BRPI0017590B1 - conjugado de maitansinoide - anticorpo anti-erbb, e formulação farmacêutica - Google Patents

Abstract

conjugado de maitansinoide - anticorpo anti-erbb, formulação farmacêutica, artigo e uso de tal conjugado e de tal formulação. a presente invenção refere-se a conjugado de anticorpo anti-erbb2 ligado a maitansinoide. tal conjugado caracteriza-se pelo fato de o dito anticorpo anti-erbb2 se ligar essencialmente ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal murino 4d5 (atcc crl 10463) e de o dito maitansinoide ser selecionado do grupo que consiste em maitansina, maitansinol e um éster de maitansinol. esse conjugado é apropriado para uso na produção de medicamento para tratamento de tumor que superexpressa erbb2, por exemplo câncer de mama.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para CONJUGADO DE MAITANSINOIDE - ANTICORPO ANTI-ErbB, E FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA.

Dividido do PI 0012196-7, depositado em 23/06/2000.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a conjugados de maitansinoide e de anticorpo receptor anti-ErbB, à formulação farmacêutica à base deles e a artigos industrializados contendo-os, utilizáveis em tratamento, especialmente terapias de câncer dirigidas a receptor de ErbB.

Antecedentes da Invenção

- Maitansina e Maitansinoides

A maitansina foi isolada pela primeira vez a partir do arbusto do leste africano Maytenus serrata (patente US 3.896.111). Em seguida, descobriu-se que certos micróbios também produzem maitansinoides, tais como maitansinol e ésteres C-3 maitansinol (patente US 4.151.042). Análogos de maitansinol e maitansinol sintéticos são descritos, por exemplo, nas patentes US 4.137.230, 4.248.870, 4.256.746, 4.260.608, 4.265.814, 4.294.757, 4.307.016, 4.308.268, 4.308.269, 4.309.428, 4.313.946, 4.315.929,

4.317.821, 4.322.348, 4.331.598, 4.361.650, 4.364.866, 4.424.219,

4.450.254, 4.362.663 e 4.371.533, cujos relatórios descritivos são expressamente incorporados ao presente como referência.

Maitansina e maitansinoides são altamente citotóxicos, mas sua utilização clínica em terapia de câncer vem sendo grandemente limitada pelos seus severos efeitos colaterais sistêmicos atribuídos principalmente à sua má seletividade para tumores. Testes clínicos com maitansina haviam sido suspensos devido a sérios efeitos adversos sobre o sistema nervoso central e o sistema gastrintestinal (Issel et al., Can. Trtmnt. Rev., 5:199-207,. 1978).

- FAMÍLIA ErbB DE TIROSINA QUINASES RECEPTORAS E ANTICORPOS ANTI-ErbB

Os membros da família ErbB de tirosina quinases receptoras são mediadores importantes do crescimento, diferenciação e sobrevivência celular. A família de receptor inclui quatro membros distintos, que incluem receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR ou ErbB1), HER2 (ErbB2 ou p185^neu)> HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4 ou tiro2).

O p185^neufoi identificado originalmente como produto do gene de transformação de neuroblastomas de ratos tratados quimicamente. A forma ativada do proto-oncogene neu resulta de uma mutação pontual (valina em ácido glutâmico) na região de transmembrana da proteína codificada. A amplificação do homólogo humano de neu é observada em cânceres de mama, ovário e correlatos com mau prognóstico (Slamon et al., Science, 235:177182, 1987; Slamon et al., Science, 244:707-712, 1989; e patente US 4.968.603). Até o momento, nenhuma mutação pontual análoga à do protooncogene neu foi relatada para tumores humanos. A sobre-expressão de ErbB2 (frequentemente, mas não uniformemente devido à amplificação genética) também foi observada em outros carcinomas, incluindo carcinomas do estômago, endométrio, glândulas salivares, pulmão, rim, cólon, tiroide, pâncreas e bexiga. Vide, entre outros, King et al., Science, 229:974, 1985; Yokota et al., Lancet, 1:765-767, 1986; Fukushigi et al., Mol. Cell. Biol., 6:955-958, 1986; Geurin et al., Oncogene Res., 3:21-31, 1988; Cohen et al., Oncogene, 4:81-88, 1989; Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034, 1991; Borst et al., Gynecol. Oncol, 38:364, 1990; Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425, 1990; Kern et al, Cancer Res., 50:5184, 1990; Park et al., Cancer Res., 49:6605, 1989; Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:354-357, 1990; Aasland et al., Br. J. Cancer, 57:358-363, 1988; Williams et al., Pathiobiology, 59:46-52, 1991; e McCann et al., Cancer, 65:88-92, 1990. O ErbB2 pode ser sobre-expresso em câncer da próstata (Gu et al., Cancer Lett, 99:185-9, 1996; Ross et al., Hum. Pathol., 28:827-33, 1997; Ross et al, Cancer, 79:2162-70, 1997; e Sadasivan et al., J. Urol., 150:126-31, 1993). Uma forma dividida de oncogene erbB2 codificadora de urn receptor ErbB2 constitutivamente fosforilado por tirosina é descrita no Pedido WO 00/20579, publicado em 13 de abril de 2000. A proteína erbB2 codificada pela variante dividida possui exclusão em um quadro de 16 aminoácidos (CVDLDDKGCPA3

EQRAS), dois dos quais são resíduos de cisteína conservados.

Foram descritos anticorpos dirigidos aos produtos de proteína p185^neu de ratos e ErbB2 humanos. Drebin e colegas levantaram anticorpos contra o produto genético neu de rato, p185^neu. Vide, por exemplo, Drebin et al., Cell, 41:695-706, 1985; Myers et al., Meth. Enzym., 198:277-290, 1991; e WO 94/22478. Drebin et al., Oncogene, 2:273-277, 1998, relatam que misturas de anticorpos reativas com duas regiões distintas de p185^neu resultam em efeitos antitumorais sinérgicos sobre células NIH-3T3 transformadas por neu implantadas em camundongos nus. Vide também a patente US 5.824.311, concedida em 20 de outubro de 1998.

Outros anticorpos anti-ErbE2 com diversas propriedades foram descritos em Tagliabue et al., Int. J. Cancer. 47:933-937, 1991; McKenzie et al., Oncogene, 4:543-548, 1989; Maier et al, Cancer Res., 51:5361-5369, 1991; Bacus et al, Molecular Carcinogenesis, 3:350-362, 1990; Stancovski et al., PNAS (USA), 88:8691-8695, 1991; Bacus et al, Cancer Research, 52:2580-2589, 1992; Xu et al, Int. J. Cancer, 53:401-408, 1993; WO 94/00136; Kasprzyk et al, Cancer Research, 52:2771-2776, 1992; Hancock et al, Cancer Res., 51:4575-4580, 1991; Shawver et al, Cancer Res., 54:1367-1373, 1994; Arteaga et al, Cancer Res., 54:3758-3765, 1994; Harwerth et al, J. Biol. Chem., 267:15160-15167, 1992; patente US 5.783.186; e Klapperetal, Oncogene, 14:2099-2109, 1997.

Hudziak et al, Mol. Cell. Biol, 9(3):1165-1172, 1989, descrevem a geração de um quadro de anticorpos anti-ErbB2 que foram caracterizados através da utilização da linhagem celular de tumor de mama humano SKBR-3. A proliferação celular relativa das células SK-BR-3 em seguida à exposição dos anticorpos foi determinada por manchas violetas de cristal das monocamadas após 72 horas. Através da utilização deste ensaio, obteve-se inibição máxima com o anticorpo denominado 4D5 que inibiu a proliferação celular em 56%. Outros anticorpos no quadro reduziram a proliferação celular em menor extensão neste ensaio. Concluiu-se adicionalmente que o anticorpo 4D5 sensibiliza linhagens celulares de tumor de mama que sobreexpressem ErbB2 para os efeitos citotóxicos de TNF-α. Vide também a pa tente US 5.677.171, concedida em 14 de outubro de 1997. Os anticorpos anti-ErbB2 discutidos em Hudziak et al., são caracterizados adicionalmente em Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558, 1990; Kotts et al., In Vitro, 26(3):59A, 1990; Sarup et al., Growth Regulation, 1:72-82, 1991; Shepard et al., J. Clin. Immunol., 11(3):117-127, 1991; Kumar et al., Mol. Cell. Biol, 11(2):979-986, 1991; Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother., 37:255263, 1993; Pietras et al., Oncogene, 3:1829-1838, 1994; Vitetta et al., Cancer Research, 54:5301-5309, 1994; Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665, 1994: Scott et al., J. Biol. Chem., 266:14300-5, 1991; D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:7202-7206, 1994; Lewis et al., Cancer Research, 56:1457-1465, 1996; e Schaefer et al., Oncogene, 15:13851394, 1997.

O anticorpo anti-HER2 monoclonal de murinos inibe o crescimento de linhagens celulares de câncer de mama que sobre-expressem HER2 no nível 2+ e 3+, mas não apresenta atividade sobre células que expressam níveis menores de HER2 (Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother., 1993). Com base nesta observação, o anticorpo 4D5 foi humanizado (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89:4285-4289, 1992). A versão humanizada denominada Herceptin® (huMAb4D5-8, rhuMAbHER2, patente US 5.821.337) foi testada em pacientes com câncer de mama cujos tumores sobre-expressam HER2 mas que haviam progredido após quimioterapia convencional (Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14:737-744, 1996; Clobeigh et al., J. Clin. Oncol, 17:2639-2648, 1999). A maior parte dos pacientes neste teste expressou HER2 no nível 3+, embora uma parte tenha sido de tumores 2+. Notadamente, Herceptin® induziu reações clínicas em 15% dos pacientes (reações completas em 4% de pacientes e reações parciais em 11 %) e a duração média dessas reações foi de 9,1 meses. Herceptin® recebeu aprovação comercial da Administração de Alimentos e Drogas em 25 de setembro de 1998 para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático, cujos tumores sobre-expressam a proteína ErbB2.

Seleção de homologia resultou na identificação de dois outros membros da família de receptores de ErbB; ErbB3 (patente US 5.183.884 e

5.480.968, bem como Kraus et al., PNAS (USA), 86:9193-9197, 1989) e ErbB4 (pedido de patente EP 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 90:1746-1750, 1993; e Plowman et al., Nature, 366:473-475, 1993). Ambos estes receptores exibem maior expressão sobre pelo menos algumas linhagens celulares de câncer de mama.

- CONJUGADOS DE ANTICORPOS E MAITANSINOIDE

Em tentativa de melhorar seu índice terapêutico, maitansina e maitansinoides foram conjugados a anticorpos que se unem especificamente a antígenos de células tumorais. São descritos imunoconjugados que contenham maitansinoides, por exemplo, nas patentes US 5.208.020 e 5.416.064 e na patente EP 0.425.235 B1, cujas revelações são expressamente incorporadas ao presente como referência. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 93:8618-8623, 1996, descreveram imunoconjugados que compreendem um maitansinoide denominado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido a câncer colorretal humano. Concluiu-se que o conjugado é altamente citotóxico para células de câncer do cólon cultivadas e exibiu atividade antitumores em um ensaio de crescimento de tumor in vivo. Chari et al., Cancer Research, 52:127-131, 1992, descrevem imunoconjugados em que um maitansinoide foi conjugado através de uma ligação de dissulfeto ao anticorpo A7 de murinos que se liga a um antígeno sobre linhagens celulares de câncer de cólon humano, ou a outro anticorpo monoclonal de murinos TA.1 que se liga ao oncogene HER-2/neu. A citotoxicidade do conjugado de maitansinoide-TA.1 foi testada in vitro sobre a linhagem de células de câncer de mama humano SK-BR-3, que expressa 3 x 10⁵ antígenos de superfície HER-2 por célula. O conjugado de drogas atingiu um grau de citotoxicidade similar à droga maitansinoide livre, que pode ser aumentada através do aumento do número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticorpo. O conjugado de maitansinoide-A7 exibiu baixa citotoxicidade sistêmica em camundongos.

Embora Herceptin® seja uma revolução no tratamento de pacientes com cânceres de mama que sobre-expressem ErbB2 que tenham recebido extensa terapia anticâncer anterior, geralmente cerca de 85% dos pacientes nessa população deixam de responder, ou respondem muito pouco, ao tratamento com Herceptin® e, no teste clínico anterior à aprovação comercial, o tempo médio de avanço da doença em todos os pacientes tratados foi de apenas 3,1 meses. Existe, portanto, necessidade clínica significativa de desenvolvimento de outras terapias de câncer dirigidas a HER2 para os pacientes com tumores que sobre-expressem HER2 ou outras doenças associadas à expressão de HER2 que não respondem, ou respondem mal, ao tratamento com Herceptin®.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

A presente invenção baseia-se na descoberta experimental inesperada de que conjugados de maitansinoide e Herceptin® são altamente eficazes no tratamento de tumores que sobre-expressem HER2 (ErbB2) e que não respondam, ou respondam mal, à terapia com Herceptin®.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de tumores em mamíferos, em que o tumor é caracterizado pela sobre-expressão de um receptor de ErbB e não responde ou responde mal ao tratamento com um anticorpo anti-ErbB monoclonal, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado do anticorpo anti-ErbB com um maitansinoide.

Em realização preferida, o paciente é um ser humano. Em outra realização preferida, o receptor de ErbB é ErbB2 (HER2) (humano). O método não é limitado pelo mecanismo de ação do anticorpo anti-ErbB utilizado. Assim, o anticorpo anti-ErbB pode possuir, por exemplo, propriedades inibidoras do crescimento e/ou pode induzir a morte celular e/ou apoptose. Em realização especificamente preferida, o método refere-se ao tratamento de câncer, incluindo, sem limitação, câncer de mama, ovário, estômago, endométrio, glândulas salivares, pulmão, rim, cólon, colorretal, tiroide, pâncreas, próstata e bexiga. Preferencialmente, o câncer é câncer de mama, particularmente câncer de mama que sobre-expresse ErbB2 em nível 2+ ou acima, de maior preferência em nível 3+. Um grupo preferido de anticorpos possui característica biológica de um anticorpo monoclonal 4D5 ou se liga essencialmente ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 4D5, sendo particu larmente preferida uma forma humanizada do anticorpo monoclonal de murinos 4D5 (ATCC CRL 10463).

O maítansinoide utilizado nos conjugados da presente invenção pode ser maitansina ou, preferencialmente, maitansinol ou um éster maitansinol. O anticorpo e maítansinoide podem ser conjugados por uma ligação química biespecífica, tal como N-succinimidil-4-(2-piridiltio)propanoato (SPDP) ou N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP). O grupo de ligação entre o anticorpo e o maítansinoide pode ser, por exemplo, um grupo dissulfeto, um grupo tioéter, um grupo lábil a ácido, um grupo fotolábil, um grupo lábil a peptidase ou um grupo lábil a esterase.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um artigo industrializado que compreende um recipiente e uma composição nele contida, em que a composição compreende um conjugado de maítansinoide e anticorpo anti-ErbB e compreende adicionalmente uma etiqueta (também chamada rótulo) ou bula que indica que a composição pode ser utilizada para o tratamento de câncer caracterizado por sobre-expressão de um receptor de ErbB, preferencialmente em nível 2+ ou acima.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHQS

A Figura 1 exibe a estrutura do maítansinoide, denominada DM1.

A Figura 2 ilustra a estrutura de um conjugado de Herceptin®DM1.

A Figura 3 é o perfil da eluição do conjugado de Herceptin®DM1 sobre uma coluna de filtragem de gel Sephacryl S300.

A Figura 4 exibe a sequência de nucleotídeos de uma construção de plasmídeo de transgênese HER2 (SEQ ID NO:1) que direciona a expressão de HER2 humano nativo (ErbB2) na glândula mamária de um camundongo transgênico. A figura inclui a sequência de nucleotídeos do inserto de cDNA do HER2 (ErbB2) (SEQ ID NO:2), bem como a sequência de aminoácidos deduzida de HER2 (ErbB2) (SEQ ID NO:3), incluindo a sequência de sinal. Na SEQ ID NO:3, resíduos de cerca de 22 a cerca de 645, inclusive, representam o domínio extracelular de HER2 (ErbB2).

A Figura 5 ilustra o efeito de Herceptin®-DM1 sobre tumores transgênicos HER2. Pedaços de 2 mm³ de tumores transgênicos HER2MMTV foram transplantados para a almofada de gordura mamária de camundongos FVB. Quando os tumores atingiram 250 mm³, grupos de oito camundongos receberam injeção intravenosa em cinco dias consecutivos com um conjugado de Herceptin®-DM1. Dois outros grupos de camundongos foram tratados de forma intraperitoneal duas vezes por semana com 10 mg/kg de Herceptin® ou Rituxan®.

A figura 6 exibe a sequência de região variável de cadeia pesada de um anticorpo 2C4 anti-HER2 humanizado.

A figura 7 exibe a sequência de região variável de cadeia leve de um anticorpo 2C4 anti-HER2 humanizado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

I - DEFINIÇÕES

A menos que definido em contrário, os termos técnicos e científicos utilizados no presente possuem o mesmo significado comumente compreendido pelos técnicos comuns no assunto a que pertence a presente invenção. Singleton etal., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2^a edição, J. Wiley & Sons (Nova Iorque NY, Estados Unidos, 1994). Um técnico no assunto reconhecerá muitos métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos no presente, que poderão ser utilizados na prática da presente invenção. De fato, a presente invenção não é limitada, de nenhuma forma, aos métodos e materiais descritos. Para os propósitos da presente invenção, os seguintes termos são definidos abaixo.

Um receptor de ErbB ou ErbB é uma tirosina quinase de proteína receptora que pertence à família de receptores de ErbB e inclui receptores de ErbB1 (EGFR), ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3) e ErbB4 (HER4) e outros membros dessa família a serem identificados no futuro. A definição inclui especificamente receptores de ErbB codificados por formas divididas dos oncogenes de ErbB correspondentes, incluindo, sem limitação, variante de exclusão de ErbB2 descrita no pedido WO 00/20579 (publicada em 13 de abril de 2000). O receptor de ErbB compreenderá geralmente um domínio extracelular, que pode se ligar a um ligante de ErbB; um domínio de transmembrana lipofílico; um domínio de tirosina quinase intracelular conservado; e um domínio de sinalização de terminal carboxila que abriga diversos resíduos de tirosina que podem ser fosforilados. O receptor de ErbB pode ser um receptor de ErbB de sequência nativa ou um derivado funcional, tal como uma de suas variantes de sequência de aminoácido. Preferencialmente, o receptor de ErbB é um receptor de ErbB humano de sequência nativa.

As expressões ErbB1, receptor de fator de crescimento epidérmico e EGFR, são utilizados de forma intercambiável no presente e refere-se a EGFR de sequência nativa conforme descrito, por exemplo, em Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem,, 56:881-914, 1987, incluindo suas formas mutantes de ocorrência natural (por exemplo, EGFR mutante de exclusão como em Humphrey et al., PNAS(USA), 87:4207-4211, 1990) e seus derivados funcionais, tais como variantes de sequências de aminoácidos. O ErbB1 refere-se ao gene codificador do produto de proteína EGFR.

