RU2636046C2 - Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения - Google Patents

Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения Download PDF

Info

Publication number
RU2636046C2
RU2636046C2 RU2011133819A RU2011133819A RU2636046C2 RU 2636046 C2 RU2636046 C2 RU 2636046C2 RU 2011133819 A RU2011133819 A RU 2011133819A RU 2011133819 A RU2011133819 A RU 2011133819A RU 2636046 C2 RU2636046 C2 RU 2636046C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibody
activated
target
binding
antibodies
Prior art date
Application number
RU2011133819A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2011133819A (ru
Inventor
Нэнси Э. СТАГЛИАНО
Джеймс У. УЭСТ
Катрин КАМАТ
Пол Х. БЕССЕТТ
Фред ГЛАК
Джейсон СЭЙДЖЕРТ
Патрик ДОХЕРТИ
Original Assignee
Сайтомкс Терапьютикс, Инк
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сайтомкс Терапьютикс, Инк filed Critical Сайтомкс Терапьютикс, Инк
Publication of RU2011133819A publication Critical patent/RU2011133819A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2636046C2 publication Critical patent/RU2636046C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2845—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Neurology (AREA)

Abstract

Данная группа объектов изобретения относится к области биотехнологии. Предложено активируемое антитело, содержащее а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (AB), связывающееся с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR); б) маскирующую часть (MM), которая ингибирует специфичное связывание AB в нерасщепленном состоянии с EGFR, но не препятствует его связыванию и не конкурирует с ним за связывание с EGFR в расщепленном состоянии; в) расщепляемую часть (CM), которая действует в качестве субстрата для протеазы; и г) линкеры (L1 и L2). Активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет структуру от N-конца к С-концу (MM)-L1-(CM)-L2-(АВ) и активируется в ткани-мишени, локализованной вместе с мишенью и протеазой для CM. Также описана композиция для лечения опухоли, аутоиммунного заболевания или воспалительного заболевания или для ингибирования ангиогенеза; применение активируемого антитела для получения лекарственного средства; способы получения активируемого антитела и молекула выделенной нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность активируемого антитела. Конструкция активируемого антитела по настоящему изобретению обеспечивает более эффективную доставку к клеткам-мишеням и может найти дальнейшее применение в медицине. 6 н. и 24 з.п. ф-лы, 36 ил., 60 табл., 19 пр.

Description

Перекрестная ссылка
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительных заявок на патенты США № 61/144110, поданной 12 января 2009 года, № 61/144105, поданной 12 января 2009 года, № 61/249441, поданной 7 октября 2009 года, и № 61/249416, поданной 7 октября 2009 года, которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
Уровень техники
Протеинотерапия изменила сущность медицины, найдя применение при лечении различных заболеваний. Терапия антителами, в частности, оказалась эффективной при лечении определенных заболеваний, но в некоторых случаях терапевтическая эффективность антител была ограничена токсичностью вследствие широкой экспрессии мишеней.
Однако, как в случае любых лекарственных средств, существует потребность в лекарственных средствах, обладающих лучшей специфичностью и избирательностью в отношении мишеней, особенно при создании второго поколения лекарственных средств на основе антител, связывающихся с известными мишенями. Более точное направленное воздействие антител в месте локализации заболевания может уменьшить системную токсичность и расширить терапевтическое применение антител.
В области низкомолекулярных лекарственных средств была разработана методика создания пролекарств с активной химической частью. Такие пролекарства вводят в относительно неактивной (или значительно менее активной) форме. После введения пролекарство метаболизируется in vivo в активное соединение. Такая методика создания пролекарств позволяет повысить избирательность лекарственного средства в отношении предполагаемой мишени и уменьшить вредные воздействия. Лекарственные средства, применяемые для направленного воздействия на гипоксические раковые клетки в результате окислительно-восстановительной активации, используют в больших количествах фермент редуктазу, присутствующую в гипоксической клетке, для превращения лекарственного средства в цитотоксическую форму, в результате чего происходит его активация. Так как пролекарство обладает низкой цитотоксичностью до активации, существует значительно меньший риск поражения нераковых клеток, благодаря чему снижается число побочных эффектов, вызываемых данным лекарственным средством. Поэтому существует потребность в терапии антителами, обладающими признаками пролекарства.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям модифицированных и активируемых антител, предназначенным для лечения и диагностики. Композиции активируемого антитела характеризуются более высокой биологической доступностью и биологическим распределением по сравнению с обычной терапией антителами, обладающими признаками пролекарства. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам применения указанных композиций для диагностики и лечения, а также к созданию таких композиций.
Одним объектом настоящего изобретения является модифицированное антитело, содержащее антитело или фрагмент антитела (АВ), способные специфически связываться с мишенью и связанные с маскирующей частью (ММ), где связывание с маскирующей частью снижает способность антитела связываться с мишенью так, что константа диссоциации (Kd) АВ, связанного с ММ, в отношении мишени по меньшей мере в 100 раз больше, по меньшей мере в 1000 раз больше или по меньшей мере в 10000 раз больше константы диссоциации Kd АВ, не связанного с ММ в отношении мишени.
Другим объектом настоящего изобретения является модифицированное антитело, содержащее антитело или фрагмент антитела (АВ), способные специфически связываться с мишенью и связанные с маскирующей частью (ММ), где связывание ММ с АВ снижает способность АВ связываться с мишенью по меньшей мере на 90% по сравнению со способностью связываться с мишенью АВ, не связанного с ММ, при определении с помощью анализа замещения мишени in vitro. Такое связывание ММ с АВ снижает способность АВ связываться с его мишенью в течение по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 24 часов или по меньшей мере 72 часов.
В соответствии с другим объектом изобретения модифицированное антитело дополнительно связано с расщепляемой частью (СМ). Расщепляемая часть может быть расщеплена ферментом, может быть восстановлена восстановителем или может быть подвергнута фотолизу. Расщепляемая часть может быть специфически расщеплена, восстановлена или подвергнута фотолизу со скоростью по меньшей мере около 1×104 М-1·с-1, по меньшей мере 5×104 М-1·с или по меньшей мере 10×104 М-1·с. В одном варианте осуществления изобретения СМ модифицированного антитела находится внутри ММ.
Константа диссоциации (Kd) ММ в отношении АВ в модифицированных антителах по настоящему изобретению обычно по меньшей мере в 100 раз больше Kd АВ в отношении мишени. Kd ММ в отношении АВ обычно меньше 10 нМ, меньше 5 нМ или равна примерно 1 нМ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения ММ модифицированного антитела снижает способность АВ связываться с его мишенью благодаря специфическому связыванию с антигенсвязывающим доменом АВ. Такое связывание может быть нековалентным. ММ модифицированного антитела может снижать способность АВ связываться с его мишенью аллостерически или стерически. В определенных вариантах осуществления изобретения ММ модифицированного антитела обладает не более чем 50% сходством аминокислотной последовательности с природным партнером связывания АВ.
В определенных вариантах осуществления изобретения АВ модифицированного антитела является фрагментом антитела, выбираемым из группы, состоящей из Fab'-фрагмента, F(ab')2-фрагмента, scFv, scAB, dAb, антитела с одним доменом тяжелой цепи и антитела с одним доменом легкой цепи.
В родственных вариантах осуществления изобретения АВ модифицированного антитела выбирают из группы, состоящей из антител, приведенных в таблице 2, или более конкретно источник АВ представляет собой цетуксимаб, панитумумаб, инфликсимаб, адалимумаб, эфализумаб, ипилимумаб, тремелимумаб, адекатумумаб, Hu5c8, алемтузумаб, ранибизумаб, тозитумомаб, ибритумомаб тиуксетан, ритуксимаб, инфликсимаб, бевацизумаб или фигитумумаб. В конкретном варианте осуществления изобретения модифицированное антитело не является алемтузумабом.
В родственных вариантах осуществления изобретения мишень АВ выбирают из группы, состоящей из мишеней, приведенных в таблице 1. В типичных вариантах осуществления изобретения мишень представляет собой EGFR, TNFальфа, CD11a, CSFR, CTLA-4, EpCAM, VEGF, CD40, CD20, Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4, Jagged 1, Jagged 2, CD52, MUC1, IGF1R, трансферрин, gp130, VCAM-1, CD44, DLL4 или IL4. В одном конкретном варианте осуществления изобретения мишень не является CD52.
В конкретном варианте осуществления изобретения модифицированное антитело дополнительно содержит второе АВ, при этом мишень для второго АВ выбирают из группы, состоящей из мишеней, приведенных в таблице 1.
В родственных вариантах осуществления изобретения СМ является субстратом для фермента, выбираемого из группы, состоящей из ферментов, приведенных в таблице 3. В конкретных вариантах осуществления изобретения СМ является субстратом для легумаина, плазмина, TMPRSS-3/4, MMP-9, MT1-MMP, катепсина, каспазы, эластазы нейтрофилов человека, бета-секретазы, uPA или PSA. В тех вариантах осуществления изобретения, в которых модифицированное АВ содержит СМ, АВ выбирают из группы, состоящей из антител, приведенных в таблице 2, и, в частности, из цетуксимаба, панитумумаба, инфликсимаба, адалимумаба, эфализумаба, ипилимумаба, тремелимумаба, адекатумумаба, Hu5c8, алемтузумаба, ранибизумаба, тозитумомаба, ибритумомаба тиуксетана, ритуксимаба, инфликсимаба, бевацизумаба или фигитумумаба. В одном конкретном варианте осуществления изобретения АВ не является алемтузумабом.
В одном варианте осуществления изобретения, в котором модифицированное антитело содержит АВ, связанное СМ и ММ, мишень выбирают из группы, состоящей из мишеней, приведенных в таблице 1, или мишень представляет собой EGFR, TNFальфа, CD11a, CSFR, CTLA-4, EpCAM, VEGF, CD40, CD20, Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4, Jagged 1, Jagged 2, CD52, MUC1, IGF1R, трансферрин, gp130, VCAM-1, CD44, DLL4 или IL4. В одном конкретном варианте осуществления изобретения мишень не является CD52.
Модифицированное антитело может быть дополнительно связано со второй расщепляемой частью (СМ), которая может быть специфически модифицирована ферментом. В данном варианте осуществления изобретения вторая расщепляемая часть является субстратом для легумаина, плазмина, TMPRSS-3/4, MMP-9, MT1-MMP, катепсина, каспазы, эластазы нейтрофилов человека, бета-секретазы, uPA или PSA.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения модифицированное антитело дополнительно содержит линкерный пептид, расположенный между АВ и ММ; модифицированное антитело дополнительно содержит линкерный пептид, расположенный между ММ и СМ; или модифицированное антитело дополнительно содержит линкерный пептид, расположенный между АВ и СМ; или модифицированное антитело дополнительно содержит два линкерных пептида, из которых первый линкерный пептид расположен между АВ и СМ, а второй линкерный пептид расположен между ММ и СМ. Линкер выбирают из группы, состоящей из расщепляемого линкера, нерасщепляемого линкера и линкера с разветвленной цепью.
В определенных вариантах осуществления изобретения модифицированное антитело дополнительно содержит детектируемую часть. В одном конкретном варианте осуществления изобретения детектируемая часть является диагностическим средством.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения модифицированные антитела по настоящему изобретению дополнительно содержат средство, конъюгированное с АВ. В соответствии с одним объектом изобретения средство является терапевтическим средством, например, противоопухолевым средством. В таких вариантах осуществления изобретения средство конъюгировано с углеводной частью АВ, при этом углеводная часть может быть расположена снаружи антигенсвязывающей области АВ. Альтернативно средство может быть конъюгировано с сульфгидрильной группой АВ.
Модифицированные антитела по настоящему изобретению характеризуются периодом полувыведения из сыворотки при введении в организм, равным по меньшей мере 5 дням.
Консенсусная последовательность ММ некоторых модифицированных антител по настоящему изобретению представляет собой CISPRGC, C(N/P)H(HVF)(Y/T)(F/W/T/L)(Y/G/T/S)(T/S/Y/H)CGCISPRGCG, xCxxYQCLxxxxxx, XXQPxPPRVXX, PxPGFPYCxxxx, xxxxQxxPWPP, GxGxCYTILExxCxxxR, GxxxCYxIxExxCxxxx, GxxxCYxIxExWCxxxx, xxxCCxxYxIxxCCxxx или xxxxxYxILExxxxx. В конкретном варианте осуществления изобретения консенсусная последовательность специфически связывается с антителом против VEGF, антителом против EFGR или антителом против CTLA-4.
Родственным объектом настоящего изобретения является активируемое антитело (АА), содержащее антитело или фрагмент антитела (АВ), способные специфически связываться с мишенью; маскирующую часть (ММ), связанную с антителом, которая способна ингибировать специфическое связывание АВ с его мишенью; и расщепляемую часть (СМ), связанную с АВ, которая может быть специфически расщеплена ферментом; причем когда АА находится в отсутствие достаточной ферментативной активности для расщепления СМ, ММ снижает специфическое связывание АВ с его мишенью по меньшей мере на 90% по сравнению с тем, когда АА находится в присутствии достаточной ферментативной активности для расщепления СМ, и ММ не ингибирует специфическое связывание АВ с его мишенью. В конкретных вариантах осуществления изобретения связывание АВ с его мишенью снижается в течение по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 24 часов или по меньшей мере 72 часов.
В одном варианте осуществления изобретения, относящемся к АА, константа диссоциации (Kd) АВ, связанного с ММ и СМ, в отношении мишени по меньшей мере в 100 раз больше Kd АВ, не связанного с ММ и СМ. В родственном варианте осуществления изобретения константа диссоциации (Kd) ММ в отношении АВ обычно по меньшей мере в 100 раз больше Kd АВ в отношении мишени. Kd ММ в отношении антитела обычно меньше 10 нМ, меньше 5 нМ или равна примерно 1 нМ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, относящихся к АА, ММ может специфически связываться с антигенсвязывающим доменом АВ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, относящихся к АА, СМ может быть специфически расщеплена ферментом со скоростью по меньшей мере около 1×104 М-1·с-1, по меньшей мере 5×104 М-1·с или по меньшей мере 10×104 М-1·с.
В определенных вариантах осуществления изобретения, относящихся к АА, АВ является фрагментом антитела, выбираемым из группы, состоящей из Fab'-фрагмента, F(ab')2-фрагмента, scFv, scAB, dAb, антитела с одним доменом тяжелой цепи и антитела с одним доменом легкой цепи.
В определенных вариантах осуществления изобретения АВ АА выбирают из группы, состоящей из антител, приведенных в таблице 2. В конкретных вариантах осуществления изобретения АВ представляет собой цетуксимаб, панитумумаб, инфликсимаб, адалимумаб, эфализумаб, ипилимумаб, тремелимумаб, адекатумумаб, Hu5c8, алемтузумаб, ранибизумаб, тозитумомаб, ибритумомаб тиуксетан, ритуксимаб, инфликсимаб, бевацизумаб или фигитумумаб.
В определенных вариантах осуществления изобретения мишень для АА выбирают из группы, состоящей из мишеней, приведенных в таблице 1. В конкретных вариантах осуществления изобретения мишень представляет собой EGFR, TNFальфа, CD11a, CSFR, CTLA-4, EpCAM, VEGF, CD40, CD20, Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4, Jagged 1, Jagged 2, CD52, MUC1, IGF1R, трансферрин, gp130, VCAM-1, CD44, DLL4 или IL4.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения АВ не является алемтузумабом и мишень не является CD52.
В определенных вариантах осуществления изобретения СМ АА является субстратом для легумаина, плазмина, TMPRSS-3/4, MMP-9, MT1-MMP, катепсина, каспазы, эластазы нейтрофилов человека, бета-секретазы, uPA или PSA. В конкретных вариантах осуществления изобретения АА дополнительно связано со второй расщепляемой частью (СМ), которая может быть специфически модифицирована ферментом. В данном варианте осуществления изобретения вторая СМ является субстратом для легумаина, плазмина, TMPRSS-3/4, MMP-9, MT1-MMP, катепсина, каспазы, эластазы нейтрофилов человека, бета-секретазы, uPA или PSA.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, относящихся к АА, СМ расположена внутри ММ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, относящихся к АА, ММ характеризуется не более чем 50% сходством аминокислотной последовательности с природным партнером связывания АВ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения АА дополнительно содержит линкерный пептид, расположенный между ММ и СМ. В конкретных вариантах осуществления изобретения линкерный пептид расположен между АВ и СМ.
В определенных вариантах осуществления изобретения АА по настоящему изобретению дополнительно содержат детектируемую часть или средство, конъюгированные с АВ.
Другим объектом настоящего изобретения является комплекс активируемого антитела (ААС), содержащий два антитела или фрагмента антитела (АВ1 и АВ2), которые специфически связываются со своими мишенями; по меньшей мере одну маскирующую часть (ММ), связанную с АВ1 или АВ2, которая может ингибировать специфическое связывание АВ1 и АВ2 с их мишенями; и по меньшей мере одну расщепляемую часть (СМ), связанную с АВ1 или АВ2, которая может быть специфически расщеплена ферментом, в результате чего происходит активация композиции ААС; причем, когда ААС находится в нерасщепленном состоянии, ММ ингибирует специфическое связывание АВ1 и АВ2 с их мишенями, а, когда ААС находится в расщепленном состоянии, ММ не ингибирует специфическое связывание АВ1 и АВ2 с их мишенями.
В одном варианте осуществления изобретения ААС является биспецифическим, при этом АВ1 и АВ2 связываются с одним и тем же эпитопом на одной и той же мишени; АВ1 и АВ2 связываются с разными эпитопами на одной мишени; или АВ1 и АВ2 связываются с разными эпитопами на разных мишенях.
В одном варианте осуществления изобретения, относящемся к ААС, СМ может быть специфически расщеплена ферментом со скоростью по меньшей мере около 1×104 М-1·с-1.
В тех вариантах осуществления изобретения, в которых АВ1 или АВ2 ААС является фрагментом антитела, указанный фрагмент антитела выбирают из группы, состоящей из Fab'-фрагмента, F(ab')2-фрагмента, scFv, scAB, dAb, антитела с одним доменом тяжелой цепи и антитела с одним доменом легкой цепи.
В одном варианте осуществления изобретения, относящемся к ААС, АВ1 и/или АВ2 выбирают из группы, состоящей из антител, приведенных в таблице 2. В конкретном варианте осуществления изобретения АВ1 и/или АВ2 представляют собой цетуксимаб, панитумумаб, инфликсимаб, адалимумаб, эфализумаб, ипилимумаб, тремелимумаб, адекатумумаб, Hu5c8, алемтузумаб, ранибизумаб, тозитумомаб, ибритумомаб тиуксетан, ритуксимаб, инфликсимаб, бевацизумаб или фигитумумаб.
В одном варианте осуществления изобретения, относящемся к ААС, мишень для АВ1 и/или АВ2 выбирают из группы, состоящей из мишеней, приведенных в таблице 1. В родственном варианте осуществления изобретения мишень для АВ1 и/или АВ2 представляют собой EGFR, TNFальфа, CD11a, CSFR, CTLA-4, EpCAM, VEGF, CD40, CD20, Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4, Jagged 1, Jagged 2, CD52, MUC1, IGF1R, трансферрин, gp130, VCAM-1, CD44, DLL4 или IL4. В конкретном варианте осуществления изобретения АВ1 и АВ2 могут связываться соответственно с EGFR и VEGF, рецептором Notch и EGFR, лигандом Jagged и EGFR или сМЕТ и VEGF.
В родственном варианте осуществления изобретения, относящемся к ААС, СМ является субстратом для фермента, выбираемого из группы, состоящей из ферментов, приведенных в таблице 3. В конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая часть является субстратом для легумаина, плазмина, TMPRSS-3/4, MMP-9, MT1-MMP, катепсина, каспазы, эластазы нейтрофилов человека, бета-секретазы, uPA или PSA. В другом конкретном варианте осуществления изобретения ААС дополнительно связан со второй расщепляемой частью (СМ), которая может быть специфически расщеплена ферментом, при этом вторая СМ является субстратом для легумаина, плазмина, TMPRSS-3/4, MMP-9, MT1-MMP, катепсина, каспазы, эластазы нейтрофилов человека, бета-секретазы, uPA или PSA.
В конкретных вариантах осуществления изобретения, относящихся к ААС, ММ характеризуется не более чем 50% сходством аминокислотной последовательности с природным партнером связывания АВ.
В других конкретных вариантах осуществления изобретения ААС дополнительно содержит детектируемую часть или дополнительно конъюгирован со средством.
Настоящее изобретение относится также к способу лечения или диагностики состояния у субъекта, который содержит введение указанному субъекту композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела (АВ), способные специфически связываться с его мишенью; маскирующую часть (ММ), связанную с АВ, которая может ингибировать специфическое связывание АВ с его мишенью; и расщепляемую часть (СМ), связанную с АВ, которая может быть специфически расщеплена ферментом; причем при введении субъекту в отсутствие достаточной ферментативной активности для расщепления СМ, ММ снижает специфическое связывание АВ с его мишенью по меньшей мере на 90% по сравнению со случаем, когда АА находится в присутствии достаточной ферментативной активности для расщепления СМ, и ММ не ингибирует специфическое связывание АВ с его мишенью.
При осуществлении данного способа АВ выбирают из группы, состоящей из Fab'-фрагмента, F(ab')2-фрагмента, scFv, scAB, dAb, антитела с одним доменом тяжелой цепи и антитела с одним доменом легкой цепи.
В конкретном варианте осуществления изобретения указанное состояние является раком.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения ММ не является природным партнером связывания АВ.
В разных вариантах осуществления изобретения, относящихся к способу, АВ выбирают из группы, состоящей из антител, приведенных в таблице 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения АВ представляет собой цетуксимаб, панитумумаб, инфликсимаб, адалимумаб, эфализумаб, ипилимумаб, тремелимумаб, адекатумумаб, Hu5c8, алемтузумаб, ранибизумаб, тозитумомаб, ибритумомаб тиуксетан, ритуксимаб, инфликсимаб, бевацизумаб или фигитумумаб.
В разных вариантах осуществления изобретения, относящихся к данному способу, мишень выбирают из группы мишеней, приведенных в таблице 1. В конкретных вариантах осуществления изобретения мишень представляет собой EGFR, TNFальфа, CD11a, CSFR, CTLA-4, EpCAM, VEGF, CD40, CD20, Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4, Jagged 1, Jagged 2, CD52, MUC1, IGF1R, трансферрин, gp130, VCAM-1, CD44, DLL4 или IL4.
В наиболее конкретном варианте осуществления изобретения, относящемся к данному способу, АВ не является алемутузумабом и мишень не является CD52.
В разных вариантах осуществления изобретения, относящихся к данному способу, СМ является субстратом для фермента, выбираемого из группы, состоящей из ферментов, приведенных в таблице 3. В конкретных вариантах осуществления изобретения СМ является субстратом для легумаина, плазмина, TMPRSS-3/4, MMP-9, MT1-MMP, катепсина, каспазы, эластазы нейтрофилов человека, бета-секретазы, uPA или PSA.
Настоящее изобретение относится также к способу ингибирования ангиогенеза у млекопитающего, который содержит введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей модифицированное антитело (АВ), активируемое антитело (АА), комплекс активируемого антитела (ААС) или AACJ, где мишень представляет собой EGFR, TNFальфа, CD11a, CSFR, CTLA-4, EpCAM, VEGF, CD40, CD20, Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4, Jagged 1, Jagged 2, CD52, MUC1, IGF1R, трансферрин, gp130, VCAM-1, CD44, DLL4 или IL4. В конкретном варианте осуществления изобретения АВ представляет собой цетуксимаб, панитумумаб, инфликсимаб, адалимумаб, эфализумаб, ипилимумаб, тремелимумаб, адекатумумаб, Hu5c8, алемтузумаб, ранибизумаб, тозитумомаб, ибритумомаб тиуксетан, ритуксимаб, инфликсимаб, бевацизумаб или фигитумумаб; СМ является субстратом для легумаина, плазмина, TMPRSS-3/4, MMP-9, MT1-MMP, катепсина, каспазы, эластазы нейтрофилов человека, бета-секретазы, uPA или PSA.
Настоящее изобретение относится также к способу получения композиции активируемого антитела (АА), включающему получение антитела или фрагмента антитела (АВ), способного специфически связываться с мишенью; связывание с АВ маскирующей части (ММ), способной ингибировать специфическое связывание АВ с его мишенью; и связывание с АВ расщепляемой части (СМ), которая может быть специфически расщеплена ферментом; при этом константа диссоциации (Kd) АВ, связанного с ММ, в отношении мишени по меньшей мере в 100 раз больше константы диссоциации Kd АВ, не связанного с ММ в отношении мишени.
В одном варианте осуществления изобретения, относящемся к данному способу, АВ является антителом или получено из антитела, выбираемого из группы, состоящей из антител, приведенных в таблице 2. В конкретном варианте осуществления изобретения АВ представляет собой или получено из цетуксимаба, панитумумаба, инфликсимаба, адалимумаба, эфализумаба, ипилимумаба, тремелимумаба, адекатумумаба, Hu5c8, алемтузумаба, ранибизумаба, тозитумомаба, ибритумомаба тиуксетана, ритуксимаба, инфликсимаба, бевацизумаба или фигитумумаба.
В одном очень конкретном варианте осуществления изобретения АВ не является алемтузумабом и мишень не является CD52.
В другом варианте осуществления изобретения, относящемся к данному способу, СМ является субстратом для фермента, выбираемого из группы, состоящей из ферментов, приведенных в таблице 3. В конкретном варианте осуществления изобретения СМ является субстратом для легумаина, плазмина, TMPRSS-3/4, MMP-9, MT1-MMP, катепсина, каспазы, эластазы нейтрофилов человека, бета-секретазы, uPA или PSA.
Настоящее изобретение относится также к способу скрининга пептидов-кандидатов для выявления пептида маскирующей части (ММ), способного связываться с антителом или фрагментом антитела (АВ), который содержит создание библиотеки пептидных остовов, в которой каждый пептидный остов содержит трансмембранный белок (ТМ) и пептид-кандидат; контактирование АВ с библиотекой; идентификацию по меньшей мере одного пептида-кандидата, способного связываться с АВ; и определение того, находится ли константа диссоциации (Kd) пептида-кандидата в отношении АВ, в пределах 1-10 нМ.
В разных вариантах осуществления изобретения, относящихся к данному способу, библиотека содержит вирусы, клетки или споры. В одном варианте осуществления изобретения библиотека содержит E. coli. В другом варианте осуществления изобретения пептидный остов дополнительно содержит детектируемую часть.
Настоящее изобретение относится также к другому способу скрининга для идентификации пептида маскирующей части (ММ), способного маскировать антитело или фрагмент антитела (АВ) с оптимальной маскирующей эффективностью, который содержит создание библиотеки, содержащей множество АВ, каждое из которых связано с пептидом-кандидатом, при этом АВ могут специфически связываться с мишенью; инкубацию каждого члена библиотеки с мишенью; и сравнение сродства связывания каждого члена библиотеки в отношении мишени со сродством связывания с мишенью каждого АВ, не связанного с пептидом-кандидатом. В конкретном варианте осуществления изобретения оптимальная эффективность связывания имеет место тогда, когда сродство связывания с мишенью члена библиотеки составляет 10% по сравнению со сродством связывания с мишенью немодифицированного АВ.
Одним объектом настоящего изобретения является терапевтическое средство на основе антитела, обладающее лучшей биологической доступностью, при этом сродство связывания терапевтического средства на основе антитела с мишенью в первой ткани меньше сродства связывания терапевтического средства на основе антитела с мишенью во второй ткани. Родственным объектом изобретения является также фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент антитела (АВ), способные специфически связываться с мишенью, и фармацевтически приемлемый наполнитель, при этом сродство антитела или фрагмента антитела к мишени в первой ткани меньше сродства антитела или фрагмента антитела к мишени во второй ткани. В конкретном варианте осуществления изобретения сродство в первой ткани в 10-1000 раз меньше сродства во второй ткани. В одном варианте осуществления изобретения антитело связано с маскирующей частью (ММ), способной снижать связывание АВ с мишенью, и расщепляемой частью (СМ), специфически расщепляемой ферментом.
В родственных вариантах осуществления изобретения мишень представляет собой EGFR, TNFальфа, CD11a, CSFR, CTLA-4, EpCAM, VEGF, CD40, CD20, Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4, Jagged 1, Jagged 2, CD52, MUC1, IGF1R, трансферрин, gp130, VCAM-1, CD44, DLL4 или IL4. В родственных вариантах осуществления изобретения СМ является субстратом для легумаина, плазмина, TMPRSS-3/4, MMP-9, MT1-MMP, катепсина, каспазы, эластазы нейтрофилов человека, бета-секретазы, uPA или PSA. В родственных вариантах осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела представляет собой цетуксимаб, панитумумаб, инфликсимаб, адалимумаб, эфализумаб, ипилимумаб, тремелимумаб, адекатумумаб, Hu5c8, алемтузумаб, ранибизумаб, тозитумомаб, ибритумомаб тиуксетан, ритуксимаб, инфликсимаб, бевацизумаб или фигитумумаб.
В конкретном варианте осуществления изобретения первая ткань является здоровой тканью, а вторая ткань является больной тканью; первая ткань является опухолью на ранней стадии, а вторая ткань является опухолью на поздней стадии; первая ткань является доброкачественной опухолью, а вторая ткань является злокачественной опухолью; первая ткань и вторая ткань пространственно отделены друг от друга; первая ткань является эпителиальной тканью, а вторая ткань является тканью молочной железы, головы, шеи, легкого, поджелудочной железы, нервной системы, печени, предстательной железы, мочеполовой системы или шейки матки.
В одном варианте осуществления изобретения терапевтическое средство на основе антитела дополнительно связано со средством. В конкретном варианте осуществления изобретения средство является противоопухолевым средством.
Настоящее изобретение относится также к специфическим композициям, предназначенным для диагностического и терапевтического применения. Объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая активируемое легумаином антитело или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое плазмином антитело или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое каспазой антитело или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая TMPRSS-3/4-активируемое антитело или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая PSA-активируемое антитело или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая антивируемое катепсином антитело или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое эластазой нейтрофилов человека антитело или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое бета-секретазой антитело или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая uPA-активируемое антитело или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая TMPRSS-3/4-активируемое антитело или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая МТ1-ММР-активируемое антитело или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело к EGFR или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело к TNFальфа или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело к CD11a или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело к CSFR или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело к CTLA-4 или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело к EpCAM или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело к CD40L или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело к Notch1 или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело к Notch3 или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело к Jagged1 или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело к Jagged2 или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело цетуксимам или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело вектибикс или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело инфликсимаб или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело адалимумаб или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело эфализумаб или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело ипилимумаб или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); композиция, содержащая активируемое антитело тремелимумаб или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ); или композиция, содержащая активируемое антитело адекатумумаб или фрагмент антитела (АВ), связанные с маскирующей частью (ММ).
Публикации, включенные в настоящее описание изобретения в качестве ссылки
Все публикации, патенты и заявки на патенты, указанные в настоящем изобретении, включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки так, как если бы ссылка была специально сделана на каждую отдельную публикацию, патент или заявку на патент.
Краткое описание чертежей
Новые признаки изобретения представлены в прилагаемой формуле изобретения. Особенности и преимущества настоящего изобретения будут более очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения, в котором приведены иллюстративные варианты осуществления изобретения с использованием принципов изобретения, и из прилагаемых чертежей, где:
На фиг.1 показано активированное протеазой активируемое антитело, содержащее антитело (АВ), маскирующую часть (ММ) и расщепляемую часть (СМ).
На фиг.2 показана активность типичного активируемого антитела in vivo. В блоке А показана здоровая ткань, с которой активируемое антитело не может связываться, при этом побочные эффекты являются минимальными; в блоке В показана больная ткань, в которой активируемое антитело активировано специфичной для болезни протеазой/восстановителем, позволяющей активируемому антителу связываться с мишенью и оказывать эффективное воздействие.
На фиг.3 показан процесс получения активированного протеазой активируемого антитела, который содержит скрининг маскирующих частей, скрининг расщепляемых частей, сборку маскирующей части, расщепляемой части и антитела, экспрессию и очистку собранной конструкции и анализ собранной конструкции в отношении активности и токсичности in vitro и in vivo.
На фиг.4 показана типичная аминокислотная последовательность ММР-9-расщепляемого маскированного антитела scFv против VEGF.
На фиг.5 представлены данные анализа ELISA, показывающие активацию ферментом ММР-9 активируемых антител МВР:scFv против VEGF с маскирующими частями 306 и 314. Образцы обрабатывали TEV для удаления МВР-гибридизированного партнера и затем активировали путем расщепления ферментом ММР-9.
На фиг.6 представлены данные анализа ELISA, показывающие ММР-9-зависимое связывание с VEGF конструкции антитела scFv против VEGF с меткой His и маскирующей частью 306.
На фиг.7 представлены данные анализа ELISA, показывающие ММР-9-зависимое связывание с VEGF активируемых антител scFv-Fc против VEGF с маскирующими частями 306 и 314, полученных из супернатантов клеток НЕК.
На фиг.8 представлены данные анализа ELISA, показывающие ММР-9-зависимое связывание с VEGF конструкций активируемых антител scFv-Fc против VEGF с маскирующими частями 306 и 314, которые были очищены на колонке с белком А.
На фиг.9 показано, что маскирующая часть 306, которая связывается с антителом против VEGF со сродством >600 нМ, эффективно не предотвращает связывание с VEGF.
На фиг.10 показаны легкая и тяжелая цепи антитела против CTLA4, соединенные при помощи SOE-ПЦР с целью создания конструкций scFv в обеих ориентациях, VHVL и VLVH.
На фиг.11 показано использование ПЦР с целью добавления сайтов для клонирования маскирующей части, последовательности расщепляемой части, линкера GGS2 у N-конца конструкций VHVL и VLVH антитела scFv против CTLA4.
На фиг.12 показана активация активируемого антитела под воздействием ММР-9.
На фиг.13 показано, что при расщеплении расщепляемой части с удалением маскирующей части связывание антитела восстанавливается.
На фиг.14 показана активация активируемого антитела протеазой, в результате чего антитело связывается так же, как немодифицированные антитела.
На фиг.15 показано ингибирование активируемого антитела, содержащего антитело со специфическим сродством связывания к VEGF; активированное активируемое антитело связывается с VEGF со сродством на пикомолярном уровне.
На фиг.16 показано, что активируемое антитело, содержащее антитело со специфическим сродством связывания к VEGF, ингибирует пролиферацию HUVEC.
На фиг.17 показано, что культивируемые опухолевые клетки характеризуются устойчивой активацией in situ активируемого антитела, содержащего антитело со специфическим сродством связывания к VEGF.
