４年７月１２日に、ブダペスト条約に基づく寄託に移管されている。

得られた株及び親株８０はそれぞれ、Ｌブイヨン中で、２９℃で６時間、培養することができる。次に、それぞれ得られた培養物０．１ｍｌを、２０ｍｍ×２００ｍｍの試験管中の発酵培地２ｍｌに接種し、回転式振盪培養機（３５０ｒｐｍ）を用いて、２９℃で６５時間、培養することができる。培養後、培地中に蓄積するヒスチジンの量を、ペーパークロマトグラフィによって求めることができる。ペーパーは、移動相（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ））で展開することができる。ニンヒドリンのアセトン溶液（０．５％）を、可視化試薬として用いることができる。

発酵培地の組成（ｐＨ６．０）（ｇ／ｌ）：
エタノール ２０．０
豆濃（大豆加水分解物） 総窒素として０．２
Ｌ−プロリン １．０
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２５．０
ＫＨ₂ＰＯ₄ ２．０
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．０
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ₄ ０．０１
チアミン ０．００１
ベタイン ２．０
ＣａＣＯ₃ ６０．０
エタノール、プロリン、ベタイン及びＣａＣＯ₃は、別個に滅菌する。滅菌前にｐＨを６．０に調整する。

実施例２０
Ｌ−グルタミン酸生産に対するａｄｈＥ遺伝子発現増大の影響
グルタミン酸生産に対するＰ_L-tacプロモーター制御下でのａｄｈＥ遺伝子の発現促進の影響を試験するために、Ｐ１形質導入によって、上記株ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ^*；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８（ｃｌ．１８）；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，Ｐ_L-tacａｄｈＥ−Ｌｙｓ５６８，Ｖａｌ５６６（ｃｌ．１）；ＭＧ１６５５Δｔｄｈ，ｒｈｔＡ^*，ａｄｈＥ^*の染色体由来のＤＮＡ断片を、グルタミン酸生産エシェリヒア・コリＶＬ３３４ｔｈｒＣ⁺株（欧州特許第1172433号）に移入することができる（Miller, J.H.著, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, （1972）, ニューヨーク州プレーンビュー）。ＶＬ３３４ｔｈｒＣ⁺株は、２００４年１２月６日に、ロシア国立工業用微生物収集所（VKPM）（Russia, 117545
Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1）にアクセッション番号VKPM B-8961で寄託された後、２００４年１２月８日に、ブダペスト条約に基づく寄託に移管されている。

得られた株及び親株ＶＬ３３４ｔｈｒＣ⁺はそれぞれ、栄養ブイヨン３ｍｌ中で、３７℃で１８時間、浸盪しながら培養することができる。それぞれ得られた培養物０．３ｍｌを、２０ｍｍ×２００ｍｍの試験管中の発酵培地３ｍｌに接種し、２５０ｒｐｍの回転式振盪培養機を用いて、３７℃で４８時間、培養することができる。

発酵培地の組成（ｐＨ７．２）（ｇ／ｌ）：
エタノール ２０．０
硫酸アンモニウム ２５．０
ＫＨ₂ＰＯ₄ ２．０
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．０
チアミン ０．０００１
Ｌ−イソロイシン ０．０５
ＣａＣＯ₃ ２５．０
エタノール及びＣａＣＯ₃は、別個に滅菌した。

本発明を、それらの好ましい実施形態を参照して詳述してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく、各種変更形態を作製することができると共に、均等物を利用することができることは、当業者に明らかである。上述した各文献は、その全体が本明細書中に参照により援用される。

本発明により、腸内細菌科の細菌によるＬ−アミノ酸の生産を促進することができる。

Claims (7)

1. Ａ）アルコールデヒドロゲナーゼを有する腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産菌を好気的条件下でエタノールを含有する培養培地で培養すること、及び
   Ｂ）前記Ｌ−アミノ酸を前記培養培地から単離すること、
   を含む、発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法であって、
   前記アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が好気条件で機能する非野生型プロモーターの制御下で発現されることにより、野生型株と比較してアルコールデヒドロゲナーゼ活性が増大していることを特徴とし、
   前記アルコールデヒドロゲナーゼが好気条件での不活性化に耐性であり、
   前記Ｌ−アミノ酸生産菌が、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラシア属、シゲラ属、及びモルガネラ属からなる群から選択される属に属する、方法。
2. 前記非野生型プロモーターが、Ｐ_tac、Ｐ_lac、Ｐ_trp、Ｐ_trc、Ｐ_R、及びＰ_Lからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記アルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、５６８番目のグルタミン酸残基がアスパラギン酸残基以外のアミノ酸残基に置換されていることを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記アルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、５６８番目のグルタミン酸残基がリジン残基に置換されていることを含む、請求項１または２に記載の方法。
5. 前記アルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、５６８番目のグルタミン酸残基が他のアミノ酸残基に置換される変異を有し、さらに、
   Ａ）配列番号２における５６０番目のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基への置換、
   Ｂ）配列番号２における５６６番目のフェニルアラニン残基の他のアミノ酸残基への置換、
   Ｃ）配列番号２における、２２番目のグルタミン酸残基、２３６番目のメチオニン残基、４６１番目のチロシン残基、５５４番目のイソロイシン残基、及び７８６番目のアラニ
   ン残基それぞれの他のアミノ酸残基への置換、並びに
   Ｄ）これらの組合せ、
   からなる群から選択される変異を有する、請求項１または２に記載の方法。
6. 配列番号２における、２２番目のグルタミン酸残基、２３６番目のメチオニン残基、４６１番目のチロシン残基、５５４番目のイソロイシン残基、及び７８６番目のアラニン残基が、それぞれ、グリシン残基、バリン残基、システイン残基、セリン残基、及びバリン残基へ置換される、請求項５に記載の方法。
7. 前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸、及びＬ−ロイシンからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

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