As expressões ErbB2 e HER2 são utilizadas de forma intercambiável no presente e designam a proteína HFR2 humana descrita, por exemplo, em Semba et al., PNAS (USA)t 82:6497-6501, 1985, e Yamamoto et al., Nature, 319:230-234, 1986, (número de acesso Genebank - Banco de Dados de Sequências - X03363) e derivados funcionais, tais como suas variantes de sequências de aminoácidos. O termo erbB2 refere-se ao gene codificador de HER2 humano e neu refere-se ao gene codificador de p185^neude rato. O HER2 preferido é um HER2 humano de sequência nativa. Exemplos de anticorpos que se ligam ao HER2 incluem Mabs 4D5 (ATCC CRL 10463), 2C4 (ATCC HB-12697), 7F3 (ATCC HB-12216) e 7C2 (ATCC HB 12215) (vide patente US 5.772.997; WO 98/77797; e patente US 5.840.525, expressamente incorporada ao presente como referência). Anticorpos anti-HER2 humanizados incluem huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (Herceptin®), conforme descrito na Tabela 3 da patente US 5.821.337, expressamente incorporada ao presente como referência; 520C9 humanizado (WO 93/21319). Anticorpos anti-HER2 humanos são descritos na patente US 5.772.997, concedida em 30 de junho de 1998, e WO 97/00271, publicada em 3 de janeiro de 1997.

ErbB3 e HER3 designam o polipeptídeo receptor descrito, por exemplo, nas patentes US 5.183.884 e 5.480.968, bem como em Kraus et al., PNAS (USA), 86:9193-9197, 1989, e derivados funcionais, que incluem suas variantes de sequências de aminoácidos. Exemplos de anticorpos que se ligam ao HER3 são descritos na patente US 5.968.511 (Akita e Sliwkowski), por exemplo, o anticorpo 8B8 (ATCC HB 12070) ou uma de suas variantes humanizadas.

Os termos ErbB4 e HER4 designam no presente o polipeptídeo receptor descrito, por exemplo, no pedido de patente EP 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 90:1746-1750, 1993; e Plowman et al, Nature, 366:473-475, 1993, e derivados funcionais, incluindo suas variantes de sequências de aminoácidos, tais como as insoformas de HER4 descritas no WO 99/19488.

Um polipeptídeo nativo ou sequência nativa de EGFR, HER2, HER3 ou HER4 pode ser isolado da natureza, produzido através de técnicas de tecnologia de DNA recombinante, sintetizados quimicamente ou produzidos através de qualquer combinação destes métodos ou similares.

Derivados funcionais incluem variantes de sequências de aminoácidos e derivados covalentes dos polipeptídeos nativos, desde que retenha atividade biológica qualitativa do polipeptídeo nativo correspondente. Variantes de sequências de aminoácidos geralmente diferem de uma sequência nativa na substituição, exclusão e/ou inserção de um ou mais aminoácidos em qualquer ponto de uma sequência de aminoácido nativa. Variantes de exclusão incluem fragmentos dos polipeptídeos nativos, com as variantes possuindo truncagens de C- e/ou N-terminal. Normalmente, variantes de sequências de aminoácidos possuirão pelo menos 70% de homologia, preferencialmente pelo menos cerca de 80%, de maior preferência pelo menos cerca de 90% de homologia com um polipeptídeo nativo.

Homologia é definida como o percentual de resíduos na varian te de sequência de aminoácido que são idênticos após o alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para atingir a homologia percentual máxima. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem-conhecidos na técnica. Um desses programas de computador é Align 2, de autoria da Genentech, Inc, que foi depositado com a documentação de usuário no Escritório de Direitos Autorais dos Estados Unidos, Washington DC 20559, Estados Unidos, em 10 de dezembro de 1991.

Ligante de ErbB indica um polipeptídeo que se liga e/ou se ativa a um receptor de ErbB. O ligante de ErbB de interesse específico no presente é um ligante de ErbB humano de sequência nativa, tal como fator de crescimento epidérmico (ECP) (Savage et al., J. Biol. Chem., 247:76127621, 1972): fator alfa de crescimento de transformação (TGF-α) (Marquardt et al. Science, 223; 1079-1082, 1984); anfirregulina, também conhecida como fator de crescimento de autocrina queratinócita ou schwanoma (Shoyab et al., Science, 243:1074-1076, 1989; Kimura et al., Nature, 348:257-260, 1990; e Cook et al., Mol. Cell. Biol., 11:2547-2557, 1991); betacelulina (Shing et al., Science, 259:1604-1607, 1993; e Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173, 1993); fator de crescimento epidérmico ligado à heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science, 251:936-939, 1991); epirregulina (Toyoda et al., J. Biol. Chem., 270:7495-7500, 1995; e Komurasaki et al., Oncogene, 15:2841-2848, 1997); herregulina (vide abaixo); neurregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387:512-516, 1997); neurregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad, Sei., 94:9562-9567, 1997); ou cripto (CR-1) (Kannan et al., J. Biol. Chem., 272(6):3330-3335, 1997). Ligantes de ErbB que se ligam a EGFR incluem EGF, TGF-α, anfirregulina, betacelulina, HB-EGF e epirregulina. Ligantes de ErbB que unem HER3 incluem herregulinas. Ligantes de ErbB capazes de ligação de HER4 incluem betacelulina, epirregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 e herregulinas.

Herregulina (HRG), quando utilizada no presente, refere-se a um polipeptídeo que ativa os complexos de proteínas ErbB2-ErbB3 e ErbB2ErbB4 (ou seja, induz a fosforilação de resíduos de tirosina no complexo mediante um ligamento a ele). Diversos polipeptídeos de herregulina englo bados por este termo são descritos em Holmes et al., Science, 256:12051210, 1992; WO 92/20798; Wen et al., Mol. Cell. Biol, 14(3):1909-1919, 1994 e Marchionni et al., Nature, 362:312-318, 1993, por exemplo. O termo inclui fragmentos biologicamente ativos e/ou variantes de um polipeptídeo de HRG de ocorrência natural, tal como um de seus fragmentos de domínios similares a EGF (por exemplo, HRGpi 177-244)·

Um hetero-olgômero de ErbB no presente é um oligômero associado de forma não covalente que compreende pelo menos dois receptores de ErbB diferentes. Esses complexos podem se formar quando uma célula que expresse dois ou mais receptores de ErbB for exposta a um ligante de ErbB e puder ser isolada através de imunoprecipitação e analisados por SDS-PAGE, conforme descrito em Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665, 1994, por exemplo. Exemplos desses heteroolgômeros de ErbB incluem complexos de EGFR-HER2, HER2-HER3 e HER3-HER4. Além disso, o hetero-olgômero de ErbB pode compreender dois ou mais receptores de HER2 combinados com um receptor diferente de ErbB, tal como HER3, HER4 ou EGFR. Outras proteínas, tais como uma subunidade receptora de citocina (por exemplo, gp130) pode ser incluída no hetero-olgômero.

No contexto de variantes de HER2, tais como fragmentos de HER2, a expressão que possui a atividade biológica de um HER2 humano nativo é utilizada para designar a capacidade qualitativa desses fragmentos em inibir o crescimento tumoral quando sobre-expressos em um modelo animal (transgênico ou não transgênico) da presente invenção.

Tumor, da forma utilizada no presente, designa todo o crescimento e proliferação de células neoplásicas, sejam malignas ou benignas, e todos os tecidos e células cancerosas e pré-cancerosas.

Os termos câncer e canceroso designam ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular não regulado. Os exemplos de câncer incluem, mas sem se limitar à carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem câncer celu lar escamoso (por exemplo, câncer celular escamoso epitelial), câncer pulmonar que inclui câncer pulmonar de células pequenas, câncer pulmonar de células não-pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou estomacal que inclui câncer gastrintestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer renal, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal e carcinoma peniano, bem como câncer do cérebro e garganta.

Um câncer que sobre-expresse um receptor de ErbB é um que possui níveis significativamente mais altos de um receptor de ErbB, tal como HER2, na sua superfície celular, em comparação com uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Essa sobre-expressão pode ser causada por amplificação genética por aumento da transcrição ou tradução. A sobreexpressão de receptor de ErbB pode ser determinada em ensaio de diagnóstico ou prognóstico através da avaliação de níveis maiores da proteína ErbB presentes sobre a superíície de uma célula (através, por exemplo, de um ensaio de imuno-histoquímica; IHC). Alternativa ou adicionalmente, podemse medir os níveis de ácido nucleico codificador de ErbB na célula, por exemplo, através de hibridação in situ fluorescente (FISH; vide WO 98/45479 publicado em outubro de 1998), Southern Blot ou reação em cadeia de polimerase (PCR), tal como PCR quantitativa em tempo real (RT-PCR). Pode-se também estudar a sobre-expressão de receptor de ErbB através da medição do antígeno derramado (domínio extracelular de ErbB, por exemplo) em urn fluido biológico, tal como soro (vide, por exemplo, patente US 4.933.294 concedida em 12 de junho de 1990; WO 91/05264, publicada em 18 de abril de 1991; patente US 5.401.638, concedida em 28 de março de 1995; e Sias et al., J. Immunol. Methods, 132:73-80, 1990). Além dos ensaios acima, diversos ensaios in vivo são disponíveis para os técnicos no assunto. Pode-se, por exemplo, expor células no interior do corpo do paciente a um anticorpo, que é opcionalmente marcado com um marcador detectável, por exemplo um isótopo radioativo, e pode-se avaliar a ligação do anticorpo a células do paciente através, por exemplo, de varredura externa em busca de radioatividade ou de análise de uma biópsia tomada de um paciente exposto anteriormente ao anticorpo.

Os tumores que sobre-expressam HER2 são avaliados por ensaios de imuno-histoquímica que correspondem ao número de cópias de moléculas de HER2 expressos por célula e podem ser determinados bioquimicamente: 0 = 0 a 10.000 cópias por célula, 1+ = pelo menos cerca de 200.000 cópias por célula; 2+ = pelo menos cerca de 500.000 cópias por célula; 3+ = pelo menos cerca de 2.000.000 cópias por célula. A sobreexpressão de HER2 no nível 3+, que gera a ativação independente de ligantes da tirosina quinase (Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 84:7159-7163, 1987) ocorre em cerca de 30% de cânceres de mama e, nesses pacientes, a sobrevivência livre de reincidência e sobrevivência geral são reduzidas (Slamon et al, Science, 244:707-712, 1989; Slamon et al., Science, 235:177-182, 1987).

Por outro lado, um câncer que não é caracterizado por sobreexpressão de um receptor de ErbB é aquele que, em um ensaio de diagnóstico, não expressa níveis mais altos que o normal de receptor de ErbB em comparação com uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido.

Um câncer independente de hormônios é aquele em que a sua proliferação não é dependente da presença de um hormônio que se liga a um receptor expresso por células no câncer. Esses cânceres não passam por regressão clínica mediante administração de estratégicas cirúrgicas ou farmacológicas que reduzam a concentração de hormônios no tumor ou perto dele. Exemplos de cânceres independentes de hormônios incluem câncer de próstata independente de androgênio, câncer de mama independente de estrogênio, câncer endometrial e câncer ovariano. Esses cânceres podem iniciar-se na forma de tumores dependentes de hormônios e progridem de uma etapa sensível a hormônios para um tumor refratário a hormônios, seguindo-se a terapia anti-hormonal.

O termo anticorpo, é utilizado no presente no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada.

A expressão anticorpo monoclonal, da forma utilizada no presente, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos e direcionados a um sítio antigênico único. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos policlonais que incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido a um determinante único sobre o antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por poderem ser sintetizados de forma não contaminada por outros anticorpos. O adjetivo monoclonal indica a característica do anticorpo como sendo obtida a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretada como exigindo a produção do anticorpo através de qualquer método específico. Os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção, por exemplo, podem ser fabricados através do método de hibridoma descrito em primeiro lugar por Kohler et al., Nature, 256:495, 1975, ou podem ser fabricados através de métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, patente US 4.816.567). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos, utilizando-se as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352624-628, 1991 e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991, por exemplo.

Os anticorpos monoclonais do presente incluem especificamente anticorpos quiméricos, em que uma parte da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou que pertencem a uma classe ou subclas se específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertencem à outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exiba a atividade biológica desejada (patente US 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 81:6851-6855, 1984). Os anticorpos quiméricos de interesse no presente incluem anticorpos primatizados que compreendem sequências de ligação de antígenos de domínios variáveis derivadas de um primata não humano (por exemplo, macaco do velho mundo, macaco mono, etc.) e sequências de região constante humana.

Fragmentos de anticorpos compreendem uma parte de um anticorpo intacto, que compreende preferencialmente a ligação de antígenos ou sua região variável. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab', F(ab')₂ e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia isolada; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmento(s) de anticorpos.

Um anticorpo intacto é aquele que compreende uma região variável de ligação de antígenos, bem como um domínio constante de cadeia leve (Cl) e domínios constantes de cadeia pesada, Ch1, Ch2 e Ch3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequências nativas (por exemplo, domínios constantes de sequências nativas humanas) ou sua variante de sequência de aminoácido. Preferencialmente, o anticorpo intacto possui uma ou mais funções efetoras.

Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm sequências mínimas derivadas de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpos receptores) em que resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejada. Em alguns casos, resíduos de região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituí dos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. De forma geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos ou pelo menos um, tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos ou substancialmente todos os circuitos hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todos os FRs são os de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente o de uma imunoglobulina. Para detalhes adicionais, vide Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-329, 1988; e Presta, Curr Op. Struct. Biol., 2:593-596, 1992.

Anticorpos anti-ErbB2 humanizados incluem huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (Herceptin®), conforme descrito na Tabela 3 da patente US 5.821.337, expressamente incorporada ao presente como referência; 520C9 humanizado (WO 93/21319) e anticorpos 2C4 humanizados conforme exibido na Figura 6.

Funções efetoras de anticorpos referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc (região Fc de sequência nativa ou região Fc variante de sequência de aminoácidos) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem ligação C1q; citotoxicidade de complemento-dependente; ligação de receptores de Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulagem baixa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc.

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, os anticorpos intactos podem ser atribuídos a diferentes classes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, com diversos destes podendo ser adicionalmente divididos em subclasses (isotipos), tais como lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são denominados α, δ, ε, γ e μ respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem-conhecidas.

Citotoxicidade mediada por células de anticorpo-dependente e ADCC referem-se a uma reação mediada por células em que células citotóxicas não específicas que expressam receptores de Fc (FcRs) (por exemplo, células do tipo Natural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado sobre uma célula alvo e subsequentemente causam lise da célula alvo. As células principais para a mediação de ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRlll. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991. Para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode-se realizar-se um ensaio de ADCC in vitro, tal como o descrito na patente US 5.500.362 ou 5 821.337. Células efetoras úteis para esses ensaios incluem células mononucleares sangúíneas periféricas (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser testada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como o descrito em Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656, 1998.

Células efetoras humanas são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e realizam função de efetor de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC), células natural killer (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células de NK sendo preferidas. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma de suas fontes nativas, por exemplo a partir de sangue ou PBMCs, conforme descrito no presente.

As expressões receptor de Fc ou FcR são utilizadas para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que une um anticorpo de IgG (receptor gama) e inclui receptores das subclasses de FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptores de FcyRII incluem FcyRIIA (receptor de ativação) e FcyRIIB (receptor de inibição), que possuem sequências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM) em seu domínio citoplasmático. A inibição de receptor FcyRIIB contém um motivo de inibição com base em tirosina imunorreceptora (ITIM) no seu domínio citoplasmático (vide análise M. em Daêron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234, 1997). TcFs são analisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev Immunol., 9:457-92, 1091; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994; e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995. Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo FcR no presente. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976 e Kim et al., J. Immunol., 24:249, 1994).

Citotoxicidade complemento-dependente ou CDC designa a capacidade de lise de um alvo na presença de complemento de uma molécula. O projeto de ativação de um complemento é iniciado pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) em uma molécula (por exemplo, um anticorpo) em complexo com um antígeno cognato. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio de CDC, por exemplo conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163, 1996.

Anticorpos nativos são normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 Dáltons, compostos de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia leve por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferen tes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia leve e pesada também possui pontes de dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada possui, em uma extremidade, um domínio variável (V_H) seguido por uma série de domínios constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável em uma extremidade (V_L) e um domínio constante na sua outra extremidade. O domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que os resíduos de aminoácidos específicos formem uma camada intermediária entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada.

O termo variável, da forma utilizada com relação a anticorpos, refere-se ao fato de que certas partes dos domínios variáveis diferem extensamente de sequência entre anticorpos e são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para seu antígeno particular. Entretanto, a variabilidade não é regularmente distribuída ao longo dos domínios variáveis dos anticorpos. Ela é concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como de cadeia pesada. As partes mais altamente conservadas de domínios variáveis são denominadas regiões estruturais (FRs). Os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves nativas compreendem quatro FRs cada, adotando em grande parte uma configuração β-pregueada, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam laços que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura β-pregueada. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelos FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígenos de anticorpos (vide Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda MD, Estados Unidos, 1991). Os domínios constantes não são diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem diversas funções efetoras, tais como a participação do anticorpo em citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC).

A expressão região hipervariável, quando utilizada no presen te, refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que sejam responsáveis pela ligação de antígenos. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácidos de uma região de determinação de complementaridade ou CDR (por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda MD, Estados Unidos, 1991) e/ou os resíduos de um circuito hipervariável (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987). Resíduos de Região Estrutural ou FR são os resíduos de domínios variáveis diferentes dos resíduos da região hipervariável, conforme definido no presente.

Um anticorpo isolado é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interferiríam com utilizações diagnosticas ou terapêuticas para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo, conforme determinado através do método de Lowry, e, de maior preferência, mais de 99% em peso, (2) em grau suficiente para obter pelo menos quinze resíduos de sequência de aminoácidos interna ou de N-terminal, através da utilização de um seqúenciador de copos rotativos, ou (3) até a homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução, utilizando azul de Coomassie ou preferencialmente, manchas de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes, já que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, entretanto, anticorpo isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.