На фиг.18 показано, что активируемое антитело является неактивным в плазме здоровых субъектов и больных раком.
На фиг.19 показано связывание scFv против CTLA4 с CTLA4 мыши и человека.
На фиг.20 показан активированный протеазой конъюгат активируемого антитела, содержащий антитело (содержащий АВ), маскирующую часть (ММ), расщепляемую часть (СМ) и конъюгированное средство. В результате расщепления расщепляемой части и удаления маски высвобождается конъюгированное антитело.
На фиг.21 показано, что связывание клонов еСРХ3.0 JS306, JS1825, JS1827 и JS1829 анализировали в клеточном сортере с возбуждением флуоресценции (FACS) в 3 разных концентрациях антитела против VEGF, меченного флуоресцентным красителем DyLight. Все три пептида с созревшей аффинностью характеризовались сродством, которое было по меньшей мере в 10 раз больше, чем у JS306.
На фиг.22 показан процесс созревания аффинности некоторых маскирующих частей антитела против EGFR.
На фиг.23 показаны кривые связывания для измерения в клетках сродства связывания Fab C225 с маскирующими частями 3690, 3954 и 3957. Маскирующие части 3954 и 3957 характеризовались сродством, которое было по меньшей мере в 100 раз больше, чем у 3690.
На фиг.24 показан анализ замещения мишенью и степень равновесного связывания в виде процентного значения связывания исходного антитела.
На фиг.25 показано, что в отличие от контрольного фермента uPA и субстрата SM16, КК1203, 1204 и 1214 характеризуются устойчивостью к расщеплению KLK5, KLK7 и плазмином.
На фиг.26 показано, что в отличие от неоптимизированного субстрата, оптимизированные субстраты Plas 1237, Plas 129 и Plas 1254 характеризуются устойчивостью к расщеплению KLK5, KLK7.
На фиг.27 в блоке А показана активация активируемых антител ScFv, содержащих субстраты для легумаина AANL и PTNL, после обработки 5 мг/мл легумаина. В блоке В показана активация активируемого антитела IgG против VEGF, содержащего субстрат для легумаина PNTL.
На фиг.28 показано отношение активированного легумаином активируемого антитела к общему содержанию активируемого антитела в каждый период времени. Несмотря на то, что активированное плазмином активируемое антитело было почти полностью активировано через 7 дней, активация активируемых легумаином активируемых антител были минимальной. Активируемые легумаином активируемые антитела, выделенные из сыворотки через 7 дней после инъекции, оставались маскированными. (n=4).
На фиг.29 показано, что маскированные одноцепочечные гибридизированные проантитела Fv-Fc характеризуются более продолжительным периодом полувыведения из сыворотки.
На фиг.30 показана концентрация scFv-Fc в сыворотке у здоровых мышей через 10 дней. Концентрация активируемого антитела оставалась постоянной через 7 дней после введения дозы, в то время как концентрация исходного антитела scFv-Fc уменьшилась через 3 дня и почти не обнаруживалась через 10 дней.
На фиг.31 показано, что концентрации активируемых антител scFv-Fc у мышей, имеющих опухоли, были высокими и сохранялась в сыворотке в течение более длительного времени по сравнению с исходным антителом scFv-Fc. Более высокая концентрация начальной дозы активируемого антитела в процентном выражении была обнаружена в сыворотке через 3 дня (В) и через 3 и 7 дней (А).
На фиг.32 показано, что активируемые антитела scFv-Fc сохраняется в более высоких концентрациях у мышей, имеющих опухоли, при выполнении исследования с многократным введением дозы. Активируемые антитела сохранялись в значительно более высоких концентрациях в сыворотке по сравнению с исходным антителом на протяжении всего исследования.
На фиг.33 показано, что активируемые антитела сохраняются на более высоких уровнях в сыворотке здоровых мышей по сравнению с исходным антителом, не модифицированным маскирующей частью.
На фиг.34 показаны активированные протеазой комплексы активируемых антител (ААС), содержащие одно или несколько антител или их фрагментов (на данной фигуре антитела определяются как ABD), маскирующую часть (ММ) и расщепляемую часть (СМ), где ABD1 и ABD2 являются произвольными обозначениями первого и второго антитела. В таких вариантах осуществления изобретения ММ1 и ММ2 связываются с доменами, содержащими соответственно ABD1 и ABD2, и действуют в качестве маскирующих частей, препятствующих связыванию мишени с нерасщепленным комплексом активируемых антител, связывающихся с двумя мишенями. Антитела могут связываться с одинаковыми или разными мишенями или с разными сайтами связывания одной мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения (фиг.1А, 1D, 1F) связывание ММ1 с доменом, содержащим ABD2 противоположной молекулы, вызывает образование комплекса, способного действовать в качестве маскирующей части ABD1 и ABD2.
На фиг.35 показан комплекс активируемого антитела с перекрестной маскировкой, благодаря которой ослабляется связывание с мишенью нерасщепленных антител, при этом связывание с мишенью повышается в присутствии средства, расщепляющего расщепляемую часть, в результате чего комплекс распадается. На данной фигуре АВ1 и АВ2 определяются соответственно как ABD1 и ABD2.
На фиг.36 показан комплекс активируемого антитела, образованный при помощи ковалентной связи ММ1 с ABD1 (AB1), при этом связывание ABD2 (AB2) с мишенью ослабляется в нерасщепленном состоянии и связывание ABD2 (AB2) с мишенью усиливается в присутствии средства, расщепляющего расщепляемую часть, в результате чего комплекс распадается. На данной фигуре АВ1 и АВ2 определяются соответственно как ABD1 и ABD2.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям модифицированных антител, предназначенным для использования в терапии и диагностике. Композиции по настоящему изобретению обеспечивают большее биологическое распределение и лучшую биологическую доступность.
Модифицированные и активируемые антитела
Композиции модифицированных антител по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела (вместе определяемые в настоящем описании изобретения как АВ), способные специфически связываться с мишенью, при этом антитело модифицировано маскирующей частью (ММ).
Специфическое связывание с мишенью антитела, модифицированного маскирующей часть и находящегося в присутствии мишени, снижено или ингибировано по сравнению со специфическим связыванием с мишенью антитела, не модифицированного маскирующей частью, или исходного антитела.
Kd антитела, модифицированного маскирующей частью, в отношении мишени может быть по меньшей мере в 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000 раз или больше либо в 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10000, 10-100000, 10-1000000, 10-10000000, 100-1000, 100-10000, 100-100000, 100-1000000, 100-10000000, 1000-10000, 1000-100000, 1000-1000000, 1000-10000000, 10000-100000, 10000-1000000, 10000-10000000, 100000-1000000 или 100000-10000000 раз больше Kd антитела, не модифицированного маскирующей частью, или исходного антитела. И наоборот, сродство связывания антитела, модифицированного маскирующей частью, в отношении мишени может быть по меньшей мере в 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000 раз или больше либо в 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10000, 10-100000, 10-1000000, 10-10000000, 100-1000, 100-10000, 100-100000, 100-1000000, 100-10000000, 1000-10000, 1000-100000, 1000-1000000, 1000-10000000, 10000-100000, 10000-1000000, 10000-10000000, 100000-1000000 или 100000-10000000 раз меньше сродства связывания антитела, не модифицированного маскирующей частью, или исходного антитела.
Константа диссоциации (Kd) маскирующей части в отношении антитела обычно больше Kd антитела в отношении мишени. Kd маскирующей части в отношении антитела может быть по меньшей мере в 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 100000, 1000000 или даже в 10000000 раз больше Kd антитела в отношении мишени. И наоборот, сродство связывания маскирующей части в отношении антитела обычно меньше сродства связывания антитела в отношении мишени. Сродство связывания маскирующей части в отношении мишени может быть по меньшей мере в 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 100000, 1000000 или даже в 10000000 раз меньше сродства связывания антитела в отношении мишени.
Специфическое связывание с мишенью антитела, модифицированного маскирующей частью и находящегося в присутствии мишени, снижено или ингибировано по сравнению со специфическим связыванием с мишенью антитела, не модифицированного маскирующей частью, или исходного антитела. По сравнению со связыванием с мишенью антитела, не модифицированного маскирующей частью, или исходного антитела способность связываться с мишенью антитела, модифицированного маскирующей частью, может быть уменьшена по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже на 100% в течение по меньшей мере 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 96 часов, в течение 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 дней, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев или больше при измерении in vivo или при помощи иммуноадсорбционного анализа замещения мишенью in vitro, описанного в настоящем описании изобретения.
Маскирующая часть может ингибировать связывание антитела с мишенью. Маскирующая часть может связываться с антигенсвязывающим доменом антитела и ингибировать связывание антитела с мишенью. Маскирующая часть может стерически ингибировать связывание антитела с мишенью. Маскирующая часть может аллостерически ингибировать связывание антитела с мишенью. В указанных вариантах осуществления изобретения, когда антитело модифицировано или связано с маскирующей частью и находится в присутствии мишени, не происходит связывания или по существу не происходит связывания антитела с мишенью или происходит не более 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% или 50% связывания антитела с мишенью по сравнению со связыванием антитела, не модифицированного маскирующей частью, исходного антитела или антитела, не связанного с маскирующей частью, в течение по меньшей мере 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 96 часов, в течение 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 дней, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев или больше при измерении in vivo или при помощи иммуноадсорбционного анализа замещения мишенью in vitro, описанного в настоящем описании изобретения.
В антителе, связанном или модифицированном маскирующей частью, маскирующая часть может ”маскировать”, уменьшать или ингибировать специфическое связывание антитела с мишенью. В антителе, связанном или модифицированном маскирующей частью, такая связь или модификация может вызывать структурное изменение, которое снижает или ингибирует способность антитела специфически связываться с мишенью.
Антитело, связанное или модифицированное маскирующей частью, можно представить следующими формулами (в направлении от аминоконца (N) к карбоксильному (С) концу:
(ММ)-(АВ)
(АВ)-(ММ)
(ММ)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
где ММ означает маскирующую часть, АВ означает антитело или фрагмент антитела и L означает линкер. Во многих вариантах осуществления изобретения может быть желательно ввести в композиции один или несколько линкеров, например, гибких линкеров, для обеспечения гибкости структуры.
В определенных вариантах осуществления изобретения маскирующая часть не является природным партнером связывания антитела. Маскирующая часть может быть модифицированным партнером связывания антитела, содержащим замены аминокислот, которые по меньшей мере немного уменьшают сродство и/или авидность связывания с антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения маскирующая часть не обладает или по существу не обладает гомологией с природным партнером связывания антитела. В других вариантах осуществления изобретения маскирующая часть не более, чем на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или 80% подобна природному партнеру связывания антитела.
Настоящее изобретение относится также к активируемым антителам (АА), в которых антитело, модифицированное маскирующей частью, может дополнительно включать одну или несколько расщепляемых частей (СМ). Такие активируемые антитела характеризуются активируемым/переключаемым связыванием с мишенью антитела. Активируемые антитела обычно включают антитело или фрагмент антитела (АВ), модифицированные или связанные с маскирующей частью (ММ), и модифицируемую или расщепляемую часть (СМ). В некоторых вариантах осуществления изобретения расщепляемая часть содержит аминокислотную последовательность, служащую в качестве субстрата для представляющей интерес протеазы. В других вариантах осуществления изобретения расщепляемая часть образует дисульфидную связь между остатками цистеина, которая расщепляется в результате восстановления. В других вариантах осуществления изобретения расщепляемая часть образует фотолитический субстрат, активируемый фотолизом.
Схематическое изображение иллюстративного активируемого антитела показано на фиг.1. Как видно на фиг.1, элементы активируемого антитела расположены таким образом, что в расщепленном состоянии (или относительно активном состоянии) и в присутствии мишени антитело связывается с мишенью, в то время как в нерасщепленном состоянии (или относительно неактивном состоянии) в присутствии мишени специфическое связывание антитела с мишенью снижается или подавляется. Специфическое связывание антитела с мишенью можно уменьшить в результате ингибирования или маскировки способности антитела специфически связываться с мишенью при помощи маскирующей части.
Kd антитела, модифицированного маскирующей частью и расщепляемой частью, в отношении мишени может быть по меньшей мере в 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000 раз или больше либо в 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10000, 10-100000, 10-1000000, 10-10000000, 100-1000, 100-10000, 100-100000, 100-1000000, 100-10000000, 1000-10000, 1000-100000, 1000-1000000, 1000-10000000, 10000-100000, 10000-1000000, 10000-10000000, 100000-1000000 или 100000-10000000 раз больше Kd антитела, не модифицированного маскирующей частью и расщепляемой частью, или исходного антитела. И наоборот, сродство связывания антитела, модифицированного маскирующей частью и расщепляемой частью, в отношении мишени может быть по меньшей мере в 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000 раз или больше либо в 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10000, 10-100000, 10-1000000, 10-10000000, 100-1000, 100-10000, 100-100000, 100-1000000, 100-10000000, 1000-10000, 1000-100000, 1000-1000000, 1000-10000000, 10000-100000, 10000-1000000, 10000-10000000, 100000-1000000 или 100000-10000000 раз меньше сродства связывания антитела, не модифицированного маскирующей частью и расщепляемой частью, или исходного антитела.
Специфическое связывание с мишенью антитела, модифицированного маскирующей частью и расщепляемой частью и находящегося в присутствии мишени, но при отсутствии модифицирующего средства (например, фермента, протеазы, восстановителя, света), может быть снижено или ингибировано по сравнению со специфическим связыванием антитела, не модифицированного маскирующей частью и расщепляемой частью, или исходного антитела. По сравнению со связыванием с мишенью исходного антитела или антитела, не модифицированного маскирующей частью и расщепляемой частью, способность связываться с мишенью антитела, модифицированного маскирующей частью и расщепляемой частью, может быть уменьшена по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и даже 100% в течение по меньшей мере 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 96 часов, в течение 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 дней, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев или больше при измерении in vivo или при помощи иммуноадсорбционного анализа замещения мишенью in vitro, описанного в настоящем описании изобретения.
Термин "расщепленное состояние" означает состояние активируемого антитела после расщепления расщепляемой части протеазой, восстановления дисульфидной связи между остатками цистеина расщепляемой части и/или фотоактивации. Термин ”нерасщепленное состояние” в используемом здесь значении означает состояние активируемого антитела при отсутствии расщепления расщепляемой части протеазой, при отсутствии восстановления дисульфидной связи между остатками цистеина расщепляемой части и/или при отсутствии света. Как было указано выше, термин "активируемое антитело (АА)" в используемом здесь значении означает активируемое антитело как в нерасщепленном (нативном) состоянии, так и в расщепленном состоянии. Специалисту должно быть понятно, что в некоторых вариантах осуществления изобретения в расщепленном активируемом антителе может отсутствовать маскирующая часть вследствие расщепления расщепляемой части протеазой и высвобождения маскирующей части (например, в тех случаях, когда маскирующая часть не связана с активируемым антителом ковалентной связью (например, дисульфидной связью между остатками цистеина).
Термин "активируемый" или "переключаемый" означает, что активируемое антитело характеризуется первым уровнем связывания с мишенью в ингибированном, маскированном или нерасщепленном состоянии (то есть первая конформация) и вторым уровнем связывания с мишенью в неингибированном, немаскированном и/или расщепленном состоянии (то есть вторая конформация), при этом второй уровень связывания с мишенью выше первого уровня связывания. Как правило, доступ активируемого антитела к мишени является более высоким в присутствии расщепляющего средства, способного расщеплять расщепляемую часть, чем при отсутствии такого расщепляющего средства. Таким образом, в активируемом антителе, находящемся в нерасщепленном состоянии, ингибировано связывание с мишенью или антитело может быть замаскировано от связывания с мишенью (то есть первая конформация такова, что антитело не может связываться с мишенью) и в расщепленном состоянии антитело не ингибировано или не замаскировано от связывания с мишенью.
Расщепляемая часть и антитело активируемого антитела могут быть выбраны таким образом, что антитело будет связывающей частью для представляющей интерес мишени и расщепляемая часть будет субстратом для протеазы, локализованной вместе с мишенью в месте лечения субъекта. Альтернативно или дополнительно расщепляемая часть является дисульфидной связью между остатками цистеина, которая расщепляется в результате восстановления указанной дисульфидной связи. Активируемые антитела содержат по меньшей мере одну расщепляемую протеазой расщепляемую часть или дисульфидную связь между остатками цистеина, и в некоторых вариантах осуществления изобретения антитела включают оба типа расщепляемых частей. Активируемые антитела могут альтернативно или дополнительно включать фотолабильный субстрат, активируемый источником света. Активируемые антитела по настоящему изобретению находят применение в тех случаях, когда протеаза, способная расщеплять сайт расщепляемой части, присутствует на относительно более высоких уровнях в содержащей мишень ткани, подвергаемой лечению, (например, больная ткань; например, лечение или диагностика), чем в ткани, не подвергаемой лечению (например, в здоровой ткани), как показано на фиг.2. Активируемые антитела по настоящему изобретению также находят применение в тех случаях, когда восстановитель, способный восстанавливать сайт в расщепляемой части, присутствует на относительно более высоких уровнях в содержащей мишень ткани, подвергаемой лечению или диагностике, чем в ткани, не подвергаемой лечению или диагностике. Активируемые антитела по настоящему изобретению также особенно пригодны для лечения или диагностики, когда источник света, например, лазер, вызывающий фотолиз сайта в расщепляемой части, вводят в содержащую мишень ткань.
В некоторых вариантах осуществления изобретения активируемые антитела вызывают меньшую токсичность и/или вредные побочные эффекты, которые в противном случае могут возникать в результате связывания антитела на не подвергаемых лечению участках, если антитело не было маскировано или каким-либо другим образом ингибировано от связывания с мишенью. Когда активируемое антитело содержит расщепляемую часть, расщепляемую восстановителем, что облегчает восстановление дисульфидной связи, антитело может быть выбрано с учетом активации, когда представляющая интерес мишень, присутствующая в месте лечения, характеризуется повышенными уровнями восстановителя, при этом такая среда обладает более высоким потенциалом восстановления, чем, например, среда в месте, не подвергаемом лечению.
Как правило, активируемое антитело можно создать путем выбора представляющего интерес антитела с сохранением остальной конформации активируемого антитела, благодаря чему маскирующая часть может маскировать антитело или уменьшать связывание антитела с мишенью. Принимаемые во внимание критерии создания структуры обеспечивают создание указанного функционального признака.
В определенных вариантах осуществления изобретения описаны активируемые антитела, связывающиеся с двумя мишенями. Такие активируемые антитела, воздействующие на две мишени, содержат два антитела, которые могут связываться с одинаковыми или разными мишенями. В конкретных вариантах осуществления изобретения активируемые антитела, направленно воздействующие на две мишени, содержат биспецифические антитела или фрагменты антител. В одном иллюстративном варианте осуществления изобретения активируемое антитело содержит антитела против IL17 и IL23. В других конкретных вариантах осуществления изобретения активируемое антитело содержит антитела против IL12 и IL23, EGFR и VEGF, IGF1R и EGFR, cMET и IGF1R, EGFR и VEGF, рецептора Notch и EGFR, лиганда Jagged и EGFR или сМЕТ и VEGF.
Активируемые антитела, связывающиеся с двумя мишенями, могут быть сконструированы с использованием расщепляемой части, расщепляемой расщепляющим средством, находящимся в ткани-мишени вместе с одной или обеими мишенями, способными связываться антителами активируемого антитела. Активируемые антитела, связывающиеся с двумя мишенями и имеющие несколько антител к одинаковым или разным мишеням, могут быть сконструированы при использовании нескольких расщепляемых частей, при этом первая расщепляемая часть расщепляется расщепляющим средством в первой ткани-мишени и вторая расщепляемая часть расщепляется расщепляющим средством во второй ткани-мишени, при наличии одной или нескольких мишеней, способных связываться с антителами активируемого антитела. Первая и вторая ткани-мишени могут быть пространственно отделены, например, могут находиться в разных местах организма. Первая и вторая ткани-мишени могут представлять собой одну, временно разделенную ткань, например, ткань, полученную в два разных периода времени, например, в первый период времени, когда ткань является нормальной опухолью, и во второй период времени, когда ткань является омертвевшей опухолью.
Настоящее изобретение относится к активируемым антителам, характеризующимся переключаемым фенотипом требуемого динамического диапазона для связывания мишени в ингибированной и неингибированной конформации. Динамический диапазон обычно определяется отношением (а) максимального обнаруживаемого значения параметра в первой совокупности условий к (b) минимальному обнаруживаемому значению указанного параметра во второй совокупности условий. Например, в случае активируемого антитела динамический диапазон определяется отношением (а) максимального обнаруживаемого значения белка-мишени, связывающегося с активируемым антителом в присутствии протеазы, способной расщеплять расщепляемую часть активируемого антитела, к (b) минимальному обнаруживаемому значению белка-мишени, связывающегося с активируемым антителом в отсутствие протеазы. Динамический диапазон активируемого антитела можно вычислить в виде отношения равновесной константы диссоциации в присутствии средства, расщепляющего активируемое антитело, (например, фермента) к равновесной константе диссоциации при отсутствии средства, расщепляющего активируемое антитело. Чем больше динамический диапазон активируемого антитела, тем лучше переключаемый фенотип активируемого антитела. Активируемые антитела, обладающие относительно более высокими значениями динамического диапазона, (например, больше 1) характеризуются более желательными переключаемыми фенотипами, обеспечивающими большее (например, преобладающее) связывание белка-мишени активируемым антителом в присутствии расщепляющего средства (например, фермента), способного расщеплять расщепляемую часть активируемого антитела, чем при отсутствии расщепляющего средства.
Активируемые антитела могут быть получены в разных структурных конфигурациях. Ниже приведены иллюстративные формулы активируемых антител. Предполагается, что порядок следования антитела, маскирующей части и расщепляемой части в направлении от N-конца к С-концу может быть изменен на обратный в активируемом антителе. Кроме того, предполагается, что расщепляемая часть и маскирующая часть могут перекрывать друг друга в аминокислотной последовательности, например, расщепляемая часть может находиться внутри маскирующей части.
Например, активируемые антитела могут быть представлены следующей формулой (в направлении от аминоконца (N) к карбоксильному (С) концу):
(ММ)-(СМ)-(АВ)
(АВ)-(СМ)-(ММ)
где ММ означает маскирующую часть, СМ означает расщепляемую часть и АВ означает антитело или его фрагмент. Следует отметить, что, хотя маскирующая часть и расщепляемая часть указаны в приведенной выше формуле в виде отдельных компонентом, предполагается, что во всех иллюстративных вариантах осуществления изобретения (включая формулы) аминокислотные последовательности маскирующей части и расщепляемой части могут перекрывать друг друга, например, расщепляемая часть может полностью или частично находиться внутри маскирующей части. Кроме того, вышеуказанные формулы могут включать дополнительные аминокислотные последовательности, которые могут быть расположены со стороны N-конца или С-конца элементов активируемого антитела.
Во многих вариантах осуществления изобретения может быть желательно ввести в конструкцию активируемого антитела один или несколько линкеров, например, гибких линкеров, для достижения гибкости в одном или нескольких соединениях ММ-СМ, СМ-АВ или тех и других вместе. Например, антитело, маскирующая часть и/или расщепляемая часть не могут содержать достаточное число остатков (например, Gly, Ser, Asp, Asn, в частности, Gly и Ser, особенно Gly) для достижения требуемой гибкости. Поэтому переключаемый фенотип таких конструкций активируемого антитела может быть улучшен путем введения одной или нескольких аминокислот, образующих гибкий линкер. Кроме того, как будет описано ниже, в тех случаях, когда активируемое антитело имеет конформационно ограниченную конструкцию, гибкий линкер может быть функционально введен для облегчения образования и сохранения циклической структуры нерасщепленного активируемого антитела.
Например, в определенных вариантах осуществления изобретения активируемое антитело имеет одну из нижеследующих формул (в которых аминокислотная последовательность представлена в направлении от N-конца к С-концу или от С-конца к N-концу):
(ММ)-L1-(CM)-(AB)
(ММ)-(СМ)-L1-(АВ)
(ММ)-L1-(СМ)-L2-(АВ)
цикло[L1-(MM)-L2-(CM)-L3-(AB)]
где ММ, СМ и АВ имеют указанные выше значения; L1, L2 и L3, которые могут независимо и необязательно присутствовать или отсутствовать, означают одинаковые или разные гибкие линкеры, содержащие по меньшей мере 1 гибкую аминокислоту (например, Gly); и префикс “цикло” при его наличии означает, что активируемое антитело имеет циклическую структуру благодаря наличию дисульфидной связи между двумя остатками цистеина в активируемом антителе. Кроме того, в вышеуказанных формулах могут присутствовать дополнительные аминокислотные последовательности, которые могут быть расположены со стороны N-конца или С-конца элементов активируемого антитела. Следует отметить, что в формуле цикло[L1-(MM)-L2-(CM)-L3-(AB)] остатки цистеина, образующие дисульфидную связь, могут быть расположены в активируемом антителе в виде одного или двух концов, в результате чего структура активируемого антитела с дисульфидной связью (и, таким образом, в конформационно ограниченном состоянии) может напоминать лассо или омегу. Аминокислотная последовательность конца может определять дополнительные признаки активируемого антитела, такие как связывание с рецептором-мишенью, облегчающее локализацию активируемого антитела, увеличение периода полувыведения из сыворотки и тому подобные. Активируемое антитело может включать направленно воздействующие части (например, лиганд для рецептора клетки, присутствующей в ткани-мишени) и части, увеличивающие период полувыведения из сыворотки (например, полипептиды, связывающиеся с белками сыворотки, такими как иммуноглобулин (например, IgG) или сывороточный альбумин (например, сывороточный альбумин человека (HSA)).
ЭЛЕМЕНТЫ МОДИФИЦИРОВАННЫХ И АКТИВИРУЕМЫХ АНТИТЕЛ
(а) Антитела или фрагменты антител (совместно обозначаемые как АВ)
В соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы антитела против любого антигена или гаптена. Антитела, используемые в настоящем изобретении, могут быть направлены против любой детерминанты, например, против опухолевых, бактериальных, грибковых, вирусных, паразитарных, микоплазматических антигенов, антигенов гистосовместимости, дифференцировочных антигенов и других антигенов клеточной мембраны, поверхностных антигенов патогенных организмов, токсинов, ферментов, аллергенов, лекарственных средств, внутриклеточных мишеней и любых биологически активных молекул. Кроме того, может быть использована комбинация антител, воздействующих на разные антигенные детерминанты.
В используемом здесь значении антитело является непроцессированным антителом или фрагментом антитела, содержащим антигенсвязывающий домен, которое может связываться, в частности, специфически связываться с представляющей интерес мишенью, обычно с представляющим интерес белком-мишенью. Схематическое изображение активируемого антитела приведено на фиг.1. В таких вариантах осуществления изобретения антитело может включать, не ограничиваясь ими, вариабельные области или гипервариабельные участки легкой и/или тяжелой цепей антитела (VL, VH), фрагменты вариабельной области (Fv), Fab'-фрагменты, F(ab')2-фрагменты, Fab-фрагменты, одноцепочечные антитела (scAb), вариабельные области одноцепочечных антител (scFv), области, определяющие комплементарность (CDR), доменные антитела (dAb), иммуноглобулины с одним доменом тяжелой цепи типа ВНН или BNAR, иммуноглобулины с одним доменом легкой цепи или другие полипептиды, известные в данной области, содержащие антитело, способное связываться с белками-мишенями или эпитопами белков-мишеней. В других вариантах осуществления изобретения антитело может быть химерной или гибридной комбинацией, содержащей несколько антител, например, первое антитело и второе антитело, при этом каждое антитело может связываться с одинаковыми или разными мишенями. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело является биспецифическим антителом или его фрагментом, предназначенным для связывания с двумя разными антигенами. В некоторых вариантах осуществления изобретения использованы в активируемой форме первые ММ и СМ, связанные с первым антителом, и/или вторые ММ и СМ, связанные соответственно со вторым антителом.
Антитело может быть природным антителом или его фрагментом, неприродным антителом или его фрагментом, синтетическим антителом или его фрагментом, гибридным антителом или его фрагментом или генетически сконструированным антителом или его фрагментом. Антитело может быть гуманизированным антителом или его фрагментом.
В определенных вариантах осуществления изобретения активируемое антитело может содержать несколько антител. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут быть получены из биспецифических антител или их фрагментов. В других вариантах осуществления изобретения активируемое антитело может быть сконструировано искусственно и включать антитела, выделенные из двух разных антител или их фрагментов. В таких вариантах осуществления изобретения антитела могут быть предназначены для связывания с двумя разными мишенями, двумя разными антигенами или двумя разными эпитопами на одной мишени. Активируемое антитело, содержащее несколько антител, способных связываться с несколькими сайтами мишени, обычно предназначено для связывания с разными сайтами связывания одной или нескольких представляющих интерес мишеней, при этом первое антитело активируемого антитела по существу не мешает связыванию с мишенью второго антитела активируемого антитела. Активируемые антитела, содержащие несколько антител, дополнительно могут включать несколько звеньев АВ-ММ, которые могут быть необязательно разделены дополнительными расщепляемыми частями так, что под воздействием модифицирующего средства не подавляется специфическое связывание антител с мишенями или антитела становятся ”немаскированными”.
В некоторых вариантах осуществления изобретения использование фрагментов антител в качестве источников антител усиливает проникновение к сайтам-мишеням. Fab’-фрагменты иммуноглобулинов IgG получают путем расщепления антитела пепсином [в результате чего образуется двухвалентный фрагмент, (Fab')2] или папаином [в результате чего образуются 2 одновалентных фрагмента (2 Fab)]. Parham, 1983, J. Immunol. 131:2895-2902; Lamoyi and Nasonoff, 1983, J. Immunol. Meth. 56: 235-243. Двухвалентный (Fab')2-фрагмент может быть расщеплен путем мягкого восстановления одной или нескольких дисульфидных связей с образованием одновалентных Fab'-фрагментов. Fab- и (Fab’)2-фрагменты меньше целого антитела, но обладают признаками антитела и поэтому могут легче проникать к сайту или ткани-мишени при использовании в качестве антитела. Такая особенность может создавать преимущество при доставке in vivo в определенных вариантах осуществления изобретения, так как многие такие фрагменты не проникают через плацентарный барьер. Поэтому в соответствии с данным вариантом осуществления настоящего изобретения активируемое антитело может быть доставлено in vivo (например, в опухоль) беременной женщине без воздействия на плод.
В данной области хорошо известны методы конструирования антитела (или его фрагмента) для определенной мишени. Хорошо известна структура антител и их фрагментов, вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела (VH и VL), Fv, F(ab')2, Fab-фрагментов, одноцепочечных антител (scAb), вариабельных областей одноцепочечных антител (scFv), областей, определяющих комплементарность (CDR), и доменных антител (dAb). В данной области известны методы конструирования полипептида, имеющего требуемый антигенсвязывающий домен антигена-мишени.
В данной области также хорошо известны методы модификации антител или фрагментов антител путем присоединения дополнительных полипептидов. Например, такие пептиды как маскирующая часть, расщепляемая часть или линкеры могут быть присоединены для модификации антител с целью конструирования модифицированных антител и активируемых антител по настоящему изобретению. Активируемые антитела, содержащие активируемые протеазой антитела, могут быть сконструированы стандартными методами, схематически показанными на фиг.3.
Антитело или его фрагмент (совместно определяемые как АВ) может специфически связываться с белком-мишенью. Антитело по настоящему изобретению может специфически связываться с мишенью при значении константы диссоциации (Kd) не более 1000 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 1 нМ, 500 пМ, 400 пМ, 350 пМ, 300 пМ, 250 пМ, 200 пМ, 150 пМ, 100 пМ, 50 пМ, 25 пМ, 10 пМ, 5 пМ, 1 пМ, 0,5 пМ или 0,1 пМ.
Типичные классы мишеней антитела включают, не ограничиваясь ими, рецепторы на поверхности клетки и секретируемые связывающие белки (например, факторы роста), растворимые ферменты, структурные белки (например, коллаген, фибронектин) и тому подобные. В некоторых вариантах осуществления изобретения активируемые антитела по настоящему изобретению включают антитела, способные связываться с внеклеточной мишенью, обычно с внеклеточным белком-мишенью. В других вариантах осуществления изобретения активируемые антитела могут быть сконструированы с возможностью поглощения клеткой и предназначены для переключения фенотипа внутри клетки.
В иллюстративных вариантах осуществления изобретения, не ограничивающих настоящее изобретение, антитело является партнером связывания для любой мишени, указанной в таблице 1. В конкретных иллюстративных вариантах осуществления изобретения антитело является партнером связывания для EGFR, TNFальфа, CD11a, CSFR, CTLA-4, EpCAM, VEGF, CD40, CD20, Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4, Jagged 1, Jagged 2, CD52, MUC1, IGF1R, трансферрина, gp130, VCAM-1, CD44, DLL4 или IL4. В одном конкретном варианте осуществления изобретения антитело не является партнером связывания для CD52.
В таблице 2 приведены типичные источники антител, используемых в иллюстративных вариантах осуществления изобретения, не ограничивающих объем настоящего изобретения. В конкретных иллюстративных вариантах осуществления изобретения источником антитела по настоящему изобретению является цетуксимаб, панитумумаб, инфликсимаб, адалимумаб, эфализумаб, ипилимумаб, тремелимумаб, адекатумумаб, Hu5c8, алемтузумаб, ранибизумаб, тозитумомаб, ибритумомаб тиуксетан, ритуксимаб, инфликсимаб, бевацизумаб или фигитумумаб. В одном конкретном варианте осуществления изобретения источником антитела не является алемтузумаб или Campath™.