Um anticorpo que se liga a um antígeno de interesse, tal como antígeno ErbB2, é aquele capaz de se ligar ao antígeno com afinidade sufi ciente, de tal forma que o anticorpo seja útil como agente diagnóstico e/ou terapêutico para direcionar uma célula que expresse o antígeno e/ou para o fornecimento direcionado a um agente citotóxico ou outro quimioterapêutico, tal como um maitansinoide. Quando o anticorpo for um que se liga a ErbB2, ele normalmente se ligará de preferência ao ErbB2, em oposição a outros receptores de ErbB e pode ser um que não apresente reação cruzada significativa com outras proteínas, tais como EGFR, ErbB3 ou ErbB4. Nessas realizações, a extensão de ligação do anticorpo a essas proteínas nãoErbB2 (por exemplo, ligação de superfície celular ao receptor endógeno) será de menos de 10%, conforme determinado através de análise de ordenamento de células ativado por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA). Algumas vezes, o anticorpo anti-ErbB2 não apresentará reação cruzada significativa com a proteína neu de rato, conforme descrito, por exemplo, em Schecter et al-, Nature, 312:513, 1984 e Drebin et al., Nature, 312:545-548, 1984.

A menos que indicado em contrário, as expressões anticorpo 4D5 monoclonal e anticorpo monoclonal 4D5 referem-se a um anticorpo que contém resíduos de ligação de antígenos do anticorpo 4D5 de murinos, ou dele derivados. O anticorpo monoclonal 4D5 pode ser, por exemplo, anticorpo monoclonal 4D5 de murinos (ATCC CRL 10463) ou uma de suas variantes, tais como anticorpo humanizado 4D5, que possui resíduos de aminoácidos de antígenos de anticorpo monoclonal 4D5 de murino. Exemplos de anticorpos humanizados 4D5 incluem huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (Herceptin®), como na patente US 5.821.337, com huMAb4D5-8 (Herceptin®) sendo preferido um anticorpo 4D5 humanizado.

Um anticorpo que possui característica biológica de um anticorpo designado, tal como o anticorpo monoclonal designado 4D5, é aquele que possui uma ou mais características biológicas daquele anticorpo que o distingue de outros anticorpos que se unem ao mesmo antígeno (por exemplo, ErbB2). Um anticorpo com uma característica biológica de 4D5, por exemplo, pode exibir efeito inibidor de crescimento sobre células de sobre expressão de ErbB2 de maneira que seja dependente do nível de expressão de ErbB2 e/ou se ligar ao mesmo epítopo no domínio extracelular de ErbB2 que o ligado por 4D5 (que bloqueia, por exemplo, a ligação de anticorpo monoclonal 4D5 ao ErbB2).

Um agente inibidor do crescimento, quando utilizado no presente, designa um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente uma célula cancerosa que expressa ErbB, seja in vitro ou in vivo. Assim, o agente inibidor do crescimento pode ser um que reduza significativamente o percentual de células de expressão de ErbB em fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam o andamento do ciclo celular (em um lugar diferente da fase S), tais como agentes que induzem a interrupção de G1 e a interrupção da fase M. Bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores de topo II, tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposida e bleomicina. Os agentes que interrompem G1 também influenciam na interrupção da fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA, tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracila e ara-C. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado Cell Cycle Regulation, Oncogenes and Antineoplastic Drugs, por Murakami et al (WB Saunders: Filadélfia, Estados Unidos, 1995), especialmente pág. 13.

Exemplos de anticorpos inibidores do crescimento são aqueles que se ligam a ErbB2 e inibem o crescimento de células tumorais que sobreexpressem o ErbB2. Os anticorpos anti-ErbB2 inibidores do crescimento preferidos inibem o crescimento de células tumorais mamárias SK-BR-3 em cultura celular em mais de 20% e, preferencialmente, mais de 50% (por exemplo, cerca de 50% a cerca de 100%) em concentração de anticorpos de cerca de 0,5 a 30 pg/ml, em que a inibição do crescimento é determinada seis dias após exposição das células SK-BR-3 ao anticorpo (vide patente US 5.677.171 concedida em 14 de outubro de 1997). O ensaio de inibição do crescimento da célula SK-BR-3 é descrito em mais detalhes naquela patente e a seguir. O anticorpo inibidor do crescimento preferido é anticorpo monoclonal 4D5, tal como 4D5 humanizado.

Uma molécula (tal como um anticorpo) que induz a morte celular é uma que faz com que uma célula viável torne-se inviável. A célula é geralmente uma que expressa o receptor de ErbB2, especialmente quando a célula sobre-expresse o receptor de ErbB2. Preferencialmente, a célula é uma célula cancerosa, tal como uma célula da mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tiroide, pâncreas, próstata ou bexiga. In vitro, a célula pode ser uma célula SK-BR-3, BT474, Caiu 3, MDAMB-453, MDA-MB-361 ou SKOV3. A morte celular in vitro pode ser determinada na ausência de complemento e células efetoras imunológicas para distinguir a morte celular induzida por citotoxicidade mediada por célula anticorpo-dependente (ADCC) ou citotoxicidade complemento-dependente (CDC). Assim, o ensaio de morte celular pode ser realizado através da utilização de soro desativado por calor (ou seja, na ausência de complemento) e na ausência de células efetoras imunológicas. Para determinar se o anticorpo é capaz de induzir a morte celular, a perda da integridade da membrana é avaliada pela retirada de iodeto de propídeo (PI), azul de tripano (vide Moore et al., Cytotechnology, 17:1-11, 1995) ou 7AAD pode ser determinado com relação a células não tratadas. Os anticorpos preferidos que induzem a morte celular são aqueles que induzem a retirada de PI no ensaio de retirada de PI em células de BT474. Exemplos de anticorpos que induzem a morte celular incluem anticorpos anti-ErbB2 7C2 e 7F3 (WO 98/17797, expressamente incorporada ao presente como referência), incluindo suas variantes humanizadas e/ou amadurecidas por afinidade.

Uma molécula (tal como um anticorpo) que induz a apoptose é aquela que induz a morte celular programada conforme determinado pela ligação de anexina V, fragmentação de DNA, contração celular, dilatação de retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de bolhas membranosas (denominadas corpos apoptóticos). A célula é normalmente aquela que sobre-expressa o receptor de ErbB2. Preferencialmente, a célula é uma célula tumoral, tal como uma célula de mama, ovário, estômago, en dométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tiroide, pâncreas ou bexiga. In vitro, a célula pode ser uma célula SK-BR-3, BT474, Caiu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SKOV3. Diversos métodos são disponíveis para a avaliação dos eventos celulares associados à apoptose. A translocação de fosfatidil serina (PS), por exemplo, pode ser medida através da ligação de anexina; a fragmentação de DNA pode ser avaliada através de escadas de DNA; e a condensação de cromatina/nuclear juntamente com fragmentação de DNA podem ser avaliadas por qualquer aumento das células hipodiploides. Preferencialmente, a molécula que induz a apoptose é aquela que resulta em cerca de 2 a 50 vezes, preferencialmente cerca de 5 a 50 vezes e, de maior preferência, cerca de 10 a 50 vezes, a indução de ligação de anexina com relação à célula não tratada em um ensaio de ligação de anexina, através da utilização de células BT474 (vide abaixo). Algumas vezes, o anticorpo próapoptótico será aquele que bloqueia adicionalmente a ativação de ligante ErbB de um receptor de ErbB. Em outras situações, o anticorpo é aquele que não bloqueia significativamente a ativação de ligantes de ErbB de um receptor de ErbB. Além disso, a molécula pode induzir apoptose, sem induzir grande redução do percentual de células em fase S (por exemplo, um que induza redução de apenas cerca de 0 a 10% do percentual dessas células com relação ao controle). Exemplos de anticorpos que induzem apoptose incluem anticorpos anti-ErbB2 7C2 e 7F3 (WO 98/17797, expressamente incorporada ao presente como referência), incluindo suas variantes amadurecidas por afinidade e/ou humanizadas.

Um anticorpo que bloqueia a ativação de ligantes de um receptor de ErbB é aquele que reduz ou evita essa ativação conforme definido acima, em que o anticorpo é capaz de bloquear a ativação de ligantes do receptor de ErbB de forma substancialmente mais eficaz que o anticorpo monoclonal 4D5, por exemplo, de forma aproximadamente tão eficaz quanto anticorpos monoclonais 7F3 ou 2C4 ou seus fragmentos de Fab e, preferencialmente, de forma aproximadamente tão eficaz que o anticorpo monoclonal 2C4 ou um de seus fragmentos de Fab. O anticorpo que bloqueia a ativação de ligantes de um receptor de ErbB, por exemplo, pode ser aquele que é cerca de 50 a 100% mais eficaz que 4D5 no bloqueio da formação de um hetero-olgômero de ErbB. O bloqueio da ativação de ligantes de um receptor de ErbB pode ocorrer através de qualquer meio, através, por exemplo, de interferência com: ligação de ligante a um receptor de ErbB, formação de complexo de ErbB, atividade de tirosina quinase de um receptor de ErbB em um complexo de ErbB e/ou fosforilação de resíduo(s) de tirosina quinase em ou por um receptor de ErbB. Exemplos de anticorpos que bloqueiam a ativação de ligantes de um receptor de ErbB incluem os anticorpos monoclonais 2C4 e 7F3 (que bloqueiam a ativação de HRG de ErbB2/ErbB3 e heteroolgômeros de ErbB2/ErbB4; e ativação de epirregulina, EGF, TGF-α, anfirregulina e/ou HB-EGF de um hetero-olgômero de EGFR/ErbB2); e anticorpos L26, L96 e L288 (Klapper et al., Oncogene, 14:2099-2109, 1997), que bloqueiam a ligação de EGF e NDF a células T47D que expressam EGFR, ErbB2, ErbB3 e ErbB4. Variantes amadurecidas por afinidade e/ou humanizadas destes e de outros anticorpos da definição são especificamente incluídas.

O termo epítopo é utilizado para designar sítios de ligação para anticorpos (monoclonais ou policlonais) sobre antígenos de proteína.

Os anticorpos que se ligam a um certo epitopo são identificados através de mapeamento de epítopos. Existem vários métodos conhecidos na técnica para o mapeamento e caracterização da localização dos epítopos sobre as proteínas, que incluem a resolução da estrutura de cristal de um complexo de antígeno-anticorpo, ensaios de concorrência, ensaios de expressão de fragmentos genéticos e ensaios com base em peptídeos sintéticos, conforme descrito, por exemplo, no Capítulo 11 de Harlow e Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, Estados Unidos, 1999. Os ensaios de concorrência são discutidos abaixo. De acordo com os ensaios de expressão de fragmentos genéticos, a estrutura de leitura aberta que codifica a proteína é fragmentada, seja aleatoriamente ou através de construções genéticas específicas, e é determinada a reatividade dos fragmentos expressos da proteína com o anticorpo a ser testado. Os fragmentos genéticos podem ser pro duzidos, por exemplo, através de PCR e, em seguida, transcritos e traduzidos em proteína in vitro, na presença de aminoácidos radioativos. A ligação do anticorpo aos fragmentos de proteína radioativa marcados é então determinada através de imunoprecipitação e eletroforese de gel. Certos epítopos também podem ser identificados através da utilização de grandes bibliotecas de sequências de peptídeos aleatórias exibidas sobre a superfície de partículas de fago (bibliotecas de fago). Alternativamente, uma biblioteca definida de fragmentos de peptídeos em sobreposição pode ser testada para determinação da ligação ao anticorpo de teste em ensaios de ligação simples. Esta úitima abordagem é apropriada para a definição de epítopos lineares de cerca de cinco a quinze aminoácidos.

Um anticorpo que se liga essencialmente ao mesmo epítopo como anticorpo de referência quando os dois anticorpos reconhecem epítopos idênticos ou estericamente sobrepostos. Os métodos mais rápidos e amplamente utilizados de determinação se dois epítopos se ligam a epítopos idênticos ou estericamente sobrepostos são ensaios de concorrência, que podem ser configurados em uma série completa de formatos diferentes, utilizando antígeno marcado ou anticorpo marcado. Normalmente, o antígeno é imobilizado sobre uma placa com 96 cavidades e a capacidade de bloqueio da ligação de anticorpos marcados por anticorpos não marcados é medida através da utilização de marcadores radioativos ou enzimáticos.

O epítopo 4D5 é a região no domínio extracelular de ErbB2 à qual se liga o anticorpo 4D5 (ATCC CRL 10463). Este epítopo fica próximo ao domínio transmembranoso de ErbB2 e se estende desde próximo do resíduo 519 a perto do resíduo 625, incluindo a sequência de domínio extracelular de ErbB2, inclusive, em SEQ ID NO: 3, Figura 4. Para selecionar os anticorpos que se unem ao epítopo 4D5, pode-se realizar um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como o descrito em Harlow e Lane, acima. Altemativamente, pode-se realizar o mapeamento de epítopos para determinar se o anticorpo se liga ao epítopo 4D5 de ErbB2 (por exemplo, qualquer um ou mais resíduos na região próxima do resíduo 529 a perto do resíduo 625, inclusive, em SEQ ID NO:3).

O epítopo 3Η4 é a região do domínio extracelular de ErbB2 à qual se liga ao anticorpo 3H4. Esse epítopo inclui resíduos de cerca de 541 a cerca de 599, inclusive, na sequência de aminoácido do domínio extracelular de ErbB2 (vide Figura 4 e SEQ ID NO: 3).

O epítopo 7C2/7F3 é a região no N-terminal do domínio extracelular de ErbB2 à qual se ligam os anticorpos 7C2 e/ou 7F3 (cada qual depositado no ATCC, vide abaixo). Para selecionar os anticorpos que se ligam ao epítopo de 7C2/7F3, pode-se realizar um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como o descrito em Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Ed Harlow e David Lane, 1988. Alternativamente, pode-se realizar o mapeamento de epítopos para determinar se o anticorpo se une ao epítopo 7C2/F3 sobre ErbB2 (por exemplo, qualquer um ou mais dos resíduos na região próxima do residuo 22 até perto do resíduo 53 de ErbB2; vide Ftgura 4e SEQ ID NO:3).

Um tumor que não responde, ou responde mal, ao tratamento com um anticorpo anti-ErbB monoclonal não exibe aprimoramento estatisticamente significativo em reação ao tratamento de anticorpo anti-ErbB quando comparado a qualquer tratamento ou tratamento com placebo em um modelo animal reconhecido ou um teste clínico humano, ou que responda ao tratamento inicial com anticorpos anti-ErbB mas cresça à medida que prossegue o tratamento. Um modelo animal particularmente apropriado para teste de eficácia de anticorpos anti-ErbB é o modelo de animal transgêníco descrito no presente e ilustrado no Exemplo 3.

Os termos tratar e tratamento designam o tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é o de prevenir ou reduzir a velocidade (amenizar) de uma mudança fisiológica ou disfunção indesejada, tal como o desenvolvimento ou difusão de câncer. Para os propósitos da presente invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas sem limitar-se ao alívio de sintomas, redução da extensão da doença, estado estabilizado (ou seja, sem piora) da doença, atraso ou redução da velocidade do avanço da doença, melhoria ou paliativo do estado doentio e remissão (seja parcial ou total), seja ela detectável ou não detectável. Tratamento pode também indicar prolongamento da sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada caso não receba tratamento. Os necessitados de tratamento incluem aqueles que já possuem a condição ou disfunção, bem como aqueles predispostos a ter a condição ou disfunção ou em que a disfunção ou condição deva ser evitada.

Uma disfunção é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento da presente invenção. Isso inclui disfunções ou doenças crônicas e agudas, que incluem as condições patológicas que predispõem o mamífero à disfunção em questão. Exemplos não limitadores de disfunções a serem tratadas no presente incluem tumores benignos e malignos; leucemias e malignidades linfoides, particularmente câncer de mama, ovário, estômago, endométrio, glândulas salivares, pulmão, rim, cólon, tiroide, pâncreas, próstata ou bexiga. Uma disfunção preferida a ser tratada de acordo com a presente invenção é tumor maligno, tal como câncer de mama, que sobre-expressa um receptor de ErbB (por exemplo, ErbB2 e/ou EGFR) e não responde ou responde mal ao tratamento com anticorpo ao(s) receptor(es) que é (são) sobre-expresso(s). Uma disfunção particularmente preferida é um câncer de mama que sobre-expressa ErbB2 que não responda ou responda mal à terapia com Herceptin®.

A expressão quantidade terapeuticamente eficaz designa uma quantidade de droga eficaz para o tratamento de uma doença ou disfunção em mamíferos. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz da droga pode reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (ou seja, reduzir a velocidade até certo ponto e, preferencialmente, parar) a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir (ou seja, reduzir a velocidade até certo ponto e, preferencialmente, parar) metástase tumoral; inibir, até certo ponto, o crescimento tumoral; e/ou reduzir até certo ponto um ou mais dos sintomas associados com o câncer. Até o ponto em que a droga pode evitar o crescimento e/ou matar células cancerosas existentes, ela pode ser citostática e/ou citotóxica. Para a terapia de câncer, a eficácia pode ser medida, por exemplo, através da determinação do tempo para o avanço da doença (TTP) e/ou determinação da velocidade30 de reação (RR).

A expressão agente citotóxico, da forma utilizada no presente, designa uma substância que iniba ou evite a função das células e/ou cause a destruição das células. A expressão destina-se a incluir isótopos radioativos (por exemplo, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos e toxinas, tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo seus fragmentos e/ou variantes.

Um agente quimioterapêutico é um composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclosfosfamída (Cytoxan®); sulfonates alquila, tais como busulfam, improsulfam e piposulfam; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilmelaminas, que incluem altretamina, trietileno melamina, trietileno fosforamida, trietilenotio fosforamida e trimetilol melamina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, tais como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabólitos tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamipurina, tioguanina, análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; androgênios tais como calusterona, propionate de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostana, testolactona; antiadrenais tais como aminoglutetimida, mitotana, trilostana, repositor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; ansacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; etoglucid; nitrato de gálio; hidróxi ureia; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatin; fenamet; pirarubicin; ácido podofilínico; hidrazida de 2-etila; procarbazina; PSK®; razoxana; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosídeo (Ara-C); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, tais como paclitaxel (Taxol®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton NJ, Estados Unidos) e docetaxel (Taxotere®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucila; gencitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposídeo; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS-2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; espermamicinas; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima. Também estão incluídos nesta definição os agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação hormonal sobre tumores, tais como antiestrogênios, incluindo, por exemplo, 4(5)-imidazóis inibidores de tamoxifeno, raloxifeno e aromatase, 4-hidróxi tamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston); e antiandrogênios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.

O termo pró-droga, da forma utilizada no presente pedido, designa uma forma precursora ou derivada de uma substância farmaceuticamente ativa que seja menos citotóxica a células tumorais em comparação com a droga original e seja capaz de ser enzimaticamente ativada ou convertida na forma original mais ativa. Vide, por exemplo, Wilman, Prodrugs in

Cancer Chemoterapy, Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615^a Meeting Belfast, 1986 e Stella et al., Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Dellivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp 247-267, Humana Press, 1985. As pró-drogas da presente invenção incluem, mas sem se limitar a pró-drogas que contenham fosfato, pró-drogas que contenham tiofosfato, pró-drogas que contenham sulfato, pró-drogas que contenham peptídeos, pró-drogas modificadas por D-aminoácidos, pródrogas glicosiladas, pró-drogas contendo p-lactamas, pró-drogas contendo fenoxi acetamida opcionalmente substituídas ou pró-drogas contendo fenil acetamida opcionalmente substituídas, 5-fluorocitosina e outras pró-drogas de 5-fluorouridina que podem ser convertidas na droga livre citotóxica mais ativa. Exemplos de drogas citotóxicas que podem ser derivadas em uma forma de pró-droga para utilização na presente invenção incluem, mas sem se limitar aos agentes quimioterapêuticos descritos acima.