Таблица 1
Типичные мишени
1-92-LFA-3 cMet HGF IL4 PSMA
анти-Y Льюиса Коллаген hGH IL4R RAAG12
рецептор J апелина CSFR Гиалуронидаза IL6 Фосфат сфингозина 1
комплемент С5 CSFR-1 IFNальфа Рецептор инсулина TGFбета
CD11a CTLA-4 IFNбета Лиганды Jagged TNFальфа
CD172A CXCR4 IFNгамма Jagged 1 TNFальфа
CD19 DL44 IgE Jagged 2 TNFR
CD20 DLL4 Рецептор IgE MUC1 TRAIL-R1
CD22 EGFR IGF Na/K ATPase TRAIL-R2
CD25 EpCAM IGF1R NGF Трансферрин
CD28 EPHA2 IL11 Рецепторы Notch Рецептор трансферрина
CD3 ERBB3 IL12 Notch 1 TRK-A
CD30 Белок F RSV IL13 Notch 2 TRK-B
CD33 FAP IL15 Notch 3 VCAM-1
CD40 FGF-2 IL17 Notch 4 VEGF
CD40L FGFR1 IL18 PDGF-AA VEGF-A
CD41 FGFR2 IL1B PDGF-BB VEGF-B
CD44 FGFR3 IL1R PDGFRальфа VEGF-C
CD52 FGFR4 IL2 PDGFRальфа VEGF-D
CD64 Рецептор фолата IL21 PDGFRбета VEGFR1
CD80 Рецепторы GP IIb/IIIa IL23 PDGFRбета VEGFR2
CD86 Gp130 IL23R Фосфатидил-серин VEGFR3
Клаудин-3 GPIIB/IIIA IL29 PIGF альфа4,бета 1-интегрин
Клаудин-4 HER2/neu IL2R PSCA альфа4,бета7-интегрин
Таблица 2
Типичные источники антител
Торговое название антитела (название антитела) Мишень
Avastin™ (бевацизумаб) VEGF
Lucentis™ (ранибизумаб) VEGF
Erbitus™ (цетуксимаб) EGFR
Vectibix™ (панитумумаб) EGFR
Remicade™ (инфликсимаб) TNFα
Humira™ (адалимумаб) TNFα
Tysabri™ (натализумаб) Интегрин α4
Simulect™ (базиликсимаб) IL2R
Soliris™ (экулизумаб) Комплемент С5
Raptiva™ (эфализумаб) CD11a
Bexxar™ (тозитумомаб) CD20
Zevalin™ (ибритумомаб тиуксетан) CD20
Rituxan™ (ритуксимаб) CD20
Zenapax™ (даклизумаб) CD25
Myelotarg™ (гемтузумаб) CD33
Mylotarg™ (гемтузумаб озогамицин) CD33
Campath™ (алемтузумаб) CD52
ReoPro™ (абициксимаб) Рецептор гликопротеина IIb/IIIa
Xolair™ (омализумаб) IgE
Herceptin™ (трастузумаб) Her2
Synagis™ (паливизумаб) белок F RSV
(ипилимумаб) CTLA-4
(тремебимумаб) CTLA-4
Hu5c8 CD40L
(пертузумаб) Her2-neu
(эртумаксомаб) CD3/Her2-neu
Orencia™ (абатацепт) CTLA-4
(танезумаб) NGF
(бавитуксимаб) Фосфатидилсерин
(залутумумаб) EGFR
(мапатумумаб) EGFR
(матузумаб) EGFR
(нимотузумаб) EGFR
ICR62 EGFR
Моноклональное антитело 528 EGFR
СН806 EGFR
MDX-447 EGFR/CD64
(эдреколомаб) EpCAM
RAV12 RAAG12
huJ591 PSMA
Enbrel™ (этанерцепт) TNF-R
Amevive™ (алефацепт) 1-92-LFA-3
Antril™, Kineret™ (анкинра) IL-1Ra
GC1008 TGFбета
Notch 1
Jagged 1
(адекатумумаб) EpCAM
(фигитумумаб) IGF1R
(тоцилизумаб) IL-6
Типичные источника некоторых антител, указанных в таблице 2, подробно описаны в следующих публикациях, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки благодаря описанию одного или нескольких указанных источников антител: Remicade™ (инфликсимаб): патент США № 6015557, Nagahira K, Fukuda Y, Oyama Y, Kurihara T, Nasu T, Kawashima H, Noguchi C, Oikawa S, Nakanishi T. Humanization of a mouse neutralizing monoclonal antibody against tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). J Immunol Methods. 1999 Jan 1; 222(1-2):83-92.) Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, et al. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody. Mol Immunol. 1993 Nov; 30(16): 1443-53. Humira™ (адалимумаб): последовательность в патенте США № 6258562. Raptiva™ (эфализумаб): последовательность, приведенная в публикации Werther WA, Gonzalez TN, O'Connor SJ, McCabe S, Chan B, Hotaling T, Champe M, Fox JA, Jardieu PM, Berman PW, Presta LG. Humanization of an anti-lymphocyte function-associated antigen (LFA)-l monoclonal antibody and reengineering of the humanized antibody for binding to rhesus LFA-1. J Immunol. 1996 Dec 1; 157(11):4986-95. Mylotarg™ (гемтузумаб озогамицин): (последовательность, приведенная в публикации CO MS, Avdalovic NM, Caron PC, Avdalovic MV, Scheinberg DA, Queen C: Chimeric and humanized antibodies withspecificity for the CD33 antigen. J Immunol 148:1149, 1991) (Caron PC, Schwartz MA, Co MS, Queen C, Finn RD, Graham MC, Divgi CR, Larson SM, Scheinberg DA. Murine and humanized constructs of monoclonal antibody Ml95 (anti-CD33) for the therapy of acute myelogenous leukemia. Cancer. 1994 Feb 1; 73(3 Suppl): 1049-56). Soliris™ (экулизумаб): Hillmen P, Young N, Schubert J, Brodsky R, Socie G, Muus P, Roth A, Szer J, Elebute M, Nakamura R, Browne P, Risitano A, Hill A, Schrezenmeier H, Fu C, Maciejewski J, Rollins S, Mojcik C, Rother R, Luzzatto L (2006). The complement inhibitor eculizumab in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. N Engl J Med 355 (12): 1233-43. Tysabri™ (натализумаб): последовательность, приведенная в публикации Leger OJ, Yednock TA, Tanner L, Horner HC, Hines DK, Keen S, Saldanha J, Jones ST, Fritz LC, Bendig MM. Humanization of a mouse antibody against human alpha-4 integrin: a potential therapeutic for the treatment of multiple sclerosis. Hum Antibodies. 1997; 8(1):3-16. Synagis™ (паливизумаб): последовательность, приведенная в публикации Johnson S, Oliver C, Prince GA, Hemming VG, Pfarr DS, Wang SC, Dormitzer M, O'Grady J, Koenig S, Tamura JK, Woods R, Bansal G, Couchenour D, Tsao E, Hall WC, Young JF. Development of a humanized monoclonal antibody (MEDI-493) with potent in vitro and in vivo activity against respiratory syncytial virus. J Infect Dis. 1997 Nov; 176(5): 1215-24. Ипилимумаб: J. Immunother: 2007; 30(8): 825-830 Ipilimumab (Anti-CTLA4 Antibody) Causes Regression of Metastatic Renal Cell Cancer Associated With Enteritis and Hypophysitis; James C. Yang, Marybeth Hughes, Udai Kammula, Richard Royal, Richard M. Sherry, Suzanne L. Topalian, Kimberly B. Suri, Catherine Levy, Tamika Allen, Sharon Mavroukakis, Israel Lowy, Donald E. White, and Steven A. Rosenberg. Тремелимумаб: Oncologist 2007;12;153-883; Blocking Monoclonal Antibody in Clinical Development for Patients with Cancer; Antoni Ribas, Douglas C. Hanson, Dennis A. Noe, Robert Millham, Deborah J. Guyot, Steven H. Bernstein, Paul C. Canniff, Amarnath Sharma and Jesus Gomez-Navarro.
(b) Маскирующая часть (ММ)
Маскирующая часть (ММ) по настоящему изобретению обычно является аминокислотной последовательностью, связанной с АВ, расположение которой позволяет снизить способность антитела специфически связываться с его мишенью. В некоторых случаях ММ связана с АВ при помощи линкера.
У антитела, модифицированного маскирующей частью и находящегося в присутствии мишени, ослаблено или ингибировано специфическое связывание с мишенью по сравнению со специфическим связыванием антитела, не модифицированного маскирующей частью, или исходного антитела.
Kd антитела, модифицированного маскирующей частью, в отношении мишени обычно больше Kd антитела, не модифицированного маскирующей частью, или Kd исходного антитела. И наоборот, сродство связывания антитела, модифицированного маскирующей частью, в отношении мишени обычно меньше сродства связывания антитела, не модифицированного маскирующей частью, или исходного антитела.
Константа диссоциации (Kd) маскирующей части в отношении антитела обычно больше Kd антитела в отношении мишени. И наоборот, сродство связывания маскирующей части в отношении антитела обычно меньше сродства связывания антитела в отношении мишени.
У антитела, модифицированного маскирующей частью и находящегося в присутствии мишени, может быть ослаблено или ингибировано специфическое связывание с мишенью по сравнению со специфическим связыванием антитела, не модифицированного маскирующей частью, или исходного антитела. У антитела, модифицированного расщепляемой частью и маскирующей частью и находящегося в присутствии мишени, но при отсутствии достаточного количества фермента или ферментативной активности для расщепления расщепляемой части, ослаблено или ингибировано специфическое связывание с мишенью по сравнению со специфическим связыванием антитела, модифицированного расщепляемой частью и маскирующей частью, в присутствии мишени и достаточного количества фермента или ферментативной активности для расщепления расщепляемой части.
Маскирующая часть может ингибировать связывание антитела с мишенью. Маскирующая часть может связываться с антигенсвязывающим доменом антитела и ингибировать связывание антитела с мишенью. Маскирующая часть может стерически ингибировать связывание антитела с мишенью. Маскирующая часть может аллостерически ингибировать связывание антитела с мишенью. В указанных вариантах осуществления изобретения, когда антитело модифицировано или связано с маскирующей частью и находится в присутствии мишени, не происходит связывания или по существу не происходит связывания антитела с мишенью или происходит не более 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% или 50% связывания антитела с мишенью по сравнению со связыванием антитела, не модифицированного маскирующей частью, исходного антитела или антитела, не связанного с маскирующей частью, в течение по меньшей мере 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 96 часов, в течение 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 дней, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев или больше при измерении in vivo или при помощи иммуноадсорбционного анализа замещения мишенью in vitro, описанного в настоящем описании изобретения.
В определенных вариантах осуществления изобретени маскирующая часть не является природным партнером связывания антитела. Маскирующая часть может быть модифицированным партнером связывания антитела, содержащим замены аминокислот, которые по меньшей мере немного уменьшают сродство и/или авидность связывания с антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения маскирующая часть не обладает или по существу не обладает гомологией с природным партнером связывания антитела. В других вариантах осуществления изобретения маскирующая часть не более чем на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или 80% подобна природному партнеру связывания антитела.
Когда антитело находится в ”маскированном” состоянии, даже в присутствии мишени для антитела, маскирующая часть мешает или ингибирует связывание антитела с мишенью. Однако в немаскированном состоянии антитела вмешательство маскирующей части в связывание антитела с мишенью снижается, делая возможным больший доступ антитела к мишени и обеспечивая связывание с мишенью.
Например, когда модифицированное антитело является активируемым антителом и содержит расщепляемую часть, у антитела может быть удалена маскировка в результате расщепления расщепляемой части в присутствии фермента, предпочтительно фермента, специфичного для болезни. Таким образом, в нерасщепленном активируемом антителе маскирующая часть маскирует антитело от связывания с мишенью, но по существу или значительно не препятствует или не конкурирует за связывание антитела с мишенью, когда активируемое антитело находится в расщепленной конформации. Таким образом, комбинация маскирующей части и расщепляемой части облегчает образование переключаемого/активируемого фенотипа, при этом маскирующая часть снижает связывание антитела с мишенью при нахождении активируемого антитела в нерасщепленном состоянии, при этом расщепление расщепляемой части протеазой увеличивает связывание антитела с мишенью.
Структурные свойства маскирующей части могут быть различными в зависимости от разных факторов, таких как минимальная аминокислотная последовательность, необходимая для интерференции связывания антитела с мишенью, представляющая интерес связывающаяся пара белка-мишени и антитела, величина антитела, длина расщепляемой части, расположение расщепляемой части внутри маскирующей части и маскировка антитела в нерасщепленном активируемом антителе, наличие или отсутствие линкеров, наличие или отсутствие цистеина внутри или с боковой стороны антитела, необходимого для образования дисульфидной связи между остатками цистеина в расщепляемой части, и тому подобных.
Одним методом маскировки антитела или его фрагмента (АВ) в активируемом антителе является заключение активируемого антитела в петлю, которая стерически препятствует доступу мишени к антителу. В соответствии с данным методом остатки цистеина расположены рядом с N-концом, С-концом или антителом активируемого антитела так, что при образовании дисульфидной связи между остатками цистеина антитело маскируется.
В некоторых вариантах осуществления изобретения маскирующая часть связана с активируемым антителом ковалентной связью. В других вариантах осуществления изобретения связывание композиции активируемого антитела с мишенью предотвращают путем связывания маскирующей части с N-концом активируемого антитела. В другом варианте осуществления изобретения активируемое антитело связывают с маскирующей частью при помощи дисульфидных мостиков между остатками цистеина маскирующей части и активируемого антитела.
Маскирующая часть может быть получена в разных формах. В определенных вариантах осуществления изобретения маскирующая часть может быть известным партнером связывания антитела, при условии, что маскирующая часть связывается с антителом с меньшим сродством и/или авидностью по сравнению с белком-мишенью, с которым антитело должно связываться после расщепления расщепляемой части, чтобы уменьшить интерференцию маскирующей части в связывание антитела с мишенью. Как указано выше, маскирующая часть может маскировать антитело от связывания с мишенью, когда активируемое антитело не расщеплено, но по существу не препятствует или не конкурирует за связывание с мишенью, когда активируемое антитело расщеплено. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело и маскирующая часть не содержат аминокислотных последовательностей пары природных партнеров связывания, в частности, по меньшей мере антитело или маскирующая часть не имеет аминокислотной последовательности природного партнера связывания.
Эффективность ингибирования маскирующей частью связывания антитела с мишенью можно измерить, определяя величину эффективности маскировки при помощи иммуноадсорбционного анализа замещения мишенью, описанного в разделе ”Примеры” настоящего описания изобретения. Эффективность маскировки маскирующими частями определяют с учетом по меньшей мере двух параметров: сродство маскирующей части к антителу или его фрагменту и пространственное отношение маскирующей части к области связывания антитела с мишенью.
Что касается сродства, то в качестве примера можно отметить, что маскирующая часть может обладать высоким сродством, но лишь частично ингибировать сайт связывания антитела, в то время как другая маскирующая часть может обладать более низким сродством к антителу, но полностью ингибировать связывание с мишенью. В течение коротких периодов времени маскирующая часть с более низким сродством может обеспечивать достаточную маскировку, но с течением времени такая маскирующая часть может быть заменена мишенью (вследствие недостаточного сродства к антителу).
Аналогичным образом две маскирующие части с одинаковым сродством могут обеспечивать разную степень маскировку в зависимости от того, каким образом они ингибируют сайт связывания антитела или препятствуют связыванию антитела с мишенью. В другом примере маскирующая часть с высоким сродством может связываться и изменять структуру антитела, практически полностью ингибируя связывание с мишенью, в то время как другая маскирующая часть с высоким сродством может только частично ингибировать связывание. Таким образом, выявление эффективной маскирующей части не может быть основано только на сродстве, а должно включать эмпирическое измерение эффективности маскировки. Замещение маскирующей части мишенью в активируемом антителе в зависимости от времени можно измерить для оптимизации выбора маскирующих частей. Для достижения данной цели в настоящем описании изобретения представлен новый анализ замещения мишенью.
В некоторых вариантах осуществления изобретения маскирующую часть можно идентифицировать в результате скрининга библиотеки активируемых антител-кандидатов, содержащих разные маскирующие части. Например, антитело и расщепляемую часть можно выбрать на основании требуемой комбинации фермента/мишени, и аминокислотную последовательность маскирующей части можно идентифицировать путем описанного ниже скрининга с учетом достижения переключаемого фенотипа. Например, для идентификации приемлемой маскирующей части при помощи методов скрининга, рассмотренных в настоящем описании изобретения, может быть использована библиотека произвольных пептидов (например, от около 2 до около 40 аминокислот или больше). В конкретных вариантах осуществления изобретения маскирующие части со специфическим сродством связывания к антителу или его фрагменту (АВ) можно идентифицировать методом скрининга, который содержит создание библиотеки пептидных остовов, состоящей из маскирующих частей-кандидатов, в которой каждый остов состоит из трансмембранного белка и маскирующей части-кандидата. Указанную библиотеку затем вводят в соприкосновение со всем антителом или его частью, в частности, с непроцессированным антителом, фрагментом природного антитела или неприродным фрагментом, содержащим антитело (также способным связываться с представляющей интерес мишенью), и идентифицируют одну или несколько маскирующих частей-кандидатов, связанных с обнаруживаемым антителом. Скрининг может включать еще один цикл сортинга с магнитным возбуждением (MACS) или сортинга с возбуждением флуоресценции (FACS). Скрининг может также включать определение константы диссоциации (Kd) маскирующей части в отношении антитела и последующее определение эффективности маскировки.
Таким образом можно идентифицировать активируемые антитела, содержащие маскирующую часть, которая ингибирует связывание антитела с мишенью в нерасщепленном состоянии и делает возможным связывание антитела с мишенью в расщепленном состоянии, и дополнительно можно выбрать активируемое антитело, обладающее оптимальным динамическим диапазоном переключаемого фенотипа. Методы идентификации активируемых антител с требуемым переключаемым фенотипом более подробно описаны ниже.
Альтернативно маскирующая часть может не связываться специфически с антителом, а просто препятствовать связыванию антитела с мишенью в результате неспецифического взаимодействия, такого как стерическое препятствие. Например, маскирующая часть может быть расположена в нерасщепленном активируемом антителе так, что третичная или четвертичная структура активируемого антитела позволяет маскирующей части маскировать антитело путем взаимодействия на основании зарядов, благодаря чему антитело удерживает маскирующую часть в положении, препятствующем доступу мишени к антителу.
Активируемые антитела могут быть также получены с конформационно ограниченной структурой, такой как циклическая структура, которая облегчает получение переключаемого фенотипа. Для этого в конструкцию активируемого антитела вводят два остатка цистеина, и в результате образования дисульфидной связи между парами остатков цистеина активируемое антитело заключается в петлю или циклическую структуру. Таким образом, активируемое антитело может быть расщеплено требуемой протеазой при одновременном ингибировании связывания мишени с антителом. При расщеплении расщепляемой части циклическая структура размыкается, обеспечивая доступ мишени к антителу.
Пары остатков цистеина могут быть расположены в активируемом антителе в любом положении, позволяющем получить конформационно ограниченное активируемое антитела, которое после расщепления расщепляемой части по существу не препятствует связыванию мишени с антителом. Например, пара остатков цистеина может быть расположена в маскирующей части и линкере, фланкированном маскирующей частью и антителом, в линкере, фланкированном маскирующей частью и антителом или в других приемлемых конфигурациях. Например, маскирующая часть или линкер, фланкирующий маскирующую часть, может включать один или несколько остатков цистеина, образующих дисульфидный мостик с остатком цистеина, расположенным с противоположной стороны маскирующей части, когда активируемое антитело имеет складчатую структуру. Обычно желательно, чтобы остатки цистеина в паре располагались снаружи антитела с тем, чтобы не мешать связыванию с мишенью после расщепления активируемого антитела. Если остаток цистеина из пары остатков цистеина, используемых для образования дисульфидной связи, находится внутри антитела, желательно, чтобы его положение не препятствовало связыванию антитела с мишенью после воздействия восстановителя.
Типичные активируемые антитела, способные образовывать циклическую структуру при помощи дисульфидных связей между остатками цистеина, могут иметь общую формулу (которая может читаться в направлении от N-конца к С-концу или от С-конца до N-конца):
Xn1-(Cys1)-Xm-CM-AB-(Cys2)-Xn2
Xn1-цикло[(Cys1)-Xm-CM-AB-(Cys2)]-Xn2
где:
Xn1 и Xn2 независимо и необязательно присутствуют или отсутствуют и при наличии независимо означают любую аминокислоту и могут необязательно включать аминокислотную последовательность гибкого линкера (например, по меньшей мере один остаток Gly, Ser, Asn, Asp, обычно по меньшей мере один остаток Gly или Ser, обычно по меньшей мере один остаток Gly), и n1 и n2 независимо выбирают из нуля или любого целого числа, обычно не больше 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
Cys1 и Cys2 означают первый и второй остатки цистеина пары, способной образовывать дисульфидную связь;
Xm означает аминокислоты маскирующего фрагмента (ММ), где Х означает любую аминокислоту, при этом Xm может необязательно включать гибкий линкер (например, по меньшей мере один остаток Gly, Ser, Asn, Asp, обычно по меньшей мере один остаток Gly или Ser, обычно по меньшей мере один остаток Gly), и m означает целое число больше 1, обычно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше (как описано выше);
СМ означает расщепляемую часть (по настоящему изобретению); и
АВ означает антитело или его фрагмент (по настоящему изобретению).
В значении, используемом в приведенной выше формуле, “цикло” означает дисульфидную связь в активируемом антителе, образующую циклическую структуру активируемого антитела. Кроме того, приведенная выше формула содержит активируемые антитела, связывающиеся с двумя мишенями, при этом ММ обозначена АВ1 и АВ обозначено АВ2, где АВ1 и АВ2 являются произвольными обозначениями первого и второго антитела и мишень, способная связываться с антителами, может представлять собой одинаковые или разные мишени либо одинаковые или разные сайты связывания одной мишени. В таких вариантах осуществления изобретения АВ1 и/или АВ2 действует в качестве маскирующей части, препятствуя связыванию мишени с нерасщепленным активируемым антителом, связывающимся с двумя мишенями.
Как показано выше, остатки цистеина могут быть расположены в активируемом антителе в виде одного или двух концов (представленных выше Xn1 и Xn2), образуя структуру, напоминающую лассо или омега, когда активируемое антитело имеет структуру, связанную дисульфидной связью (и, таким образом, находится в конформационно ограниченном состоянии). Аминокислотная последовательность указанных концов может сообщать активируемому антителу дополнительные свойства, такие как связывание с рецептором мишени, что облегчает локализацию активируемого антитела.
В определенных конкретных вариантах осуществления изобретения маскирующая часть не препятствует проникновению активируемого антитела в клетку.
(с) Расщепляемая часть (СМ)
В некоторых вариантах осуществления изобретения расщепляемая часть (СМ) активируемого антитела может включать аминокислотную последовательность, которая может служить в качестве субстрата для протеазы, обычно внеклеточной протеазы. В других вариантах осуществления изобретения расщепляемая часть содержит пару остатков цистеина, способную образовывать дисульфидную связь, которая может быть расщеплена восстановителем. В других вариантах осуществления изобретения расщепляемая часть является субстратом, который может быть расщеплен фотолизом.
Расщепляемая часть расположена в активируемом антителе так, что при расщеплении расщепляемой части расщепляющим средством (например, субстрат для протеазы расщепляемой части расщепляется протеазой и/или дисульфидная связь между остатками цистеина разрушается под воздействием восстановителя) или под воздействием светового фотолиза в присутствии мишени активируемое антитело расщепляется и антитело связывается с мишенью, при этом связывание нерасщепленного антитела с мишенью ингибируется маскирующей частью (фиг.2). Следует отметить, что аминокислотная последовательность расщепляемой части может перекрывать или находиться внутри маскирующей части, при этом вся расщепляемая часть или ее часть облегчает маскировку антитела, когда активируемое антитело не ингибировано, не расщеплено или не маскировано.
Расщепляемая часть может быть выбрана с учетом протеазы, находящейся в ткани вместе с требуемой мишенью для антитела в активируемом антителе. Известны разные условия, в которых представляющая интерес мишень находится вместе с протеазой, и в данной области хорошо известен субстрат для протеазы. В случае рака ткань, являющаяся мишенью, может быть раковой тканью, в частности, раковой тканью солидной опухоли. В научной литературе отмечено повышенное содержание протеаз, имеющих известные субстраты, в ряде раков, например, в солидных опухолях. Смотрите, например, публикацию La Rocca et al., (2004) British J. of Cancer 90(7): 1414-1421. Неограничивающие примеры заболеваний включают: все типы раков (рак молочной железы, легкого, колоректальный рак, рак предстательной железы, головы и шеи, поджелудочной железы и т.д.), ревматоидный артрит, болезнь Крона, меланомы, SLE, сердечно-сосудистые поражения, ишемию и т.д. Кроме того, известны мишени, связанные с развитием ангиогенеза, такие как VEGF. Когда антитело в активируемом антителе выбирают с учетом его способности связываться с мишенью, относящейся к развитию ангиогенеза, такой как VEGF, приемлемой расщепляемой частью является часть, содержащая пептидный субстрат, расщепляемый протеазой, присутствующей в месте лечения рака, в частности, в более высоком количестве по сравнению с нераковыми тканями. В одном типичном варианте осуществления изобретения антитело в активируемом антителе может связываться с VEGF и расщепляемая часть может быть субстратом для металлопротеазы матрикса (ММР), расщепляемым ММР. В других вариантах осуществления изобретения антитело в активируемом антителе может связываться с представляющей интерес мишенью и расщепляемая часть может быть, например, легумаином, плазмином, TMPRSS-3/4, MMP-9, MT1-MMP, катепсином, каспазой, эластазой нейтрофилов человека, бета-секретазой, uPA или PSA. В других вариантах осуществления изобретения активируемое антитело может быть активировано другими протеазами, специфичными для болезней, отличных от рака, таких как рассеянный склероз или ревматоидный артрит.
Немодифицированная или нерасщепленная расщепляемая часть может эффективно ингибировать или маскировать антитело, присоединяя маскирующую часть к антителу. В результате модификации расщепляемой части (расщепления, восстановления, фотолиза) антитело утрачивает маскировку и может связываться с мишенью.
Активируемое антитело может включать несколько расщепляемых частей, например, активируемое антитело может включать первую расщепляемую часть (СМ1) и вторую расщепляемую часть (СМ2). СМ1 и СМ2 могут быть разными субстратами для одного фермента (например, могут характеризоваться разным сродством связывания с ферментом), разными субстратами для разных ферментов, СМ1 может быть субстратом для фермента и СМ2 может быть субстратом для фотолиза, СМ1 может быть субстратом для фермента и СМ2 может быть субстратом для восстановления или СМ1 может быть субстратом для фотолиза и СМ2 может быть субстратом для восстановления и т.д.
Расщепляемая часть может быть специфически модифицирована (расщеплена, восстановлена или подвергнута фотолизу) средством (то есть ферментом, восстановителем, светом) со скоростью около 0,001-1500×104 М-1·с-1 или по меньшей мере 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250 или 1500×104 М-1·с-1.
Для специфического расщепления ферментом расщепляемую часть должна находиться в соприкосновение с ферментом. Расщепляемая часть может быть расщеплена, когда активируемое антитело, содержащее антитело, связанное с маскирующей частью и расщепляемой частью, находится в присутствии мишени и достаточной ферментативной активности. Достаточная ферментативная активность определяется способностью фермента контактировать с расщепляемой частью и вызывать расщепление. Можно легко предположить, что фермент может находиться рядом с расщепляемой частью, не будучи в состоянии расщеплять расщепляемую часть из-за других клеточных факторов или модификации белка фермента.
Типичные субстраты могут включать, не ограничиваясь ими, субстраты, расщепляемые одним или несколькими следующими ферментами или протеазами, приведенными в таблице 3.
Таблица 3
Типичные ферменты/протеазы
ADAM10 Каспаза 8 Катепсин S ММР 8
ADAM12 Каспаза 9 FAP ММР 9
ADAM17 Каспаза 10 Гранзим В ММР-13
ADAMTS Каспаза 11 Гуанидинобензоатаза (GB) ММР 14
ADAMTS5 Каспаза 12 Гепсин МТ-SP1
BACE Каспаза 13 Эластаза нейтрофилов человека (HNE) Неприлизин
Каспазы Каспаза 14 Легумаин NS3/4A
Каспаза 1 Катепсины Матриптаза 2 Плазмин
Каспаза 2 Катепсин А Меприн PSA
Каспаза 3 Катепсин В ММР 1 PSMA
Каспаза 4 Катепсин D ММР 2 TACE
Каспаза 5 Катепсин Е ММР 3 TMPRSS 3/4
Каспаза 6 Катепсин К ММР 7 uPA
Каспаза 7 МТ1-ММР
Альтернативно или дополнительно антитело в активируемом антителе может связываться с представляющей интерес мишенью и расщепляемая часть может иметь дисульфидную связь, образуемую парой остатков цистеина, которая расщепляется восстановителем, который содержит, не ограничиваясь ими, клеточный восстановитель, такой как глутатион (GSH), тиоредоксины, NADPH, флавины, аскорбат и тому подобные, которые могут присутствовать в больших количествах в ткани или вокруг солидной опухоли.
(d) Линкеры
Линкеры, пригодные для использования в композициях по настоящему изобретению, являются линкерами, придающими гибкость модифицированному антителу или активируемому антителу, для облегчения ингибирования связывания антитела с мишенью. Такие линкеры обычно определяются как гибкие линкеры. Приемлемые линкеры могут быть легко выбраны и могут иметь любую приемлемую длину, например, от 1 аминокислоты (например, Gly) до 20 аминокислот, от 2 аминокислот до 15 аминокислот, от 3 аминокислот до 12 аминокислот, в том числе от 4 аминокислот до 10 аминокислот, от 5 аминокислот до 9 аминокислот, от 6 аминокислот до 8 аминокислот или от 7 аминокислот до 8 аминокислот, и могут включать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот.
Типичные гибкие линкеры включают полимеры глицина (G)n, полимеры глицина-серина (в том числе, например, (GS)n, (GSGGS)n и (GGGS)n, где n означает целое число, равно по меньшй мере единице), полимеры глицина-аланина, полимеры аланина-серина и другие гибкие линкеры, известные в данной области. Полимеры глицина и глицина-серина являются относительно не структурированными и поэтому могут служить в качестве нейтральной связи между компонентами. Глицин охватывает значительно большее пространство phi-psi, чем аланин и гораздо меньше ограничен по сравнению с остатками, имеющими более длинные боковые цепи (смотрите, публикацию Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Типичные гибкие линкеры включают, не ограничиваясь ими, Gly-Gly-Ser-Gly, Gly-Gly-Ser-Gly-Gly, Gly-Ser-Gly-Ser-Gly, Gly-Ser-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Ser-Gly, Gly-Ser-Ser-Ser-Gly и тому подобные. Квалифицированному специалисту должно быть понятно, что активируемое антитело может включать линкеры, которые являются полностью или частично гибкими, в частности, линкер может быть гибким линкером, а также может включать одну или несколько частей, сообщающих меньшую гибкость структуре, для получения требуемой структуры активируемого антитела.
(е) Дополнительные элементы
Помимо вышеописанных элементов модифицированные антитела и активируемые антитела могут содержать дополнительные элементы, такие как, например, N- или С-концевые аминокислотные последовательности активируемого антитела. Например, активируемые антитела могут включать направленно воздействующую часть, облегчающую доставку в представляющую интерес клетку или ткань. Кроме того, в контексте описанных ниже библиотек активируемых антител такое активируемое антитело может быть получено в виде остовного белка, облегчающего отображение активируемого антитела на поверхности клетки.
ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Композиции и активируемые антитела по настоящему изобретению могут быть использованы для разных целей, в том числе для терапии и диагностики.
Примером активируемого антитела по настоящему изобретению может быть активируемое легумаином антитело против EGFR, связанное с маскирующей частью, активируемое плазмином антитело против EGFR, связанное с маскирующей частью, TMPRSS-3/4-активируемое антитело против EGFR, связанное с маскирующей частью, активируемый легумаином цетуксимаб, связанный с маскирующей частью, активируемый плазмином цетуксимаб, связанный с маскирующей частью, TMPRSS-3/4-активируемый цетуксимаб, связанный с маскирующей частью, активируемый легумаином вектибикс, связанный с маскирующей частью, активируемый плазмином вектибикс, связанный с маскирующей частью, или TMPRSS-3/4-активируемый вектибикс, связанный с маскирующей частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения активируемые антитела могут быть использованы для лечения или диагностики карцином головы и шеи, ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы.
Примером активируемого антитела по настоящему изобретению может быть ММР9-активируемое антитело против TNFальфа, связанное с маскирующей частью, МТ1-ММР-активируемое антитело против TNFальфа, связанное с маскирующей частью, активируемое катепсином антитело против TNFальфа, связанное с маскирующей частью, ММР9-активируемый инфликсимаб, связанный с маскирующей частью, МТ1-ММР-активируемый инфликсимаб, связанный с маскирующей частью, активируемый катепсином инфликсимаб, связанный с маскирующей частью, ММР9-активируемый адалимумаб, связанный с маскирующей частью, МТ1-ММР-активируемый адалимумаб, связанный с маскирующей частью или активируемый катепсином адалимумаб, связанный с маскирующей частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные активируемые антитела могут быть использованы для лечения или диагностики ревматоидного артрита или рассеянного склероза.
Примером активируемого антитела по настоящему изобретению может быть активируемое легумаином антитело против CD11a, связанное с маскирующей частью, активируемое плазмином антитело против CD11a, связанное с маскирующей частью, активируемое каспазой антитело против CD11a, связанное с маскирующей частью, активируемое катепсином антитело против CD11a, связанное с маскирующей частью, активируемый легумаином эфализумаб, связанный с маскирующей частью, активируемый плазмином эфализумаб, связанный с маскирующей частью, активируемый каспазой эфализумаб, связанный с маскирующей частью, активируемый катепсином эфализумаб, связанный с маскирующей частью, активируемое легумаином антитело против CSFR, связанное с маскирующей частью, активируемое плазмином антитело против CSFR, связанное с маскирующей частью, или активируемое катепсином антитело против CSFR, связанное с маскирующей частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные активируемые антитела могут быть использованы для лечения или диасностики опухолеассоциированных макрофагов для карцином.
Примером активируемого антитела по настоящему изобретению может быть активируемое плазмином антитело против CTLA-4, связанное с маскирующей частью, активируемое каспазой антитело против CTLA-4, связанное с маскирующей частью, МТ1-ММР-активируемое антитело против CTLA-4, связанное с маскирующей частью, активируемый плазмином ипилимумаб, связанный с маскирующей частью, активируемый каспазой ипилимумаб, связанный с маскирующей частью.
Примером активируемого антитела по настоящему изобретению может быть МТ1-ММР-активируемый ипилимумаб, связанный с маскирующей частью, активируемый плазмином тремелимумаб, связанный с маскирующей частью, активируемый каспазой тремелимумаб, связанный с маскирующей частью, МТ1-ММР-активируемый тремелимумаб, связанный с маскирующей частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные активируемые антитела могут быть использованы для лечения или диагностики злокачественных меланом.
Примером активируемого антитела по настоящему изобретению может быть PSA-активируемое антитело против ЕРСАМ, связанное с маскирующей частью, активируемое легумаином антитело против ЕРСАМ, связанное с маскирующей частью, PSA-активируемый адекатумумаб, связанный с маскирующей частью, или активируемый легумаином адекатумумаб, связанный с маскирующей частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные активируемые антитела могут быть использованы для лечения или диагностики рака предстательной железы.