A expressão ácido nucleico designa polinucleotídeos tais como ácido desoxirribonucleico (DNA) e, quando apropriado, ácido ribonucleico (RNA). A expressão também inclui, como equivalentes, análogos de DNA ou RNA feitos com análogos de nucleotídeos e, conforme aplicável, polinucleotídeos de cadeia simples (com sentido ou sem sentido) e dupla. Uma molécula de ácido nucleico isolada é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada a partir de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual é normalmente associada na fonte natural do ácido nucleico. Uma molécula de ácido nucleico isolada é diferente da forma ou ambiente em que é encontrada na natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas são distintas, portanto, da molécula de ácido nucleico que existe em células naturais. Entretanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente expressam o anticorpo em que, por exemplo, a molécula de ácido nucleico encontra-se em uma localização cromossômica diferente daquele das células naturais.

Da forma utilizada no presente, o termo vetor designa uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual tenha sido ligado. A expressão vetor de expressão inclui plasmídeos, cosmídeos ou fagos capazes de sintetizar a proteína HER2 desejada codificada pelo gene recombinante correspondente conduzido pelo vetor. Os vetores preferidos são aqueles capazes de reprodução autônoma e/ou expressão de ácidos nucleicos aos quais são ligados. No presente relatório descritivo, plasmídeo e vetor são utilizados de forma intercambiável, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente utilizada.

Da forma utilizada no presente, as expressões elementos reguladores de transcrição e sequências reguladoras de transcrição são utilizadas de forma intercambiável e refere-se a sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência codificadora operacionalmente ligada em um organismo hospedeiro específico. As sequências de controle que são apropriadas para procariontes, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um sítio de ligação de ribossomo. Células eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores, amplificadores, sinais de divisão e sinais de poliadenilação. Estes termos destinamse a englobar todos os elementos que promovam ou regulem a transcrição, incluindo promotores, elementos centrais necessários para interação básica de fatores de transcrição e polimerase de RNA, elementos anteriores, amplificadores e elementos de reação (Lewin, Genes V, (Oxford University Press, Oxford, Inglaterra), pp. 847-873). A referência do presente aos elementos reguladores de transcrição de um gene ou classe de genes inclui todos ou uma região intacta dos elementos reguladores de transcrição de ocorrência natural e formas modificadas dos elementos reguladores de transcrição do gene ou grupo de genes. Essas formas modificadas incluem redisposições dos elementos, exclusões de alguns elementos ou sequências estranhas e inserção de elementos heterólogos. A natureza modular dos elementos reguladores de transcrição e a ausência de dependência de posição da função de alguns elementos reguladores, tais como amplificadores, torna essas modificações possíveis. Numerosas técnicas são disponíveis para dissecar os elementos reguladores de genes para determinar sua localização e função. Essas informações podem ser utilizadas para dirigir a modificação dos elementos, se desejado. Prefere-se, entretanto, que seja utilizada uma região intacta dos elementos reguladores de transcrição de um gene.

A expressão promotor específico de tecido indica uma sequência de nucleotídeos que serve de promotor, ou seja, regula a expressão de uma sequência de DNA selecionada operacionalmente ligada ao promotor e que efetua a expressão da sequência de DNA selecionada em células específicas de um tecido, tal como células de uma glândula mamária. Em realização ilustrativa, construções de gene que utilizam promotores específicos de glândulas mamárias podem ser utilizadas para dirigir preferencialmente a expressão de uma proteína HER2 ou fragmento de proteína no tecido da glândula mamária.

O ácido nucleico é operacionalmente ligado quando colocado em relacionamento funcional com outra sequência de ácido nucleico. O DNA para uma pré-sequência ou líder de secreção, por exemplo, é operacionalmente ligado ao DNA para um polipeptídeo caso seja expresso na forma de pré-proteína que participe da secreção do polipeptídeo; um promotor ou amplificador é operacionalmente ligado a uma sequência codificadora caso afete a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossomos é operacionalmente ligado a uma sequência codificadora caso seja posicionada de forma a facilitar a tradução. Geralmente, 'Operacionalmente ligado indica que as sequências de DNA que são conectadas são contíguas e, no caso de líder de secreção, contíguas e em fase de leitura. Entretanto, os amplificadores não necessitam ser contíguos. A conexão é conseguida através de ligação em sítios de restrição convenientes. Caso esses sítios não existam, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligações são utilizados de acordo com a prática convencional.

O termo transfecção designa a introdução de um ácido nucleico, por exemplo, um vetor de expressão, em uma célula receptora através de transferência genética mediada por ácido nucleico. Transformação, da forma utilizada no presente, designa um processo em que o genótipo de uma célula é modificado como resultado da tomada celular de DNA ou RNA exógeno e, por exemplo, a célula transformada expressa uma forma recom35 binante de HER2.

Da forma utilizada no presente, o termo transgene designa uma sequência de ácido nucleico que é parcial ou totalmente heteróloga, ou seja, estranha, para o animal transgênico ou célula no qual é introduzida, ou é homóloga a um gene endógeno do animal transgênico ou célula no qual é introduzida, mas que é projetada para ser inserida, ou é inserida, no genoma do animal de forma a alterar o genoma da célula em que é inserida (é inserida, por exemplo, em uma localização que difira daquela do gene natural ou sua inserção resulte em extração). Um transgene pode ser operacionalmente ligado a uma ou mais sequências reguladoras de transcrição e qualquer outro ácido nucleico, tal como introns, que possa ser necessário para a expressão ideal de um ácido nucleico selecionado.

Consequentemente, a expressão construção de transgene designa um ácido nucleico que inclui um transgene e (opcionalmente) outras sequências de ácido nucleico, tais como sequência reguladora de transcrição, sítios de poliadenilação, origens de replicação, genes marcadores, etc, que podem ser úteis na manipulação geral do transgene para inserção no genoma de um organismo hospedeiro.

O termo transgênico é utilizado no presente como adjetivo para descrever a propriedade, por exemplo, de abrigar um transgene de um animal ou construção. Da forma utilizada no presente, por exemplo, um organismo transgênico é qualquer animal, preferencialmente um mamífero não humano, em que uma ou mais células do animal contém ácido nucleico heterólogo introduzido por meio de intervenção humana, tal como através de técnicas transgênicas bem-conhecidas na técnica. O ácido nucleico é introduzido na célula, direta ou indiretamente através de introdução em um precursor da célula, por forma de manipulação genética deliberada, tal como através de microinjeção ou de infecção com um vírus recombinante. A expressão manipulação genética não inclui procriação cruzada clássica, nem fertilização in vitro, mas sim se dirige à introdução de uma molécula de DNA recombinante. Esta molécula pode ser integrada em um cromossomo ou pode ser DNA em reprodução extracromossômica. Nos animais transgênicos típicos descritos no presente, o transgene faz com que as células expressem ou sobre-expressem uma forma recombinante das proteínas HER2 desejadas. As expressões linhagem fundadora e animal fundador designam os animais que são o produto maduro dos embriões aos quais foi adicionado o transgene, ou seja, os animais que cresceram a partir dos embriões em que foi inserido DNA, e que foram implantados em um ou mais hospedeiros substitutos.

As expressões progênie e progênie do animal transgênico indicam toda e qualquer descendência de qualquer geração seguinte aos mamíferos originalmente transformados. A expressão mamífero não humano indica todos os membros da classe dos mamíferos, exceto seres humanos. Mamífero indica qualquer animal classificado como mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de fazenda, animais de zoológico, esportivos ou de estimação, tais como camundongo, rato, coelho, porco, carneiro, bode, boi e primatas superiores.

Da forma utilizada no presente, as expressões célula, linhagem celular e cultura celular são utilizadas de forma intercambiável e todas essas designações incluem progênie. Assim, as expressões transformantes e células transformadas incluem a célula objeto primária e as culturas dela derivadas, sem considerar o número de transferências. Também se compreende que toda a progênie pode não ser precisamente idêntica em teor de DNA, devido a mutações inadvertidas ou deliberadas. Inclui-se progênie mutante que possui a mesma função ou atividade biológica selecionada para a célula originalmente transformada. Será claro a partir do contexto quando forem desejadas designações distintas.

Um lipossoma é uma pequena bolha composta de vários tipos de lipídios, fosfolipidios e/ou tensoativo que é útil para o fornecimento de uma droga (tal como os anticorpos anti-ErbB2 descritos no presente e, opcionalmente, um agente quimioterapêutico) a um mamífero. Os componentes do lipossoma são comumente dispostos em formação de duas camadas, similar à disposição de lipídios de membranas biológicas.

A expressão bula é utilizada para designar instruções costu meiramente incluídas em pacotes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização, dosagem, administração, contraindicações e/ou avisos referentes à utilização desses produtos terapêuticos.

Um cardioprotetor é um composto ou composição que evita ou reduz as disfunções do miocárdio (ou seja, cardiomiopatia e/ou congestão cardíaca) associada à administração de uma droga, tal como um anticorpo anti-ErbB2 ou seu conjugado com maitansinoide, a um paciente. O cardioprotetor pode, por exemplo, bloquear ou reduzir um efeito cardiotóxico mediado por radical livre e/ou evitar ou reduzir os danos por tensão oxidativa. Exemplos de cardioprotetores englobados pela presente definição incluem o agente quelante de ferro dexrazoxano (ICRF-187) (Seifert et al., The Annals of Pharmacotherapy, 28:1063-1072, 1994); um agente redutor de lipídios e/ou antioxidante, tal como probucol (Singal et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 27:1055-1063, 1995); amifostina (éster fosfato de 2-[(3aminopropil)amino]etanotiol-diidrogênio aminotiol, também denominado WR2721, e a sua forma retirada celular desfosforilada denominada WR-1065) e ácido S-3-(3-metilaminopropilamino)propilfosforotioico (WR-151327), vide Green et al., Cancer Research, 54:738-741, 1994; digoxina (Bristow, M. R. em Bristow M. R., ed., Drug-Induced Heart Disease, Nova Iorque, Estados Unidos: Elsevier 191-215, 1980); bloqueadores beta, tais como metoprolol (Hjalmarson et al, Drugs, 47: Supl. 4:31-9, 1994; e Shaddy et al., Am. Heart J., 129:197-9, 1995); vitamina E; ácido ascórbico (vitamina C); varredores de radicais livres, tais como ácido oleanólico, ácido ursólico e N-acetil cisteína (NAC); compostos de captura de centrifugação, tais como alfa-fenil-terc-butil nitrona (PBN); (Paracchini et al., Anticancer Res,, 13:1607-1612, 1993); compostos selênio orgânicos, tais como P251 (Elbesen); e similares.

- Descrição Detalhada

A presente invenção baseia-se em resultados obtidos em um modelo de tumor transgênico-HER2 de murino inovador, em que Herceptin® ou o anticorpo 4D5 de murino a partir do qual derivou-se Herceptin® apresentou pouco efeito sobre o crescimento de tumores. Utilizando-se este mo delo para testar a eficácia do Herceptin® e conjugados de maitansinoide e Herceptin®, concluiu-se, surpreendentemente, que, embora o tumor transplantado obtido a partir desses camundongos transgênicos tenha reagido mal ao tratamento com Herceptin®, os conjugados de maitansinoide e Herceptin® foram altamente eficazes.

Consequentemente, a presente invenção baseia-se na utilização de conjugados de maitansinoide e anticorpo anti-ErbB no tratamento de tumores que sobre-expressem ErbB e que não reajam bem a anticorpos antiErbB e/ou tratamento com maitansinoide.

A - PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-ERBB

Segue-se uma descrição de exemplos de técnicas para a produção dos anticorpos utilizados de acordo com a presente invenção. A produção de anticorpos será ilustrada com referência a anticorpos anti-ErbB2 mas será evidente para os técnicos no assunto que anticorpos para outros membros da família de receptores de ErbB podem ser produzidos e modificados de maneira similar.

O antígeno de ErbB2 a ser utilizado para a produção de anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúvel do domínio extracelular de ErbB2 ou uma de suas partes, que contenha o epítopo desejado. Alternativamente, as células que expressam ErbB2 na sua superfície celular (por exemplo, células NIH-3T3 transformadas para sobre-expressar ErbB2; ou uma linhagem celular de carcinoma, tal como células de SK-BR-3, vide Stancovski et al., PNAS (USA), 88:8691-8695, 1991), podem ser utilizadas para gerar anticorpos. Outras formas de ErbB2 úteis para a geração de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto.

(I) ANTICORPOS POLICLONAIS:

Os anticorpos policlonais são preferencialmente elevados em animais através de diversas inieções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno relevante e um coadjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante a uma proteína que seja imunogênica na espécie a ser imunizada, tal como hemocianina do tipo buraco de fechadura, albumina de soro, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja, utilizando-se um agente bi funcional ou derivante, tal como éster maleimido benzoil sulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína). N-hidróxi succinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCh ou R¹N=C=NR, em que R e R¹ são grupos alquila diferentes.

Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivados através de combinação, por exemplo, de 100 pg ou 5 pg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com três volumes de adjuvante completo de Freund e injeção da solução de forma intradérmica em diversos locais. Um mês mais tarde, os animais são injetados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptideo ou conjugado em adjuvante completo de Freund através de injeção subcutânea em diversos sítios. Sete a 14 dias mais tarde, os animais são sangrados e o soro é testado para o título do anticorpo. Os animais são injetados até os patamares do título. Preferencialmente, o animal é injetado com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado a uma proteína diferente e/ou através de um reagente de ligação cruzada diferente. Os conjugados também podem ser feitos em cultura celular recombinante na forma de fusões de proteínas. Além disso, agentes de agregação tais como alumínio são apropriadamente utilizados para amplificar a reação imunológica.

(II) ANTICORPOS MONOCLONAIS:

Os anticorpos monoclonais são obtidos a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades. Assim, o adjetivo monoclonal indica a característica do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos distintos.

Os anticorpos monoclonais podem ser fabricados, por exemplo, através da utilização do método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256:495, 1975, ou podem ser fabricados através de métodos de DNA recombinantes (patente US 4.816.567).

No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro, tal como um hamster, é imunizado na forma descrita acima para gerar linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Linfócitos são então fundidos com células de mieloma, através da utilização de um agente de fusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986).

As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas em meio de cultura apropriado que contém preferencialmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Caso as células de mieloma parentais não contenham a enzima fosforribosil transferase de hipoxantina guanina (HGPRT ou HPRT), por exemplo, o meio de cultivo para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência de HGPRT.

Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, suportam a produção estável de alto nível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. Dentre eles, as linhagens celulares de mieloma preferidas são linhagens de mieloma de murinos tais como as derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis através da Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e as células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis através da American Type Culture Collection (Coleção Norte-Americana de Tipos de Culturas - ATCC), Rockville, Maryland, Estados Unidos. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. immunol, 133:3001, 1984; e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker Inc, Nova Iorque, Estados Unidos, 1987).

Os meios de cultura em que são cultivadas células de hibridoma são testados para determinação da produção de anticorpos monoclonais dirigidos ao antígeno. Preferencialmente, a especificidade de ligação de an ticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é selecionada através de imunoprecipitação ou de um ensaio de ligação in vitro, tais como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado por enzima (ELISA).

A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, através da análise de Scatchard de Munson et al.., Anal. Biochem., 107:220, 1980.

Após a identificação de células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, os clones podem ser subclonados através da limitação de procedimentos de diluição e cultivados através de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986). Meios de cultivo apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na forma de tumores de ascites em um animal.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são apropriadamente separados do meio de cultura, fluido de ascites ou soro através de procedimentos convencionais de purificação de anticorpos, tais como proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese de gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

O DNA codificador dos anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado através da utilização de procedimentos convencionais (através, por exemplo, da utilização de sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de se ligar especificamente aos genes codificadores das cadeias pesada e leve de anticorpos de murinos). As células de hibridoma servem de fonte preferida desse DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras, tais como células de E. coli, células de símios COS, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de anticorpos, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes: Os artigos de análise sobre a expressão recombinante em bactérias de DNA que codifiquem o anticorpo incluem Skerra et al. (Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262, 1993 e Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188, 1992).

Em realização adicional, anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos geradas através de utilização das técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554, 1990, Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991 e Marks et al., J. Mol. BioL, 222:581-597, 1991 descrevem o isolamento de anticorpos humanos e de murinos, respectivamente, utilizando-se bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa nM) através de embaralhamento de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783, 1992), bem como infecções combinatórias e recombinação in vivo, como estratégia para a construção de bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Fes.. 21:2265-2266, 1993). Desta forma, essas técnicas são alternativas viáveis a técnicas de hibridoma de anticorpos monoclonais tradicionais para o isolamento de anticorpos monoclonais.

O DNA também pode ser modificado, por exemplo, através de substituição da sequência de codificação para domínios constantes de cadeia pesada e cadeia leve humana no lugar das sequências de murinos homólogas (patente US 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.

S. A., 81:6851, 1984), ou através de ligação covalente à sequência de codificação de imunoglobulina no todo ou em parte da sequência de codificação para um polipeptídeo que não seja de imunoglobulina.

Tipicamente, esses polipeptídeos que não são de imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo, ou são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio de combinação de antígeno para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio de combinação de antígeno que possui especificidade para um antígeno e outro sítio de combinação de antígeno que possui especificidade para um antígeno diferente.

Ill) ANTICORPOS HUMANIZADOS:

Métodos de humanização de anticorpos não humanos foram descritos na técnica. Preferencialmente, um anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos aminoácidos não humanos são muitas vezes denominados resíduos de importação, que são simplesmente retirados de um domínio variável de importação. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323327, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988), através de substituição de sequências de regiões hipervariáveis para as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, esses anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (patente US 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pela sequência correspondente a partir de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos de regiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores.

A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método de melhor adequação, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é filtrada em comparação com toda a biblioteca de sequências de domínio variável humanas. A sequência humana mais próxima daquela do roedor é então aceita como região de estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296, 1993; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901, 1987). Outro método utiliza uma região estrutural específica derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A, 89:4285, 1992; Presta et al., J. Immunol., 151:2623, 1993).