Примером активируемого антитела по настоящему изобретению может быть активируемое эластазой нейтрофилов человека антитело против CD40L, связанное с маскирующей частью, или активируемое эластазой нейтрофилов человека антитело Hu5c8, связанное с маскирующей частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные активируемые антитела могут быть использованы для лечения или диагностики лимфом.
Примером активируемого антитела по настоящему изобретению может быть активируемое бета-секретазой антитело против Notch1, связанное с маскирующей частью, активируемое легумаином антитело против Notch1, связанное с маскирующей частью, активируемое плазмином антитело против Notch1, связанное с маскирующей частью, uPA-активируемое антитело против Notch1, связанное с маскирующей частью, активируемое бета-секретазой антитело против Notch3, связанное с маскирующей частью, активируемое легумаином антитело против Notch3, связанное с маскирующей частью, активируемое плазмином антитело против Notch3, связанное с маскирующей частью, uPA-активируемое антитело против Notch3, связанное с маскирующей частью, активируемое бета-секретазой антитело против Jagged1, связанное с маскирующей частью, активируемое легумаином антитело против Jagged1, связанное с маскирующей частью, активируемое плазмином антитело против Jagged1, связанное с маскирующей частью, uPA-активируемое антитело против Jagged1, связанное с маскирующей частью, активируемое бета-секретазой антитело против Jagged2, связанное с маскирующей частью, активируемое легумаином антитело против Jagged2, связанное с маскирующей частью, активируемое плазмином антитело против Jagged2, связанное с маскирующей частью, или uPA-активируемое антитело против Jagged2, связанное с маскирующей частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные активируемые антитела могут быть использованы для лечения или диагностики рака молочной железы, головы и шеи, ободочной кишки и других карцином, отрицательных по трем мишеням (отрицательные к мишеням ER, PR и Her2).
Примером активируемого антитела по настоящему изобретению может быть ММР-активируемое антитело против CD52, связанное с маскирующей частью, или ММР-активируемое антитело против кампата, связанное с маскирующей частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные активируемые антитела могут быть использованы для лечения или диагностики рассеянного склероза.
Примером активируемого антитела по настоящему изобретению может быть ММР-активируемое антитело против MUC1, связанное с маскирующей частью, активируемое легумаином антитело против MUC1, связанное с маскирующей частью, активируемое плазмином антитело против MUC1, связанное с маскирующей частью, или uPA-активируемое антитело против MUC1, связанное с маскирующей частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные активируемые антитела могут быть использованы для лечения или диагностики эпителиальных опухолей.
Примером активируемого антитела по настоящему изобретению может быть активируемое легумаином антитело против IGF1R, связанное с маскирующей частью, активируемое плазмином антитело против IGF1R, связанное с маскирующей частью, активируемое каспазой антитело против IGF1R, связанное с маскирующей частью, активируемый легумаином фигитумумаб, связанный с маскирующей частью, активируемый плазмином фигитумумаб, связанный с маскирующей частью, или активируемый каспазой фигитумумаб, связанный с маскирующей частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные активируемые антитела могут быть использованы для лечения или диагностики немелкоклеточного рака легких и других эпителиальных опухолей.
Примером активируемого антитела по настоящему изобретению может быть активируемое легумаином антитело против рецептора трансферрина, связанное с маскирующей частью, активируемое плазмином антитело против рецептора трансферрина, связанное с маскирующей частью, или активируемое каспазой антитело против рецептора трансферрина, связанное с маскирующей частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения активируемые антитела могут быть использованы для лечения или диагностики солидных опухолей и опухолей поджелудочной железы.
Примером активируемого антитела по настоящему изобретению может быть активируемое легумаином антитело против gp130, связанное с маскирующей частью, активируемое плазмином антитело против gp130, связанное с маскирующей частью, или uPA-активируемое антитело против gp130, связанное с маскирующей частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные активируемые антитела могут быть использованы для лечения или диагностики солидных опухолей.
В определенных других типичных вариантах осуществления изобретения, не ограничивающих объем изобретения, композиции активируемых антител включают маскированное легумаином антитело, специфичное к Notch1, uPA-активируемое маскированное антитело, специфичное к Jagged1, активируемое плазмином маскированное антитело scFv против VEGF, ММР-9-активируемое маскированное антитело scFv против VCAM и ММР-9-активируемое маскированное антитело против CTLA4.
Указанные активируемые антитела приведены только в качестве примеров, и такие активируемые ферментом маскированные антитела могут быть сконструированы для любой мишени, не ограничиваясь мишенями, приведенными в таблице 1, и с использованием любого антитела, не ограничиваясь антителами, приведенными в таблице 2.
Комплексы активируемых антител
В соответствии с одним объектом настоящего изобретения активируемое антитело существует в виде комплекса (ААС), содержащего два или более антитела, показанных на фиг.34-36. В настоящем описании изобретения представлены комплексы активируемых антител (ААС), которые характеризуются активируемым/переключаемым связыванием с одним или несколькими белками-мишенями. Комплексы активируемых антител обычно включают одно или несколько антител или фрагментов антител (АВ), маскирующие части (ММ) и расщепляемые части (СМ). В некоторых вариантах осуществления изобретения расщепляемая часть содержит аминокислотную последовательность, которая служит в качестве субстрата для представляющей интерес протеазы. В других вариантах осуществления изобретения расщепляемая часть образует дисульфидную связь между остатками цистеина, которая расщепляется восстановлением. Комплекс активируемого антитела характеризуется активируемой конформацией, в которой по меньшей мере одно антитело является менее доступным для мишени в немодифицированном состоянии, чем после модификации расщепляемой части, например, в присутствии расщепляющего средства (например, протеазы, которая распознает сайт расщепления расщепляемой части) или восстановителя (например, восстановителя, который восстанавливает дисульфидные связи в расщепляемой части).
Расщепляемая часть и антитело комплекса активируемого антитела могут быть выбраны так, чтобы антитело являлось связывающей частью для представляющей интерес мишени и расщепляемая часть являлась субстратом для протеазы, находящейся вместе с мишенью в месте лечения субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения комплексы активируемых антител могут вызывать меньшую токсичность и/или вредные побочные эффекты, которые в противном случае могут возникать в результате связывания немаскированных антител в местах, не подвергаемых лечению. В некоторых вариантах осуществления изобретения комплекс активируемого антитела может дополнительно включать детектируемую часть или диагностическое средство. В определенных вариантах осуществления изобретения комплекс активируемого антитела конъюгирован с терапевтическим средством, находящимся снаружи антигенсвязывающей области. Комплексы активируемых антител могут быть также использованы в диагностике и/или визуализации или для обнаружения наличия или отсутствия расщепляющего средства в образце.
Комплекс активируемого антитела схематически изображен на фиг.43. Как показано на данной фигуре, элементы комплекса активируемого антитела расположены таким образом, что при нахождении расщепляемой части в расщепленном состоянии (или в относительно активном состоянии) и в присутствии мишени, антитело связывается с мишенью, в то время как при нахождении расщепляемой части в нерасщепленном состоянии (или в относительно неактивном состоянии) в присутствии мишени, связывание антитела с мишенью подавляется благодаря маскировке антитела маскирующей частью в комплексе. В используемом здесь значении термин ”расщепленное состояние” означает состояние комплекса активируемого антитела после расщепления расщепляемой части протеазой и/или восстановления дисульфидной связи между остатками цистеина в расщепляемой части. Термин ”нерасщепленное состояние” в используемом здесь значении означает состояние комплекса активируемого антитела при отсутствии расщепления расщепляемой части протеазой и/или при отсутствии восстановления дисульфидной связи между остатками цистеина в расщепляемой части. Как было указано выше, термин ”комплекс активируемого антитела (ААС)” в используемом здесь значении означает комплекс активируемого антитела как в нерасщепленном (нативном) состоянии, так и в расщепленном состоянии. Квалифицированному специалисту должно быть очевидно, что в некоторых вариантах осуществления изобретения в расщепленном комплексе активируемого антитела может отсутствовать маскирующая часть вследствие расщепления расщепляемой части протеазой, в результате чего происходит высвобождение маскирующей части (например, если маскирующая часть не связана с комплексом активируемого антитела ковалентной связью).
Термин ”активируемый” или “переключаемый” означает, что комплекс активируемого антитела характеризуется первым уровнем связывания с мишенью при нахождении в нативном или нерасщепленном состоянии (то есть в первой конформации) и вторым уровнем связывания с мишенью при нахождении в расщепленном состоянии (то есть во второй конформации), при этом второй уровень связывания с мишенью выше первого уровня связывания. Как правило, доступ мишени к антителу комплекса активируемого антитела увеличивается в присутствии расщепляющего средства, способного расщеплять расщепляемую часть, по сравнению с отсутствием такого расщепляющего средства. Таким образом, в нативном или нерасщепленном состоянии антитело замаскировано от связывания с мишенью (то есть первая конформация препятствует доступу мишени к антителу) и в расщепленном состоянии антитело не замаскировано от связывания с мишенью.
Как правило, комплекс активируемого антитела можно получить, выбирая представляющее интерес антитело и создавая остальную часть комплекса активируемого антитела так, чтобы при конформационном ограничении маскирующая часть обеспечивала маскировку антитела. Комплексы активируемых антител, связывающиеся с двумя мишенями, содержат два антитела, которые могут связываться с одинаковыми или разными мишенями. В конкретных вариантах осуществления изобретения комплексы активируемых антител, связывающиеся с двумя мишенями, содержат биспецифические антитела или фрагменты антител.
В определенных вариантах осуществления изобретения комплекс состоит из двух активируемых антител (АА), каждое из которых содержит антитело или его фрагмент (АВ), расщепляемую часть (СМ) и маскирующую часть (ММ), в результате чего достигается перекрестная маскировка, то есть маскирующая часть в активируемом антителе препятствует связыванию антитела с мишенью (фиг.34А). В других вариантах осуществления изобретения комплекс состоит из двух активируемых антител, при этом каждое активируемое антитело содержит антитело и одно активируемое антитело содержит расщепляемую часть и маскирующую часть, в результате чего достигается общая перекрестная маскировка, то есть маскирующая часть вызывает образование комплекса и препятствует связыванию с мишенью антител в обоих активируемых антителах (фиг.34В). В других вариантах осуществления изобретения комплекс состоит из двух активируемых антител, каждое из которых содержит два антитела, две расщепляемые части и две маскирующие части, благодаря чему достигается перекрестная маскировка, то есть маскирующие части одного активируемого антитела препятствуют связыванию с мишенью антител другого активируемого антитела (фиг.34С). В других вариантах осуществления изобретения комплекс состоит из двух активируемых антител, при этом одно активируемое антитело содержит два антитела, две расщепляемые части и две маскирующие части, благодаря чему достигается общая перекрестная маскировка, то есть маскирующие части препятствуют связыванию с мишенью антител других активируемых антител (фиг.34D). В других вариантах осуществления изобретения комплекс состоит из двух молекул биспицефического активируемого антитела, которое содержит два антитела, две расщепляемые части и две маскирующие части, благодаря чему в комплексе достигается перекрестная маскировка, то есть ММ1 препятствует связыванию с мишенью антитела АВ1 противоположной молекулы и ММ2 препятствует связыванию с мишенью антитела АВ2 противоположной молекулы (фиг.34Е). В других вариантах осуществления изобретения комплекс состоит из двух молекул биспецифического активируемого антитела, которое содержит два антитела, одну расщепляемую часть и одну маскирующую часть, благодаря чему в комплексе достигается общая перекрестная маскировка, то есть маскирующая часть препятствует связыванию с мишенью обоих антител (фиг.34F).
Как правило, распад комплекса активируемого антитела и доступ к мишеням по меньшей мере одного антитела в комплексах активируемых антител увеличивается в присутствии расщепляющего средства, способного расщеплять расщепляемые части, по сравнению с отсутствием такого расщепляющего средства (фиг.35). Два активируемых антитела комплекса могут содержать антитела, которые связываются с разными мишенями или с разными эпитопами одной мишени.
Одна пара ММ/АВ комплекса может быть использована для образования устойчивого комплекса и не имеет собственной терапевтической мишени. Высокое сродство маскирующей части к нетерапевтическому антителу позволяет образовать устойчивый комплекс даже при более низком сродстве маскирующей части к терапевтическому антителу. Низкое сродство маскирующей части к терапевтическому антителу в случае многовалентного комплекса является достаточным для маскировки терапевтического средства на основе антитела, но после расщепления такой комплекс быстро распадается. Для максимального связывания с мишенью в расщепленном состоянии разница между сродством маскирующей части и мишени к антителу должна быть максимальной.
В других вариантах осуществления изобретения антитело может образовывать ковалентную связь с маскирующей частью противоположной молекулы комплекса. В присутствии расщепляющего средства комплекс распадается таким образом, что по меньшей мере одно из других антител связывается с мишенью (фиг.36). Такая ковалентная связь может быть образована между боковыми цепями реакционно-способной аминокислоты в маскирующей части и антителе, например, при помощи дисульфидной связи между остатками цистеина или химической конъюгации реакционно-способных групп с маскирующей частью и каталитическим антителом. Примеры ковалентного связывания антител приведены в публикациях Chmura A.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001 July 17, 98(15): 8480-8484; Rader, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003 April 29, 100(9): 5396-5400; Armentano, F. et al., Immunology Letters, 2006 February 28, 103(1): 51-57.
Следует отметить, что, хотя маскирующая часть и расщепляемая часть указаны как отдельные компоненты, предполагается, что аминокислотные последовательности маскирующей части и расщепляемой части могут перекрывать друг друга, например, расщепляемая часть может полностью или частично находиться внутри маскирующей части. Во многих вариантах осуществления изобретения желательно ввести в конструкцию комплекса активируемого антитела один или несколько линкеров, например, гибких линкеров, для обеспечения гибкости в одном или нескольких соединениях ММ-СМ, СМ-АВ или обоих соединениях. Помимо вышеописанных элементов комплексы активируемых антител могут содержать дополнительные элементы, такие как, например, N- или С-концевая аминокислотная последовательность комплекса активируемого антитела.
Конъюгаты активируемых антител
В соответствии с одним объектом настоящего изобретения антитело в активируемом антителе дополнительно конъюгировано со средством, таким как терапевтическое средство, в результате чего образуются конъюгаты активируемых антител (AACJ), являющиеся специфическим типом активируемого антитела. Такое средство может быть присоединено непосредственно к антителу или с помощью линкера. Такие средства или линкеры избирательно присоединяются к таким участкам антител, которые не являются частью антигенсвязывающего центра молекулы. Типичный конъюгат активируемого антитела показан на фиг.20.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения средство может быть конъюгировано с антителом. Если желательно доставить и высвободить средство, конъюгированное с антителом, используют иммуноглобулины, относящиеся к классам, которые, как известно, активируют комплемент. В других применениях могут быть использованы иммуноглобулины-носители, которые не могут активировать комплемент. Такие иммуноглобулины-носители могут включать определенные классы антител, такие как IgM, IgA, IgD, IgE; определенные подклассы IgG или определенные фрагменты иммуноглобулинов, например, неполные антитела (одна пара тяжелой и легкой цепей) или Fab, Fab’ или (Fab’)2-фрагменты.
Типичные конъюгаты активируемых антител представляют собой активируемые антитела, связанные с терапевтическим средством, при этом антитело воздействует на EGFR, CD44, Notch1, 2, 3 или 4, Jagged1 или 2, ЕрСАМ или IGF-1R.
Химические методы связывания, рассмотренные в настоящем описании изобретения, позволяют полученному конъюгату активируемого антитела сохранить способность связываться с антигеном и активировать путь активации комплемента (если активируемое антитело также обладает такой способностью). Поэтому при введении субъекту конъюгата активируемого антитела последующее образование иммунных комплексов с антигенами-мишенями in vivo может активировать систему активации комплемента в сыворотке субъекта. Линкер должен расщепляться комплементом, поэтому средство может быть расщеплено в месте направленного воздействия одним или несколькими ферментами пути активации комплемента. Высвобождение большей части средства происходит после доставки к месту направленного воздействия.
В типичном варианте осуществления изобретения известно, что не все клетки опухоли имеют антигенную детерминанту мишени. Таким образом, системы доставки, требующие интернализации в клетке-мишени, обеспечивают успешную доставку в те опухолевые клетки, которые имеют антигенную детерминанту и способны интернализировать конъюгат. Опухолевые клетки, которые не имеют антигенной детерминанты или не обладают способностью интернализации, не будут подвергнуты воздействию. В соответствии с данным способом по настоящему изобретению конъюгаты активируемых антител доставляют средство в клетки-мишени. Однако более важным является то, что после доставки средства к клетке-мишени способ по настоящему изобретению позволяет высвободить или активировать активное или активируемое терапевтическое средство. Высвобождение или активация могут быть опосредованы следующими факторами в организме субъекта, не ограничиваясь ими: ферментами комплемента, активатором плазминогена ткани, урокиназой, плазмином или другим ферментом, обладающим протеолитической активностью, путем активации фотосенсибилизатора или модификации субстрата. После высвобождения средство может свободно проникать в места направленного воздействия, например, в опухолевую массу. Таким образом средство воздействует на опухолевые клетки, которые не имеют антигенной детерминанты или не могут интернализировать конъюгат. Кроме того, весь процесс не зависит от интернализации конъюгата.
(а) Методы конъюгирования средств
В настоящем изобретении использовано несколько методов присоединения средств к антителам (содержащим антитела и их фрагменты), при этом двумя типичными методами являются присоединение к углеводным частям антитела или присоединение к сульфгидрильным группам антитела. В определенных вариантах осуществления изобретения такое присоединение существенно не изменяет основные характеристики антитела или самого активируемого антитела, такие как иммуноспецифичность и иммунореактивность. Дополнительными преимуществами таких методов являются простота выполнения реакции и устойчивость полученного конъюгата антитела. В определенных вариантах осуществления изобретения антитело сначала конъюгируют с одним или несколькими представляющими интерес средствами и затем присоединяют маскирующую часть и расщепляемую часть с образованием конъюгата активируемого антитела. В других вариантах осуществления изобретения антитело сначала присоединяют к маскирующей части и расщепляемой части, после чего представляющий интерес средство конъюгируют с антителом, получая при этом конъюгат активируемого антитела.
i. Присоединение к окисленным углеводным частям
В определенных вариантах осуществления изоборетения средства могут быть конъюгированы с углеводной частью антитела. Некоторые углеводные части расположены в Fc-области иммуноглобулина и необходимы для связывания с С1. Углеводная часть Fc-области иммуноглобулина может быть использована в соответствии со схемой, описанной в вариантах осуществления изобретения, где антитело является антителом или фрагментом антитела, содержащим по меньшей мере часть Fc-области. Альтернативно в схеме реакции, рассмотренной в настоящем описании изобретения, могут быть использованы Fab- или Fab'-фрагменты любых иммуноглобулинов, содержащих углеводные части. Примером такого иммуноглобулина является IgM человека, описанный в публикации Putnam et al. (1973, Science 182:287).
Боковые цепи углеводов антител, Fab- или Fab'-фрагментов или других фрагментов, содержащих антитело, могут быть избирательно окислены с образованием альдегидов. Могут быть использованы разные оксиданты, такие как перйодная кислота, параперйодная кислота, метаперйодат натрия и метаперйодат калия. Полученные альдегиды затем могут быть подвергнуты взаимодействию с аминогруппами (например, производными аммиака, такими как первичный амин, вторичный амин, гидроксиламин, гидразин, гидразид, фенилгидразин, семикарбазид или тиосемикарбазид) с образованием шиффова основания или восстановленного шиффова основания (например, имина, энамина, оксима, гидразона, фенилгидразона, семикарбазона, тиосемикарбазона или их восстановленных форм). Химические методы окисления антител описаны в патенте США № 4867973, который полностью включен в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Окисление антител указанными оксидантами может быть выполнено известными методами. Антитело обычно используют для окисления в форме водного раствора, имеющего концентрацию менее 100 мг/мл, предпочтительно 1-20 мг/мл. Кислородсодержащую кислоту или ее соль используют в качестве оксиданта в форме водного раствора, имеющего концентрацию 0,001-10 мМ, иногда 1,0-10 мМ. Количество используемой кислородсодержащей кислоты или ее соли зависит от типа антитела, но обычно такую кислоту используют в избытке, например, в количестве, которое в два-десять раз больше количества окисляемого углевода. Однако оптимальное количество можно определить путем обычного экспериментирования.
Окисление антител кислородсодержащими кислотами или их солями обычно выполняют в оптимальных условиях, содержащих рН около 4-8, температуру от 0°С до 37°С и время реакции от около 15 минут до 12 часов. Реакция окисления кислородсодержащей кислотой или ее солью может быть выполнена при минимальном освещении для предотвращения избыточного окисления.
Альтернативно углеводная часть антитела может быть модифицирована ферментативными методами для присоединения или взаимодействия с другими химическими группами. Одним примером такого фермента является галактозооксидаза, которая окисляет галактозу в присутствии кислорода с образованием альдегида. Окисление углеводной части антител может быть также выполнено с помощью фермента, галактозооксидазы (Cooper et al., 1959, J. Biol. Chem. 234:445-448). Антитело используют в водном растворе, обычно имеющем концентрацию 0,5-20 мг/мл. Фермент обычно используют в количестве около 5-100 единиц на мл раствора при значении рН от около 5,5 до около 8,0. Влияние рН, концентрации субстрата, буферов и концентраций буферов на ферментативную реакцию описано в вышеуказанной публикации Cooper et al.
Конъюгаты антител, конъюгаты активируемых антител или промежуточные соединения антитела с линкером по настоящему изобретению могут быть получены в результате осуществления взаимодействия окисленного антитела с любым линкером или средством, имеющим приемлемую аминогруппу, выбираемую из групп первичного амина, вторичного амина, гидразина, гидразида, гидроксиламина, фенилгидразина, семикарбазида и тиосемикарбазида. В типичном методе раствор окисленного антитела или антитела с линкером в концентрации от около 0,5 до 20 мг/мл смешивают со средством или линкером (молярные отношения реакционноспособной аминогруппы к альдегиду антитела находятся в интервале от около 1 до около 10000) и раствор инкубируют в течение примерно 1-18 часов. Приемлемые температуры находятся в интервале от 0°С до 37°С, и рН может быть равен примерно 6-8. Полученные конъюгаты могут быть необязательно стабилизированы приемлемым восстановителем, таким как цианоборогидрид натрия или борогидрид натрия.
ii. Присоединение к сульфгидрильным группам
Когда антитело является непроцессированным антителом или содержит по меньшей мере часть тяжелой цепи, из сульфидных связей молекулы иммуноглобулина могут быть образованы свободные сульфгидрильные группы. Данный процесс выполняют путем мягкого восстановления антитела. Дисульфидные связи IgG, которые обычно подвержены восстановлению, служат для связывания двух тяжелых цепей. Дисульфидные связи, расположенные рядом с антигенсвязывающей областью, относительно не подвергаются воздействию. Такое восстановление вызывает утрату способности фиксировать комплемент, но не препятствует связыванию антитела с антигеном (Karush et al., 1979, Biochem. 18:2226-2232). Свободные сульфгидрильные группы, образованные внутри области тяжелой цепи, затем могут быть подвергнуты взаимодействию с реакционно-способными группами линкера или средства с образованием ковалентной связи, которая снижает интерференцию антигенсвязывающего центра иммуноглобулина. Такие реакционно-способные группы включают, не ограничиваясь ими, реакционно-способные галогеналкильные группы (содержащие, например, галогенацильные группы), п-меркурибензоатные группы и группы, участвующие в реакциях присоединения Михаэля (содержащие, например, имиды малеиновой кислоты и группы, описанные в публикации Mitra and Lawton, 19979, J. Amer. Chem. Soc. 101:3097-3110). Галогеналкил может быть любой алкильной группой, замещенной бромом, йодом или хлором.
Подробное описание условий, методов и материалов, пригодных для мягкого восстановления антител и фрагментов антител, представлено в публикации Stanworth and Turner, 1973, In Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1, Second Edition, Weir (ed.), Chapter 10, Blackwell Scientific Publications, London, глава из которой включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
Конъюгаты антитела со средством (или промежуточные соединения антитела с линкером), получаемые путем присоединения к свободным сульфгидрильным группам восстановленного иммуноглобулина или восстановленных фрагментов антитела, не активируют комплемент или активируют его на пренебрежимо низком уровне. Таким образом, указанные конъюгаты могут быть использованы в системах in vivo, где расщепление и высвобождение средства является нежелательным (например, ферментом, воздействующим на конкретный субстрат). Такие конъюгаты могут быть также использованы в тех случаях, когда желательно, чтобы высвобождение не было опосредовано комплементом. В таком варианте осуществления изобретения средство может быть связано с сульфгидрильными группами восстановленного антитела с помощью линкеров, подверженных расщеплению ферментами, обладающими протеолитической активностьью, которые включают, не ограничиваясь ими, трипсин, урокиназу, плазмин, активатор плазминогена ткани и тому подобные.
Несмотря на то, что присоединение средства к сульфгидрильным группам антитела, снижает способность конъюгата фиксировать комплемент, такие методы присоединения могут быть использованы для получения конъюгатов активируемых антител, предназначенных для использования в опосредуемой комплементом системе высвобождения. В таком варианте осуществления изобретения средство, присоединенное к линкеру субстрата, чувствительного к комплементу, может быть присоединено к сульфгидрильным группам восстановленных антител или активируемых антител и доставлено к мишени в смеси с неконъюгированными активируемыми антителами, способными активировать комплемент. Такие антитела должны активировать комплемент, который должен отщеплять средство от конъюгата.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения для присоединения к сульфгидрильным группам восстановленных антител или активируемых антител линкеры субстрата или средства модифицируют, присоединяя йодалкильную группу к одному концу линкера. Немодифицированный сайт линкера может или не может быть ковалентно связан со средством. Например, линкеры субстрата, представляющие собой сложный эфир или амид, связанный со средствами, модифицируют путем добавления йодалкильной группы, в результате чего образуется йодалкильное производное. Как было указано выше, линкер может быть подвержен расщеплению или устойчив к расщеплению активированным комплементом, трипсином, плазмином, активатором плазминогена ткани, урокиназой или другим конкретным ферментом, обладающим протеолитической активностью.
(b) Средства, предназначенные для конъюгирования с антителами
Антитела могут быть присоединены к любому средству, которое сохраняет основные свойства после взаимодействия с антителом и позволяет антителу сохранить иммуноспецифичность и иммунореактивность, обеспечивая соответствующее функционирование активируемого антитела. Средство может включать все химические модификации и производные средств, по существу сохраняющие свою биологическую активность.
Средство, к которому желательно присоединить альдегид окисленной углеводной части антитела, должно содержать аминогруппу, выбираемую из групп первичного амина, вторичного амина, гидразина, гидразида, гидроксиламина, фенилгидразина, семикарбазида и тиосемикарбазида. Средство, не содержащее такой аминогруппы, может быть модифицировано с введением приемлемой аминогруппы, пригодной для связывания.
Средство, присоединяемое к антителу для использования в активируемом антителе, выбирают в зависимости от предполагаемого применения (то есть для нейтрализации, предотвращения пролиферации клеток, гормонотерапии или генотерапии). Такие средства могут включать, не ограничиваясь ими, например, фармацевтические средства, токсины, фрагменты токсинов, алкилирующие средства, ферменты, антибиотики, антиметаболиты, антипролиферативные средства, гормоны, нейротрансмиттеры, ДНК, РНК, siРНК, олигонуклеотиды, антисмысловую РНК, аптамеры, диагностические средства, рентгеноконтрастные красители, радиоактивные изотопы, флуорогенные соединения, магнитные метки, наночастицы, маркерные соединения, лектины, соединения, изменяющие проницаемость клеточной мембраны, фотохимические соединения, мелкие молекулы, липосомы, мицеллы, векторы генотерапии, вирусные векторы и тому подобные. В таблице 4 приведены неограничивающие примеры типичных фармацевтических средств, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, причем приведенный список ни в коем случае не является всеобъемлющим. Наконец, могут быть использованы комбинации средств или комбинации средств разных классов.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения в качестве средств могут быть использованы фотохимические вещества, содержащие фотосенсибилизаторы и фототермолитические средства. Эффективные фотосенсибилизаторы включают, не ограничиваясь ими, порфирины и модифицированные порфирины (например, гематопорфирин, дигидразид гематопорфирина, дигидразид дейтеропорфирина и дигидразид протопорфирина), бенгальскую розу, акридины, тиазины, ксантены, антрахиноны, азины, флавин и неметаллсодержащие порфирины, порфириноподобные соединения, метилен синий, эозин, псоралин и тому подобные. Другие фотосенсибилизаторы включают, не ограничиваясь ими, тетрациклины (например, диметилхлортетрациклин), сульфонамиды (например, сульфаниламид), гризеофулвин, фенотиазины (например, хлорпромазин), тиазиды, сульфонилмочевину и многие другие. Фотохимические вещества могут быть сконструированы или синтезированы для поглощения света в определенном диапазоне длин волн. В качестве средств могут быть использованы фототермолитические средства, такие как азур А, которые активируются в месте действия под воздействием источника света (смотрите публикацию Anderson and Parrish, 1983, Science 220:524-527).
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения в качестве средств могут быть использованы ферменты, катализирующие модификацию субстрата с образованием цитотоксических побочных продуктов. Примеры таких ферментов включают, не ограничиваясь ими, глюкозооксидазу, галактозооксидазу, ксантеноксидазу и тому подобные.
Таблица 4
Типичные фармацевтические средства, предназначенные для конъюгирования
Название/класс Связь Производители
I. Антибактериальные средства
Аминогликозиды
Стрептомицин сложный эфир/амид
Неомицин сложный эфир/амид Dow, Lilly, Dome, Pfipharmics
Канамицин сложный эфир/амид Bristol
Амикацин сложный эфир Bristol
Гентамицин сложный эфир/амид Upjohn, Wyeth, Schering
Тобрамицин сложный эфир/амид Lilly
Стрептомицин В сложный эфир/амид Squibb
Спектиномицин сложный эфир Upjohn
Ампициллин амид Squibb, Parke-Davis, Comer, Wyeth, Upjohn, Bristol, SKF
Сульфаниламид амид Merrell-National
Полимиксин амид Burroughs-Wellcome, Dow, Parke-Davis
Хлорамфеникол сложный эфир Parke-Davis
II. Антивирусные средства
Ацикловир Burroughs-Wellcome
Вира А сложный эфир/амид Parke-Davis
Симметрел амид Endo
III. Противогрибковые средства
Нистатин сложный эфир Squibb, Primo, Lederle, Pfizer, Holland-Rantor
IV. Противоопухолевые средства
Адриамицин сложный эфир/амид Adria
Церубидин сложный эфир/амид Ives
Блеомицин сложный эфир/амид Bristol
Алкеран амид Burroughs-Wellcome
Велбан сложный эфир Lilly
Онковин сложный эфир Lilly
Фторурацил сложный эфир Adria, Roche, Herbert
Метотрексат амид Lederle
Тиотепа - Lederle
Бизантрен - Lederle
Новантрон сложный эфир Lederle
Тиогуанин амид Burroughs-Wellcome
Прокарабизин - Hoffman La Roche
Цитарабин - Upjohn
V. Радиофармацевтические средства
125I
131I
99mTc (Технеций)
VI. Тяжелые металлы
Барий
Золото
Платина
VII. Антимикоплазменные средства
Тилозин
Спектиномицин
(с) Линкеры для конъюгирования средств
В настоящем изобретении использовано несколько методов присоединения средств к антителам: (а) присоединение к углеводным частям антитела или (b) присоединение к сульфгидрильным группам антитела. В соответствии с настоящим изобретением антитела могут быть ковалентно связаны со средством при помощи промежуточного линкера, имеющего по меньшей мере две реакционно-способные группы, одна из которых взаимодействует с антителом и другая взаимодействует со средством. Линкер, который может включать любое совместимое органическое соединение, может быть выбран таким образом, чтобы взаимодействие с антителом (или средством) не оказывало вредного влияния на реактивность и избирательность антитела. Кроме того, присоединение линкера к средству не должно отрицательно влиять на активность средства. Приемлемыми линкерами для взаимодействия с окисленными антителами или окисленными фрагментами антител являются линкеры, содержащие амин, выбираемый из групп первичного амина, вторичного амина, гидразина, гидразида, гидроксиламина, фенилгидразина, семикарбазида и тиосемикарбазида. Такие реакционно-способные функциональные группы могут быть частью структуры линкера или могут быть введены в результате приемлемой химической модификации линкеров, не содержащих таких групп.
В соответствии с настоящим изобретением приемлемые линкеры, предназначенные для присоединения восстановленных антител, включают линкеры, имеющие определенные реакционно-способлные группы, которые могут взаимодействовать с сульфгидрильной группой восстановленного антитела или его фрагмента. Такие реакционно-способные группы включают, не ограничиваясь ими, реакционно-способные галогеналкильные группы (содержащие, например, галогенацетильные группы), п-меркурибензоатные группы и группы, используемые в реакциях присоединения Михаэла (содержащие, например, имиды малеиновой кислоты и группы, описанные в публикации Mitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101:3097-3110).
Средство может быть присоединено к линкеру до или после присоединения линкера к антителу. В определенных применениях может быть желательно сначала получить промежуточное соединение антитела с линкером, в котором линкер не связан с ассоциированным средством. В зависимости от конкретного применения затем с линкером может быть ковалентно связано определенное средство. В других вариантах осуществления изобретения антитело сначала присоединяют к маскирующей части, расщепляемой части и ассоциированным линкерам и затем присоединяют к линкеру для конъюгирования.
(i) Линкеры с разветвленной цепью
В конкретных вариантах осуществления изобретения использованы линкеры с разветвленной цепью, которые имеют несколько сайтов для присоединения средств. В случае линкеров с несколькими сайтами ковалентное связывание с антителом позволяет получить промежуточное соединение антитела с линкером, к которому средство может быть присоединено на ряде сайтов. Указанные сайты могут представлять собой альдегидные или сульфгидрильные группы или любой химический сайт, к которому могут быть присоединены средства.
Альтернативно более высокая удельная активность (или более высокое отношение средств к антителу) может быть достигнута в результате присоединения линкера с одним сайтом к нескольким сайтам антитела. Несколько сайтов могут быть введены в антитело двумя методами. Во-первых, можно получить несколько альдегидных групп и/или сульфгидрильных групп в одном антителе. Во-вторых, можно присоединить к альдегидной или сульфгидрильной группе антитела ”линкер с разветвленной цепью”, имеющий несколько функциональных сайтов для последующего присоединения линкеров. Функциональные сайты линкера с разветвленной цепью или линкера с несколькими сайтами могут быть альдегидные или сульфгидрильные группы или любой химический сайт, к которому могут быть присоединены линкеры. Более высокая удельная активность может быть достигнута в результате объединения двух указанных подходов, то есть присоединения линкеров с несколькими сайтами к нескольким сайтам антитела.
(ii) Расщепляемые линкеры
В одном варианте осуществления настоящего изобретения могут быть использованы пептидные линкеры, расщепляемые ферментами системы комплемента, которые включают, не ограничиваясь ими, урокиназу, активатор плазминогена ткани, трипсин, плазмин или другой фермент, обладающий протеолитической активностью. В соответствии с одним способом по настоящему изобретению средство присоединяют с помощью линкера, расщепляемого комплементом. Антитело выбирают из класса, способного активировать комплемент. Таким образом, конъюгат антитела со средством активирует путь активации комплемента и высвобождает средство в месте направленного воздействия. В соответствии с другим способом по настоящему изобретению средство присоединяют с помощью линкера, расщепляемого ферментами, обладающими протеолитической активностью, такими как урокиназа, активатор плазминогена ткани, плазмин или трипсин. Неограничивающие примеры расщепляемых линкерных последовательностей приведены в таблице 5.
Таблица 5
Типичные линкерные последовательности, предназначенные для конъюгирования
Типы расщепляемых последовательностей Аминокислотная последовательность
Последовательности, расщепляемые плазмином
Проурокиназа PRFKIIGG
PRFRIIGG
TGFβ SSRHRRALD
Плазминоген RKSSIIIRMRDVVL
Стафилокиназа SSSFDKGKYKKGDDA
SSSFDKGKYKRGDDA
Расщепляемые последовательности фактора Ха IEGR
IDGR
GGSIDGR
ММР-расщепляемые последовательности
Желатиназа А PLGLWA
Последовательности, расщепляемые коллагеназой
Коллаген кожи теленка (α1(I) цепь) GPQGIAGQ
Коллаген кожи теленка (α2(I) цепь) GPQGLLGA
Коллаген хряща быка (α1(II) цепь) GIAGQ
Коллаген печени человека (α(III) цепь) GPLGIAGI
α2М человека GPEGLRVG
PZP человека YGAGLGVV
AGLGVVER
AGLGISST
α1М крысы EPQALAMS
QALAMSAI
α2М крысы AAYHLVSQ
MDAFLESS
α1I3(2J) крысы ESLPVVAV
α1I3(27J) крысы SAPAVESE
Коллагеназа фибробластов человека (автолитическое расщепление) DVAQFVLT
VAQFVLTE
AQFVLTEG
PVQPIGPQ
Кроме того, средства могут быть присоединены к антителу при помощи дисульфидных связей (например, дисульфидных связей молекулы цистеина). Так как многие опухоли в естественных условиях высвобождают глутатион (восстановитель) в больших количествах, глутатион может восстанавливать дисульфидные связи с последующим высвобождением средства в месте доставки. В определенных вариантах осуществления изобретения восстановитель, модифицирующий расщепляемую часть, должен также модифицировать линкер конъюгированного активируемого антитела.
(iii) Спейсеры и расщепляемые элементы
В другом варианте осуществления изобретения может быть необходимо создать линкер, оптимизирующий пространство между средством и антителом активируемого антитела. Указанная цель может быть достигнута в результате использования линкера общей формулы:
W-(CH2)n-Q
где:
W означает -NH-CH2- или -СН2-;
Q означает аминокислоту, пептид; и
n является целым числом от 0 до 20.
В других вариантах осуществления изобретения линкер может включать спейсерный элемент и расщепляемый элемент. Спейсерный элемент позволяет расположить расщепляемый элемент в стороне от ядра антитела, в результате чего расщепляемый элемент является более доступным для расщепляющего фермента. В качестве спейсерных элементов могут быть использованы определенные вышеописанные линкеры с разветвленной цепью.
Следует отметить, что присоединение линкера к средству (спейсерного элемента к расщепляемому элементу или расщепляемого элемента к средству) необязательно должно быть выполнено путем присоединения или взаимодействия. Любая реакция, позволяющая получить продукт с приемлемой устойчивостью и биологической совместимостью, является приемлемой.
(iv) Сывороточный комплемент и выбор линкеров
В соответствии с одним способом по настоящему изобретению, когда желательно высвобождение средства, используют антитело, относящееся к классу антител, способных активировать комплемент. Полученный конъюгат сохраняет способность связываться с антигеном и активировать путь активации комплемента. Таким образом, в соответствии с данным вариантом осуществления настоящего изобретения средство присоединяют к одному концу расщепляемого линкера или расщепляемого элемента и другой конец линкерной группы присоединяют к определенному сайту антитела. Например, средство, имеющее гидроксильную группу или аминогруппу, может быть присоединено к карбоксильному концу пептида, аминокислоте или другому выбранному линкеру при помощи соответственно сложноэфирной или амидной связи. Например, такие средства могут быть присоединены к линкерному пептиду при помощи реакции образования карбодиимида. Если средство содержит функциональные группы, мешающие присоединению к линкеру, такие интерферирующие функциональные группы могут быть блокированы до присоединения и разблокированы сразу же после получения конъюгата продукта или промежуточного соединения. Противоположный конец или аминоконец линкера затем используют в том виде как есть или после дополнительной модификации для связывания с антителом, способным активировать комплемент.
Линкеры (или спейсерные элементы линкеров) могут иметь любую требуемую длину, при этом один конец линкера может быть ковалентно присоединен к определенным сайтам антитела активируемого антитела. Другой конец линкера или спейсерного элемента может быть присоединен к аминокислотному или пептидному линкеру.
Таким образом, при связывании конъюгатов с антигеном в присутствии комплемента амидная или сложноэфирная связь, присоединяющая средство к линкеру, расщепляется с высвобождением средства в активной форме. Указанные конъюгаты при введении субъекту обеспечивают доставку и высвобождение средства в месте направленного воздействия и позволяют особенно эффективно доставлять in vivo фармацевтические средства, антибиотики, антиметаболиты, антипролиферативные средства и подобные средства, приведенные в таблице 4, но не ограничивающиеся ими.
(v) Линкеры для высвобождения средства без активации комплемента
В другом применении, относящемся к направленной доставке, желательно высвобождение средства без активации комплемента, так как активация пути активации комплемента в конечном счете может лизировать клетку-мишень. Поэтому указанный подход приемлем, когда доставку и высвобождение средства необходимо выполнить без лизиса клетки-мишени. Такую цель ставят при доставке в клетки-мишени клеточных медиаторов, таких как гормоны, ферменты, кортикостероиды, нейротрансмиттеры, гены или ферменты. Указанные конъюгаты могут быть получены путем присоединения средства к антителу, не способному активировать комплемент при помощи линкера, который может быть расщеплен сывороточными протеазами. При введении конъюгата субъекту быстро образуются комплексы антиген-антитело, при этом расщепление средства происходит медленно, в результате чего соединение высвобождается в месте направленного воздействия.
(vi) Биохимические кросс-линкеры
В других вариантах осуществления изобретения активируемое антитело может быть конъюгировано с одним или несколькими терапевтическими средствами при помощи определенных биохимических кросс-линкеров. Перекрестносшивающие реагенты образуют молекулярные мостики, связывающие функциональные группы двух разных молекул. Для поэтапного связывания двух разных белков могут быть использованы бифункциональные кросс-линкеры, которые устраняют образование нежелательного гомополимера. Типичные гетеробифункциональные кросс-линкеры приведены в таблице 6.
Таблица 6
Типичные гетеробифункциональные кросс-линкеры
Гетеробифункциональные кросс-линкеры
Линкер Взаимодействие Преимущества и применения Длина спейсера после перекрестного сшивания
SMPT Первичные амины Сульфгидрилы Большая устойчивость 11,2 А
SPDP Первичные амины Сульфгидрилы Получение тиолата Расщепляемое перекрестное сшивание 6,8 А
LC-SPDP Первичные амины Сульфгидрилы Удлиненный спейсер 15,6 А
Сульфо-LC-SPDP Первичные амины Сульфгидрилы Удлиненный спейсер Водорастворимый 15,6 А
SMCC Первичные амины Сульфгидрилы Устойчивая реакционно-способная группа имида малеиновой кислоты Конъюгирование антитела с ферментом Конъюгирование белка-носителя с гаптеном 11,6 А
Сульфо-SMCC Первичные амины Сульфгидрилы Устойчивая реакционно-способная группа имида малеиновой кислоты Водорастворимый Конъюгирование антитела с ферментом 11,6 А
MBS Первичные амины Сульфгидрилы Конъюгирование антитела с ферментом Конъюгирование белка-носителя с гаптеном 9,9 А
Сульфо-MBS Первичные амины Сульфгидрилы Водорастворимый 9,9 А
SIAB Первичные амины Сульфгидрилы Конъюгирование антитела с ферментом 10,6 А
Сульфо-SIAB Первичные амины Сульфгидрилы Водорастворимый 10,6 А
SMPB Первичные амины Сульфгидрилы Удлиненный спейсер Конъюгирование антитела с ферментом 14,5 А
Сульфо-SMPB Первичные амины Сульфгидрилы Удлиненный спейсер Водорастворимый 14,5 А
EDE/сульфо-NHS Первичные амины Карбоксильные группы Конъюгирование носителя с гаптеном 0
ABH Углеводы Неизбирательное Взаимодействует с сахарными группами 11,9 А
(vii) Нерасщепляемые линкеры или прямое присоединение
В других вариантах осуществления настоящего изобретения может быть сконструирован конъюгат, который доставляет средство к мишени, но не высвобождает. Такая цель может быть достигнута в результате прямого присоединения средства к антителу или при помощи нерасщепляемого линкера.
Указанные нерасщепляемые линкеры могут включать аминокислоты, пептиды, D-аминокислоты и другие органические соединения, которые могут быть модифицированы с включением функциональных групп, которые затем могут быть использованы для присоединения к антителам методами, рассмотренными в настоящем описании изобретения. Такие органические линкеры могут иметь общую формулу:
W-(CH2)n-Q
где W означает -NH-CH2- или -СН2-;
Q означает аминокислоту, пептид; и
n является целым числом от 0 до 20.
(viii) Нерасщепляемые конъюгаты
Альтернативно соединение может быть присоединено к антителам, которые не активируют комплемент. При использовании антител, не способных активировать комплемент, присоединение может быть выполнено при помощи линкеров, расщепляемых активированным комплементом, или при помощи линкеров, которые не расщепляются активированным комплементом.
(d) Применения конъюгатов активируемых антител
Конъюгаты активируемых антител со средством (AACJ) по настоящему изобретению могут быть использованы в терапии, диагностике, для модификации субстрата и в подобных применениях.
Конъюгаты активируемых антител по настоящему изобретению могут быть использованы в разных терапевтических применениях in vivo, которые включают, не ограничиваясь ими, лечение новообразований, содержащих рак, аденомы и гиперплазии; определенные иммунологические нарушения, содержащие аутоиммунные заболевания, реакции ”трансплантат против хозяина” (например, после трансплантации костного мозга), иммуносупрессорные заболевания, например, после трансплантации почки или костного мозга. Лечение таких клеточных нарушений, содержащий, например, трансплантацию костного мозга, может включать удаление (путем лизиса) нежелательных клеток, например, злокачественных клеток или зрелых Т-лимфоцитов.
Терапевтические применения обычно сфокусированы на лечении разных клеточных нарушений, содержащих вышеописанные нарушения, путем введения эффективного количества конъюгатов антитела со средством по настоящему изобретению. Такие свойства антитела, как иммуноспецифичность и иммунореактивность в отношении определенного антигена, делают его идеально пригодным для доставки средств к определенным клеткам, тканям, органам или любому другому месту, где находится указанный антиген.
В соответствии с данным объектом изобретения функцией конъюгата активируемого антитела является доставка конъюгата к месту направленного воздействия.
Выбор антител, линкеров и средств, используемых для получения конъюгатов активируемых антител, зависит от цели доставки. Доставка и высвобождение или активация средств в конкретных местах направленного воздействия может вызвать избирательный лизис или ингибирование пролиферации опухолевых клеток, раковых клеток, грибов, бактерий, паразитов или вирусов. Может быть также осуществлена направленная доставка в выбранные места гормонов, ферментов или нейротрансмиттеров. Кроме того, способ по настоящему изобретению может найти применение в программах генотерапии, в соответствии с которыми может быть произведена доставка ДНК или специфических генов in vivo или in vitro к клеткам-мишеням, в которых отсутствует данный конкретный ген. Конъюгаты могут быть также использованы для уменьшения или предотвращения активации онкогенов, таких как myc, ras и тому подобные.
При введении in vivo могут быть использованы средства конъюгатов активируемых антител в любом приемлемом адъюванте, содержащем сыворотку или физиологический раствор, вместе с другим белком или без другого белка, такого как сывороточный альбумин человека. Квалифицированный специалист может легко определить дозу конъюгатов, которая может быть различной в зависимости от характера клеточного нарушения и используемого средства. Способ введения может быть парентеральным, при этом внутривенное введение обычно является более предпочтительным.
(i) Модификация субстрата
В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения активация субстрата средства может быть использована для опосредования образования синглетного кислорода или пероксидов и лизиса клеток. В данном конкретном варианте осуществления изобретения средство является ферментом. Например, галактозооксидаза окисляет галактозу и некоторые производные галактозы в положении С6. В ходе реакции окисления молекулярный кислород превращается в пероксид водорода, который является токсичным для соседних клеток. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения может быть также использован фермент глюкозооксидаза, флавофермент. Указанный фермент является высокоспецифичным к β-D-глюкозе и может действовать в качестве антибиотика благодаря образованию пероксида. Указанный фермент может быть присоединен непосредственно к антителу или при помощи нерасщепляемого линкера. Субъекту вводят эффективную дозу указанного конъюгата активируемого антитела и затем вводят субстрат. Лизис клеток опосредован образованием пероксидов методами, рассмотренными в настоящем описании изобретения. Токсический эффект пероксидов может быть усилен путем введения второго фермента, предпочтительно человеческого происхождения, для превращения пероксида в более токсичную гипохлористую кислоту. Примеры приемлемых ферментов включают, не ограничиваясь ими, миелопероксидазу, лактопероксидазу и хлорпероксидазу.
Методы отображения и композиции для идентификации и/или оптимизации активируемых антител
Ниже описаны методы идентификации и оптимизации активируемых антител, а также композиции, используемые при выполнении таких методов.
(а) Библиотеки активируемых антител и активируемых антител-кандидатов, отображаемых на реплицируемых биологических частицах
Как правило, методы скрининга с целью идентификации и/или оптимизации активируемого антитела для получения переключаемого фенотипа могут включать конструирование библиотеки реплицируемых биологических частиц, отображающих на своей поверхности множество разных активируемых антител-кандидатов. Такие библиотеки затем подвергают скринингу для идентификации активируемых антител-кандидатов, имеющих одну или несколько требуемых характеристик.
Библиотеки активируемых антител-кандидатов могут содержать активируемые антитела-кандидаты, отличающиеся одним или несколькими признаками, такими как маскирующая часть, линкер (который может быть частью маскирующей части), расщепляемая часть (которая может быть частью маскирующей части) и антитело. В одном варианте осуществления изобретения активируемые антитела в библиотеке отличаются маскирующей частью и/или линкером при сохранении антитела и расщепляемой части. В активируемом антителе, содержащем пару остатков цистеина для образования дисульфидной связи, может быть изменено относительное положение остатков цистеина.
Библиотека, предназначенная для скрининга, обычно является библиотекой реплицируемых биологических частиц, отображающих на своей поверхности разные активируемые антитела-кандидаты. Например, библиотека активируемых антител-кандидатов может включать множество активируемых антител-кандидатов, отображаемых на поверхности популяции реплицируемых биологических частиц, при этом каждый член указанного множества активируемых антител-кандидатов содержит: (а) антитело или его фрагмент (АВ); (b) расщепляемую часть (СМ); и (с) маскирующую часть-кандидата (ММ-кандидат), при этом антитело, расщепляемая часть и маскирующая часть-кандидат расположены с возможностью определения способности маскирующей части-кандидата ингибировать связывание антитела с мишенью в нерасщепленном состоянии и обеспечивать связывание антитела с мишенью в расщепленном состоянии. Приемлемые реплицируемые биологические частицы включают клетки (например, бактерии (такие как E. coli), дрожжи (например, S. cerevesiae), клетки простейших, клетки млекопитающих, бактериофаг и вирусы. В данной области хорошо известны методы отображения антител.
(b) Отображение активируемых антител-кандидатов на поверхности реплицируемых биологических частиц
В данной области известны разные методы отображения с использованием реплицируемых биологических частиц. Указанные методы включают, не ограничиваясь ими, методы отображения на мРНК и рибосомах, отображение на эукариотических вирусах и отображение на поверхности бактерий, дрожжей и клеток млекопитающих. Смотрите публикации Wilson, D. S., et al. 2001 PNAS USA 98(7):3750-3755; Muller, O. J., et al. (2003) Nat. Biotechnol. 3:312; Bupp, K. and M. J. Roth (2002) Mol. Ther. 5(3):329 3513; Georgiou, G., et al., (1997) Nat. Biotechnol. 15(1):29 3414; and Boder, E. T. and K. D. Wittrup (1997) Nature Biotech. 15(6):553 557. Методы отображения на поверхности привлекательны тем, что позволяют использовать клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции (FACS) для анализа и скрининга библиотеки. Смотрите публикации Daugherty, P. S., et al. (2000) J. Immuunol. Methods 243(1 2):211 2716; Georgiou, G. (2000) Adv. Protein Chem. 55:293 315; Daugherty, P. S., et al. (2000) PNAS USA 97(5):2029 3418; Olsen, M. J., et al. (2003) Methods Mol. Biol. 230:329 342; Boder, E. T. et al. (2000) PNAS USA 97(20): 10701 10705; Mattheakis, L. C., et al. (1994) PNAS USA 91(19): 9022 9026; и Shusta, E. V., et al. (1999) Curr. Opin. Biotech. 10(2):117 122. Дополнительные методы отображения, которые могут быть использованы для идентификации пептида, способного связываться с представляющей интерес биологической мишенью, описаны в патенте США № 7256038, который включен в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
Отображающим остовом является полипептид, который, будучи экспрессированным в клетке-хозяине, отображается на доступной внеклеточной поверхности клетки-хозяина и обеспечивает представление функционально связанного гетерологичного полипептида. Например, отображающие остовы находят применение в способах по настоящему изобретению для облегчения скрининга активируемых антител-кандидатов. Можно получить отображающие остовы, позволяющие легко выделить представляющий интерес гетерологичный полипептид, например, под воздействием протеазы, которая облегчает расщепление гибридного белка и выделение активируемого антитела-кандидата из отображаемого остова.
Отображение на фаге позволяет локализовать пептиды в виде концевых гибридов с белками оболочки, например, pIII, pIIV частиц бактериофага. Смотрите публикации Scott, J.K. and G.P. Smith (1990) Science 249(4967):386-390; и Lowman, H.B., et al. (1991) Biochem. 30(45):10832-10838. Полипептиды со специфической функцией связывания обычно выделяют путем инкубации с мишенью, вымывания несвязывающего фага, элюирования связанного фага и повторной амплификации популяции фага путем инфицирования новой культуры бактерий.
Типичные композиции и методы отображения на фаге и клетке описаны в патентах США №№ 5223409, 5403484, 7118159, 6979538, 7208293, 5571698 и 5837500.
Дополнительные типичные отображающие остовы и методы их применения описаны в публикации заявки на патент США № 2007/0065158, опубликованной 22 марта 2007 года.
Отображающий остов может необязательно включать сайт расщепления протеазой (отличающийся от сайта расщепления протеазой расщепляемой части), позволяющий выделить активируемое антитело или активируемое антитело-кандидат с поверхности клетки-хозяина.
В одном варианте осуществления изобретения, в котором реплицируемой биологической частицей является бактериальная клетка, приемлемые отображающие остовы включают подвергнутый циклической перестановке белок наружной мембраны OmpX (CPX) Escherichia coli, описанный в публикации Rice et al., Protein Sci. (2006) 15: 825-836. Смотрите также патент США № 7256038, выданный 14 августа 2007 года.
(с) Конструкции, кодирующие активируемые антитела
Настоящее изобретение дополнительно относится к конструкциям нуклеиновых кислот, которые включают последовательности, кодирующие активируемые антитела и/или активируемые антитела-кандидаты. Приемлемые конструкции нуклеиновых кислот включают, не ограничиваясь ими, конструкции, которые могут быть экспрессированы в прокариотической или эукариотической клетке. Экспрессирующие конструкции обычно выбирают с учетом их совместимости с клеткой-хозяином, используемой для их экспрессии.
Например, могут быть получены и использованы невирусные и/или вирусные конструкции векторов, содержащих плазмиды, которые обеспечивают репликацию ДНК, кодирующей активируемое антитело или активируемое антитело-кандидат, и/или экспрессию в клетке-хозяине. Выбор вектора зависит от типа клетки, предназначенной для размножения, и цели размножения. Определенные конструкции пригодны для амплификации и получения требуемой последовательности ДНК в больших количествах. Другие векторы пригодны для экспрессии в клетках в культуре. Выбор соответствующего вектора хорошо известен в данной области. Многие такие векторы можно приобрести коммерческим путем. Указанные конструкции могут быть созданы методами, хорошо известными в данной области.
Для экспрессии в клетке-хозяине полинуклеотид, кодирующий активируемое антитело или антивируемое антитело-кандидат, функционально связывают с регуляторной последовательностью, облегчающей достижение требуемых свойств в процессе экспрессии. Указанные регуляторные последовательности могут включать промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры, сайленсеры, индукторы и 3'- или 5'-концевые UTR. Экспрессирующие конструкции обычно также содержат область инициации транскрипции и трансляции, которая может быть индуцибельной или конститутивной, при этом кодирующую область функционально связывают под транскрипционным контролем области инициации транскрипции и области терминации транскрипции и трансляции. Указанные контролирующие области могут быть нативными для вида, из которого получают нуклеиновую кислоту, или могут быть получены из экзогенных источников.
Промоторы могут быть конститутивными или регулируемыми. В некоторых случаях может быть желательно использовать условно активные промоторы, такие как индуцибельные промоторы, например, промоторы, чувствительные к температуре. Индуцибельными элементами являются элементы последовательности ДНК, которые действуют совместно с промоторами и могут быть связаны с репрессорами (например, система репрессоров lacO/LAC Iq в E. coli) или индукторами (например, система индукторов gal1/GAL4 в дрожжах). В таких случаях транскрипция фактически прекращается до тех пор, пока промотор не будет вновь активирован или индуцирован, после чего транскрипция возобновляется.
Конструкции, в том числе экспрессирующие конструкции, могут также включать селектируемый маркер, облегчающий, например, рост клеток-хозяев, содержащих представляющую интерес конструкцию. Гены таких селективных маркеров могут содержать фенотипический признак, позволяющий выбрать трансформированные клетки-хозяева, такой как устойчивость к дигидрофолат-редуктазе или неомицину для культуры эукариотических клеток.
Экспрессирующие конструкции могут включать сайты рестрикции для введения и удаления последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих активируемое антитело и/или активируемое антитело-кандидат. Альтернативно или дополнительно экспрессирующие конструкции могут включать фланкирующие последовательности, которые могут служить в качестве основы для праймеров, облегчая амплификацию нуклеиновой кислоты (например, амплификацию на основе ПЦР) представляющей интерес последовательности, кодирующей активируемое антитело.
Вышеописанные экспрессирующие системы могут быть использованы в прокариотических или эукариотических клетках стандартными методами в зависимости от цели экспрессии. В некоторых вариантах осуществления изобретения в качестве экспрессирующих клеток-хозяев могут быть использованы одноклеточные организмы, такие как E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомых в комбинации с векторами на основе бакуловируса или клетки высших организмов, таких как позвоночные, например, клетки COS 7, HEK 293, CHO, ооциты Xenopus и т.д. В данной области известны экспрессирующие системы для каждого из указанных классов и типов клеток-хозяев.
(d) Методы конструирования библиотек активируемых антител/активируемых антител-кандидатов, отображаемых на реплицируемых биологических частицах
В настоящем описании изобретения представлены методы конструирования библиотек активируемых антител и/или активируемых антител-кандидатов по настоящему изобретению.
В одном варианте осуществления изобретения метод конструирования библиотеки активируемых антител и/или библиотеки активируемых антител-кандидатов содержит: (а) конструирование совокупности векторов на основе рекомбинантной ДНК по настоящему изобретению, кодирующих множество активируемых антител и/или активируемых антител-кандидатов; (b) трансформацию клеток-хозяев векторами, полученными на стадии (а); и (с) культивирование клеток-хозяев, трансформированных на стадии (b), в условиях, приемлемых для экспрессии и отображения гибридных полипептидов.
(е) Получение последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих активируемые антитела-кандидаты
Активируемые антитела-кандидаты, предназначенные для использования в методах скрининга, могут быть получены методами, известными в данной области. В данной области хорошо известны такие методы как отображение полипептида, отображение одноцепочечного антитела, отображение антитела и отображение фрагмента антитела. Как правило, для рандомизации выбирают элемент активируемого антитела, например, маскирующую часть, который изменяется в библиотеке активируемых антител-кандидатов. Активируемые антитела-кандидаты в библиотеке могут быть полностью рандомизированы или смещены, например, с изменением повторяемости нуклеотидов/остатков или положения аминокислот в элементе.
Методы скрининга активируемых антител
Настоящее изобретение относится к методам идентификации активируемых антител, которые могут быть ферментативно активируемыми антителами, активируемыми антителами, восприимчивыми к восстановителю, или активируемыми антителами, которые активируются ферментами или восстановителями либо теми и другими вместе. Указанные методы обычно включают контактирование множества активируемых антител-кандидатов с мишенью, способной связывать антитело активируемых антител, и протеазой, способной расщеплять расщепляемую часть активируемых антител, отбор первой популяции членов указанного множества, которые связываются с мишенью под воздействием протеазы, контактирование указанной первой популяции с мишенью при отсутствии протеазы и отбор второй популяции членов из указанной первой популяции путем удаления из первой популяции членов, которые связываются с мишенью при отсутствии протеазы, таким образом указанный метод позволяет отобрать активируемые антитела-кандидаты, характеризующиеся более низким связыванием с мишенью при отсутствии протеазы по сравнению со связыванием с мишенью в присутствии протеазы.
Указанный метод скрининга активируемых антител-кандидатов, имеющих требуемый переключаемый фенотип, обычно выполняют на стадии позитивного скрининга (для идентификации членов, связывающихся с мишенью после воздействия протеазы) и на стадии негативного скрининга (для идентификации членов, которые не связываются с мишенью без воздействия протеазой). Стадия негативного скрининга может быть выполнена, например, путем удаления из популяции членов, которые связываются с мишенью при отсутствии протеазы. Следует отметить, что выполнение методов скрининга библиотеки, рассмотренных в настоящем описании изобретения, может быть начато с негативного скрининга для отбора кандидатов, которые не связываются с меченой мишенью при отсутствии фермента (то есть не связываются с меченой мишенью в нерасщепленном состоянии), с последующим выполнением позитивного скрининга (то есть обработка ферментом и отбор членов, которые связываются с меченой мишенью в расщепленном состоянии). Однако для удобства метод скрининга описан ниже с выполнением позитивного отбора в качестве первой стадии.
Стадии позитивного и негативного скрининга обычно выполняют при помощи проточной цитометрии для отбора активируемых антител-кандидатов на основе связывания с детектируемой меченой мишенью. Один цикл процедуры скрининга содержит как стадию позитивного скрининга, так и стадию негативного скрининга. Указанные методы могут быть повторно выполнены для скрининга библиотеки, что позволяет увеличить число циклов (включая полные или неполные циклы, например, 1,5 цикла, 2,5 цикла и т.д.). Таким образом, в полученной популяции может быть увеличено число активируемых антител-кандидитов, обладающих переключаемыми характеристиками.
Как правило, методы скрининга выполняют после конструирования библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих множество активируемых антител-кандидатов в отображающем остове, который в свою очередь помещают для экспрессии на поверхность реплицируемой биологической частицы. В используемом здесь значении множество активируемых антител-кандидатов представляет собой множество полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, кодирующие активируемые антитела-кандидаты, при этом у членов указанного множества изменена аминокислотная последовательность по меньшей мере одного из компонентов активируемого антитела, например, изменена аминокислотная последовательность маскирующей части, расщепляемой части или антитела, обычно маскирующей части.
Например, антитело и расщепляемая часть в активируемых антителах-кандидатах остаются постоянными и в библиотеке активируемых антител-кандидатов изменяется аминокислотная последовательность маскирующей части. В соответствии с другим примером может быть создана библиотека, содержащая активируемые антитела-кандидаты, содержащие маскирующую часть, в которой остаток цистеина расположен с возможностью образования дисульфидной связи с другим остатком цистеина в активируемом антителе-кандидате (при этом другие остатки, выбираемые для конструирования маскирующей части, имеют аминокислотную последовательность, которая в противном случае полностью или по меньшей мере частично рандомизирована). В соответствии с другим примером может быть создана библиотека, содержащая активируемые антитела-кандидаты, в которых маскирующая часть содержит полностью рандомизированную аминокислотную последовательность. Такие библиотеки могут содержать активируемые антитела-кандидаты, сконструированные с учетом одного или нескольких указанных критериев. Производя скрининг членов указанного множества описанными методами, можно идентифицировать члены, которые содержат маскирующие части-кандидаты, имеющие требуемый переключаемый фенотип.
В одном варианте осуществления изобретения, относящемся к указанным методам, каждый член множества активируемых антител-кандидатов отображен на поверхности реплицируемой биологической частицы (представленной здесь бактериальными клетками). Члены множества подвергают воздействию протеазы, способной расщеплять расщепляемую часть активируемых антител-кандидатов, и осуществляют контактирование с мишенью, которая является партнером связывания антитела активируемых антител-кандидатов. Бактериальные клетки, отображающие членов, содержащих антитела, которые связываются с мишенью после воздействия протеазы, идентифицируют и/или отделяют, обнаруживая связывание с мишенью (например, обнаружение комплекса антитело-мишень). Члены, содержащие антитела, связывающиеся с мишенью после воздействия протеазы (в результате чего происходит расщепление расщепляемой части), затем вводят в соприкосновение с мишенью при отсутствии протеазы. Бактериальные клетки, отображающие членов, содержащих антитела, которые характеризуются пониженным или необнаруживаемым связыванием с мишенью при отсутствии расщепления, идентифицируют и/или отделяют, обнаруживая клетки с отсутствием связанной мишени. Таким образом идентифицируют и/или отбирают членов множества активируемых антител-кандидатов, которые связываются с мишенью в расщепленном состоянии и характеризуются пониженным или необнаруживаемым связыванием с мишенью в нерасщепленном состоянии.
Как было отмечено выше, библиотеки активируемых антител-кандидатов могут быть сконструированы для скрининга одного или нескольких признаков конструкций активируемых антител, например, для оптимизации переключаемого фенотипа в отношении одного или нескольких элементов, таких как маскирующая часть, расщепляемая часть и антитело. Для облегчения оптимизации может быть изменен один или несколько других элементов активируемого антитела. Например, может быть изменена маскирующая часть, включая изменение числа или положения остатков цистеина или других остатков, которые могут определять другие характеристики конформации активируемого антитела при отсутствии расщепляющего средства (например, фермента); может быть изменена расщепляемая часть для идентификации субстрата, оптимизированного в отношении одной или нескольких требуемых характеристик (например, специфичность расщепления ферментом и тому подобных); и/или может быть изменено антитело для оптимизации переключаемого связывания с мишенью.
Элементы в библиотеке активируемых антител-кандидатов обычно выбирают в соответствии с представляющим интерес белком-мишенью, при этом активируемое антитело должно быть активировано для более сильного связывания с мишенью в присутствии расщепляющего средства (например, фермента), который расщепляет ращепляемую часть. Например, при постоянных значениях расщепляемой части и антитела в членах библиотеки расщепляемую часть выбирают с возможностью расщепления расщепляющим средством (например, ферментом), находящимся вместе с представляющей интерес мишенью, которая является партнером связывания антитела. Таким образом можно выбрать активируемое антитело, которое избирательно активируется в соответствующих биологических условиях и в соответствующей биологической локализации. Например, если необходимо создать активируемое антитело, предназначенное для использования в качестве соединения против ангиогенеза и характеризующееся переключаемым фенотипом в отношении связывания с VEGF, расщепляемую часть активируемого антитела-кандидата выбирают в качестве субстрата для фермента и/или восстановителя, присутствующего в данной области вместе с VEGF (например, расщепляемая часть, расщепляемая металлопротеазой матрикса). В качестве другого примера можно привести конструирование активируемого антитела, предназначенного для использования в качестве соединения против ангиогенеза и характеризующегося переключаемым фенотипом в отношении связывания с рецептором Notch, связывания с лигандом Jagged или связывания с EGFR, когда расщепляемую часть активируемого антитела-кандидата выбирают в качестве субстрата для фермента и/или восстановителя, находящегося вместе с рецептором Notch, лигандом Jagged или EGFR (например, расщепляемая часть, расщепляемая uPA или плазмином).
Как было указано выше, антитело обычно выбирают в соответствии с представляющей интерес мишенью. В данной области известны многие мишени. Представляющие интерес биологические мишени включают белки-мишени, которые, как было установлено, опосредуют заболевание. Такие мишени включают, не ограничиваясь ими, рецепторы на поверхности клетки и секретируемые связывающие белки (например, факторы роста), растворимые ферменты, структурные белки (например, коллаген, фибронектин), внутриклеточные мишени и тому подобные. Типичные мишени, не ограничивающие объем изобретения, приведены в таблице 1, но специалисты в данной области могут легко определить другие приемлемые мишени. Кроме того, в данной области известны многие поротеазы, присутствующие вместе с представляющими интерес мишенями. Поэтому специалисты в данной области могут легко определить соответствующие ферменты и субстраты для ферментов, используемые при выполнении вышеописанных методов.
(а) Оптимальное увеличение отображения на поверхности клетки до скрининга активируемых антител
До выполнения скрининга может быть желательно увеличить число клеток, экспрессирующих соответствующий отображающий пептидный остов на поверхности клетки. Оптимальное увеличение числа клеток позволяет удалить из библиотеки клетки, которые (1) не экспрессируют отображающие пептидные остовы на наружной мембране клетки или (2) экспрессируют нефункциональные отображающие пептидные остовы на наружной мембране клетки. Нефункциональные отображающие пептидные остовы плохо отображают активируемое антитело-кандидат, например, в результате наличия терминирующего кодона или мутации делеции.