É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humani zados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das sequências parentais e diversos produtos humanizados conceituais, através da utilização de modelos tridimensionais das sequências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. São disponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveis estruturas de conformação tridimensional de possíveis sequências de imunoglobulina selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da possível sequência de imunoglobulina, ou seja, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina possível de se ligar ao seu antígeno. Desta forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências do receptor e de importação, de forma que seja atingida a característica desejada do anticorpo, tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s) desejado(s). Geralmente, os resíduos da região hipervariável são direta e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação de antígenos.

O Exemplo 1 abaixo descreve a produção de um exemplo de anticorpo anti-ErbB2 humanizado. O anticorpo humanizado do presente pode compreender, por exemplo, resíduos da região hipervariável não humana incorporados em um domínio pesado variável humano e pode compreender adicionalmente uma substituição de região de estrutura (FR) em posição selecionada a partir do grupo que consiste em 69H, 71H e 73H, utilizando-se o sistema de numeração de domínio variável estabelecido em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological interest, quinta edição, Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda MD, Estados Unidos, 1991. Em uma realização, o anticorpo humanizado compreende substituições de FR em duas ou em todas as posições 69H₍ 71H e 73H.

São contempladas diversas formas do anticorpo humanizado. O anticorpo humanizado pode ser, por exemplo, um fragmento de anticorpo, tal como Fab. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode ser um anticorpo intacto, tal como um anticorpo de lgG1 intacto.

(IV) ANTICORPOS HUMANOS:

Como alternativa à humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. É agora possível produzir, por exemplo, animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção endógena de imunoglobulina. Descreveu-se, por exemplo, que a exclusão homozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (J_H) em camundongos quiméricos e mutantes de linhagem germinativa resulta na inibição completa de produção de anticorpos endógenos. A transferência do conjunto de genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana nesses camundongos mutantes de linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante estímulo de antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A, 90:2551, 1993; Jakobovits et al., Nature, 362:255-258, 1993; Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33, 1993; e patente US 5.591.669, 5.589.369 e 5.545.807.

Alternativamente, pode-se utilizar tecnologia de exibição de fago (McCafferty et al., Nature, 348:552-553, 1990) para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vivo a partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes de domínio (V) de anticorpos são clonados em estrutura em um gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos na forma de fragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de cadeia única do genoma de fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene codificador do anticorpo que exibe essas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A exibição de fago pode ser realizada em uma série de formatos; para sua análise, vide, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology, 3:564-571, 1993. Diversas fontes de segmentos de gene V podem ser utilizadas para exibição do fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991, isolaram um conjunto diverso de anticorpos de antioxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para um conjunto diverso de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados seguindo-se essencialmente as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991, ou Griffith et al., EMBO J,t 12:725-734,1993. Vide também as patentes US 5.565.332 e 5.573.905.

Conforme discutido acima, os anticorpos humanos podem também ser gerados por células B ativadas in vitro (vide patentes US 5.567.710 e 5.229.275).

Anticorpos anti-ErbB2 humanos são descritos na patente US 5.772.997 concedida em 30 de junho de 1998 e WO 97/00271 publicada em três de janeiro de 1997.

(V) FRAGMENTOS DE ANTICORPOS:

Foram desenvolvidas diversas técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117, 1992; e Brennan et al., Science, 229:81, 1985). Entretanto, esses fragmentos podem ser agora produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados, por exemplo, a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos de Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos de F(ab')₂ (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167, 1992). De acordo com outra abordagem, fragmentos de F(ab')₂ podem ser isolados diretamente a partir de cultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo selecionado é um fragmento de Fv de cadeia única (scFv). Vide WO 93/16185; patente US 5.571.894; e patente US 5.587.458. O fragmento de anticorpo também pode ser um anti corpo linear, conforme descrito, por exemplo, na patente US 5.641.870. Esses fragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

(VI) ANTICORPOS BIESPECÍFICOS:

Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Exemplos de anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos diferentes da proteína ErbB2. Outros desses anticorpos podem combinar um sítio de ligação de ErbB2 com sítio(s) de ligação para EGFR, ErbB3 e/ou ErbB4. Alternativamente, um braço anti-ErbB2 pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula acionadora sobre um leucócito, tal como uma molécula receptora de célula T (por exemplo CD2 ou CD3) ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de forma a concentrar-se em mecanismos de defesa celular para a célula de expressão de ErbB2. Anticorpos biespecíficos podem também ser utilizados para localizar agentes citotóxicos para células que expressem ErbB2. WO 96/16673 descreve um anticorpo anti-ErbB2/anti-FcyRIII e a patente US 5.837.234 descreve um anticorpo anti-ErbB2/anti-FcyRI biespecífico. Um anticorpo antiErbB2/Fca biespecífico é exibido em WO 98/02463. A patente US 5.821.337 ensina um anticorpo anti-ErbB2/anti-CD3 biespecífico.

Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total baseia-se na coexpressão de dois pares de cadeia levecadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuem especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305:537-539, 1983). Devido à disposição aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é normalmente feita através de etapas de cromatografia de afinidade, é um tanto problemática e os rendimentos do produto são baixos. Procedimentos similares são descritos em WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J, 10:3655-3659, 1991. De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de antígeno-anticorpo) são fundidas em sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão é feita preferencialmente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte da articulação, regiões CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs codificadores das fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são cotransfectados em um organismo hospedeiro apropriado. Isso proporciona grande flexibilidade de ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeos em realizações em que razões desiguais das três cadeias de polipeptídeos utilizadas na construção proporcionam rendimentos ótimos. É possível, entretanto, inserir as sequências de codificação em duas ou todas as três cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão, quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos em razões iguais resultar em altos rendimentos ou quando as razões não forem de significação particular.

Em realização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeia levecadeia pesada de imunoglobulina híbrida (que proporciona segunda especificidade de ligação) no outro braço. Concluiu-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, como a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica proporciona forma fácil de separação. Esta abordagem é descrita em WO 94/04690. Para detalhes adicionais de geração de anticorpos biespecíficos, consulte, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210, 1986.

De acordo com outra abordagem descrita na patente US

5.731.168, a interface intermediária entre um par de moléculas de anticorpos pode ser construída de forma a maximizar o percentual de heterodímeros que é recuperado da cultura de células recombinantes. A interface intermediária preferida compreende pelo menos uma parte do domínio Ch3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias pequenas laterais de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (tais como tirosina ou triptofano). Cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre a interface da segunda molécula de anticorpo, através da substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por cadeias menores (tais como alanina ou treonina). Isso proporciona um mecanismo de aumento do rendimento do heterodimero sobre outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.

As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados, por exemplo, através da utilização de ligações químicas. Brennan et al., Science, 229:81, 1985, descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são divididos proteoliticamente para gerar fragmentos de F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente formador de complexo de ditiol arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e evitar a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos de Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-ΤΝΒ é então novamente convertido no Fab'-tiol através de redução com mercapto etil amina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab'-ΤΝΒ para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

O progresso recente possibilitou a recuperação direta dos fragmentos de Fab'-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225, 1992, descrevem a produção de uma molécula de anticorpo biespecífico F(ab')2 totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi segregado separa damente de E. coii e submetido a acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar às células que sobre-expressem o receptor de ErbB2 e as células T humanas normais, bem como iniciar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humanos.

Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecificos diretamente a partir de cultura celular recombinante também foram descritas. Anticorpos biespecificos foram produzidos, por exemplo, através da utilização de zíperes de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553, 1992. Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes através de fusão genética. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de suspensão para formar monômeros e, em seguida, novamente oxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de diacorpos descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.

S. A, 90:6444-6448, 1993, forneceu um mecanismo alternativo para a fabricação de fragmentos de anticorpos biespecificos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (V_H) conectado a um domínio variável de cadeia leve (V_L) por um ligante que é curto demais para permitir o emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia. Consequentemente, os domínios V_H e V_L de um fragmento são forçados a se emparelhar com os domínios V_H e V_L complementares de outro fragmento, de maneira a formar dois sítios de ligação de antígenos. Outra estratégia de fabricação de fragmentos de anticorpos biespecificos através da utilização de dímeros Fv de cadeia única (sFv) também foi relatada. Vide Gruber et al., J. ImmunoL, 152:5368, 1994.

São contemplados anticorpos com mais de duas valências. Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et al., J. ImmunoL, 147:60, 1991.

(VII) OUTRAS MODIFICAÇÕES DE SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS:

É (são) contemplada(s) modificação(ões) de sequência de aminoácido dos anticorpos anti-ErbB2 descritos no presente. Pode ser desejável, por exemplo, aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de sequências de aminoácidos do anticorpo anti-ErbB2 são preparadas através da introdução de trocas de nucleotídeos apropriadas no ácido nucleico de anticorpo anti-ErbB2, ou através da síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos do anticorpo anti-ErbB2. Qualquer combinação de deleção, inserção ou substituição é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As mudanças de aminoácidos também podem alterar processos pós-translacionais do anticorpo antiErbB2, tais como a mudança do número ou posição dos sítios de glicosilação.

Um método útil de identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo anti-ErbB2 que são locais preferidos para mutagênese é denominado mutagênese de varredura de alanina, conforme descrito por Cunningham e Wells, Science, 244:1081-1085, 1989. Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos desejados é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lis e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (de maior preferência alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com antígeno ErbB2. Esses sítios de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refinados pela introdução de outras variações ou adicionais nos sítios de substituição ou para os mesmos. Assim, embora o sítio para introdução de uma variação de sequência de aminoácido seja predeterminado, a natureza intrínseca da mutação não necessita ser predeterminada. Para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, por exemplo, varredura de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região alvo e as variantes de anticorpos anti-ErbB2 são selecionadas para a atividade desejada.

As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de terminais carboxila e/ou amino que variam de comprimento de um resíduo a polipeptídeos que contenham cem ou mais resíduos, bem como inserções entre as sequências de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo anti-ErbB2 com um resíduo metionila N-terminal ou do anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpos anti-ErbB2 incluem a fusão ao N- ou C-terminal do anticorpo anti-ErbB2 a uma enzima (para ADEPT, por exemplo) ou um polipeptídeo que aumente a meia-vida do soro no anticorpo.

Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácido. Estas variantes contêm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo anti-ErbB2 substituída por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariáveis, mas também são contempladas alterações de FR. Substituições conservadoras são exibidas na Tabela 1 sob o título de substituições preferidas. Caso essas substituições resultem em mudança da atividade biológica, mudanças mais substanciais, denominadas exemplos de substituições na Tabela 1 ou conforme descrito adicionalmente abaixo com referência a classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos são selecionados.

Tabela 1

Resíduo Original	Substituições Exemplificadas	Substituições Preferidas
Ala (A)	vai; leu; ile	vai
Arg (R)	lys; gin; asn	lys
Asn (N)	gin; his; asp, lys; arg	gin
Asp (D)	glu; asn	glu
Cys (C)	ser; ala	ser
Gin (Q)	asn; glu	asn
Glu (E)	asp; gin	asp
Giy (G)	ala	ala
His(H)	asn; gin; lys; arg	arg

Resíduo Original	Substituições Exemplificadas	Substituições Preferidas
ΙΙθ (I)	leu; vai; met; ala; phe; norleucina	leu
Leu (L)	norleucina; ile; vai; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gin; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; vai; ile; ala; tyr	tyr
Pro (P)	ala	ala
Ser(S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp(W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Vai (V)	ile; leu; met; phe; ala; norleucina	leu

Modificações substanciais das propriedades biológicas do anticorpo são alcançadas através da seleção de substituições que diferem significativamente de efeito sobre a manutenção de (a) estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, na forma de folha 5 ou conformação helicoidal; (b) carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio desejado; ou (c) volume da cadeia lateral. Resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral:

(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gin, his, lis, arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Substituições não conservatives causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo anti-ErbB2 também pode ser substituí do, geralmente com serina, para aprimorar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar a ligação cruzada aberrante. Por outro lado, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para aumentar sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo for um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento de Fv).

Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo progenitor (tal como um anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimento adicional terá(ão) propriedades biológicas aprimoradas com relação ao anticorpo progenitor do qual é (são) gerada(s). Uma forma conveniente de geração dessas variantes de substituição envolve maturação por afinidade através da utilização de exibição de fago. Resumidamente, diversos locais de regiões hipervariáveis (por exemplo, seis a sete sítios) sofrem mutações para gerar todas as substituições amino possíveis em cada sítio. As variantes de anticorpos geradas desta forma são exibidas de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos na forma de fusões para o produto de gene III de M13 embalado em cada partícula. As variantes exibidas por fagos são então selecionadas de acordo com sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) conforme descrito no presente. A fim de identificar possíveis sítios de regiões hipervariáveis para modificação, mutagênese de varredura de alanina pode ser realizada para identificar resíduos de regiões hipervariáveis que contribuem significativamente para a ligação de antígenos. Alternativa ou adicionalmente, pode ser vantajoso analisar uma estrutura de cristal do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o ErbB2 humano. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos à substituição de acordo com as técnicas elaboradas no presente. Uma vez que essas variantes sejam geradas, o quadro de variantes é submetido à seleção conforme descrito no presente e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

Pode ser desejável modificar o anticorpo da presente invenção com relação à função efetora, por exemplo, de forma a aumentar a citotoxicidade mediada por célula antígeno-dependente (ADCC) e/ou citotoxicidade complemento-dependente (CDC) do anticorpo. Isso pode ser atingido através da introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo. Alternativa ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região de Fc, de forma a permitir a formação de ligação de dissulfeto intercadeias nessa região. O anticorpo homodimérico, assim gerado, pode possuir capacidade de internalização aprimorada e/ou morte celular mediada por complemento aprimorado e citotoxicidade celular de anticorpo-dependente (ADCC). Vide Caron et al., J. Exp. Med, 176:1191-1195, 1992, e Shopes, B., J. Immunol, 148:2918-2922, 1992. Anticorpos homodiméricos com atividade antitumoral aprimorada podem também ser preparados através da utilização de ligação cruzada heterobifuncional, conforme descrito em Wolf et a!., Cancer Research, 53:2560-2565, 1993. Alternativamente, pode ser construído um anticorpo que possui regiões Fc duplas e pode, portanto, apresentar lise complementar aprimorada e capacidades de ADCC. Vide Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230, 1989.

Para aumentar a meia-vida do anticorpo em soro, pode-se incorporar um epítopo de ligação de receptor selvagem no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo), conforme descrito, por exemplo, na patente US 5.739.277. Da forma utilizada no presente, a expressão epítopo de ligação de receptor selvagem designa um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgGi, lgG₂, lgG₃ ou lgG₄) que é responsável pelo aumento da meia vida em soro in vivo da molécula de IgG.

(VIII) VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO:

Os anticorpos são glicosilados em posições conservadas em suas regiões constantes (Jefferis e Lund, Chem. Immunol, 65:111-128, 1997; Wright e Morrison, TibTECH, 15:26-32, 1997). As cadeias laterais de oligossacarídeos das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd et al., Mol. Immunol., 32:1311-1318, 1996; Wittwe e Howard, Biochem., 29:41754180, 1990) e a interação intramolecular entre partes da glicoproteína que podem afetar a conformação e apresentou superfície tridimensional da glicoproteína (Hefferis e Lund, acima; Wyss e Wagner, Current Opin. Biotech., 7:409-416, 1996). Os oligossacarídeos podem também servir para dirigir uma glicoproteína dada a certas moléculas baseadas em estruturas de reconhecimento específicas. Relatou-se, por exemplo, que, a IgG em galactose, a porção de oligossacarídeo move-se para fora do espaço inter-CH2 e os resíduos terminais de N-acetil glucosamina tornam-se disponíveis para se ligar à proteína de ligação de manose (Malhotra et al., Nature Med., 1:237243, 1995). Remoção por glicopeptidase dos oligossacarídeos de CAMPATH-1H (anticorpo lgG1 monoclonal de murino humanizado recombinante que reconhece o antígeno CDw52 de linfócitos humanos) produzido em células de ovário de hamster chinês (CHO) resultou em completa redução da lise mediada por complemento (CMCL) (Boyd et al., Mol. Immunol, 32:13111318, 1996), enquanto a remoção seletiva de resíduos de ácido siálico utilizando neuraminidase resultou em ausência de perda de DMCL. Também se relatou que a glicosilação de anticorpos afeta a citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC). Particularmente, relatou-se que células de CHO com expressão regulada por tetraciclina de β(1,4)-N-acetil glucosaminil transferase III (GnTHI), formação catalisadora de glicosil-transferase de GlcNAc em divisão apresenta maior atividade de ADCC (Umana et al., Mature Biotech., 17:176-180, 1999).

A glicosilação de anticorpos é tipicamente N-ligada ou O-ligada. O N-ligado designa a ligação da porção carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeos asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer dessas sequências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio potencial de glicosilação. A glicosilação O-ligada designa a ligação de um dos açúcares N-acetil galactosamina, galactose ou xilose a um ácido hidróxi amino, mais comumente serina ou treonina, embora possam também ser utilizadas 5hidróxi prolina ou 5-hidróxi lisina.

Variantes de glicosilação de anticorpos são variantes em que o padrão de glicosilação de um anticorpo é alterado. Alterar significa excluir uma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo, adicionando uma ou mais porções de carboidrato ao anticorpo, modíficando-se a composição de glicosilação (padrão de glicosilação), a extensão da glicosilação, etc.

A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente atingida através de alteração da sequência de aminoácido, de forma a conter uma ou mais das sequências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração também pode ser feita através da adição de um ou mais resíduos de serina ou treonina, ou substituição por estes, à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação Oligados). De forma similar, a remoção de locais de glicosilação pode ser atingida através da alteração de aminoácidos nos locais de glicosilação nativa do anticorpo.

A sequência de aminoácido é normalmente alterada pela sequência de ácido nucléico subjacente. Moléculas de ácido nucléico que codificam variantes de sequência de aminoácido do anticorpo anti-ErbB2 são preparadas através de uma série de métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas sem se limitar ao isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação através de mutagênese mediada por oligonucleotídeos (ou sítiodirigida), mutagênese de PCR e mutagênese de conjunto de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante do anticorpo antiErbB2.

A glicosilação (incluindo padrão de glicosilação) de anticorpos também pode ser alterada sem modificar a sequência de aminoácido ou a sequência de nucleotídeos subjacente. A glicosilação depende em grande parte da célula hospedeira utilizada para expressar o anticorpo. Como o tipo de célula utilizado para a expressão de glicoproteínas recombinantes, tais como anticorpos, como potenciais terapêuticos são raramente a célula nativa, pode-se esperar variações significativas do padrão de glicosilação dos anticorpos (vide, por exemplo, Hse et al., J. Biol. Chem., 272:9062-9070, 1997). Além da seleção de células hospedeiras, fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos incluem o modo de crescimento, formulação dos meios, densidade do cultivo, oxigenação, pH, esquemas de purificação e similares. Diversos métodos foram propostos para alterar o padrão de glicosilação atingido em um organismo hospedeiro especifico, que incluem a introdução ou sobre-expressão de certas enzimas envolvidas na produção de oligossacarídeos (patentes US 5.047.335, 5.510.261 e 5.278.299). A glicosilação ou certos tipos de glicosilação podem ser enzimaticamente removidos da glicoproteína, através da utilização, por exemplo, de endoglicosidase H (Endo H). Além disso, a célula hospedeira recombinante pode ser geneticamente construída, fazendo defeitos, por exemplo, no processamento de certos tipos de polissacarídeos. Estas técnicas e outras similares são bem-conhecidas na técnica.

A estrutura de glicosilação de anticorpos pode ser facilmente analisada através de técnicas convencionais de análise de carboidrato, que incluem cromatografia de lectina, RMN, espectrometria de massa, HPLC, GPC, análise de composição de monossacarídeos, digestão enzimática sequencial e HPAEC-PAD, que utiliza cromatografia de intercâmbio de ânions de alto pH para separar os oligossacarídeos com base na carga. Métodos de liberação de oligossacarídeos para fins analíticos também são conhecidos e incluem, sem limitação, tratamento enzimático (comumente realizado através da utilização de peptídeo-N-glicosidase F/endo-f-galactosidase), eliminação através da utilização de ambiente alcalino desfavorável para liberar principalmente estrutura O-ligada e métodos químicos que utilizam hidrazina anidra para liberar oligossacarídeos N- e O-ligados.

(IX) SELEÇÃO DE ANTICORPOS COM AS PROPRIEDADES DESEJADAS:

Foram descritas acima técnicas de geração de anticorpos. Podese selecionar adicionalmente anticorpos com certas características biológicas, conforme o desejado.

Para identificar, por exemplo, anticorpos anti-ErbB2 inibidores do crescimento, pode-se selecionar anticorpos que inibam o crescimento de células cancerosas que sobre-expressem ErbB2. Em uma realização, o anticorpo inibidor do crescimento selecionado é capaz de inibir o crescimento de células SK-BR-3 em cultura celular em cerca de 20 a 100% e, preferencial5 mente, cerca de 50 a 100% em concentração de anticorpos de cerca de 0,5 a 30 μρ/πιΙ. Para identificar esses anticorpos, pode-se realizar o ensaio de SK-BR-3 descrito na patente US 5.677.171. De acordo com este ensaio, as células SK-BR-3 são cultivadas em uma mistura 1:1 de F12 e meio DMEM suplementado com soro bovino fetal a 10%, glutamina e estreptomicina de 10 penicilina. As células de SK-BR-3 são colocadas em 20.000 células em um disco de cultura celular de 35 mm (2 ml/disco de 35 mm). 0,5 a 30 μ9/ηΊΐ do anticorpo anti-ErbB2 são adicionados por disco. Após seis dias, o número de células, em comparação com células não tratadas, é contado através da utilização de um contador celular eletrônico Coulter. Esses anticorpos que ini15 bem o crescimento das células SK-BR-3 em cerca de 20 a 100% ou cerca de 50 a 100% podem ser selecionados na forma de anticorpos inibidores do crescimento.

Para selecionar anticorpos que induzam a morte celular, a perda de integridade da membrana conforme indicado, por exemplo, por PI, azul de 20 tripano ou tomada de 7AAD pode ser determinada com relação ao controle. O ensaio preferido é o ensaio de tomada de PI através da utilização de células BT474. De acordo com este ensaio, células BT474 (que podem ser obtidas através da Coleção Norte-Americana de Tipos de Culturas, Rockville MD, Estados Unidos) são cultivadas em Meio Eagle Modificado da Dulbecco 25 (D-MEM):F-12 de Ham (50:50) suplementado com FBS desativado por calor a 10% (Hyclone) e 2 mM de L-glutamina. (Desta forma, o ensaio é realizado na ausência de complemento e células efetoras imunológicas). As células BT474 são semeadas em densidade de 3 x 10⁶ por disco em discos de 100 x 20 mm e mantidas em crescimento por uma noite. O meio é então removi30 do e substituído com meio novo isolado ou meio que contenha 10 ng/ml do anticorpo monoclonal apropriado. As células são incubadas por um período de tempo de três dias. Em seguida a cada tratamento, as monocamadas são lavadas com PBS e separadas através de tripsina. As células são então centrifugadas a 1200 rpm por cinco minutos a 4°C, o pélete foi ressuspenso em 3 ml de tampão de ligação de Ca²⁺ resfriado com gelo (10 mM de Hepes, pH 7,4, 140 mM de NaCI, 2,5 mM de CaCI₂) e dividida em 12 x 75 tubos de 35 mm com tampa de coador (1 ml por tubo, três tubos por grupo de tratamento) para a remoção dos conjuntos de células. Os tubos recebem então PI (10 pg/ml). Amostras podem ser analisadas através da utilização de um citômetro de fluxo Facscan e software CellQuest da Facsconvert (Becton Dickinson). Estes anticorpos que incluem níveis estatisticamente significativos de morte celular, conforme determinado pela retirada de PI, podem ser selecionados como anticorpos indutores de morte celular.

A fim de selecionar anticorpos que induzam apoptose, é disponível um ensaio de ligação de anexina que utiliza células BT474. As células BT474 são cultivadas e semeadas em discos, conforme discutido no parágrafo anterior. O meio é então removido e substituído com meio novo isolado ou meio contendo 10 qg/ml do anticorpo monoclonal. Após um período de incubação de três dias, as monocamadas são lavadas com PBS e separadas através de tripsina. As células são então centrifugadas, ressuspensas em tampão de ligação de Ca²⁺ e divididas em tubos conforme discutido acima para o ensaio de morte celular. Os tubos recebem então anexina marcada (por exemplo, V-FTIC de anexina) (1 gg/ml). As amostras podem ser analisadas através da utilização de um citômetro de fluxo Facscan e software CellQuest Facsconvert (Becton Dickinson). Estes anticorpos que induzem níveis estatisticamente significativos de ligação de anexina com relação ao controle são selecionados como anticorpos indutores de apoptose.

Além do ensaio de ligação de anexina, é disponível um ensaio de manchas de DNA utilizando-se células BT474. A fim de realizar este ensaio, células BT474 que foram tratadas com o anticorpo de interesse conforme descrito nos dois parágrafos anteriores são incubadas com 9 qg/ml de Hoechst 33342 por duas horas a 37°C, analisadas em seguida sobre um citômetro de fluxo Epics Elite (Coulter Corporation), utilizando software Modfit LT (Verity Software House). Anticorpos que induzem modificação do per61 centual de células apoptóticas que seja de duas vezes ou mais (e, preferencialmente, três vezes ou mais) que as células não tratadas (até 100% de células apoptóticas) podem ser selecionados na forma de anticorpos próapoptóticos, utilizando este ensaio.

Para identificar um anticorpo que bloqueie a ativação de ligante de um receptor de ErbB, pode-se determinar a capacidade do anticorpo em bloquear a ligação de ligante ErbB a células que expressem o receptor de ErbB (em conjugação, por exemplo, com outro receptor de ErbB com o qual o receptor de ErbB de interesse forma um hetero-olgômero de ErbB). Células que expressam naturalmente ou são transfectadas para expressar receptores de ErbB do hetero-olgômero de ErbB podem ser incubadas com o anticorpo e expostas em seguida ao ligante de ErbB marcado. A capacidade do anticorpo anti-ErbB2 de bloquear a ligação de ligante ao receptor de ErbB no hetero-olgômero de ErbB pode ser então avaliada.

A inibição de ligação de HRG a linhagens celulares de tumor de mama MCF7 por anticorpos anti-ErbB2 pode ser realizada, por exemplo, através da utilização de culturas de MCF7 monocamada sobre gelo em um formato de placa de 24 cavidades, essencialmente conforme descrito no Exemplo 1 abaixo. Anticorpos monoclonais anti-ErbB2 podem ser adicionados a cada cavidade e incubados por trinta minutos. rHRGp1₁₇7.₂24 (25 pm) pode ser então adicionado e a incubação pode prosseguir por 4 a 16 horas. Podem ser preparadas curvas de reação à dosagem e um valor de IC50 pode ser calculado para o anticorpo de interesse. Em uma realização, o anticorpo que bloqueia a ativação de ligante de um receptor de ErbB terá IC50 para inibição da ligação de HRG a células MCF7 neste ensaio de cerca de 50 nM ou menos, de maior preferência 10 nM ou menos. Quando o anticorpo for um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fab, a IC₅₀ para a inibição de ligação de HRG a células MCF7 neste ensaio pode ser, por exemplo, de cerca de 100 nM ou menos, de maior preferência 50 nM ou menos.

Alternativa ou adicionalmente, pode-se determinar a capacidade do anticorpo anti-ErbB2 em bloquear a fosforilação de tirosina estimulada por ligante ErbB de um receptor de ErbB presente em um hetero-olgômero de ErbB. Células que expressem de forma endógena os receptores de ErbB ou transfectadas para expressá-los, por exemplo, podem ser incubadas com o anticorpo e, em seguida, testadas quanto à determinação da atividade de fosforilação de tirosina dependente de ligante ErbB, através da utilização de um monoclonal antifosfotirosina (que é opcionalmente conjugado com um rótulo detectável). O ensaio de ativação de receptor de quinase descrito na patente US 5.766.863 também é disponível para determinação da ativação de receptor de ErbB e do bloqueio daquela atividade por um anticorpo.

Em uma realização, pode-se selecionar um anticorpo que inibe o estímulo por HRG de fosforilação de p180 tirosina em células de MCF7. As células de MCF7 podem ser colocadas, por exemplo, em placas de 24 cavidades e anticorpos monoclonais para ErbB2 podem ser adicionados a cada cavidade e incubados por trinta minutos à temperatura ambiente; em seguida, pode-se adicionar rHRG31₁₇₇_₂44 a cada cavidade até concentração final de 0,2 nM e a incubação pode prosseguir por oito minutos. Os meios podem ser aspirados de cada cavidade e as reações podem ser suspensas através da adição de 100 μΙ de tampão de amostra de SDS (5% de SDS, 25 mM de DTT e 25 mM de Tris-HCI, pH 6,8). Cada amostra (25 jal) pode ser colocada em eletroforese sobre um gel de grau de 4 até 12% (Novex) e, em seguida, transferida por eletroforese para membrana de difluoreto de polivinilideno. A imunotransferência de antifosfotirosina (a 1 pg/ml) podem ser desenvolvidas e a intensidade da faixa reativa predominante a M_r de cerca de 180.000 pode ser quantificada através de densitometria de reflexão. O anticorpo selecionado preferencialmente inibirá de forma significativa o estímulo de HRG de fosforilação de p180 tirosina em cerca de 0 a 35% do controle neste ensaio. Pode-se preparar uma curva de reação à dosagem para inibição de estímulo por HRG de fosforilação de p180 tirosina conforme determinado através de densitometria de reflexão e pode ser calculada IC50 para o anticorpo de interesse. Em uma realização, o anticorpo que bloqueia a ativação de ligante de um receptor de ErbB terá IC50 para a inibição do estímulo por HRG de fosforilação de p180 tirosina neste ensaio de cerca de 50 nM ou menos, de maior preferência 10 nM ou menos. Quando o anticorpo for um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fab, a IC50 para a inibição do estímulo de HRG de fosforilação de p180 tirosina neste ensaio pode ser, por exemplo, de cerca de 100 nM ou menos, de maior preferência 50 nM ou menos.

Pode-se também determinar os efeitos inibidores do crescimento do anticorpo sobre células MDA-MB-175, por exemplo, essencialmente conforme descrito em Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394, 1997. De acordo com este ensaio, células MDA-MB-175 podem ser tratadas com um anticorpo monoclonal anti-ErbB2 (10 pg/ml) por quatro dias e manchadas com violeta de cristal. Incubação com um anticorpo anti-ErbB2 pode exibir um efeito inibidor do crescimento sobre essa linhagem celular, similar à exibida por anticorpo monoclonal 2C4. Em uma realização adicional, o HRG exógeno não reverterá significativamente esta inibição. Preferencialmente, o anticorpo será capaz de inibir a proliferação celular de células MDA-MB-175 até um ponto maior que o anticorpo monoclonal 4D5 (e opcionalmente até um ponto maior que o anticorpo monoclonal 7F3), ambos na presença e ausência de HRG exógeno.

Em uma realização, o anticorpo anti-ErbB2 de interesse pode bloquear a associação dependente de heregulina de ErbB2 com ErbB3 em células de MCF7 e SK-BR-3, conforme determinado em um experimento de coimunoprecipitação, de forma substancialmente mais eficaz que o anticorpo monoclonal 4D5 e, preferencialmente, de forma substancialmente mais eficaz que o anticorpo monoclonal 7F3.

Para selecionar anticorpos que se ligam a um epítopo sobre ErbB2 unido por um anticorpo de interesse, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina_; tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane, 1988, pode ser realizado. Alternativa ou adicionalmente, pode-se efetuar mapeamento de epítopos através de métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Figuras 1A e 1B do presente).

Os resultados obtidos nos ensaios baseados em células descritos acima podem ser então seguidos por testes em animais, tais como testes clínicos em seres humanos, modelos e murinos. Particularmente, a incapacidade ou capacidade limitada de tratamento de tumores de sobreexpressão de ErbB2 de um anticorpo pode ser demonstrada no modelo de camundongo transgênico descrito no presente pedido conforme descrito nos Exemplos abaixo.

B - CONJUGADOS DE MAITANSINOIDE E ANTICORPO ANTIERBB (IMUNOCONJUGADOS)

Conjugados de maitansinoide e anticorpo anti-ErbB são preparados através de ligação química de um anticorpo anti-ErbB a uma molécula de maitansinoide sem reduzir significativamente a atividade biológica do anticorpo ou da molécula de maitansinoide. Os maitansinoides são bemconhecidos no estado da técnica e podem ser sintetizados através de técnicas conhecidas ou isolados a partir de fontes naturais. Os maitansinoides apropriados são descritos, por exemplo, na patente US 5.208.020 e nas outras patentes e outras publicações designadas acima. Os maitansinoides preferidos são maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tais como diversos ésteres de maitansinol.

Existem vários grupos de ligação conhecidos na técnica para a fabricação de conjugados de maitansinoide e anticorpo, que incluem, por exemplo, os descritos nas patentes US 5.208.020 ou patente EP 0.425.235 B1 e Chari et al., Cancer Research, 52:127-131, 1992. Os grupos de ligação incluem grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos lábeis a ácido, grupos fotolábeis, grupos lábeis a peptidase ou grupos lábeis a esterase, conforme descrito nas patentes identificadas acima, sendo preferidos grupos dissulfeto e tioéter.

Os conjugados do anticorpo e maitansinoide podem ser fabricados através da utilização de uma série de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais, tais como N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometila)ciclo-hexano-1-carboxilato, imino tiolano (IT), derivados bifuncionais de imido ésteres (tais como HCI adipimidato de dimetila), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(pdiazônio benzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tais como 2,6-di-isocianato tolueno) e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5-diflúor-2,4dinitrobenzeno). Agentes de acoplamento particularmente preferidos incluem N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem J., 173:723-737, 1978) e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar uma ligação de dissulfeto.

O ligante pode ser conectado à molécula de maitansinoide em várias posições, dependendo do tipo da ligação. Uma ligação de éster pode ser formada, por exemplo, na posição C-3 que contém um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxila e na posição C-20 que contém um grupo hidroxila, através da utilização de técnicas de acoplamento convencionais. Em realização preferida, a ligação é formada na posição C-3 de maitansinol ou um análogo de maitansinol.

C - FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

Formulações terapêuticas dos conjugados de maitansinoide e anticorpo utilizado de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenagem através de mistura de um anticorpo que possua o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^a edição, Osol, A. Ed., 1980), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Estabilizantes, excipientes ou veículos aceitáveis são atóxicos para os pacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, que incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecil dimetil benzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabeno, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3pentanol e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imu noglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos que incluem glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Znproteína); e/ou tensoativos não iônicos tais como Tween, Pluronics ou polietileno glicol (PEG). Formulações de anticorpos anti-ErbB2 liofilizados preferidas são descritas em WO 97/04801, expressamente incorporada ao presente como referência.

A formulação do presente pode também conter mais de um composto ativo conforme o necessário para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente os que tenham atividades complementares que não se prejudiquem entre si. Pode ser desejável, por exemplo, proporcionar anticorpos que se ligam ao EGFR, ErbB2 (por exemplo, um anticorpo que se liga a um epítopo diferente sobre ErbB2), ErbB3, ErbB4 ou fator endotelial vascular (VEGF) na formulação única. Alternativa ou adicionalmente, a composição pode compreender adicionalmente um agente quimioterapêutico, agente citotóxico, citocina, agente inibidor do crescimento, agente antihormonal e/ou cardioprotetor. Essas moléculas são adequadamente presentes em combinação, em quantidades que sejam eficazes para o propósito desejado.

Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de acumulação ou polimerização interfacial, tais como hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^a edição, Osol, A. Ed., 1980.

Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem math zes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos que contenham o anticorpo, com essas matrizes estando na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como metacrilato de (poli)2-hidroxietila ou álcool (poli)vinílico), polilactidas (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de etila, acetato de etileno-vinila não degradável, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradáveis, tais como Depot da Lupron (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidróxi butírico.

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente conseguido através de filtragem por membranas de filtragem estéreis.

D - TRATAMENTO COM OS CONJUGADOS DE MAITANSINOIDE E ANTICORPOS ANTI-ErbB2

Contempla-se que, de acordo com a presente invenção, os conjugados de maitansinoide e anticorpos anti-ErbB2 podem ser utilizados para o tratamento de diversas doenças ou disfunções. Exemplos de condições ou disfunções incluem tumores benignos ou malignos; leucemias e malignidades linfoides; outras disfunções, tais como disfunções neurais, gliais, astrocitais, hipotalâmicas, glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais, blastocoélicas, inflamatórias, angiogênicas e imunológicas.

Geralmente, a doença ou disfunção a ser tratada é câncer. Exemplos de câncer a serem tratados no presente incluem, mas sem se limitar à carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem câncer celular escamoso (por exemplo, câncer celular escamoso epitelial), câncer do pulmão, incluindo câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão de células não-pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer do estômago ou gástrico; incluindo câncer gastrintestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma de endométrio ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, câncer renal, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal e carcinoma peniano, bem como câncer do cérebro e garganta.

O câncer compreenderá geralmente células de expressão de ErbB2, de tal forma que um anticorpo anti-ErbB2 do presente seja capaz de ligar-se ao câncer, e será tipicamente caracterizado pela sobre-expressão do receptor de ErbB. Em realização preferida, o câncer compreende células de expressão de ErbR2 e, de preferência ainda maior, células que são caracterizadas pela sobre-expressão do receptor de ErbB2. Para determinar ErbB2, por exemplo, a expressão de ErbB2 no câncer são disponíveis diversos ensaios de diagnóstico/prognóstico. Em uma realização, a sobre-expressão de ErbB2 pode ser analisada através de IHC, utilizando-se, por exemplo, o Herceptest® (Dako). Seções de tecido embebidas em parafina de uma biópsia tumoral podem ser submetidas ao ensaio de IHC e conceder um critério de intensidade de manchas de proteína ErbB2_: conforme segue:

Nota 0: não se observam manchas ou observa-se mancha da membrana em menos de 10% das células tumorais.