Число клеток можно увеличить путем выращивания популяции клеток и индуцирования экспрессии отображающих пептидных остовов. Затем клетки сортируют, например, на основании обнаружения детектируемого сигнала или части, входящей в остов, меченого антитела, которое связывается с общей частью отображающего остова или активируемого антитела. Указанные методы более подробно описаны в публикации заявки на патент США № 2007/0065158, опубликованной 22 марта 2007 года.
(b) Скрининг связывания с мишенью расщепленных активируемых антител
До скрининга библиотеку активируемых антител-кандидатов можно увеличить (например, путем выращивания в приемлемой среде в культуре в приемлемых условиях). После оптимального увеличения или в качестве первой стадии библиотеку подвергают первому скринингу для идентификации активируемых антител-кандидатов, которые связываются с мишенью после воздействия протеазы. Указанная стадия часто определяется как стадия позитивного отбора.
Для идентификации членов, которые связываются с мишенью после расщепления протеазой, библиотеку активируемых антител-кандидатов вводят в соприкосновение с протеазой, способной расщеплять расщепляемую часть отображаемых активируемых антител-кандидатов в течение достаточного периода времени и в условиях, приемлемых для расщепления субстратом протеазы расщепляемой части. Специалисты в данной области могут легко оценить разные комбинации протеазы-расщепляемой части, в которых протеаза является ферментом, способным расщеплять расщепляемую часть и присутствующим in vivo вместе с представляющей интерес мишенью (которая является партнером связывания антитела). Например, ферменты, приемлемые для представляющей интерес мишени, ассоциированной с солидной опухолью, (например, VEGF) включают металлопротеазы матрикса (например, ММР-2), дезинтегрин и металлопротеазы (ADAM)/ADAM с тромбоспондинподобными фрагментами (ADAMTS), катепсины и калликреины. В данной области известны аминокислотные последовательности субстратов, используемых в качестве расщепляемых частей и активируемых антителах, которые при желании могут быть подвергнуты скринингу для идентификации оптимальных последовательностей, пригодных для использования в качестве расщепляемой части, путем адаптации методов, рассмотренных в настоящем описании изобретения. Типичные субстраты могут включать, не ограничиваясь ими, субстраты, расщепляемые ферментами, указанными в таблице 3.
Библиотеку активируемых антител-кандидатов также подвергают воздействию мишени в течение достаточного периода времени и в условиях, приемлемых для связывания с мишенью, которые выбирают в соответствии с условиями, в которых предполагается связывание мишени с антителом. Библиотека активируемых антител-кандидатов может быть подвергнута воздействию протеазы до контактирования с мишенью (например, для получения популяции активируемых антител-кандидатов, содержащей расщепленные активируемые антитела) или одновременно с контактированием с мишенью, причем последний способ является лучшей моделью ожидаемой ситуации in vivo, в которой протеаза и мишень будут присутствовать в одной окружающей среде. После воздействия протеазы и мишени библиотеку подвергают скринингу для отбора членов со связанными мишенями, которые включают активируемые антитела-кандидаты в комплексе антитело-мишень.
Активируемые антитела-кандидаты со связанными мишенями могут быть обнаружены разными способами. Например, мишень может иметь детектируемую метку, и первая популяция связанных с мишенью активируемых антител-кандидатов может быть отобрана в результате обнаружения детектируемой метки для конструирования второй популяции со связанной мишенью (например, позитивный отбор связанных с мишенью активируемых антител-кандидатов).
(с) Скрининг активируемых антител-кандидатов, которые не связываются с мишенью без расщепления протеазой
Популяция активируемых антител-кандидатов, отобранных на основании связывания с мишенью после воздействия протеазы, может быть увеличена (например, путем выращивания в приемлемой среде в культуре в приемлемых условиях), после чего увеличенную библиотеку подвергают второму скринингу для идентификации членов, характеризующихся пониженным или не обнаруживаемым связыванием с мишенью при отсутствии воздействия протеазы. Популяция, полученная в результате второго скрининга, будет включать активируемые антитела-кандидаты, которые, не будучи расщепленными, не связываются с мишенью в значительной степени или на обнаруживаемом уровне. Поэтому указанная стадия часто определяется как стадия негативного отбора.
Популяцию, полученную в результате первого скрининга, вводят в соприкосновение с мишенью при отсутствии протеазы в течение достаточного периода времени и в условиях, приемлемых для связывания с мишенью, которые могут быть выбраны в соответствии с условиями, в которых ожидается связывание мишени с антителом. Затем выполняют негативный отбор для идентификации активируемых антител-кандидатов с относительно низким связыванием с мишенью, включая антитела, которые не связываются с мишенью на детектируемом уровне. Указанный отбор может быть выполнен с использованием мишени, меченной детектируемой меткой, и анализа популяции, подвергнутой воздействию мишени, методом проточной цитометрии для выделения субпопуляции клеток, отображающих активируемые антитела-кандидаты, не связывающихся с мишенью на детектируемом уровне и/или образующих относительно более низкий детектируемый сигнал. Таким образом, указанная субпопуляция содержит клетки, отображающие активируемые антитела-кандидаты, которые характеризуются пониженным или необнаруживаемым связыванием с мишенью при отсутствии расщепления.
(d) Детектируемые метки
Термины ”детектируемая метка” и “детектируемая часть” имеют взаимозаменяемые значения и означают молекулу, подлежащую обнаружению, которая содержит, не ограничиваясь ими, радиоактивные изотопы, флуоресцентные вещества, хемилюминесцентные вещества, хромофоры, ферменты, субстраты для ферментов, кофакторы ферментов, ингибиторы ферментов, красители, ионы металлов, золи металлов, лиганды (например, биотин, авидин, стрептавидин или гаптены) и тому подобные. Термин ”флуоресцентное вещество” означает вещество или его часть, способные флуоресцировать в детектируемом диапазоне. Типичные детектируемые части, пригодные для использования в качестве меток мишеней, включают аффинные метки и флуоресцентные белки.
Термин ”аффинная метка” означает сегмент пептида, который может быть присоединен к мишени, которая может быть обнаружена с помощью молекулы, связывающейся с аффинной меткой и подающей детектируемый сигнал (например, флуоресцентное соединение или белок). В качестве аффинной метки в принципе может быть использован любой пептид или белок, для которого существует антитело или другой специфический связывающее средство. Типичные аффинные метки, пригодные для использования, включают, не ограничиваясь ими, пептид, связывающийся с моноцитарным адапторным белком (MONA), Т7-связывающий пептид, стрептавидинсвязывающий пептид, полигистидин, белок А (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991)), глутатион-S-трансферазу (Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988), аффинную метку Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)), вещество Р, пептид FLAG (Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988)) или другую антигенную детерминанту или домен связывания. Смотрите публикацию Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991). Молекулы ДНК, кодирующие аффинные метки, можно приобрести у коммерческих поставщиков (таких как, например, Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.).
Любой флуоресцентный полипептид (определяемый также в настоящем описании изобретения как флуоресцентная метка), хорошо известный в данной области, может быть использован в качестве детектируемой части или с аффинной меткой отображающих пептидных остовов, рассмотренных в настоящем описании изобретения. Приемлемым флуоресцентным полипептидом является полипептид, который может быть экспрессирован в требуемой клетке-хозяине, такой как бактериальная клетка или клетка млекопитающего, и может подавать детектируемый сигнал, пригодный для оценки в качественном отношении (положительный/отрицательный) и количественном отношении (сравнительная степень флуоресценции). Типичные флуоресцентные полипептиды включают, не ограничиваясь ими, желтый флуоресцентный белок (YFP), голубой флуоресцентный белок (CFP), GFP, mRFP, RFP (tdimer2), HCRED и т.д. или любой мутант (например, флуоресцентные белки, модифицированные с достижением более высокой флуоресценции или сдвинутого эмиссионного спектра), аналог или его производное. В данной области хорошо известны другие приемлемые флуоресцентные полипептиды, а также конкретные примеры флуоресцентных полипептидов, представленных в настоящем описании изобретения.
В способах по настоящему изобретению могут быть также использованы метки на основе биотина. Биотинилирование молекул мишени и субстратов хорошо известно, например, известно большое число биотинилирующих средств, включая средства, взимодействующие с амином и тиолом, предназначенных для биотинилирования белков, нуклеиновых кислот, углеводов, карбоновых кислот; смотрите, например, главу 4 публикации Molecular Probes Catalog, Haugland, 6th Ed. 1996, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Биотинилированный субстрат может быть обнаружен в результате связывания с партнером связывания меченого биотина, таким как авидин или стрептавидин. Аналогичным образом известно большое число гаптенилирующих реагентов.
(е) Методы скрининга
Может быть использован любой приемлемый метод, позволяющий отделить и выделить активируемые антитела. Например, клетку, отображающую представляющее интерес активируемое антитело, можно отделить при помощи FACS, иммунохроматографии, или, в том случае, когда детектируемая метка является магнитной, путем магнитного разделения. В результате такого разделения популяция содержит много клеток, обладающих требуемым признаком, например, клеток, связывающихся с мишенью после расщепления либо слабо связывающихся или не связывающихся с мишенью на детектируемом уровне при отсутствии расщепления.
Например, активируемые антитела-кандидаты, связанные на обнаруживаемом уровне с меченой мишенью, можно отобрать разными методами, известными в данной области. Например, меченые активируемые антитела-кандидаты можно отделить от немеченных активируемых антител-кандидатов при помощи проточной цитометрии (например, FACS®). Методы проточной цитометрии могут соответствовать более или менее строгим требованиям, предъявляемым к разделению популяции активируемых антител-кандидатов, например, в результате изменения установки дискриминационного окна для выделения матированных или более светлых популяций клеток во вторую популяцию для дальнейшего скрининга.
В другом примере для отделения связанных с мишенью активируемых антител-кандидатов от антител, не связанных с мишенью, может быть использована иммуноаффинная хроматография. Например, подложка (такая как колонка, магнитные шарики), содержащая связанное антитело против мишени, может быть введена в соприкосновение с активируемыми антителами-кандидатами, подвергнутыми воздействию протеазы и мишени. Активируемые антитела-кандидаты, содержащие связанную мишень, связываются с антителом против мишени, облегчая, таким образом, отделение от активируемых антител-кандидатов, не имеющих связанной мишени. Если целью скрининга является получение популяции с большим содержанием нерасщепленных активируемых антител-кандидатов, которые характеризуются относительно более низким связыванием с мишенью или отсутствием детектируемого связывания с мишенью (например, по сравнению с другими активируемыми антителами-кандидатами), то в представляющую интерес субпопуляцию входят члены, у которых отсутствует или имеется относительно слабый детектируемый сигнал связанной мишени. Например, при выполнении такого негативного отбора с помощью иммуноаффинного анализа на основании связанной мишени представляющей интерес субпопуляцией является субпопуляция, не связанная подложкой против мишени.
(f) Скрининг активируемых антител, связывающихся с двумя мишенями
Методы скрининга, представленные в настоящем описании изобретения, могут быть легко адаптированы для идентификации активируемых антител, содержащих два антитела, связывающихся с двумя мишенями. Как правило, указанный метод содержит конструирование библиотеки, содержащей множество активируемых антител-кандидатов, в которой каждый член указанного множества содержит первое антитело, второе антитело, первую расщепляемую часть и/или вторую расщепляемую часть, первую маскирующую часть и/или вторую маскирующую часть. Указанную библиотеку вводят в соприкосновение с мишенью, способной связываться по меньшей мере с первым антителом, и расщепляющим средством, способным расщеплять первую расщепляемую часть. Первую популяцию членов библиотеки отбирают на основании связывания с мишенью в присутствии расщепляющего средства (например, протеазы для расщепляемой части). Отобранную популяцию затем подвергают описанному выше негативному скринингу, при выполнении которого оценивают связывание мишени с членами библиотеки при отсутствии расщепляющего средства. Вторую популяцию членов получают, удаляя субпопуляцию членов, связывающихся с указанной мишенью при отсутствии расщепляющего средства. Указанная цель может быть достигнута, например, путем отделения членов, не связанных с мишенью, от членов, связанных с мишенью, путем обнаружения меченой мишени. Таким образом, указанный метод позволяет отобрать активируемые антитела-кандидаты, характеризующиеся более низким связыванием с мишенью при отсутствии расщепляющего средства по сравнению со связыванием с указанной мишенью в присутствии расщепляющего средства. Указанный метод может быть повторен для обеих мишеней.
Типичные варианты методов скрининга для отбора активируемых антител-кандидатов
Вышеуказанные методы могут быть модифицированы для отбора популяций и членов библиотеки, обладающих требуемыми характеристиками.
(а) Определение эффективности маскировки маскирующих частей
Эффективность маскировки маскирующих частей определяют на основании по меньшей мере двух параметров: сродство маскирующей части к антителу или его фрагменту и пространственное отношение маскирующей части к области связывания антитела с мишенью.
Что касается сродства, то в качестве примера можно отметить, что маскирующая часть может обладать высоким сродством, но лишь частично ингибировать сайт связывания антитела, в то время как другая маскирующая часть может обладать более низким сродством к антителу, но полностью ингибировать связывание с мишенью. В течение коротких периодов времени маскирующая часть с более низким сродством может обеспечивать достаточную маскировку, но с течением времени такая маскирующая часть может быть замещена мишенью (из-за недостаточного сродства к антителу).
Аналогичным образом две маскирующие части с одинаковым сродством могут демонстрировать разную степень маскировки в заисимости от того, насколько хорошо они ингибируют сайт связывания антитела или предотвращают связывание антитела с мишенью. В другом примере маскирующая часть с высоким сродством может связываться с антителом и изменять его структуру, в результате чего связывание с мишенью будет полностью ингибировано, в то время как другая маскирующая часть с высоким сродством может лишь частично ингибировать связывание. Вследствие этого обнаружение эффективной маскирующей части не может быть основано только на сродстве, а может включать эмпирическое измерение эффективности маскировки. Для оптимизации выбора маскирующих частей можно измерить замещение маскирующей части мишенью в активируемом антителе в зависимости от времени. Для достижения данной цели в настоящем описании изобретения рассмотрен новый анализ замещения мишенью (TDA).
Анализ TDA, который может быть использован для обнаружения и подтверждения эффективности маскированных активируемых антител, содержит эмпирическое определение эффективности маскировки путем сравнения способности маскированного антитела связываться с мишенью со способностью немаскированного и/или исходного антитела связываться с мишенью. Эффективность связывания может быть выражена в процентах равновесного связывания по сравнению со связыванием немаскированного/исходного антитела. Когда антитело модифицировано маскирующей частью и находится в присутствии мишени, специфическое связывание антитела с мишенью может быть снижено или подавлено по сравнению со специфическим связыванием антитела, не модифицированного маскирующей частью, или исходного антитела. При сравнении связывания с мишенью антитела, не модифицированного маскирующей частью, или исходного антитела, способность связываться с мишенью антитела, модифицированного маскирующей частью, может быть уменьшена по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и даже на 100% в течение по меньшей мере 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 96 часов, 5, 10, 154, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 дней или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев или больше при измерении in vivo или при помощи иммуноадсорбционного анализа замещения мишенью in vitro, описанного в настоящем описании изобретения.
(b) Итеративный скрининг для идентификации и/или оптимизации элементов активируемого антитела
Методы скрининга и библиотеки активируемых антител-кандидатов могут быть легко адаптированы для идентификации и/или оптимизации одного или нескольких элементов активируемого антитела. Например, могут быть получены активируемые антитела-кандидаты, в которых изменен один или несколько элементов, таких как антитело, расщепляемая часть, линкеры и тому подобные, и исследованы с помощью методов скрининга, рассмотренных в настоящем описании изобретения.
(с) Антитела, активируемые восстановителем
Несмотря на то, что вышеописанные методы скрининга предназначены для идентификации активируемых антител, следует отметить, что активируемое антитело или активируемое антитело-кандидат, содержащее расщепляемую часть, которая может облегчить образование дисульфидной связи между остатками цистеина в активируемом антителе, также может быть исследовано с помощью методов скрининга, рассмотренных в настоящем описании изобретения. Такие активируемые антитела могут включать или не включать расщепляемую часть (которая может быть такой же или другой расщепляемой частью), которая может быть или не быть субстратом для протеазы. В указанных вариантах осуществления изобретения вышеописанный позитивный скрининг может быть выполнен при использовании восстановителя (например, в восстановительных условиях), воздействующего на активируемое антитело или активируемое антитело-кандидат, который может расщеплять дисульфидную связь пары остатков цистеина активируемого антитела. Негативный скрининг затем может быть выполнен при отсутствии восстанавливающих условий. Таким образом, полученная библиотека может быть обогащена активируемыми антителами, которые активируются под воздействием условий, восстанавливающих дисульфидную связь.
(d) Фотоактивируемые антитела
Несмотря на то, что вышеописанные методы скрининга предназначены для идентификации активируемых антител, следует отметить, что активируемое антитело или активируемое антитело-кандидат, которое содержит фоточувствительную расщепляемую часть и может быть активировано фотолизом, также может быть исследовано с помощью указанных методов скрининга. В таких вариантах осуществления изобретения вышеописанный позитивный скрининг активируемого антитела или активируемого антитела-кандидата может быть выполнен под воздействием света. Негативный скрининг затем может быть выполнен при отсутствии света. Таким образом, библиотека может быть обогащена антителами, активируемыми под воздействием света.
(е) Число циклов и скрининг активируемых антител без использования остова
Увеличивая число циклов в вышеуказанных методах, можно идентифицировать популяции и членов библиотек, обладающих лучшими характеристиками переключения. Может быть выполнено любое число циклов скрининга.
Кроме того, отдельные клоны активируемых антител-кандидатов могут быть выделены и подвергнуты скринингу для определения динамического диапазона активируемого антитела-кандидата. Активируемые антитела-кандидаты могут быть также исследованы в отношении требуемого переключаемого фенотипа отдельно от остова, то есть активируемое антитело-кандидат может быть экспрессировано или сконструировано отдельно от отображающего остова и переключаемый фенотип активируемого антитела-кандидата может быть оценен при отсутствии остова и при желании в бесклеточной системе (например, при использовании солюбилизованного активируемого антитела).
(f) Оптимизация компонентов и переключающей активности активируемого антитела
Вышеуказанные методы могут быть модифицированы для оптимизации продуктивности активируемого антитела, например, активируемого антитела, идентифицированного при выполнении вышеописанного метода скрининга. Например, если желательно оптимизировать продуктивность маскирующей части, например, обеспечить лучшее ингибирование связывания с мишенью антитела в нерасщепленном состоянии, аминокислотные последовательности антитела и расщепляемой части могут быть оставлены без изменения в библиотеке активируемых антител-кандидатов, а маскирующая часть может быть изменена, в результате чего члены библиотеки будут иметь разные маскирующие части. Маскирующая часть может быть оптимизирована разными способами, включая изменение числа и/или типа аминокислот, образующих маскирующую часть. Например, каждый член множества активируемых антител-кандидатов может включать маскирующую часть-кандидата, содержащую по меньшей мере один аминокислотный остаток цистеина, при этом остальные аминокислотные остатки будут различными у членов множества. В соответствии с другим примером каждый член множества активируемых антител-кандидатов может включать маскирующую часть-кандидата, содержащую аминокислотный остаток цистеина и произвольную последовательность аминокислотных остатков, например, произвольную последовательности, состоящую из 5 аминокислот.
(g) Отбор активируемых антител с увеличенным динамическим диапазоном
Как было указано выше, интерес также представляют активируемые антитела, имеющие требуемый динамический диапазон в отношении связывания мишени в немаскированном/расщепленном состоянии по сравнению с маскированным/нерасщепленным состоянием. Такими активируемыми антителами являются, например, антитела, у которых отсутствует связывание в присутствии мишени на физиологических уровнях, имеющих место в разных областях тела субъекта, подвергаемых и не подвергаемых лечению, но которые после расщепления протеазой демонстрируют высокое сродство и/или высокую авидность связывания с мишенью. Чем больше динамический диапазон активируемого антитела, тем лучше переключаемый фенотип активируемого антитела. Таким образом, активируемые антитела могут быть оптимизированы с целью отбора антител с увеличенным динамическим диапазоном связывания с мишенью в присутствии или отсутствии расщепляющего средства.
Вышеуказанные методы скрининга могут быть модифицированы с целью лучшего отбора активируемых антител, обладающих требуемым и/или оптимизированным динамическим диапазоном. Как правило, указанная цель может быть достигнута путем изменения концентраций мишени, используемых на стадиях позитивного и негативного отбора, при этом скрининг связывания с мишенью активируемых антител, подвергнутых воздействию протеазы (то есть скрининг популяции, содержащей расщепленные активируемые антитела), выполняют при относительно более низкой концентрации мишени по сравнению со скринингом связывания с мишенью нерасщепленных активируемых антител. Поэтому концентрация мишени изменяется на разных стадиях с целью конструирования избирательного давления на переключаемый фенотип. При желании разница в концентрациях мишени, используемых на стадиях позитивного и негативного отбора, может быть увеличена при увеличении числа циклов.
Использование относительно более низкой концентрации мишени на стадии позитивного отбора может усиливать отбор тех членов активируемых антител, которые характеризуются лучшим связыванием с мишенью в расщепленном состоянии. Например, скрининг активируемых антител, подвергнутых воздействию протеазы, может быть выполнен при концентрации мишени, которая примерно в 2-100 раз меньше, примерно в 2-50 раз меньше, примерно в 2-20 раз меньше, примерно в 2-10 раз меньше или примерно в 2-5 раз меньше, чем Kd взаимодействия антитела с мишенью. В результате этого после отбора популяции активируемых антител, связанных с мишенью, отобранная популяция будет обогащена активируемыми антителами, обладающими более высоким сродством и/или авидностью связывания по сравнению с другими активируемыми антителами в популяции.
Использование относительно более высокой концентрации мишени на стадии негативного отбора может стимулировать отбор членов активируемых антител с пониженным или не обнаруживаемым связыванием с мишенью в нерасщепленном состоянии. Например, скрининг активируемых антител, которые не были подвергнуты воздействию протеазы (на стадии негативного отбора), может быть выполнен при концентрации мишени, которая примерно в 2-100 раз больше, примерно в 2-50 раз больше, примерно в 2-20 раз больше, примерно в 2-10 раз больше или примерно в 2-5 раз больше, чем Kd взаимодействия антитела с мишенью. В результате этого после отбора популяции активируемых антител, не связывающихся с мишенью на детектируемом уровне, отобранная популяция будет обогащена активируемыми антителами, демонстрирующими более низкое связывание с мишенью в нерасщепленном состоянии, по сравнению с другими нерасщепленными активируемыми антителами в популяции. Другими словами, после отбора популяции активируемых антител, которые на связываются с мишенью на детектируемом уровне, отобранная популяция будет обогащена активируемыми антителами, у которых ингибировано связывание антитела с мишенью, например, благодаря маскировке антитела, препятствующей связыванию с мишенью.
Когда активируемое антитело является активируемым антителом, связывающимся с двумя мишенями, вышеописанный метод скрининга может быть адаптирован для получения активируемых антител с требуемым динамическим диапазоном в отношении первой мишени, которая может связываться с первым антителом, и в отношении второй мишени, которая может связываться со вторым антителом. Связывание мишени с антителом, находящимся в отщепленной части активируемого антитела, представленного на отображающем остове, можно определить, оценивая образование комплексов антитело-мишень в растворе (таком, как культуральная среда), например, при помощи иммунохроматографии с использованием антитела против фрагмента активируемого антитела, захватывающего отщепленный фрагмент, с последующим обнаружением связанной, меченой мишени на колонке.
(h) Тестирование растворимых активируемых антител
Активируемые антитела-кандидаты могут быть тестированы в отношении способности сохранять переключаемый фенотип в растворимой форме. Один такой метод содержит иммобилизацию мишени на подложке (на матрице, например, на поверхности сенсорного чипа СМ5 Biacore™). Представляющая интерес мишень можеть быть иммобилизована любым приемлемым методом (например, с помощью стандартного связывания с амином). Поверхность подложки может быть блокирована для уменьшения неспецифического связывания. Указанный метод может необязательно включать использование контрольного образца (например, подложки, не содержащей иммобилизованной мишени (например, для оценки фонового связывания с подложкой) и/или соединения, служащего в качестве негативного контрольного образца (например, для оценки специфичности связывания активируемого антитела-кандидата с мишенью по сравнению с веществом, не являющимся мишенью).
После иммобилизации мишени путем ковалентного связывания активируемое антитело-кандидат вводят в контакт с подложкой в условиях, делающих возможным специфическое связывание с иммобилизованной мишенью. Активируемое антитело-кандидат может контактировать с иммобилизованной на подложке мишенью в присутствии или отсутствии приемлемого расщепляющего средства для оценки переключаемого фенотипа. Оценка связывания активируемого антитела-кандидата в присутствии расщепляющего средства по сравнению с отсутствием расщепляющего средства и необязательно по сравнению со связыванием негативного контрольного образца позволяет определить реакцию связывания, которая в свою очередь является показателем переключаемого фенотипа.
(i) Скрининг отдельных частей, предназначенных для использования в активируемых антителах-кандидатах
Может быть желательно отдельно исследовать одну или несколько частей активируемого антитела-кандидата, например, антитело, маскирующую часть или расщепляемую часть, до тестирования активируемого антитела-кандидата в отношении переключаемого фенотипа. Например, известные методы идентификации пептидных субстратов, расщепляемых определенными протеазами, могут быть использованы для идентификации расщепляемых частей, предназначенных для использования в антителах, активируемых такими протеазами. Кроме того, существуют разные методы идентификации пептидных последовательностей, связывающихся с представляющей интерес мишенью. Такие методы могут быть использованы, например, для идентификации антител, связывающихся с определенной мишенью, или для идентификации маскирующей части, связывающейся с определенным антителом.
Вышеуказанные методы включают, например, такие методы, в которых часть активируемого антитела-кандидата, например, антитело, маскирующая часть или расщепляемая часть, может быть отображена с использованием реплицируемой биологической частицы.
(j) Автоматизированные методы скрининга
В определенных вариантах осуществления изобретения методы скрининга, рассмотренные в настоящем описании изобретения, могут быть автоматизированы с конструированием удобных, высокопроизводительных методов скрининга библиотеки активируемых антител в отношении требуемой переключаемой активности, выполняемых в реальном времени. Автоматизированные методы могут быть предназначены для выполнения итеративных циклов позитивного и негативного отбора, при этом отобранные популяции разделяются и автоматически подвергаются следующему скринингу на протяжении требуемого числа циклов.
Может быть произведена итеративная оценка активируемых антител в популяции на протяжении определенного периода времени с последующим выполнением стадии позитивного отбора, стадии негативного отбора или обеих стадий. Кроме того, информация, относящаяся к среднему динамическому диапазону популяции активируемых антител-кандидатов при выбранных концентрациях мишени на стадиях позитивного и негативного отбора может быть отслежена и сохранена для дальнейшего анализа, например, для оценки влияния разных концентраций мишени.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выполняемая платформа, такая как программное обеспечение компьютера, может контролировать операцию обнаружения и/или измерения и может выполнять числовые операции, относящиеся к вышеописанным стадиям, и предоставлять требуемые выходные данные (например, анализа методом проточной цитометрии и т.д.). Компьютерная программа содержит считываемую комьютером запоминающую среду, имеющую считываемый компьютером программный код, встроенный в среду. Аппаратное обеспечение, необходимое для использования в таком автоматизированном устройстве, должно быть известно специалистам в данной области и может включать компьютерные контроллеры, автоматизированные манипуляторы образцом, средства измерения флуоресценции, принтеры и системы оптического вывода. Измерительное устройство может включать один или несколько фотодетекторов для измерения сигналов флуоресценции образцов, в которых использованы молекулы, обнаруживаемые флуоресцентными методами. Измерительное устройство может также включать управляемый компьютером шаговый двигатель, с помощью которого все контрольные и/или испытуемые образцы могут быть расположены в определенном порядке и автоматически и повторно установлены напротив фотодетектора на стадии измерения интенсивности флуоресценции.
Измерительное устройство (например, FACS) может быть функционально соединено со стандартным или специализированным компьютерным контроллером. Указанный контроллер может включать компьютерную программу, управляющую работой измерительного устройства и выполняющую числовые операции, относящиеся к вышеуказанным стадиям. Контроллер может принимать данные настройки и другие данные в виде файла, ввода на диске или шине данных. Дисплей и принтер также могут быть использованы для визуального отображения операций, выполняемых компьютером. Специалистам в данной области должно быть понятно, что функции, выполняемые контроллером, могут быть выполнены полностью или частично в виде модулей программного обеспечения, выполняемого в компьютерной системе общего назначения. Альтернативно для выполнения вышеописанных функций и операций может быть использована специализированная автономная система с интегральными схемами прикладной ориентации.
Методы использования активируемых антител в терапии
Активируемые антитела могут быть включены в фармацевтические композиции, содержащие, например, терапевтически эффективное количество представляющего интерес активируемого антитела и носитель, который является фармацевтически приемлемым наполнителем (определяемым также как фармацевтически приемлемый носитель). В данной области известны многие фармацевтически приемлемые наполнители, которые выбирают в зависимости от способа введения, подвергаемого лечению заболевания и других переменных параметров, хорошо известных в данной области. Фармацевтически приемлемые наполнители всесторонне описаны в разных публикациях, содержащих, например, A. Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition. Lippincott, Willliams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds. 3th ed. Amer. Pharmaceutical Assoc. Фармацевтические композиции могут также включать другие компоненты, такие как средства, регулирующие рН, и буферы, средства, регулирующие тоничность, стабилизаторы, смачивающие вещества и тому подобные. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция, содержащая активируемое антитело, заключена в наночастицы или липосомы.
Приемлемые компоненты для фармацевтических композиций, содержащих активируемые антитела, могут быть определены на основании фармацевтичесаких композиций, существующих для антитела в активируемом антителе. Например, если активируемое антитело содержит антитело к EGFR, TNFальфа, CD11a, CSFR, CTLA-4, EpCAM, VEGF, CD40, CD20, Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4, Jagged 1, Jagged 2, CD52, MUC1, IGF1R, трансферрину, gp130, VCAM-1, CD44, DLL4 или IL4, то фармацевтический препарат, содержащий такие активируемые антитела, может быть получен в соответствии с методами получения композиций, пригодных для использования с указанным антителом.
Как правило, фармацевтичесекие препараты, содержащие одно или несколько активируемых антител и предназначенные для хранения, получают путем смешивания активируемого антитела с требуемой степенью чистоты с необязательными физиологически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington's Pharmaceurical Sciences, 16th editiuon, Osol, A. Ed. (1980)) в форме лиофилизованных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, содержащие аскорбиновую кислоты и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид безалкония; хлорид бензетония; фениловый, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярный (менее примерно 10 остатков) полипептид; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислолты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, содержащие глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразователи, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как твин™, плюроник™ или полиэтиленгликоль (PEG).
Препараты, предназначенные для введения in vivo, должны быть стерильными. Препараты стерилизуют, фильтруя через стерильные фильтрующие мембраны. Фармацевтические препараты могут также содержать несколько активных соединений, необходимых для лечения конкретного заболевания, при этом дополнительные активные соединения содержат активные вещества, комплементарные активируемому антителу. Такие соединения присутствуют в комбинации в количествах, обеспечивающих эффективное воздействие.
Фармацевтический препарат может быть получен в разных лекарственных формах, предназначенных для системного введения или местных инъекций. Компоненты могут находиться в носителе, таком как микрокапсула, полученная методами коацервации или межфазной полимеризации, например, соответственно в виде гидроксиметилцеллюлозной или желатиновой микрокапсулы и полиметилметакрилатной микрокапсулы, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в виде макроэмульсий. Такие методы описаны в публикации Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Препараты, содержащие активируемые антитела, также могут быть препаратами пролонгированного действия. Типичные препараты пролонгированного действия могут включать полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие активируемое антитело, которые представляют собой формованные изделия, например, пленки или микрокапсулы. Примеры матриц пролонгированного действия включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли-2-гидроксиэтилметакрилат или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразрушаемый этиленвинилацетат, разрушаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. Если полимеры, такие как этиленвинилацетат и сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты высвобождают молекулы в течение более 100 дней, то определенные гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени.
Инкапсулированные активируемые антитела, остающиеся в организме в течение длительного времени, могут денатурировать или агрегировать под воздействием влаги при физиологической температуре (~37°С), в результате чего снижается биологическая активность и изменяется иммуногенность. Препараты могут быть стабилизированы соответствующими методами в зависимости от используемого механизма. Например, если механизм агрегации вызывает образование нежелательных межмолекулярных S-S связей в результате взаимообмена тиоэфирных и дисульфидных связей, препарат может быть стабилизирован путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации кислых растворов, контролирования влаги, использования соответствующих добавок и конструирования специальных композиций полимерной матрицы.
Активируемые антитела могут быть конъюгированы для направленной доставки активного средства, используемого в лечебных целях. Например, активируемые антитела могут быть конъюгированы с наночастицами или липосомами, содержащие инкапсулированные или ассоциированные лекарственные средства. Таким образом может быть достигнута направленная доставка лекарственного средства. В данной области хорошо известны методы связывания полипептидов с липосомами, которые могут быть использованы для связывания активируемых антител с липосомами для направленной и/или избирательной доставки содержимого липосом. В качестве примера можно отметить, что полипептиды могут быть ковалентно связаны с липосомами при помощи простых тиоэфирных связей. Наночастицы из пегилированного желатина и пегилированные липосомы также могут быть использованы в качестве носителя для присоединения полипептидов, например, одноцепочечных антител. Смотрите, например, публикацию Immordino et al., (2006) Int. J. Nanomedicine. September; 1(3):297-315, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки благодаря описанию методов конъюгирования полипептидов, например, фрагментов антител, с липосомами.
(а) Способы лечения
Активируемые антитела по настоящему изобретению могут быть использованы в способах лечения соответствующих субъектов благодаря комбинации расщепляемой части и антитела в активируемом антителе. Активируемое антитело может быть введено любым приемлемым способом, содержащим пероральное, парентеральное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное и интраназальное введение, и при желании в виде местной инъекции (например, в место локализации солидной опухоли). Способы парентерального введения включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение.
Термин ”локализация лечения” или “локализация заболевания” означает место, в котором активируемое антитело должно быть активировано, например, место, в котором вместе находятся мишень для одного или обоих антител в активируемом антителе и расщепляющее средство, способное расщеплять расщепляемую часть в активируемом антителе, изображенные на фиг.2. Локализация лечения содержит ткани, доступные для местного введения (например, инъекции, вливания (например, с помощью катетера) и т.д.) или системного введения (например, введение в место, удаленное от места локализации лечения). Места локализации лечения включают биологически ограниченные места (например, орган, капсулу опухоли, локализацию опухоли и тому подобные).