Nota 1 + : é detectada mancha de membrana fraca/mal perceptível em mais de 10% das células tumorais. As células somente são manchadas em parte da sua membrana.

Nota 2+: observam-se manchas da membrana completas de fracas a moderadas em mais de 10% das células tumorais.

Nota 3+: observam-se manchas da membrana completas de moderadas a fortes em mais de 10% das células tumorais.

Esses tumores com notas 0 ou 1+ para determinação da sobreexpressão de ErbB2 podem ser caracterizados como não sobreexpressando ErbB2, enquanto os tumores com notas 2+ ou 3+ podem ser caracterizados como sobre-expressando ErbB2.

Alternativa ou adicionalmente, ensaios de FISH tais como o Inform (vendido pela Ventana, Arizona, Estados unidos) ou Pathvision (Vysis,

Illinois, Estados Unidos) podem ser conduzidos sobre o tecido tumoral fixado por formalina e embebido em parafina, para determinar a extensão (se houver) da sobre-expressão de ErbB2 no tumor.

Em uma realização, o câncer será um que expresse (e possa sobre-expressar) EGFR. Exemplos de cânceres que podem expressar/sobre-expressar EGFR incluem câncer celular escamoso (por exemplo, câncer celular escamoso epitelial), câncer do pulmão que inclui câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão de células não-pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou do estômago que inclui câncer gastrintestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, câncer renal, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tiroide. carcinoma hepático, carcinoma anal e carcinoma peniano, bem como câncer do cérebro e da garganta.

Preferencialmente, os imunoconjugados da presente invenção e/ou ErbB, tal como proteína EGFR ou ErbB2 ao qual são ligados, são internalizados pela célula, o que resulta em aumento da eficácia terapêutica do imunoconjugado ao matar a célula cancerosa à qual se ligam. Em realização preferida, o agente citotóxico (maitansinoide) objetiva ou interfere com o ácido nucleico na célula cancerosa.

O tratamento da presente invenção tem por objetivo, tumores que sobre-expressem ErbB que não respondam, ou respondam mal, ao tratamento com um anticorpo anti-ErbB não conjugado. Esses pacientes poderão ter recebido tratamento anterior com um anticorpo anti-ErbB não conjugado a uma porção de maitansinoide, em que o tratamento anterior não resultou em aprimoramento significativo ou resultou em resposta passageira. O tratamento anterior de qualquer paciente específico com um anticorpo anti-ErbB não conjugado não é, entretanto, um requisito prévio de identificação de pacientes que são candidatos para tratamento de acordo com a presente invenção. Um médico com conhecimentos comuns pode identificar facilmen te pacientes que poderão beneficiar-se do tratamento com os imunoconjugados da presente invenção, com base em dados clínicos publicamente disponíveis e sua própria experiência. O tratamento de mamíferos, particularmente pacientes humanos, com ou sem tratamento anterior com um anticorpo anti-ErbB (não conjugado) encontra-se especificamente no escopo da presente invenção.

Os conjugados de maítansinoide e anticorpo anti-ErbB são administrados a um mamífero, preferencialmente um paciente humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo uma mistura ou através de infusão contínua ao longo de um período de tempo, através de vias intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinhal, subcutânea, intra-articular. intrasinovial, intratecal, oral, tópica ou inalações. Prefere-se administração intravenosa ou subcutânea do anticorpo.

Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração dos conjugados de maítansinoide e anticorpo anti-ErbB. A administração combinada inclui a coadministração, utilizando formulações separadas ou uma única formulação farmacêutica e a administração consecutiva em qualquer ordem, em que exista preferencialmente um período de tempo em que os dois agentes ativos (ou todos eles) exerçam simultaneamente suas atividades biológicas.

Em realização preferida, o paciente é tratado com dois ou mais anticorpos anti-ErbB diferentes, pelo menos um dos quais na forma de um conjugado de maítansinoide. O paciente pode ser tratado, por exemplo, com um primeiro conjugado de maítansinoide e anticorpo anti-ErbB2 em que o anticorpo é inibidor do crescimento (por exemplo, Herceptin®) e um segundo anticorpo anti-ErbB2 ou imunoconjugado de anticorpo, tal como um conjugado de maítansinoide e anticorpo que bloqueie a ativação de ligante de um receptor de ErbB (tal como 2C4 ou uma de suas variantes maduras por afinidade e/ou humanizadas), ou induz apoptose de uma célula de sobreexpressão de ErbB2 (tal como 7C2, 7F3 ou suas variantes humanizadas). Em outra realização, o tratamento envolve a administração de anticorpos que se ligam especificamente a dois ou mais receptores de ErbB diferentes, tais corno receptores de ErbB2 e EGFR, em que pelo menos um dos anticorpos anti-ErbB é administrado na forma de conjugado de maitansinoide. Preferencialmente, essa terapia combinada resulta em efeito terapêutico sinérgico.

Pode também ser desejável combinar a administração dos conjugados de maitansinoide e anticorpo anti-ErbB2 com a administração de um anticorpo dirigido a outro antígeno associado a tumores, que não seja membro da familia de receptores de ErbB. Neste caso, o outro anticorpo pode, por exemplo, unir-se a fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e pode apresentar-se na forma de um conjugado de maitansinoide ou outro imunoconjugado.

Em uma realização, o tratamento da presente invenção envolve a administração combinada de um ou mais conjugados de maitansinoide e anticorpo anti-ErbB2 e um ou mais agentes quimioterapêuticos ou agentes inibidores do crescimento, que incluem a co-administração de misturas de diferentes agentes quimioterapêuticos. Os agentes quimioterapêuticos preferidos incluem taxanos (tais como paclitaxel e docetaxel) e/ou antibióticos de antraciclina. A preparação e programas de dosagem para esses agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes ou conforme determinado empiricamente pelo técnico no assunto. A preparação e programas de dosagem para essa quimioterapia também são descritos em Chemotherapy Service, Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore MD, Estados Unidos, 1992.

Os conjugados de maitansinoide e anticorpo podem ser combinados com um composto anti-hormonal; por exemplo, um composto antiestrogênio tal como tamoxifeno; uma antiprogesterona, tal como onapristona (vide EP 616.812) ou um antiandrogênio, tal como flutamida, em dosagens conhecidas para essas moléculas. Quando o câncer a ser tratado for um câncer independente de hormônios, o paciente pode haver sido submetido anteriormente à terapia anti-hormonal e, após o câncer tornar-se independente de hormônios, o anticorpo anti-ErbB2 (e, opcionalmente, outros agentes descritos no presente) pode ser administrado ao paciente.

Algumas vezes, pode também ser benéfico coadministrar um cardioprotetor (para evitar ou reduzir disfunções do miocárdio associadas à terapia) ou uma ou mais citocinas ao paciente. Além dos regimes terapêuticos acima, o paciente pode ser submetido à remoção cirúrgica de células cancerosas e/ou terapia de radiação.

As dosagens apropriadas para qualquer dos agentes coadministrados acima são as utilizadas atualmente e podem ser reduzidas devido à ação combinada (sinergia) do agente e anticorpo anti-ErbB2. Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de conjugados de maitansinoide e anticorpo dependerá do tipo de doença a ser tratada, conforme definido acima, severidade e avanço da doença, se o anticorpo for administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente, resposta ao anticorpo e critério do médico atendente. O conjugado de maitansinoide e anticorpo é apropriadamente administrado ao paciente por uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 a 20 mg/kg) de anticorpo é uma dosagem inicial possível para administração ao paciente se através, por exemplo, de uma ou mais administrações separadas, ou através de infusão contínua. Dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra supressão desejada de sintomas da doença. Um regime de dosagem preferido compreende a administração de uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida por dose semanal de manutenção de cerca de 2 mg/kg do conjugado de maitansinoide e anticorpo anti-ErbB2. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O andamento dessa terapia é facilmente monitorado através de técnicas e ensaios convencionais.

E - ARTIGOS INDUSTRIALIZADOS

Em outra realização da presente invenção, é fornecido um artigo industrializado contendo materiais úteis para o tratamento das disfunções descritas acima. O artigo industrializado compreende um recipiente e uma etiqueta ou bula sobre o recipiente ou com ele associado. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma série de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente mantém uma composição que seja eficaz para o tratamento da condição e pode conter uma porta de acesso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, uma bolsa de solução intravenosa ou uma ampola que possui vedação que pode ser furada por uma agulha de injeção hipodérmica).

Pelo menos um agente ativo da composição é um conjugado de maitansinoide e anticorpo anti-ErbB2. A etiqueta ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição selecionada, tal como câncer. Em uma realização, a etiqueta ou bula indica que a composição, que compreende o anticorpo que se liga ao ErbB2, pode ser utilizada para o tratamento de câncer que expressa um receptor de ErbB selecionado a partir do grupo que consiste no receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), ErbB2, ErbB3 e ErbB4, preferencialmente EGFR. Além disso, a etiqueta ou bula pode indicar que o paciente a ser tratado é um que seja portador de câncer caracterizado pelo excesso de ativação de um receptor de ErbB selecionado a partir de EGFR, ErbB2_; ErbB3 ou ErbB4. O câncer pode ser, por exemplo, um que sobre-expresse um desses receptores e/ou que sobreexpresse um ligante de ErbB (tal como TGF-α). A etiqueta ou bula pode também indicar que a composição pode ser utilizada para o tratamento de câncer, em que o câncer não é caracterizado por sobre-expressão do receptor de ErbB2. Embora a bula presente para Herceptin® indique que o anticorpo é utilizado para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático cujos tumores sobre-expressam a proteína de ErbB2, por exemplo, a bula do presente pode indicar que o anticorpo ou composição é utilizado para o tratamento de câncer que não responda, ou responda mal ao tratamento com Herceptin® Em outras realizações, a bula pode indicar que o conjugado de maitansinoide e anticorpo ou composição pode também ser utilizado para o tratamento de câncer independente de hormônios, câncer da próstata, câncer do cólon ou câncer colorretal. Além disso, o artigo industria lizado pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um conjugado de maitansinoide de um primeiro anticorpo que se liga ao ErbB2 e inibe o crescimento de células cancerosas que sobre-expressam ErbB2; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um segundo anticorpo que se ligue ao ErbB2 e bloqueia a ativação por ligante de um receptor de ErbB, ou um conjugado desse segundo anticorpo com um maitansinoide. O artigo industrializado nesta realização da presente invenção pode compreender adicionalmente uma bula que indique que as primeira e segunda composições podem ser utilizadas para o tratamento de câncer. Alternativa ou adicionalmente, o artigo industrializado pode compreender adicionalmente um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ela pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

Detalhes adicionais da presente invenção são ilustrados nos exemplos não limitadores a seguir.

EXEMPLO 1 - PRODUÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E HUMANIZAÇÃO DO ANTICORPO 4D5 MONOCLONAL DE ANTI-ErbB2

O anticorpo monoclonal de murino 4D5, que se liga especificamente ao domínio extracelular de ErbB2, foi produzido conforme descrito em Fendly etal., Cancer Research, 50:1550-1558, 1990. Resumidamente, células NIH 3T3/HER2-3₄oo (que expressam cerca de 1 x 10⁵ moléculas de ErbB2/célula) produzidas conforme descrito em Hudziak et al., Proc. NatL Acad. Sei. (USA), 84:7158-7163, 1987, foram colhidas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 25 mM de EDTA e utilizadas para imunizar camundongos BALB/c. Os camundongos receberam injeções intraperitoneais de 10⁷ células em 0,5 ml de PBS nas semanas 0, 2, 5 e 7. Os camundongos com antissoros que imunoprecipitaram ErbB2 marcado por ³²P receberam injeções intraperitoneais de um extrato de membrana de

ErbB2 purificado com sefarose-aglutinina de gérmen de trigo (WGA) nas semanas 9 e 13. Isso foi seguido por uma injeção intravenosa de 0,1 ml da preparação de ErbB2 e os esplenócitos foram fundidos com linhagem de mieloma de camundongo X63-Ag8,653. Os sobrenadantes de hibridoma foram selecionados por ligação de ErbB2 através de ELISA e radioimunoprecipitação.

MAPEAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE EPÍTOPOS

O epítopo de ErbB2 ligado pelo anticorpo monoclonal 4D5 foi determinado através de análise de ligação competitiva (Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558, 1990). Estudos de bloqueio cruzado foram realizados através de fluorescência direta sobre células intactas, utilizando-se a Máquina de Seleção Pandex™ para quantificar a fluorescência. O anticorpo monoclonal foi conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC), através da utilização de procedimentos estabelecidos (Wofsy et al., Selected Methods in Cellular Immunology, pp. 287, Mishel e Schiigi (eds.), San Francisco, Estados Unidos, W. J. Freeman Co., 1980). Monocamadas confluentes de células NIH 3T3/HER 2-3_4Oo foram colocadas em tripsina, lavadas por uma vez e novamente suspensas a 1,75 x 10⁶ células/ml em PBS frio contendo albumina de soro bovino (BSA) a 0,5% e NaN₃ a 0,1%. Adicionou-se concentração final de 1% de partículas de látex (IDC, Portland OR, Estados Unidos) para reduzir a obstrução das membranas de placas Pandex™. Células em suspensão, 20 μΙ, e 20 μΙ de anticorpos monoclonais purificados (100 μρ/ιτιΙ a 0,1 pg/ml) foram adicionadas às cavidades da placa Pandex™ e incubadas sobre gelo por trinta minutos. Uma diluição previamente determinada de anticorpos monoclonais rotulados por FITC em 20 μΙ foi adicionada a cada cavidade, incubada por trinta minutos, lavada e a fluorescência foi quantificada pelo Pandex™. Considerou-se que os anticorpos monoclonais compartilhariam um epítopo se cada um bloqueasse o outro em 50% ou mais em comparação com um controle de anticorpo monoclonal irrelevante. Neste experimento, o anticorpo monoclonal 4D5 foi denominado epítopo I (resíduos aminoácidos de cerca de 529 a cerca de 625, inclusive, no domínio extracelular de ErbB2 (vide SEQ ID NO:3).

As características de inibição do crescimento do anticorpo monoclonal 4D5 foram avaliadas através da utilização da linhagem de células tumorais da mama, SK-BR-3 (vide Hudziak et al., Molec. Cell Biol., 9(3):1165-1172, 1989). Resumidamente, as células SK-BR-3 foram separadas através da utilização de tripsina a 0,25% (vol/vol) e suspensas em meio completo sob densidade de 4 x 10⁵ células por ml. Parcelas de 100 μΙ (4 x 10⁴ células) foram colocadas em placas de micro-diluição de 96 cavidades, as células foram mantidas em aderência e 100 μΙ de meios isolados ou meios contendo anticorpos monoclonais (concentração final de 5 pg/ml) foram então adicionados. Após 72 horas, as placas foram lavadas por duas vezes com PBS (pH 7,5), manchadas com violeta de cristal (0,5% em metanol) e analisadas para a determinação da proliferação celular relativa, conforme descrito em Sugarman et al., Science, 230:943-945, 1985. O anticorpo monoclonal 4D5 inibiu a proliferação celular relativa de SK-BR-3 em cerca de 56%.

O anticorpo monoclonal 4D5 também teve avaliada sua capacidade de inibição de fosforilação de tirosina estimulada por HRG de proteínas na faixa M_r de 180.000 a partir de lisados de células inteiras de células MCF7 (Lewis et al. Cancer Research, 56:1457-1465, 1996). Relata-se que as células MCF7 expressam todos os receptores de ErbB conhecidos, mas em níveis relativamente baixos. Como ErbB2, ErbB3 e ErbB4 possuem tamanhos moleculares praticamente idênticos, não é possível discernir qual proteína está se tornando fosforilada por tirosina quando os lisados de células inteiras são avaliados através de análise Western Blot. Entretanto, estas células são ideais para ensaios de fosforilação de tirosina de HRG pois, sob as condições de ensaio utilizadas, na ausência de HRG adicionado de forma exógena, elas exibem níveis baixos a imperceptíveis de proteínas de fosforilação de tirosina na faixa M_r de 180.000.

Células MCF7 foram colocadas em placas de 24 cavidades e anticorpos monoclonais a ErbB2 foram adicionados a cada cavidade e incubados por trinta minutos à temperatura ambiente, rHRGpi 177-244 foi então adicionado a cada cavidade até concentração final de 0,2 nM e a incubação prosseguiu por oito minutos. Meios foram cuidadosamente aspirados de cada cavidade e as reações foram suspensas através da adição de 100 μΙ de tampão de amostra de SDS (5% SDS, 25 mM de DTT e 25 mM de Tris-HCI, pH 6,8). Cada amostra (25 μΙ) foi colocada em eletroforese sobre um gel de grau de 4 a 12% (Novex) e, em seguida, transferida em eletroforese para membrana de difluoreto de polivinilideno. Imunotransferência de antifosfotirosina (4G 10, de UBI, utilizado a 1 pg/ml) foi desenvolvida e a intensidade da faixa reativa predominante a M_r de 180.000 foi quantificada através de densitometria de reflexão, conforme descrito anteriormente (Holmes et al., Science, 256:1205-1210, 1992; Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269-1466114665, 1994).

O anticorpo monoclonal 4D5 inibiu significativamente a geração de um sinal de fosforilação de tirosina induzido por HRG a M_r de 180.000. Na ausência de HRG, foi incapaz de estimular a fosforilação de tirosina de proteínas na faixa de M_r de 180.000. Além disso, este anticorpo não apresentou reação cruzada com EGFR (Fendiy et al., Cancer Research, 50:1550-1558, 1990), ErbB3 ou ErbB4. O anticorpo monoclonal 4D5 foi capaz de bloquear o estímulo por HRG de fosforilação de tirosina em 50%.

O efeito inibidor do crescimento do anticorpo monoclonal 4D5 sobre células MDA-MB-175 e SK-BR-3 na presença ou ausência de rHRGpt exógeno foi determinado (Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394, 1997). Os níveis de ErbB2 em células MDA-MB-175 são de quatro a seis vezes mais altos que o nível encontrado em células epiteliais mamárias normais e o receptor de ErbB2-ErbB4 é constitutivamente fosforilado por tirosina em células de MDA-MB-175. O anticorpo monoclonal 4D5 foi capaz de inibir a proliferação celular de células MDA-MB-175, tanto na presença como na ausência de HRG exógeno. A inibição da proliferação celular por 4D5 é dependente do nível de expressão de ErbB2 (Lewis et al., Cancer ImmunoL Immunother., 37:255-263, 1993). Pôde-se detectar inibição máxima de 66% em células SK-BR-3. Este efeito, entretanto, poderá ser superado por HRG exógeno.

HUMANIZAÇÁQ

O anticorpo monoclonal de murino 4D5 foi humanizado, através da utilização de uma estratégia de mutagênese de conversão genética, conforme descrito na patente US 5.821.337, cuja revelação completa é expressamente incorporada ao presente como referência. O anticorpo monoclonal humanizado 4D5 utilizado nos experimentos a seguir é denominado huMAb4D5-8. Este anticorpo é de isotipo lgG1.

EXEMPLO 2

CONJUGADOS DE DM1 E HERCEPTIN®

- PURIFICAÇÃO DE HERCEPTIN®

O Herceptin® (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, patente US 5.821.337) (uma ampola contendo 440 mg de anticorpo) foi dissolvido em 50 ml de tampão MES (25 mM de MES, 50 mM de NaCI, pH 5,6). A amostra foi carregada em uma coluna de intercâmbio de cátions (Sepharose S, 15 cm x 1,7 cm) que havia sido equilibrada no mesmo tampão. A coluna foi então lavada com o mesmo tampão (5 volumes de coluna). O Herceptin® foi eluído através de elevação da concentração de NaCI do tampão a 200 mM. Frações contendo o anticorpo foram reunidas, diluídas a 10 mg/ml e sofreu diálise em um tampão contendo 50 mm de fosfato de potássio, 50 mM de NaCI, 2 mM de EDTA, pH 6,5.

- MODIFICAÇÃO DE HERCEPTIN® COM SPP

O anticorpo Herceptin® purificado foi modificado com Nsuccinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para a introdução de grupos piridiltio. O anticorpo (376,0 mg, 8 mg/ml) em 44,7 ml de 50 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,5), contendo NaCI (50 mM) e EDTA (1 mM) foi tratado com SPP (5,3 equivalentes molares em 2,3 ml de etanol). Após incubação por 90 minutos sob argônio à temperatura ambiente, a mistura de reação foi filtrada por gel através de uma coluna de Sephadex G25 com 35 mM de citrato de sódio, 154 mM de NaCI e 2 mM de EDTA. Frações contendo anticorpos foram reunidas e testadas. O grau de modificação do anticorpo foi determinado conforme descrito acima. A recuperação do anticorpo modificado (Herceptin®-SPP-Py) foi de 337 mg (89,7%) com 4,5 grupos de 2-tio piridina liberáveis ligados por anticorpo.

- CONJUGAÇÃO DE HERCEPTIN®-SPP-PY COM DM1

O anticorpo modificado (337,0 mg, 9,5 pmols de grupos 2-tio piridina liberáveis) foi diluído com os 35 mM de tampão de citrato de sódio acima, pH 6,5, até concentração final de 2,5 mg/ml. DM1 (cuja estrutura é exíbida na Figura 1) (1,7 equivalente, 16,1 gmoles) em 3,0 mM de dimetil acetamida (DMA, 3% v/v na mistura final de reação) foram então adicionados à solução de anticorpo. A reação processou-se à temperatura ambiente sob argônio por 20 horas. A estrutura de conjugados de Herceptin®-DM1 é ilustrada na Figura 2.

A reação foi carregada sobre uma coluna de filtragem de gel Sephacryl S300 (5,0 cm x 90,0 cm. 1,77 I) equilibrada com 35 mM de citrato de sódio, 154 mM de NaCI, pH 6.5. A velocidade de fluxo foi de 5,0 ml/min e foram recolhidas 65 frações (20,0 ml cada). Um pico principal centralizou-se em volta da fração n- 47 (Figura 3). O pico principal compreende Herceptin®-DM1 monomérico. As Frações 44 a 51 foram reunidas e testadas. O número de moléculas de drogas DM1 ligadas por molécula de anticorpo foi determinado através da medição da absorção a 252 nm e 280 nm e concluiu-se que era de 3,7 moléculas de droga por molécula de anticorpo.

EXEMPLO 3

ANIMAIS TRANSGÊNICOS

A fim de aumentar a atividade clínica de Herceptin®, foi desenvolvido um modelo de camundongo HER2 transgênico, em que terapias dirigidas a HER2 inovadoras puderam ser testadas de forma pré-clínica. Tumores surgem facilmente em camundongos transgênicos que expressam uma forma de mutação ativada de neu, homólogo de HER2 em ratos, mas o HER2 que é sobre-expresso em cânceres de mama não sofre mutação e a formação de tumores é muito menos robusta em camundongos transgênicos que sobre-expressam HER2 sem mutação (Webster et al. Semin. Cancer Biol._: 5:69-76, 1994). Para aprimorar a formação de tumores com HER2 sem mutação, foi utilizada uma estratégia para aumentar adicionalmente a sobreexpressão de HER2 sem mutação em camundongo transgênico.

Qualquer promotor que promova a expressão de HER2 em célu las epiteliais na glândula mamária de camundongo pode ser utilizado nas construções descritas. Vários dos genes de proteína de leite são transcritos por elementos promotores/amplificadores que são especificamente ativos em glândulas mamárias. Genes de proteína do leite incluem genes que codificam caseínas a-Si e (β), β-lacto globulina, α-lacto albumina e proteína ácida de soro de leite. O promotor de β-lacto globulina ovino é bemcaracterizado e amplamente utilizado na técnica (Whitelaw et al., Biochem J., 286:31-39, 1992). Entretanto; fragmentos similares de DNA promotor de outras espécies também são apropriados. Um promotor preferido é o promotor derivado da Repetição de Terminal Longo (LTR) do Vírus de Tumor Mamário de Camundongo (MMTV). Foi gerada uma construção de transgene de HER2 da presente invenção através da utilização do promotor de LTR MMTV.

Para aprimorar a formação de tumores com HER2 sem mutação, foram feitos camundongos transgênicos através da utilização de um plasmídeo de cDNA de HER2, em que um ATG anterior foi excluído a fim de evitar o início da tradução nesses códigos de ATG anterior, que de outra forma reduziría a freqúência de início de tradução a partir dos códigos autênticos de início posterior de HER2 (vide, por exemplo, Child et al., J. Biol. Chem., 274:24335-24341, 1999). Além disso, um íntron quimérico foi adicionado à extremidade 5', que também deverá aumentar o nível de expressão conforme relatado anteriormente (Neuberger e Williams, Nucleic Acids Res., 16:6713, 1988; Buchman e Berg, Mol. Cell. Biol., 8:4395, 1988; Brinster et aL Proc. Natt. Acad. Sci. U. S. A., 85:836, 1988). O intron quimérico foi derivado de um vetor Promega, vetor de expressão de mamíferos de pCI-neo (bp 890-1022). A extremidade 3' de cDNA é flanqueada por éxons 4 e 5 de hormônio de crescimento humano e sequências de poliadenilação. Além disso, foram utilizados camundongos FVB porque essa linhagem é mais suscetível ao desenvolvimento de tumores. O promotor de MMTV-LTR foi utilizado para assegurar a expressão de HER2 específica de tecidos na glânduia mamária. Os animais foram alimentados com a dieta AIN 76A a fim de aumentar a suscetibilidade à formação de tumores (Rao et aL Breast Cancer Res. and

Treatment, 45:149-158, 1997). A sequência de nucleotídeos desta construção de plasmídeo de transgene (SEQ ID N-1) é exibida na Figura 4.

Os animais apropriados para experimentos transgênicos podem ser obtidos através de fontes comerciais padrão, tais como Taconic (Germantown NY, Estados Unidos). Muitas linhagens são apropriadas, mas fêmeas de camundongos FVB são preferidas devido à sua suscetibilidade mais alta à formação de tumores. Machos FVB foram utilizados para acasalamento e garanhões CD.1, que sofreram vasectomia, foram utilizados para estimular pseudogravidez. Os camundongos com vasectomia podem ser obtidos através de qualquer fornecedor comercial. Os fundadores foram criados com camundongos FVB ou com camundongos heterozigóticos 129/BL6 x FVB p53. Os camundongos heterozigóticos em alelo p53 foram utilizados para aumentar potencialmente a formação de tumores. Entretanto, isso comprovou ser desnecessário. Portanto, alguns tumores de F1 são de linhagem misturada. Os tumores fundadores são somente FVB. Seis fundadores foram obtidos com alguns tumores em desenvolvimento, sem terem filhotes.

EXEMPLO 4 - CAMUNDONGO TRANSGÊNICO HER2 COMO MODELO DE TUMOR PARA AVALIAR TERAPIAS DIRIGIDAS A HER2

Biópsias de glândulas mamárias de um camundongo transgênico fundador feitas conforme descrito no Exemplo 3 exibiram expressão 3+ de HER2, conforme determinado através de manchas de imunohistoquímica, com cerca de dois meses de idade. A quantidade de domínio extracelular de HER2 (ECD) derramado no soro foi medida e concluiu-se que era de cerca de 1,2 ng/ml (Huang et al., acima). Este camundongo desenvolveu em seguida um tumor mamário com cinco meses de idade, após ter quatro ninhadas. O tumor foi retirado cirurgicamente sob condições assépticas e picado em pequenos pedaços de 2 mm³, que foram então transplantados para a almofada de gordura mamária de fêmeas de camundongos FVB do tipo selvagem. Os tumores desenvolveram-se em 22 dos 31 camundongos receptores, com latência de cinco semanas. Com a passagem subsequente, os tumores desenvolveram-se com latência mais curta, cresceram mais rapidamente e a incidência do tumor aumentou para > 95% dos receptores. A ex pressão de HER2, conforme determinado através de manchas de imunohistoquímica, foi de 3+ mas heterogêneo no tumor principal, mas tornou-se uniformemente 3+ após a primeira passagem.

O tratamento de camundongos portadores de tumores com Herceptin® ou 4D5, o anticorpo de rato a partir do qual derivou-se Herceptin® humanizado, apresentou efeito apenas modesto sobre o crescimento dos tumores transplantados (Figura 5). A expressão de HER2 foi de 3+ em tumores que cresceram durante terapia de Herceptin® ou 4D5, o que indica que não houve seleção de tumores com HER2 negativo. Além disso, cy3- Herceptin® foi detectado decorando células tumorais após injeção em camundongos portadores de tumores, o que indica que a falta de eficácia não se deveu à falha do anticorpo em acessar o tumor.

Com base na expressão persistente de HER2 e na falha deste modelo de tumor em reagir a Herceptin®, foi testada uma abordagem inovadora, utilizando-se o conjugado Herceptin®-DM1 de maitansinoide conforme descrito no Exemplo 3. A Figura 5 demonstra que o conjugado Herceptin®DM1 possui atividade antitumoral dramática neste modelo. Rituxan®, anticorpo monoclonal anti-CD20 não relacionado, foi utilizado como controle negativo para estes estudos. Houve pouca reação a Herceptin® em comparação com o anticorpo controle, Rituxan®, mas houve notável atividade antitumoral sobre o conjugado de maitansinoide de Herceptin®. Conforme exibido na Figura 5, todos os camundongos tratados com Herceptin® e maitansinoide exibiram notável contração dos seus tumores, embora nenhum dos tumores tenha desaparecido. Após cerca de quatro semanas, os tumores começaram a crescer novamente. Cinco animais foram sacrificados nesse momento. Concluiu-se que seus tumores expressam HER2 em níveis 3+. Assim, não houve seleção de tumores HER2-negativos. Com base nesta observação, os três camundongos restantes foram tratados com Herceptin® e maitansinoide por cinco dias consecutivos. Os tumores regrediram novamente em reação ao tratamento.

Todas as referências mencionadas ao longo do relatório descritivo e as referências nele mencionadas são expressamente incorporadas ao presente como referência.

DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO

As linhagens celulares de hibridoma a seguir foram depositadas na Coleção Norte-Americana de Tipos de Cultivo, 10801 University Boule-

vard, Manassas VA 2011 (	3-2209, Estados Unidos (ATCC):
Designação do anticorpo	ATCC n°	Data de depósito
7C2	ATCC HB-12215	17 de outubro de 1996
7F3	ATCC HB-12216	17 de outubro de 1996
4D5	ATCCC RL 10463	24 de maio de 1990
2C4	ATCC HB-12697	8 de abril de 1999

Este depósito foi feito com base nas disposições do Tratado de

Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para o Propósito de Procedimentos de Patentes e as Regulamentações com base nele (Tratado de Budapeste). Isso assegura a manutenção de culturas viáveis por trinta anos a partir da data de depósito. Os organismos serão disponibilizados através de ATCC com base nos termos do Tratado de Budapeste, sujeito a um acordo entre a Genentech, Inc. e ATCC, que assegura a disponibilidade permanente e irrestrita da progênie das culturas ao público mediante emissão da patente Norte-Americana pertinente ou mediante a manutenção em aberto ao público de qualquer pedido de patente norte-americano ou estrangeiro, o que surgir primeiro, e assegura a disponibilidade da progênie ao determinado pelo Comissário NorteAmericano de Patentes e Marcas Comerciais a ela relevantes, de acordo com 35 USC § 122 e as normas do Comissário a ela relativas (incluindo 37 CFR § 1.12 com referência específica a 886 OG 638).

Com relação a essas designações em que se busque uma patente Européia, uma amostra do micro-organismo depositado será disponibilizada até a publicação da menção da concessão da patente Européia ou até a data em que o pedido tenha sido recusado, descartado ou seja considerado descartado, apenas pela emissão dessa amostra a um especialista nomeado pela pessoa que solicita a amostra (Norma 28(4) EPC).

O cessionário do presente pedido concordou que, caso as culturas em depósito morram, sejam perdidas ou destruídas quando cultivadas sob condições apropriadas, elas serão prontamente substituídas mediante notificação com um espécime viável da mesma cultura. A disponibilidade da linhagem depositada não deve ser considerada licença de prática da presente invenção em contravenção dos direitos concedidos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com suas leis de patentes.

O relatório descritivo acima é considerado suficiente para permitir que um técnico no assunto pratique a presente invenção. A presente invenção não deve ter seu escopo limitado pelas construções depositadas, já que as realizações depositadas destinam-se a ilustrar apenas certos aspectos da presente invenção e qualquer construção que seja funcionalmente equivalente encontra-se dentro do escopo da presente invenção. O depósito de material do presente não constitui reconhecimento de que o relatório descritivo contido no presente é inadequado para permitir a prática de qualquer aspecto da presente invenção, incluindo seu melhor modo, nem deve ser considerado limitador do escopo das reivindicações às ilustrações específicas que elas representam. Na verdade, diversas modificações da presente invenção além das exibidas e descritas no presente tornar-se-ão evidentes para os técnicos no assunto a partir do relatório descritivo acima e encontram-se dentro do escopo das reivindicações anexas.

Compreende-se que a aplicação dos ensinamentos da presente invenção a um problema ou situação específica estará dentro das capacidades de um técnico comum no assunto à luz dos ensinamentos aqui contidos. Exemplos dos produtos da presente invenção e processos representativos para seu isolamento, utilização e fabricação aparecem abaixo, mas não devem ser considerados limitadores da presente invenção.

Claims (25)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Conjugado compreendendo um anticorpo anti-ErbB2 ligado a maitansinoide, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-ErbB2 compreende o anticorpo monoclonal murino 4D5 (ATCC CRL 10463) e de que o dito maitansinoide é selecionado do grupo que consiste em maitansina, maitansinol e um éster de maitansinol.
2. 2. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o maitansinoide é um éster C-3 de maitansinol.
3. 3. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o maitansinoide é DM1 tendo a estrutura

   e de que o dito anticorpo anti-ErbB2 está ligado ao maitansinoide na posição indicada por R na estrutura.
4. 4. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-ErbB2 está ligado ao maitansinoide por um grupo de ligação selecionado do grupo que consiste em um grupo dissulfeto, um grupo tioéter, um grupo lábil a ácido, um grupo fotolábil, um grupo lábil a peptidase, e um grupo lábil a esterase.
5. 5. Conjugado de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito grupo de ligação é selecionado do grupo que consiste em um grupo dissulfeto e um grupo tioéter.
6. 6. Conjugado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o dito grupo de ligação compreende um grupo dissulfeto.
7. 7. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito conjugado compreende 1 a 10 moléculas de maitansi- noide por molécula de anticorpo.
8. 8. Conjugado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende de 3 a 5 moléculas de maitansinoide por molécula de anticorpo.
9. 9. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-ErbB2 está ligado ao maitansinoide por um ligante químico bi-específico.
10. 10. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo-fato-de^que-o-dito^ãnticorpo anti-EfbB2 está ligado ao maitansinoide por um ligante selecionado do grupo consistindo em N-succinimidil-3-(2piridilditio) propionato, succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1carboxilato, N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato, iminotiolano, dimetil adipimidato HCL, dissuccinimidil suberato, glutaraldeído, bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina, bis-(p-diazôniohenzoil)-etilenodiamina, tolueno 2,6diisocianato, e 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno.
11. 11. Conjugado de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito ligante é selecionado do grupo que consiste em Nsuccinimidil-3-(2-piridilditio) propionato, succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 -carboxilato, e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato.
12. 12. Conjugado de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o dito ligante é succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato.
13. 13. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-ErbB2 é humanizado.
14. 14. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-ErbB2 tem um efeito inibidor de crescimento sobre células SK-BR-3.
15. 15. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-ErbB2 é uma forma humanizada de anticorpo monoclonal 4D5 (ATCC CRL 10463).
16. 16. Conjugado de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-ErbB2 é selecionado do grupo que consiste em huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5_T7 e huMAb4D5-8.
17. 17. Conjugado de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-ErbB2 é huMAb4D5-8.

    5
18. 18. Conjugado de acordo com a reivindicação 17, caracterizado

    e o dito anticorpo anti-ErbB2 está ligado ao maitansinoide na posição indicada por R na estrutura.
19. 19. Conjugado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado

    10 pelo fato de que o dito anticorpo anti-ErbB2 está ligado ao maitansinoide por um grupo de ligação selecionado do grupo consistindo em um grupo dissulfeto e um grupo tioéter.
20. 20. Conjugado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-ErbB2 está ligado ao maitansinoide por

    15 um ligante selecionado do grupo consistindo em N-succinimidil-3-(2piridilditio) propionato, succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1carboxilato, e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato.
21. 21. Conjugado de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-ErbB2 está ligado ao maitansinoide por

    20 um ligante succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato.
22. 22. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações

    16 a 21, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende de 3 a 5 moléculas de maitansinoide por molécula de anticorpo.
23. 23. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento de anticorpo de ligação de antígeno.
24. 24. Conjugado de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que fragmento de anticorpo de ligação de antígeno é seleciona-

    5 do do grupo que consiste em um fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fv, diacorpo, anticorpo linear e molécula de anticorpo de cadeia única.
25. 25. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.