Соответствующая доза активируемого антитела зависит от типа заболевания, подвергаемого лечению, тяжести и течения заболевания, клинической истории субъекта и реакции на активируемое антитело, а также от решения лечащего врача. Активируемые антитела могут быть введены субъекту однократно или многократно. Активируемые антитела могут быть введены наряду с другими видами лечения, другими фармацевтическими средствами и тому подобными.
В зависимости от типа и тяжести заболевания активируемое антитело может быть введено субъекту в качестве начальной дозы, равной примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг), в виде одного или нескольких отдельных введений либо в виде непрерывного вливания. Типичная суточная доза может составлять от около 1 мкг/кг до 100 мг/кг или больше в зависимости от факторов, указанных в настоящем описании изобретения. В случае повторного введения в течение нескольких дней или более продолжительного периода времени в зависимости от заболевания лечение продолжают до достижения требуемого ослабления симптомов заболевания. Однако могут быть использованы другие схемы введения.
Композиция активируемого антитела должна быть получена, дозирована и введена в соответствии с хорошей медицинской практикой. Факторы, принимаемые во внимание в данной связи, включают конкретное заболевание, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подвергаемое лечение, клиническое состояние субъекта, этиологический фактор заболевания, место доставки активируемого антитела, способ введения, график введения и другие факторы, известные лечащим врачам. Терапевтически эффективное количество вводимого активируемого антитела, определяемое с учетом таких факторов, представляет собой минимальное количество, необходимое для предотвращения, уменьшения интенсивности симптомов или лечения заболевания или нарушения.
Облегчение или лечение заболевания или нарушения обычно предполагает уменьшение одного или нескольких симптомов заболевания или медицинских проблем, связанных с данным заболеванием или нарушением. Например, в случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может обеспечивать достижение одной или комбинации следующих целей: уменьшение числа раковых клеток; уменьшение размера опухоли; ингибирование (то есть уменьшение в некоторой степени и/или прекращение) инфильтрации раковых клеток в периферические органы; ингибирование метастазов опухоли; ингибирование в некоторой степени роста опухоли и/или уменьшение в некоторой степени интенсивности одного или нескольких симптомов, обусловленных раком. В некоторых вариантах осуществления изоборетения композиция по настоящему изобретению может быть использована для предотвращения возникновения или рецидива заболевания или нарушения у субъекта или млекопитающего.
Активируемые антитела могут быть использованы в комбинации (например, в одном препарате или в разных препаратах) с одним или несколькими дополнительными лекарственными средствами или методами лечения (комбинированная терапия). Активируемое антитело может быть введено в смеси с другим лекарственным средством или в отдельном препарате. Лекарственные средства и/или методы лечения, используемые в комбинации с активируемым антителом и выбираемые в зависимости от подлежащего лечению заболевания, включают хирургическую операцию (например, хирургическое удаление раковой ткани), лучевую терапию, трансплантацию костного мозга, химиотерапевтическое лечение, определенные комбинации вышеуказанных методов и тому подобные.
(b) Использование активируемых антител в больной ткани по сравнению со здоровой тканью
Активируемые антитела по настоящему изобретению, локализованные в здоровой ткани, характеризуются слабой активацией или ее отсутствием, при этом антитело остается в ”маскированном” состоянии и незначительно связывается или не связывается с мишенью. Однако в больной ткани в присутствии специфичной для заболевания протеазы, например, способной расщеплять расщепляемую часть в активируемом антителе, антитело утрачивает маскировку и может специфически связываться с мишенью.
Термин “здоровая ткань” означает ткань, которая продуцирует незначительное количество или не продуцирует специфичный для заболевания средство, способное специфически расщеплять или каким-либо другим образом модифицировать расщепляемую часть в активируемом антителе, например, специфичную для заболевания протеазу, специфичный для заболевания фермент или специфичный для заболевания восстановитель. Термин ”больная ткань” означает ткань, которая продуцирует специфичный для заболевания средство, способное специфически расщеплять или каким-либо другим образом модифицировать расщепляемую часть в активируемом антителе, например, специфичную для заболевания протеазу, специфичный для заболевания фермент или специфичный для заболевания восстановитель.
(с) Использование активируемых антител в больной ткани на разных стадиях заболевания
В некоторых вариантах осуществления изобретения активируемые антитела по настоящему изобретения связаны с несколькими расщепляемыми частями. Такое активируемое антитело может быть активировано на разных стадиях заболевания или активировано в разных компартментах больной ткани. В качестве примера можно отметить, что антитело, связанное с ММР-9-расщепляемой частью, и расщепляемой частью, расщепляемой катепсином D, может быть активировано на ранней стадии опухоли и на поздней стадии некротической опухоли. На ранней стадии опухоли расщепляемая часть может быть расщеплена и активируемое антитело может утратить маскировку под воздействием ММР-9. На поздней стадии опухоли расщепляемая часть может быть расщеплена и активируемое антитело может утратить маскировку под воздействием катепсина D, содержание которого повышается в умирающем центре опухолей последней стадии. В другом типичном варианте осуществления изобретения антитело, связанное с маскирующей частью и ММР-9-активируемой расщепляемой частью и активируемой каспазой расщепляемой частью, может быть расщеплено как на ранней, так и на поздней стадиях опухолей. В другом варианте осуществления изобретения плазмин в активных местах ангиогенеза (ранняя стадия опухоли) может расщеплять расщепляемую плазмином расщепляемую часть и легумаин в больных тканях вместе с проникающими макрофагами может расщеплять специфичную для легумаина расщепляемую часть на поздней стадии опухоли.
(d) Использование активируемых антител в терапии, направленной против ангиогенеза
В типичном варианте осуществления изобретения активируемое антитело, содержащее антитело, связывающееся с медиатором ангиогенеза, таким как EGFR, TNFальфа, CD11a, CSFR, CTLA-4, EpCAM, VEGF, CD40, CD20, Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4, Jagged 1, Jagged 2, CD52, MUC1, IGF1R, трансферрин, gp130, VCAM-1, CD44, DLL4 или IL4, может быть использовано при лечении заболеваний, в которых необходимо ингибировать ангиогенез, в частности, заболеваний, в которых необходимо ингибировать VEGF. VEGF-связывающиеся активируемые антитела могут представлять собой активируемые антитела, связывающиеся с двумя мишенями, в которых одно антитело связывается с VEGF, а другое антитело связывается со вторым фактором роста, таким как фактор роста фибробластов (например, FGF-2), и ингибирует активность FGF. Такие активируемые антитела, связывающиеся с двумя мишенями, могут быть сконструированы с возможностью ингибирования двух факторов, стимулирующих ангиогенез, и могут быть активированы расщепляющим средством (например, ферментом, таким как ММР или другими ферментами, аналогичными представленным в таблице 3), присутствующим в месте аберрантного ангиогенеза.
Активируемые антитела, ингибирующие ангиогенез, находят применение при лечении солидных опухолей у субъекта (например, человека), особенно солидных опухолей, ассоциированных с сосудистым ложем, которое питает опухоль, благодаря чему ингибирование развития кровеносных сосудов может вызвать ингибирование роста опухоли. Активируемые антитела против VEGF могут быть также использованы при лечении других заболеваний, для которых характерен один или несколько симптомов, поддающихся лечению в результате ингибирования анормального ангиогенеза.
Аномальный ангиогенез обычно происходит в тех случаях, когда имеет место избыточный, недостаточный или патологический рост ангиогенеза (например, место, время или начало ангиогенеза является нежелательным с медицинской точки зрения) во время заболевания или до заболевания, являясь причиной его возникновения. Избыточное, патологическое или неконтролируемый ангиогенез происходит при образовании ангиогенеза, которое вызывает ухудшение состояния или возникновение заболевания, такого как рак, в частности, васкуляризованные солидные опухоли и метастазирующие опухоли (содержащие рак ободочной кишки, рак легкого (особенно мелкоклеточный рак легкого) или рак предстательной железы), заболевания, вызванные образованием новых сосудов в глазах, в частности, диабетическая слепота, ретинопатия, прежде всего диабетическая ретинопатия или возрастная дегенерация желтого пятна и покраснение; псориаз, псориатический артрит, гемангиобластома, такая как гемангиома; воспалительные заболевания почек, такие как гломерулонефрит, в частности, мезангиопролиферативный гломерулонефрит, гемолитико-уремический синдром, диабетическая нефропатия или гипертонический неплиросклероз; разные воспалительные заболевания, такие как артрит, в частности, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз, саркоидоз, артериальный артериосклероз и заболевания, возникающие после трансплантации, эндометриоз или хроническая астма и другие состояния, хорошо известные квалифицированным специалистам. Ангиогенез может питать больные ткани, разрушать здоровые ткани, и в случае рака новые сосуды делают возможным проникновение опухолевых клеток в кровоток и внедрение в другие органы (опухолевые метастазы).
Терапия против ангиогенеза на основе активируемых антител может также найти применение при лечении отторжения трансплантатов, воспаления легких, нефротического синдрома, преэклампсии, выпота в полость перикарда, ассоциированного с перикардитом, и плеврального выпота, заболеваний и нарушений, характеризующихся нежелательной проницаемостью сосудов, например, отека, ассоциированного с опухолями головного мозга, асцитов, ассоциированных со злокачественными опухолями, синдрома Мейгса, воспаления легких, нефротического синдрома, выпота в полость перикарда, плеврального выпота, проницаемости сосудов, ассоциированной с сердечно-сосудистыми заболеваниями, такими как состояние после инфаркта миокарда и инсультов, и тому подобных.
Другие заболевания, обусловленные развитием ангиогенеза, которые можно лечить с помощью активируемых антител против ангиогенеза по настоящему изобретению, включают ангиофиброму (патологический кровоточащий ангиогенез), неоваскулярную глаукому (рост коровеносных сосудов в глазу), артериовенозные мальформации (патологическое соединение артерий и вен), несрастающиеся переломы (переломы, которые не заживают), атеросклеротические бляшки (затрудняющие кровоток в артериях), пиогенную гранулему (поражение кожи, состоящее из ангиогенеза), склеродерму (форма заболевания соединительной ткани), гемангиому (опухоль, состоящая из ангиогенеза), трахому (основная причина слепоты в странах третьего мира), гемофилическую артропатию, сосудистую адгезию и гипертрофические рубцы (анормальное образование рубцов).
Количества активируемого антитела, вводимые для достижения требуемого терапевтического эффекта, являются разными в зависимости от ряда вышеописанных факторов. Как правило, в случае лечения рака терапевтически эффективным количеством активируемого антитела является такое количество, которое эффективно ингибирует ангиогенез и снижает опухоль или атеросклероз у субъекта по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 25%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 85% или по меньшей мере примерно на 90% вплоть до полного устранения опухоли по сравнению с приемлемым контрольным образцом. В экспериментальной животной системе приемлемым контрольным животным может быть генетически идентичное животное, не подвергаемое лечению указанным средством. В неэкспериментальных системах приемлемым контрольным образцом может быть опухоль, имевшая место до введения лекарственного средства. Другими приемлемыми контрольными образцами могут быть образцы, полученные при введении плацебо.
Уменьшение опухоли можно определить любыми известными методами, которые включают, не ограничиваясь ими, измерение опухолевой массы солидной опухоли; подсчет числа опухолевых клеток при выполнении цитологических анализов; клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции (например, с использованием антитела, специфичного к опухолеспецифическому антигену), применяемый для определения числа клеток, несущих данный опухолевый антиген; компьютерную томографию, магнитно-резонансную томографию и/или рентгенологическое исследование опухоли для определения и/или контроля размера опухоли; измерение количества опухолеспецифического антигена в биологическом образце, таком как кровь или сыворотка; и тому подобные.
В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные методы позволяют эффективно замедлить рост опухоли по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 25%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 85% или по меньшей мере примерно на 90% вплоть до полного подавления роста опухоли по сравнению с приемлемым контрольным образцом. Таким образом, в указанных вариантах осуществления изобретения эффективными количествами активируемого антитела являются такие количества, которые позволяют замедлить рост опухоли по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 25%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 85% или по меньшей мере примерно на 90% вплоть до полного подавления роста опухоли по сравнению с приемлемым контрольным образцом. В экспериментальной животной системе приемлемым контрольным образцом может быть скорость роста опухоли у генетически идентичного животного, не подвергаемого лечению указанным средством. В неэкспериментальных системах приемлемым контрольным образцом может быть объем опухоли или скорость роста опухоли до введения данного лекарственного средства. Другими приемлемыми контрольными образцами могут быть образцы, полученные при введении плацебо.
Ингибирование роста опухоли можно определить любыми известными методами, которые включают, не ограничиваясь ими, анализ роста опухоли in vivo; анализ пролиферации in vitro; анализ поглощения 3Н-тимидина и тому подобные.
(е) Использование активируемых антител в противовоспалительной терапии
В другом типичном варианте осуществления изобретения, в котором активируемое антитело содержит антитело, связывающееся с медиаторами воспаления, такими как интерлейкины, активируемое антитело может быть использовано при лечении родственных заболеваний. Активируемые антитела, связывающиеся с интерлейкином, могут включать активируемые антитела, связывающиеся с двумя мишенями, которые включают антитело, связывающееся, например, с IL12, а также антитело, связывающееся с IL23, или активируемое антитело, в котором первое антитело связывается с IL17 и второе антитело связывается с IL23. Такие активируемые антитела, связывающиеся с двумя мишенями, могут быть сконструированы для лечения воспаления, при этом указанные антитела активируются расщепляющим средством (например, ферментом, таким как ММР, или другим ферментом, указанным в таблице 3), присутствующим в месте воспаления.
Нетерапевтические методы использования активируемых антител
Активируемые антитела могут быть также использованы в диагностических методах и/или методах визуализации. Например, активируемые антитела, содержащие расщепляемую ферментом расщепляемую часть, могут быть использованы для обнаружения наличия или отсутствия фермента, способного расщеплять расщепляемую часть. Такие активируемые антитела могут быть использованы в диагностике, которая может включать обнаружение in vivo (например, качественное или количественное) ферментативной активности (или в некоторых вариантах осуществления изобретения повышенного потенциала восстановления, обеспечивающего восстановление дисульфидной связи) при наличии представляющей интерес мишени в результате измеряемого накопления активированных антител в данной ткани данного организма-хозяина.
Например, расщепляемая часть может быть выбрана в качестве субстрата для протеазы, обнаруженной в месте локализации опухоли, в месте локализации вирусной или бактериальной инфекции на биологически ограниченном участке (например, в абсцессе, органе и тому подобном) и так дополнительно. Антителом может быть антитело, связывающееся с антигеном мишени. С помощью методов, известных специалисту в данной области, с антителом или другой областью активируемого антитела может быть конъюгирована детектируемая метка (например, флуоресцентная метка). Приемлемые детектируемые метки рассмотрены при описании вышеуказанных методов скрининга и ниже приведены дополнительные конкретные примеры. При использовании антитела, специфичного к белку или пептиду, характерному для данного заболевания, наряду с протеазой, активность которой повышается в представляющей интерес больной ткани, активируемые антитела связываются с больной тканью с более высокой скоростью по сравнению с тканями, в которых фермент, специфичный для расщепляемой части, отсутствует на детектируемом уровне или присутствует на более низком уровне, чем в больной ткани. Так как мелкие белки и пептиды быстро выводятся из крови при помощи фильтрующей системы почек и фермент, специфичный для расщепляемой части, не присутствует на детектируемом уровне (или присутствует на более низких уровнях в здоровых тканях), активированное антитело накапливается в больной ткани в большей степени по сравнению со здоровыми тканями.
В другом примере активируемые антитела могут быть использованы для обнаружения наличия или отсутствия расщепляющего средства в образце. Например, активируемое антитело, содержащее расщепляемую часть, которая может быть расщеплена ферментом, может быть использовано для обнаружения (качественного или количественного) наличия фермента в образце. В другом примере активируемое антитело, содержащее расщепляемую часть, которая может быть расщеплена восстановителем, может быть использовано для обнаружения (качественного или количественного) наличие восстановительных условий в образце. Для облегчения выполнения анализа указанными методами активируемое антитело может иметь детектируемую метку и может быть связано с подложкой (например, твердой подложкой, такой как предметное стекло или гранула). Детектируемая метка может находиться в той части активируемого антитела, которая высвобождается после расщепления. Анализ может быть выполнен, например, при осуществлении контактирования иммобилизованного, меченого активируемого антитела с образцом, который предположительно содержит фермент и/или восстановитель, в течение периода времени, достаточного для расщепления, и последующей промывки для удаления избытка образца и загрязняющих примесей. Наличие или отсутствие расщепляющего средства (например, фермента или восстановителя) в образце оценивают по изменению детектируемого сигнала активируемого антитела до контактирования с образцом (например, ослабление детектируемого сигнала в результате расщепления активируемого антитела расщепляющим средством в образце и удаление фрагмента антитела, к которому присоединена детектируемая метка, в результате такого расщепления.
Такие методы обнаружения могут быть адаптированы для обнаружения наличия или отсутствия мишени, способной связывать антитело в активируемом антителе. Таким образом, анализы in vitro могут быть адаптированы для оценки наличия или отсутствия расщепляющего средства и наличия или отсутствия представляющей интерес мишени. Наличие или отсутствие расщепляющего средства можно обнаружить по уменьшению детектируемой метки активируемого антитела, и наличие или отсутствие мишени можно определить путем обнаружения комплекса антитело-мишень, например, при использовании меченого антитела против мишени.
Как было указано выше, активируемые антитела по настоящему изобретению могут включать детектируемую метку. В одном варианте осуществления изобретения активируемое антитело содержит детектируемую метку, которая может быть использована в качестве диагностического средства. Неограничивающие примеры детектируемых меток, которые могут быть использованы в качестве диагностических средств, включают визуализирующие средства, содержащие радиоактивные изотопы, такие как индий или технеций; контрастирующие средства для MRI и других применений, содержащие йод, гадолиний или оксид железа; ферменты, такие как пероксидаза из хрена, щелочная фосфатаза или β-галактозидаза; флуоресцентные вещества и флуорофоры, такие как GFP, производные европия; люминесцентные вещества, такие как производные N-метилакридия, или тому подобные.
Разрушение уязвимого тромбоцита и последующее образование тромба считается причиной большинства сердечных приступов. Благодаря эффективному направленному воздействию на уязвимые тромбоциты обеспечивается доставка стабилизирующих средств, уменьшающих вероятность разрушения.
Содержание VCAM-1 повышается в областях, подверженных возникновению атеросклероза, а также на границах существующих поражений. Iiyama. et al. (1999) Circulation Research, Am. Heart Assoc. 85:199-207. Коллагеназы, такие как ММР-1, ММР-8 и ММР-13, сверхэкспрессированы в атероме человека, которая может способствовать разрушению атеросклеротических бляшек. Fricker, J. (2002) Drug Discov. Today 7(2): 86-88.
В соответствии с одним примером активируемые антитела по настоящему изобретению могут быть использованы в диагностических методах и/или методах визуализации, предназначенных для обнаружения и/или мечения атеросклеротических бляшек, например, уязвимых атеросклеротических бляшек. Благодаря направленному воздействию на белки, ассоциированные с атеросклеротическими бляшками, активируемые антитела могут быть использованы для обнаружения и/или мечения таких бляшек. Например, активируемые антитела, содержащие антитело против VSAM-1 и детектируемую метку, могут быть использованы в методах, применяемых для обнаружения и/или мечения атеросклеротических бляшек. Указанные активируемые антитела могут быть испытаны в животных моделях, таких как мыши ApoE.
Рассмотрение биологического распределения
Терапевтический потенциал композиций по настоящему изобретению обеспечивает лучшее биологическое распределение и биологическую доступность модифицированного антитела или активируемого антитела. Композиции по настоящему изобретению содержат терапевтическое средство на основе антитела, характеризующееся лучшей биологической доступностью, при этом сродство связывания терапевтического средства на основе антитела с мишенью является более низким в здоровой ткани по сравнению с больной тканью. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело, связанное с маскирующей частью, может характеризоваться более высоким сродством к мишени в больной ткани, чем в здоровой ткани. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения сродство в больной ткани в 5-10000000 раз выше сродства в здоровой ткани.
Таким образом, настоящее изобретение относится к терапевтическому антителу, обладающему лучшей биологической доступностью, при этом сродство связывания терапевтического средства на основе антитела с мишенью является более низким в первой ткани по сравнению со связыванием терапевтического средства на основе антитела с мишенью во второй ткани. В разных вариантах осуществления изобретения первая ткань является здоровой тканью и вторая ткань является больной тканью; первая ткань является опухолью на ранней стадии роста и вторая ткань является опухолью на поздней стадии рооста; первая ткань является доброкачественной опухолью и вторая ткань является злокачественной опухолью; первая ткань и вторая ткань пространственно отделены друг от друга; или в соответствии с конкретным примером первая ткань является эпителиальной тканью и вторая ткань является тканью молочной железы, головы, шеи, легкого, поджелудочной железы, нервной системы, печени, предстательной железы, мочеполовой системы или шейки матки.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Скрининг маскирующих частей-кандидатов (ММ)
Для получения композиций, содержащих антитела и их фрагменты (АВ), связанные с маскирующими частями (ММ) с требуемыми характеристиками оптимального связывания и диссоциации, выполняют скрининг библиотек маскирующих частей-кандидатов. Создают маскирующие части, имеющие разные аминокислотные последовательности, остатки цистеина в разных положениях, разную длину и подобные характеристики. Маскирующие части-кандидаты испытывают в отношении их способности связываться с представляющими интерес антителами. Для конструирования модифицированных антител предпочтительно отбирают маскирующие части, не содержащие нативной аминокислотной последовательности партнера связывания антитела.
Маскирующие части для представляющих интерес антител подвергают созреванию аффинности с целью отбора маскирующих частей со сродством около 1-10 нМ.
Пример 2. Скрининг библиотек модифицированных антител и активируемых антител (АА)
Для идентификации модифицированных антител и активируемых антител, обладающих требуемыми характеристиками переключения (то есть низким связыванием с мишенью в маскированной и/или нерасщепленной конформации и высоким связыванием с мишенью в немаскированной и/или расщепленной конформации), создают библиотеки модифицированных антител-кандидатов и активируемых антител-кандидатов, имеющих разные аминокислотные последовательности в маскирующих частях (ММ), остатки цистеина в разных положениях в маскирующей части, линкеры разной длины и разные точки присоединения к исходному антителу.
В настоящем описании изобретения дано схематическое рассмотрение метода скрининга/сортинга для идентификации активируемых антител-кандидатов, обладающих переключаемым фенотипом. Указанные библиотеки вводят в клетки с помощью экспрессирующих векторов, получая отображение активируемых антител на поверхности бактериальных клеток. После размножения библиотек в культуре клетки, отображающие полипептиды активируемых антител, обрабатывают соответствующим ферментом или восстановителем с целью расщепления или восстановления расщепляемой части. Обработанные клетки вводят в соприкосновение с мишенью, меченной флуоресцентной меткой, и клетки сортируют методом FACS для выделения клеток, отображающих активируемые антитела, связывающиеся с мишенью после расщепления/восстановления. Клетки, отображающие конструкции, связывающиеся с мишенью, размножают, выращивая в культуре. Затем клетки вводят в соприкосновение с меченой мишенью и сортируют методом FACS с целью выделения клеток, отображающих активируемые антитела, которые не связываются с меченой мишенью при отсутствии фермента/восстановителя. Указанные стадии представляют один цикл процедуры скрининга. Затем клетки подвергают дополнительным циклам, выращивая в культуре, после чего в отношении культуры снова выполняют все или некоторые стадии скрининга.
Скрининг и сортинг библиотеки могут быть также инициированы путем первоначального отбора кандидатов, которые не связываются с меченой мишенью при отсутствии фермента/восстановителя (то есть не связываются с мишенью в нерасщепленном/невосстановленном состоянии).
Пример 3. Скрининг модифицированных антител in vitro для определения эффективности маскировки маскирующей части
Для скрининга модифицированных антител и активируемых антител, обладающих оптимальными характеристиками в маскированном состоянии, например, только 10% связывания с мишенью в маскированном состоянии и в присутствии мишени, создают антитела, связанные с разными маскирующими частями, или антитела, связанные с одинаковыми маскирующими частями в разных точках присоединения, или антитела, связанные с одинаковой маскирующей частью при помощи линкеров разной длины и/или последовательностей.
Эффективность маскировки маскирующих частей можно определить по сродству маскирующей части к антителу и пространственному отношению маскирующей части к области связывания антитела с мишенью. Обнаружение эффективной маскирующей части основано на сродстве, а также на эмпирическом измерении эффективности маскировки. Для оптимизации и отбора маскирующих частей можно измерить замещение маскирующей части мишенью в модифицированном антителе или активируемом антителе в зависимости от времени. Для обнаружения и подтверждения эффективности маскированных антител в настоящем описании изобретения представлен иммуноадсорбционный анализ замещения мишенью (TDA).
При выполнения анализа TDA измеряют способность маскирующей части ингибировать связывание антитела с мишенью при терапевтически обоснованных концентрациях и времени воздействия. Указанный анализ позволяет измерить замещение маскирующей части мишенью в зависимости от времени.
В кратком изложении указанный анализ состоит в следующем: мишень антитела адсорбируют в лунках планшета для ELISA в течение ночи при температуре около 4°С. Планшет блокируют, добавляя примерно 150 мкл 2% обезжиренного сухого молока (NFDM) в PBS, около 0,5% (об./об.) твина 20 (PBST), и инкубируют при комнатной температуре в течение примерно 1 часа. Затем планшет трижды промывают PBST. Добавляют примерно 50 мкл суперблокатора (Thermo Scientific) и вводят ингибиторы протеазы (Complete, Roche). Примерно 50 мкл антитела, связанного с маскирующей частью, растворяют в суперблокаторе с ингибиторами протеазы (Complete, Roch) и инкубируют при температуре около 37°С в течение разных периодов времени. Планшет трижды промывают PBST. Добавляют примерно 100 мл антитела против huIgG-HRP в 2% NFDM/PBST и инкубируют при комнатной температуре в течение около 1 часа. Планшет четыре раза промывают PBST и два раза промывают PBS. Анализ выполняют с использованием ТМВ (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя.
Пример 4. Активируемые антитела, содержащие scFv в качестве антитела
В настоящем описании изобретения приведены примеры активируемых антител, содержащих scFv против Jagged1. Указанные активируемые антитела являются неактивными (маскированными) в нормальных условиях благодаря присоединенной маскирующей части. Когда scFv достигает места болезни, специфичный для данной болезни фермент, такой как ADAM17 расщепляет линкер субстрата, соединяющий пептидный ингибитор с scFv, вызывая его связывание с Jagged1. Для обнаружения приемлемых маскирующих частей для scFv против Jagged1 используют отображение на поверхности бактериальных клеток. В данном примере отобранные маскирующие части объединяют с субстратом для фермента, используемым в качестве пускового механизма для конструирования конструкции scFv, которая обеспечивает направленное связывание после активации протеазой.
Конструкция активируемого протеазой антитела
Гены, кодирующие активируемые антитела, содержащие одноцепочечное антитело против Jagged1, получают путем введения перекрывающего сегмента при помощи ПЦР или общего синтеза гена и лигирования в аналогичным образом расщепленную экспрессирующую плазмиду или любой другой приемлемый экспрессирующий вектор на основе бактерий, дрожжей или млекопитающего, известного специалисту в данной области. Непроцессированные антитела могут быть альтернативно получены с использованием коммерчески доступных экспрессирующих векторов, содержащих части, увеличивающие период полувыведения (например, Fc-область IgG, сывороточный альбумин или трансферрин), и методами, известными специалисту в данной области. Экспрессирующую плазмиду затем трансформируют или трансфицируют в соответствующий экспрессирующий хозяин, такой как BL21 для E. coli или клетки HEK293t. Одноцепочечные антитела собирают из культур, выращиваемых в течение ночи, с использованием набора для экстракции периплазматических фракций (Pierce) и очищают при помощи аффинной хроматографии на иммобилизованных ионах металлов и гель-хроматографии.
Анализ переключающей активности антитела in vitro
Аликвоты активированных протеазой антител в концентрации 1 пМ - 1 мкМ отдельно инкубируют в забуференном водном растворе с 0 и 50 нМ фермента в течение 3 часов. Реакционные смеси затем анализируют в отношении связывания с иммобилизованным антигеном Jagged1 методом ELISA или при помощи анализа методом резонанса поверхностных плазмонов. Свидетельством увеличения активности связывания активируемого антитела после обработки протеазой является увеличение резонанса, измеряемого прибором SPR BIAcore™. Изменение кажущейся константы диссоциации (Kd) в результате расщепления можно вычислить в соответсвии с инструкциями производителя прибора (BIAcore, GE Healthcare).
Пример 5. Клонирование антитела scFv против VEGF
В данном и последующих примерах описано конструирование активируемого антитела, содержащего маскированное ММР-9-расщепляемое антитело scFv против VEGF (мишень = VEGF; АВ = одноцепочечный Fv-фрагмент против VEGF). В качестве первой стадии продуцирования такого активируемого антитела создают конструкции, содержащие scFv против VEGF (антитело). Антитело scFv против VEGF (VL-линкер L-VH) было сконструировано на основе опубликованной последовательности ранибизумаба (Genentech, Chen. Y., Wiesmann, C., Fuh, G., Li, B., Christinger, H., McKay, P., de Vos, A.M., Lowman, H. B. (1999) Selection and Analysis of an Optimized Anti-VEGF Antibody: Crystal Structure of an Affinity-matured Fab in Complex with Antigen, J. Mol. Biol. 293, 865-881) и синтезировано в компании Codon Devices (Cambridge, MA).
Ранибизумаб является Fab-фрагментом моноклонального антитела, выделенным из такого же исходного мышиного антитела, что и бевацизумаб (Presta L.G., Chen H., O’Connor S.J. et al., Humanization of an anti-vascular endothelial growth factor vonoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders. Cancer Res., 57:4593-9, 1997). Указанный фрагмент меньше исходной молекулы и подвергнут созреванию аффинности для достижения более сильного связывания с VEGF-A. Ранибизумаб связывается и ингибирует все подтипы эндотелиального фактора роста сосудов А (VEGF-AS). В конструкцию были включены метка His6 у N-конца и сайт расщепления протеазой TEV. Протеаза TEV, выделенная из вируса гравировки табака, обладает высокой специфичностью и используется для разделения слитых белков после очистки. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности scFv против VEGF приведены ниже в таблицах 7 и 8.
Таблица 7
Нуклеотидная последовательность антитела scFv против VEGF
gatattcaactgacccagagcccttcttccctgagtgccagcgtgggtgaccgtgttacgatcacttgctcggccagccaagatatttctaactacctgaattggtaccagcagaagccaggaaaggcaccaaaagtcctgatctacttcacaagttcactgcattccggcgtaccgtcgcgctttagcggttctggcagtggtaccgacttcaccctgactatctcgagtctgcaacctgaggattttgctacatattactgtcagcaatattcgaccgtgccgtggacgttcgggcagggcaccaaagtggagattaaggggggtggaggcagcgggggaggtggctcaggcggtggagggtctggcgaggtccagctggtagaaagcgggggcggactggtccaaccgggcggatccctgcgtctgagctgcgcggcctcgggttacgactttactcactacggaatgaactgggttcgccaagcccctggtaaaggtctggaatgggtcggatggattaatacatacactggagaacctacttatgctgctgatttcaaacgtcgctttactttctctctggatacaagtaagtcaaccgcctatctgcaaatgaacagcctgcgtgcagaggacacggctgtgtactattgtgcgaaatatccttattattatggaacttcccactggtatttcgatgtatggggccagggtactctggttacagtgtcg
Таблица 8
Аминокислотная последовательность антитела scFv против VEGF
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVS
Пример 6. Скрининг и идентификация маскирующих частей для scFv против VEGF
Ранибизумаб был использован для скрининга произвольно собранной библиотеки пептидов, состоящей из пептидов, представляющих собой Х15 (8,3×109), Х4СХ7СХ4 (3,6×109) или Х12СХ3 (1,1×109), где Х означает любую аминокислоту и число означает общую вариабельность библиотеки. Общая вариабельность созданной библиотеки была равна 1,3×1010. Скрининг состоял из одного цикла скрининга методом MACS и двух циклов сортинга методом FACS. В первом цикле скрининга методом MACS 1×1011 клеток зондировали 150 нМ биотинилированного ранибизумаба, при этом было выделено 5,5×107 связывающихся клеток. В процессе первого скрининга методом FACS позитивные клетки, выделенные в результате скрининга методом MACS, зондировали 500 нМ биотинилированного ранибизумаба и визуализировали нейтральным комплексом авидин-РЕ (Molecular Probes, Eugene, OR). Второй и третий циклы отбора методом FACS выполняли с использованием 500 нМ и затем 100 нМ Alexa-меченного ранибизумабом в присутствии 20 мкМ IgG. Отдельные клоны секвенировали и затем проверяли в отношении способности связываться с scFv против VEGF при помощи анализа методом FACS. Аминокислотные последовательности маскирующих частей для scFv против VEGF приведены в нижеследующей таблице 9. (Указанные последовательности дополнительно определяются как 283 ММ, 292 ММ, 306 ММ и т.д.).
Таблица 9
Маскирующие части для scFv против VEGF
JS283 ATAVWNSMVKQSCYMQG
JS292 GHGMCYTILEDHCDRVR
JS306 PCSEWQSMVQPRCYYGG
JS308 NVECCQNYNLWNCCGGR
JS311 VHAWEQLVIQELYHC
JS313 GVGLCYTILEQWCEMGR
JS314 RPPCCRDYSILECCKSD
JS315 GAMACYNIFEYWCSAMK
Пример 7. Конструирование активируемого антитела: векторы, содержащие маскированное ММР-9-расщепляемое антитело scFv против VEGF
Расщепляемую часть (субстрат для ММР-9) гибридизировали с конструкцией маскированного scFv против VEGF с образованием расщепляемого, маскированного активируемого антитела. Типичная конструкция показана на фиг.4. Несколько типичных конструкций активируемого антитела и последовательностей, содержащих разные расщепляемые части, более подробно описано ниже. Праймеры, используемые для конструирования типичных конструкций, представлены в приведенной ниже таблице 10.
Таблица 10
Праймеры, используемые для конструирования ММР-9-расщепляемого маскированного антитела scFv против VEGF
CX0233 5'gaattcatgggccatcaccatcaccatcacggtgggg3'
CX0249 5'gtgagtaagcttttattacgacactgtaaccagagtaccctgg3'
CX0270 5'gtggcatgtgcacttggccaccttggcccactcgagctggccagactggccctgaaaatacagattttccc3'
CX0271 5'gagtgggccaaggtggccaagtgcacatgccactgggcttcctgggtccgggcggttctgatattcaactgacccagagcc3'
CX0288 5'ttcgagctcgaacaacaacaacaataacaataacaacaac3'
CX0289 5'gctttcaccgcaggtacttccgtagctggccagtctggcc3'
CX0290 5'cgctccatgggccaccttggccgctgccaccagaaccgcc3'
CX0308 5'gcccagccggccatggccggccagtctggccagctcgagt3'
CX0310 5'ccagtgccaagcttttagtggtgatggtgatgatgcgacactgtaaccagagtaccctggcc3'
CX0312 5'cttgtcacgaattcgggccagtctggccagctcgagt3'
CX0314 5'cagatctaaccatggcgccgctaccgcccgacactgtaaccagagtaccctg3'
Клонирование и экспрессия активируемого антитела: ММР-9-расщепляемое маскированное антитело scFv против VEGF в виде гибрида с МВР
Клонирование. Был клонирован гибрид МВР с антителом scFv против VEGF. МВР (белок, связывающийся с мальтозой) хорошо экспрессируется в E. coli в виде слитого белка и может быть очищен на колонке с мальтозой методом, хорошо известным в данной области для получения слитых белков. В данном примере МВР был использован для отделения маскированного scFv. His6-меченное антитело scFv против VEGF клонировали в вектор pMal-c4x (NEB) в виде С-концевого гибрида с МВР с использованием сайтов рестрикции EcoRI и HindIII на сайте множественного клонирования (MCS). Для амплификации антитела scFv против VEGF и введения сайтов EcoRI и HindIII использовали праймеры СХ0233 и СХ0249 (таблица 10).
Акцептирующий вектор для активируемого антитела (пептид маскирующей части, антитело scFv против VEGF и ММР-9-расщепляемая часть) синтезировали при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием перекрывающихся праймеров СХ0271 и СХ0270, позволяющих расположить сайт клонирования для пептида маскирующей части, линкерных последовательностей и ММР-9-расщепляемой части между сайтом протеазы TEV и антителом scFv против VEGF. Праймеры СХ0271 и СХ0249 (таблица 10) использовали для амплификации С-концевой части конструкции, в то время как праймеры СХ0270 и СХ0288 (таблица 10) использовали для амплификации N-концевой части. Продукты, полученные в результате выполнения вышеуказанных реакций, объединяли для осуществления конечной ПЦР с использованием внешних праймеров, СХ0249 и СХ0288 (таблица 10), и клонировали в вектор pMal в виде гибрида с МВР, используя сайты рестрикции SacI и HindIII.
Таблица 11
Нуклеотидная последовательность вектора, содержащего МВР/ММ-акцептирующий сайт/ММР-9 CM/scFv против VEGF
atgggccatcaccatcaccatcacggtggggaaaatctgtattttcagggccagtctggccagctcgagtgggccaaggtggccaagtgcacatgccactgggcttcctgggtccgggcggttctgatattcaactgacccagagcccttcttccctgagtgccagcgtgggtgaccgtgttacgatcacttgctcggccagccaagatatttctaactacctgaattggtaccagcagaagccaggaaaggcaccaaaagtcctgatctacttcacaagttcactgcattccggcgtaccgtcgcgctttagcggttctggcagtggtaccgacttcaccctgactatctcgagtctgcaacctgaggattttgctacatattactgtcagcaatattcgaccgtgccgtggacgttcgggcagggcaccaaagtggagattaaggggggtggaggcagcgggggaggtggctcaggcggtggagggtctggcgaggtccagctggtagaaagcgggggcggactggtccaaccgggcggatccctgcgtctgagctgcgcggcctcgggttacgactttactcactacggaatgaactgggttcgccaagcccctggtaaaggtctggaatgggtcggatggattaatacatacactggagaacctacttatgctgctgatttcaaacgtcgctttactttctctctggatacaagtaagtcaaccgcctatctgcaaatgaacagcctgcgtgcagaggacacggctgtgtactattgtgcgaaatatccttattattatggaacttcccactggtatttcgatgtatggggccagggtactctggttacagtgtcg
306 ММ и 314 ММ (таблица 9) амплифицировали из отображающего вектора есрХ с использованием праймеров СХ0289 и СХ0290 (таблица 10) и клонировали в вектор, маскированный у N-конца, используя сайты рестрикции SfiI. Соответствующие нуклеотидные и аминокислотные последовательности приведены в нижеследующей таблице 12.
Таблица 12
Последовательности 306 или 314 ММ/ММР-9 СМ/антитела scFv против VEGF
Нуклеотидная последовательность МВР/306 ММ/ММР-9 СМ/антитела scFv против VEGF
atgggccatcaccatcaccatcacggtggggaaaatctgtattttcagggccagtctggccagccgtgttctgagtggcagtcgatggtgcagccgcgttgctattatgggggcggttctggtggcagcggccaaggtggccaagtgcacatgccactgggcttcctgggtccgggcggttctgatattcaactgacccagagcccttcttccctgagtgccagcgtgggtgaccgtgttacgatcacttgctcggccagccaagatatttctaactacctgaattggtaccagcagaagccaggaaaggcaccaaaagtcctgatctacttcacaagttcactgcattccggcgtaccgtcgcgctttagcggttctggcagtggtaccgacttcaccctgactatctcgagtctgcaacctgaggattttgctacatattactgtcagcaatattcgaccgtgccgtggacgttcgggcagggcaccaaagtggagattaaggggggtggaggcagcgggggaggtggctcaggcggtggagggtctggcgaggtccagctggtagaaagcgggggcggactggtccaaccgggcggatccctgcgtctgagctgcgcggcctcgggttacgactttactcactacggaatgaactgggttcgccaagcccctggtaaaggtctggaatgggtcggatggattaatacatacactggagaacctacttatgctgctgatttcaaacgtcgctttactttctctctggatacaagtaagtcaaccgcctatctgcaaatgaacagcctgcgtgcagaggacacggctgtgtactattgtgcgaaatatccttattattatggaacttcccactggtatttcgatgtatggggccagggtactctggttacagtgtcg
Аминокислотная последовательность МВР/306 ММ/ММР-9 СМ/антитела scFv против VEGF
MGHHHHHHGGENLYFQGQSGQPCSEWQSMVQPRCYYGGGSGGSGQGGQVHMPLGFLGPGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVS
Нуклеотидная последовательность МВР/314 ММ/ММР-9 СМ/антитела scFv против VEGF
atgggccatcaccatcaccatcacggtggggaaaatctgtattttcagggccagtctggccagcggccgccgtgttgccgtgattatagtattttggagtgctgtaagagtgatggcggttctggtggcagcggccaaggtggccaagtgcacatgccactgggcttcctgggtccgggcggttctgatattcaactgacccagagcccttcttccctgagtgccagcgtgggtgaccgtgttacgatcacttgctcggccagccaagatatttctaactacctgaattggtaccagcagaagccaggaaaggcaccaaaagtcctgatctacttcacaagttcactgcattccggcgtaccgtcgcgctttagcggttctggcagtggtaccgacttcaccctgactatctcgagtctgcaacctgaggattttgctacatattactgtcagcaatattcgaccgtgccgtggacgttcgggcagggcaccaaagtggagattaaggggggtggaggcagcgggggaggtggctcaggcggtggagggtctggcgaggtccagctggtagaaagcgggggcggactggtccaaccgggcggatccctgcgtctgagctgcgcggcctcgggttacgactttactcactacggaatgaactgggttcgccaagcccctggtaaaggtctggaatgggtcggatggattaatacatacactggagaacctacttatgctgctgatttcaaacgtcgctttactttctctctggatacaagtaagtcaaccgcctatctgcaaatgaacagcctgcgtgcagaggacacggctgtgtactattgtgcgaaatatccttattattatggaacttcccactggtatttcgatgtatggggccagggtactctggttacagtgtcg
Аминокислотная последовательность МВР/314 ММ/ММР-9 СМ/антитела scFv против VEGF
MGHHHHHHGGENLYFQGQSGQRPPCCRDYSILECCKSDGGSGGSGQGGQVHMPLGFLGPGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVS
Экспрессия. Гибриды МВР:АА экспрессировали в штамме К12 ТВ1 E. coli. Устойчивую к ампициллину колонию, содержащую требуемую конструкцию, использовали для инокуляции 5 мл среды LB с 50 мкг/мл ампициллина, содержащей культуру, выращиваемую в течение ночи. Всю культуру, выращиваемую в течение ночи, использовали для инокуляции 500 мл свежей среды LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина и 0,2% глюкозы, и выращивали при 37°С и встряхивании со скоростью 250 оборотов/мин до достижения оптической плотности, равной 0,5. Изопропилтио-β-D-галактозидазу добавляли до конечной концентрации 0,3 мМ и культуру выращивали в течение еще 3 часов в таких же условиях, после чего клетки собирали центрифугированием с ускорением 3000×g. Внутриклеточные тельца очищали стандартными методами, используя 10 мл реагента для лизиса клеток BPER II (Pierce). Нерастворимое вещество собирали центрифугированием с ускорением 14000×g и растворимые белки выбрасывали. Нерастворимые вещества ресуспендировали в 5 мл реагента BPER II, содержащего 1 мг/мл лизоцима, и инкубировали на льду в течение 10 минут, после чего добавляли 5 мл реагента BPER II, разведенного водой в отношении 1:20, и образцы центрифугировали с ускорением 14000×g. Супернатант удаляли и дебрис дважды промывали реагентом BPER II, разведенным в отношении 1:20. Очищенные внутриклеточные тельца растворяли в PBS, 8 М мочевины, 10 мМ ВМЕ, рН 7,4.
Белки, гибридизированные с МВР, разводили до концентрации, равной примерно 1 мг/мл, и производили повторную укладку цепи при помощи поэтапного диализа в PBS, рН 7,4, с использованием от 8 до 0 М мочевины, в том числе 6, 4, 2, 0,5 и 0 М мочевины. На стадиях с использованием 4, 2 и 0,5 М мочевины добавляли 0,2 М аргинина, 2 мМ восстановленного глутатиона и 0,5 мМ окисленного глутатиона. Для диализа с использованием 0 М мочевины добавляли 0,2 М аргинина. После удаления мочевины белки диализовали против 0,05 М аргинина с последующим выполнением продолжительного диализа против PBS, рН 7,4. Все диализы выполняли при 4°С в течение ночи. Для удаления агрегатов каждый белок подвергали гель-хроматографии на колонке с сефакрилом S-200. Фракции, содержащие белки с правильной укладкой цепи, концентрировали, используя фильтрующую центрифугу Amicon Ultra.
Клонирование и экспрессия активируемого антитела: ММР-9-расщепляемое маскированное антитело scFv против VEGF с меткой CHis
Клонирование. Для амплификации использовали праймеры СХ0308 и СХ0310 (таблица 10) и добавляли сайт рестрикции NcoI к 5'-концу и сайт реастрикции HindIII и метку His6 к 3'-концу вектора (ММ-акцептирующий сайт/ММР-9 СМ/антитело scFv против VEGF), который затем клонировали в вектор, содержащий сигнальный пептид pelB. Маскирующие части антитела scFv против VEGF клонировали так, как было описано выше. Соответствующие нуклеотидные и аминокислотные последовательности приведены в таблице 13.
Таблица 13
Последовательности 306 или 314 ММ/ММР-9 СМ/антитела scFv против VEGF с меткой CHis
Нуклеотидная последовательность 306 ММ/ММР-9 СМ/антитела scFv против VEGF с меткой CHis
ggccagtctggccagccgtgttctgagtggcagtcgatggtgcagccgcgttgctattatgggggcggttctggtggcagcggccaaggtggccaagtgcacatgccactgggcttcctgggtccgggcggttctgatattcaactgacccagagcccttcttccctgagtgccagcgtgggtgaccgtgttacgatcacttgctcggccagccaagatatttctaactacctgaattggtaccagcagaagccaggaaaggcaccaaaagtcctgatctacttcacaagttcactgcattccggcgtaccgtcgcgctttagcggttctggcagtggtaccgacttcaccctgactatctcgagtctgcaacctgaggattttgctacatattactgtcagcaatattcgaccgtgccgtggacgttcgggcagggcaccaaagtggagattaaggggggtggaggcagcgggggaggtggctcaggcggtggagggtctggcgaggtccagctggtagaaagcgggggcggactggtccaaccgggcggatccctgcgtctgagctgcgcggcctcgggttacgactttactcactacggaatgaactgggttcgccaagcccctggtaaaggtctggaatgggtcggatggattaatacatacactggagaacctacttatgctgctgatttcaaacgtcgctttactttctctctggatacaagtaagtcaaccgcctatctgcaaatgaacagcctgcgtgcagaggacacggctgtgtactattgtgcgaaatatccttattattatggaacttcccactggtatttcgatgtatggggccagggtactctggttacagtgtcgcatcatcaccatcaccac
Аминокислотная последовательность 306 ММ/ММР-9 СМ/антитела scFv против VEGF с меткой CHis
GQSGQPCSEWQSMVQPRCYYGGGSGGSGQGGQVHMPLGFLGPGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSHHHHHH
Нуклеотидная последовательность 314 ММ/ММР-9 СМ/антитела scFv против VEGF с меткой CHis
ggccagtctggccagcggccgccgtgttgccgtgattatagtattttggagtgctgtaagagtgatggcggttctggtggcagcggccaaggtggccaagtgcacatgccactgggcttcctgggtccgggcggttctgatattcaactgacccagagcccttcttccctgagtgccagcgtgggtgaccgtgttacgatcacttgctcggccagccaagatatttctaactacctgaattggtaccagcagaagccaggaaaggcaccaaaagtcctgatctacttcacaagttcactgcattccggcgtaccgtcgcgctttagcggttctggcagtggtaccgacttcaccctgactatctcgagtctgcaacctgaggattttgctacatattactgtcagcaatattcgaccgtgccgtggacgttcgggcagggcaccaaagtggagattaaggggggtggaggcagcgggggaggtggctcaggcggtggagggtctggcgaggtccagctggtagaaagcgggggcggactggtccaaccgggcggatccctgcgtctgagctgcgcggcctcgggttacgactttactcactacggaatgaactgggttcgccaagcccctggtaaaggtctggaatgggtcggatggattaatacatacactggagaacctacttatgctgctgatttcaaacgtcgctttactttctctctggatacaagtaagtcaaccgcctatctgcaaatgaacagcctgcgtgcagaggacacggctgtgtactattgtgcgaaatatccttattattatggaacttcccactggtatttcgatgtatggggccagggtactctggttacagtgtcgcatcatcaccatcaccactaa
Аминокислотная последовательность 314 ММ/ММР-9 СМ/антитела scFv против VEGF с меткой CHis
GQSGQRPPCCRDYSILECCKSDGGSGGSGQGGQVHMPLGFLGPGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSHHHHHH
Экспрессия. Активируемые антитела, содержащие антитело scFv против VEGF с меткой His, экспрессировали в штамме К12 ТВ1 E. coli. Устойчивую к ампициллину колонию, содержащую требуемую конструкцию, использовали для инокуляции 5 мл среды LB с 50 мкг/мл ампициллина, содержащей культуру, выращиваемую в течение ночи. 2,5 мл культуры, выращиваемой в течение ночи, использовали для инокуляции 250 мл свежей среды LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина и 0,2% глюкозы, и выращивали при 37°С и встряхивании со скоростью 250 оборотов/мин до достижения оптической плотности, равной 1,0. Изопропилтио-β-D-галактозидазу добавляли до конечной концентрации 0,3 мМ и культуру выращивали в течение еще 5 часов при 30°С, после чего клетки собирали центрифугированием с ускорением 3000×g. Периплазматическую фракцию сразу же очищали методом осмотического шока, используя лизоцим. Клеточный дебрис ресуспендировали в 3 мл 50 мМ трис-буфера, 200 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 20% сахарозы, рН 7,4, и добавляли 2 мкл/мл готового раствора лизоцима. После инкубации на льду в течение 15 минут, добавляли 1,5 объема воды (4,5 мл) и клетки продолжали инкубировать на льду в течение еще 15 минут. Растворимую периплазматическую фракцию удаляли центрифугированием с ускорением 14000×g.
Белки антитела scFv против VEGF с меткой His частично очищали, используя смолу Ni-NTA. Неочищенные периплазматические экстракты помещали на 0,5 мл смолы Ni-NTA и промывали 50 мМ фосфата, 300 мМ NaCl, рН 7,4. His-меченные белки элюировали 50 мМ фосфата, 300 мМ NaCl, 200 мМ имидизала, рН 6,0. Белки концентрировали примерно до 600 мкл и буфер заменяли PBS, используя концентрирующие центрифуги Amicon Ultra.
Клонирование и экспрессия активируемого антитела: ММР-9-расщепляемое маскированное антитело scFv против VEGF в виде гибрида с Fc-фрагментом человека
Клонирование. Праймеры СХ0312 и СХ0314 (таблица 10) использовали для амплификации последовательности, кодирующей ММР-9 СМ/scFv против VEGF. Указанные праймеры также включали последовательности для 5'-концевого сайта рестрикции EcoRI и 3'-концевого сайта рестрикции NcoI и линкерную последовательность. Последовательность, амплифицированную методом ПЦР, разрезали EcoRI и NcoI и клонировали в вектор pFUSE-hIgG1-Fc2, в результате чего были получены векторы для экспрессии белков, гибридизированных с Fc-фрагментом. Маскирующие части антитела scFv против VEGF вводили в указанные векторы так, как было описано выше. Были созданы конструкции, содержащие 306 ММ, 313 ММ, 314 ММ, 315 ММ, несвязывающуюся ММ (100 ММ), а также конструкция без маскирующей части, после чего последовательности проверяли. Соответствующие нуклеотидные и аминокислотные последовательности приведены в нижеследующей таблице 14.
Таблица 14
Последовательности 306 ММ/ММР-9 СМ/антитела scFv-Fc против VEGF
Нуклеотидная последовательность 306 ММ/ММР-9 СМ/антитела scFv-Fc против VEGF
ggccagtctggccagccgtgttctgagtggcagtcgatggtgcagccgcgttgctattatgggggcggttctggtggcagcggccaaggtggccaagtgcacatgccactgggcttcctgggtccgggcggttctgatattcaactgacccagagcccttcttccctgagtgccagcgtgggtgaccgtgttacgatcacttgctcggccagccaagatatttctaactacctgaattggtaccagcagaagccaggaaaggcaccaaaagtcctgatctacttcacaagttcactgcattccggcgtaccgtcgcgctttagcggttctggcagtggtaccgacttcaccctgactatctcgagtctgcaacctgaggattttgctacatattactgtcagcaatattcgaccgtgccgtggacgttcgggcagggcaccaaagtggagattaaggggggtggaggcagcgggggaggtggctcaggcggtggagggtctggcgaggtccagctggtagaaagcgggggcggactggtccaaccgggcggatccctgcgtctgagctgcgcggcctcgggttacgactttactcactacggaatgaactgggttcgccaagcccctggtaaaggtctggaatgggtcggatggattaatacatacactggagaacctacttatgctgctgatttcaaacgtcgctttactttctctctggatacaagtaagtcaaccgcctatctgcaaatgaacagcctgcgtgcagaggacacggctgtgtactattgtgcgaaatatccttattattatggaacttcccactggtatttcgatgtatggggccagggtactctggttacagtgtcgggcggtagcggcgccatggttagatctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgagggtctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
Аминокислотная последовательность 306 ММ/ММР-9 СМ/антитела scFv-Fc против VEGF
GQSGQPCSEWQSMVQPRCYYGGGSGGSGQGGQVHMPLGFLGPGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSGGSGAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
Нуклеотидная последовательность 314 ММ/ММР-9 СМ/scFv-Fc против VEGF
ggccagtctggccagcggccgccgtgttgccgtgattatagtattttggagtgctgtaagagtgatggcggttctggtggcagcggccaaggtggccaagtgcacatgccactgggcttcctgggtccgggcggttctgatattcaactgacccagagcccttcttccctgagtgccagcgtgggtgaccgtgttacgatcacttgctcggccagccaagatatttctaactacctgaattggtaccagcagaagccaggaaaggcaccaaaagtcctgatctacttcacaagttcactgcattccggcgtaccgtcgcgctttagcggttctggcagtggtaccgacttcaccctgactatctcgagtctgcaacctgaggattttgctacatattactgtcagcaatattcgaccgtgccgtggacgttcgggcagggcaccaaagtggagattaaggggggtggaggcagcgggggaggtggctcaggcggtggagggtctggcgaggtccagctggtagaaagcgggggcggactggtccaaccgggcggatccctgcgtctgagctgcgcggcctcgggttacgactttactcactacggaatgaactgggttcgccaagcccctggtaaaggtctggaatgggtcggatggattaatacatacactggagaacctacttatgctgctgatttcaaacgtcgctttactttctctctggatacaagtaagtcaaccgcctatctgcaaatgaacagcctgcgtgcagaggacacggctgtgtactattgtgcgaaatatccttattattatggaacttcccactggtatttcgatgtatggggccagggtactctggttacagtgtcgggcggtagcggcgccatggttagatctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgagggtctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
Аминокислотная последовательность 314 ММ/ММР-9 СМ/антитела scFv-Fc против VEGF
GQSGQRPPCCRDYSILECCKSDGGSGGSGQGGQVHMPLGFLGPGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSGGSGAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
Экспрессия. 10 мкг экспрессирующих векторов для 306 ММ/ММР-9 СМ/scFv-Fc против VEGF, 314 ММ/ММР-9 СМ/scFv-Fc против VEGF или scFv-Fc против VEGF вводили в 107 свободных клеток НЕК-293 (Invitrogen, CA), используя трансфектамин 2000 в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, CA). Трансфицированные клетки инкубировали еще 72 часа. После инкубации кондиционированную среду собирали и очищали клетки и дебрис центрифугированием. Кондиционированную среду анализировали в отношении активности методом ELISA.
Пример 8. Измерение активации маскированного ММР-9-расщепляемого активируемого антитела
Для измерения активации маскированных ММР-9-расщепляемых антител против VEGF, активируемых ММР-9, в лунки титрационного микропланшета (96 Well East Wash, Corning) добавляли 100 мкл 2 мкг/мл раствора VEGF в PBS и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем лунки блокировали 3×15 минут 300 мкл суперблокатора (Pierce). Затем в лунки добавляли сто микролитров активируемого антитела (смотрите ниже подробное описание каждой конструкции), обработанного или необработанного ММР-9, в PBST с 10% суперблокатора и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Все стадии промывки повторяли три раза, используя 300 мкл PBST. Затем добавляли сто микролитров вторичного детектирующего реагента и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Обнаружение HRP завершали, используя 100 мкл одного раствора ТМВ (Pierce). Реакцию прекращали, добавляя 100 мкл 1 н. раствора HCl и измеряли оптическую плотность при 450 нМ.
Анализ ELISA конструкции активируемого антитела, содержащей МВР/ММ/ММР-9 СМ/антитело scFv против VEGF
Двести микролитров биотинилированного активируемого антитела в буфере для расщепления ММР-9 (50 мМ трис-буфера, 2 мМ CaCl2, 20 мМ NaCl, 100 мкМ ZnCl2, рН 6,8) в концентрации 200 нМ расщепляли 20 ед. протеазы TEV в течение ночи при 4°С для удаления партнера гибридизации с МВР. Образцы затем инкубировали в течение 3 часов с ~3 ед. ММР-9 или без него при 37°С, разводили в отношении 1:1 до конечной концентрации, равной 100 нМ, в PBST с 10% суперблокатора и вводили в лунки планшета для ELISA. Активируемое антитело обнаруживали при помощи конъюгата авидин-HRP, разведенного в отношении 1:7500. Активация ММР-9-расщепляемого маскированного активируемого антитела scFv против VEGF, содержащего МВР, под воздействием ММР-9 показана на фиг.5.
Анализ ELISA конструкции активируемого антитела, содержащей ММ/ММР-9 СМ/scFv против VEGF с меткой His
Неочищенные периплазматические экстракты, диализованные в буфере для расщепления ММР-9 (150 мкл), инкубировали с ~3 ед. ММР-9 или без него в течение 3 часов при 37°С. Затем образцы разводили до 400 мкл при помощи PBST с 10% суперблокатора и добавляли в лунки планшета для ELISA. Активируемое антитело обнаруживали, используя конъюгат пероксидазы из хрена (HRP) с антителом против His6, разведенный в отношении 1:5000. Активация ММР-9-расщепляемого маскированного scFv против VEGF с меткой His под воздействием ММР-9 показана на фиг.6.
Анализ ELISA конструкции активируемого антитела, содержащей ММ/ММР-9 СМ/scFv-Fc против VEGF
Пятьдесят микролитров супернатанта клеток НЕК добавляли к 200 мкл буфера для расщепления ММР-9 и инкубировали с ~19 ед. ММР-9 или без него в течение 2 часов при 37°С. Затем образцы разводили в отношении 1:1 в PBST с 10% суперблокатора и добавляли 100 мкл в лунки планшета для ELISA. Активируемое антитело обнаруживали, используя конъюгат HRP с антителом против Fc человека, разведенный в отношении 1:2500. Активация ММР-9-расщепляемого маскированного scFv-Fc против VEGF под воздействием ММР-9 показана на фиг.7.
Очистка и анализ конструкции активируемого антитела, содержащей ММ/ММР-9 СМ/scFv-Fc против VEGF
Активируемые антитела, содержащие scFv-Fc против VEGF, очищали при помощи хроматографии на колонке с белком А. 10 мл супернатантов клеток НЕК разводили в отношении 1:1 при помощи PBS и добавляли к 0,5 мл смолы белка А, предварительно уравновешенной в PBS. Колонки промывали 10 объемами PBS, элюировали связанный белок 170 мМ ацетата, 300 мл NaCl, рН 2,5 и сразу же нейтрализовали 1 мл фракции 200 мкл 2 М раствора трис-буфера, рН 8,0. Фракции, содержащие белок, концентрировали в концентрирующих центрифугах Amicon Ultra. Анализ ELISA выполняли аналогично анализу супернатантов клеток НЕК. Данные анализа ELISA, показывающие ММР-9-зависимое связывание VEGF конструкциями активируемого антитела, содержащего scFv-Fc против VEGF с маскирующими частями 306 и 314, которые были очищены на колонке с белком А, представлены на фиг.8.
Пример 9. Анализ замещения мишенью, выполняемый для обнаружения и проверки правильности эффективно маскированных терапевтических белков
VEGF адсорбировали в лунки 96-луночного титрационного микропланшета, промывали и блокировали молочным белком. В сенсибилизированные лунки вводили 25 мл культуральной среды, содержащей антитело против VEGF или активируемые антитела против VEGF, содержащие ММ JS306, и инкубировали в течение 1, 2, 4, 8 или 24 часов. После инкубации лунки промывали и при помощи иммунологического анализа с использованием антитела против huIgG измеряли степень связывания активируемого антитела. На фиг.9 показано, что маска 306 может полностью ингибировать связывание с VEGF в течение одного часа; однако через 16 часов >50% антитела против VEGF, содержащего маску 306, было связано с антигеном VEGF. Маска 306, которая связывается с антителом против VEGF со сродством >600 нМ, эффективно не предотвращала связывание с VEGF.
Пример 10. Скрининг библиотеки и выделение маскирующих частей антитела против CTLA4
Маскирующие части (ММ) антитела против CTLA4 выделяли из комбинаторной библиотеки, содержащей 1010 произвольных 15-мерных пептидов, отображаемых на поверхности E. coli методом, описанным в публикации Бессетта и др. (Bessette, P.H., Rice, J.J. and Daugherty, P.S., Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display. Protein Eng. Design & Selection. 17:10, 731-739, 2004). Биотинилированное мышиное антитело против CTLA4 (клон UC4 F10-11, 25 нМ) инкубировали с библиотекой и связанные с антителом бактерии, экспрессирующие предполагаемые связывающие пептиды, отделяли путем магнитной сортировки от несвязанных антител, используя магнитные наногранулы, покрытые стрептавидином. Последующие циклы обогащения выполняли методом FACS. В первом цикле FACS бактерии сортировали, используя биотинилированную мишень (5 нМ) и во втором цикле метили стрептавидин-фикоэритрином. В последующих циклах FACS сортировку производили с использованием антитела, меченного флуоресцентным красителем Dylight, при этом концентрацию мишени уменьшали (1 нМ, затем 0,1 нМ) во избежание эффектов авидности на второй стадии мечения и отбора связывающих частей с наибольшим сродством. В результате выполнения одного цикла MACS и трех циклов FACS был получен пул связывающих частей, из которого были секвенированы отдельные клоны. Для определения относительного сродства выполняли скрининг отдельных клонов, используя Fab-фрагмент антитела, расщепленный фицином и меченный Dylight, для уменьшения эффектов амидности двухвалентного антитела в результате экспрессии нескольких пептидов на бактериальной поверхности. В качестве дополнительной проверки специфичности мишени отдельные клоны исследовали на связывание в присутствии 20 мкМ инактивированного IgG E. coli в качестве конкурирующего вещества. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности 4 клонов, выбранные для оптимизации маскирующей части, показаны в таблице 15. Указанные последовательности взаимозаменяемо определяются как 115ММ, 184ММ, 182ММ и 175ММ. Маскирующие части-кандидаты с рядом отклонений от нормы были выбраны для определения влияния отклонений от нормы на диссоциацию маскирующей части после расщепления. Маскирующую часть, которая не связывалась с антителом против CTLA4, использовали в качестве негативного контрольного образца.
Таблица 15
Аминокислотные и нуклеотидные последовательности для маскирующих частей, которые маскируют антитело против CTLA4
КК115 ММ
M I L L C A A G R T W V E A C A N G R
ATGATTTTGTTGTGCGCGGCGGGTCGGACGTGGGTGGAGGCTTGCGCTAATGGTAGG
КК184 ММ
A E R L C A W A G R F C G S
GCTGAGCGGTTGTGCGCGTGGGCGGGGCGGTTCTGTGGCAGC
КК182 ММ
W A D V M P G S G V L P W T S
TGGGCGGATGTTATGCCTGGGTCGGGTGTGTTGCCGTGGACGTCG
КК175 ММ
S D G R M G S L E L C A L W G R F C G S
AGTGATGGTCGTATGGGGAGTTTGGAGCTTTGTGCGTTGTGGGGGCGGTTCTGTGGCAGC
Негативный контрольный образец (не связывается с антителом против CTLA4)
P C S E W Q S M V Q P R C Y Y
GCCGTGTTCTGAGTGGCAGTCGATGGTGCAGCCGCGTTGCTATTA
Пример 11. Клонирование scFv против CTLA4
ScFv против CTLA4 клонировали из линии клеток гибридомы НВ304 (Американская коллекция типовых культур), секретирующей антитело UC4F10 против CTLA4 мыши, методом, описанный Гиллиландом и др. (Gilliland L. K., N.A. Norris. H. Marquardt, T.T. Teu, M.S. Hayden, M. G. Neubauer, D.E. Yelton, R.S. Mittler. Rapid and relible cloning of antibody variable regions and generation of recombinant single chain antibody fragments. Tissue Antigens 47:1, 1-20, 1996). Подробную версию указанного метода можно найти на Web-сайте, указывая http://www перед адресом .ibms.sinica.edu.tw/~sroff/protocols/scFv/htm. Полную РНК выделяли из гибридом при помощи набора для выделения полной РНК RNeasy (Qiagen). Праймеры IgK1 (gtyttrtgngtnacytcrca) и IgH1 (acdatyttyttrtcnacyttngt) (вышеуказанная публикация Gilliland et al.) использовали для синтеза первой цепи вариабельной области легкой и тяжелой цепей. С помощью концевой трансферазы добавляли концевой поли-G-сегмент и выполняли ПЦР, используя 5'-концевой праймер ANCTAIL (Gilliland et al., вышеуказанная ссылка) (cgtcgatgagctctagaattcgcatgtgcaagtccgatggtcccccccccccccc), содержащую сайты EcoRI, SacI и XbaI для легкой и тяжелой цепей (специфичную для концевого поли-G-сегмента), 3'-концевой праймер HBS-hIgK (cgtcatgtcgacggatccaagcttacyttccayttnacrttdatrtc) и HBS-hIgH (cgtcatgtcgacggatccaagcttrcangcnggngcnarnggrtanac), выделенную из последовательностей константной области мышиного антитела и содержащую сайты HindIII, BamHI и SalI для амплификации легкой и тяжелой цепей (Gilliland et al., вышеуказанная ссылка). Конструкции и вектор расщепляли при помощи HindIII и SacI, лигировали и трансформировали в E. coli. Отдельные колонии секвенировали и подтверждали правильные последовательности для VL и VH (таблицы 16 и 17 соответственно), сравнивая с существующими антителами мыши и хомячка. Лидерные последовательности, описанные для антитела против CTLA4 в представленной последовательности, обычно также именуются сигнальной последовательностью или лидерной последовательностью секреции и являются аминокислотной последовательностью, управляющей секрецией антитела. Указанная последовательность отщепляется клеткой в процессе секреции и не входит в зрелый белок. Кроме того, такое же антитело scFv, клонированное Тувом и др. (Tuve, S., Chen, B.M., Liu, Y., Cheng, T-L., Toure P., Sow, P.S., Feng, Q., Kiviat, N., Strauss, E., Ni, S., Li, Z., Roffler, S.R. и Lieber, A. Combination of Tumor Site - Located CTL-Associated Antigen-4 Blockade and Systemic Regulatory T-Cell Depletion Induces Tumor Destructive Immune Responses. Cancer Res. 67:12, 5929-5939, 2007), было идентично последовательностям, представленным в настоящем описании изобретения.
Таблица 16
Вариабельная область легкой цепи (VL) антитела хомячка против CTLA4 мыши
Лидерная последовательность
M E S H I H V F M S L F L W V S G S C A D I M M T Q S P S S L S V S A G E K A T I S C K S S Q S L F N S N A K T N Y L N W Y L Q K P G Q S P K L L I Y Y A S T R H T G V P D R F R G S G T D F T L T I S S V Q D E D L A F Y Y C Q Q W Y D Y P Y T F G A G T K V E I K
atggaatcacatatccatgtcttcatgtccttgttcctttgggtgtctggttcctgtgcagacatcatgatgacccagtctccttcatccctgagtgtgtcagcgggagagaaagccactatcagctgcaagtccagtcagagtcttttcaacagtaacgccaaaacgaactacttgaactggtatttgcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatctattatgcatccactaggcatactggggtccctgatcgcttcagaggcagtggatctgggacggatttcactctcaccatcagcagtgtccaggatgaagacctggcattttattactgtcagcagtggtatgactacccatacacgttcggagctgggaccaaggtggaaatcaaa
Таблица 17
Вариабельная область тяжелой цепи (VH) антитела хомячка против CTLA4 мыши
Лидерная последовательность
K M R L L G L L Y L V T A L P G V L S Q I Q L Q E S G P G L V N P S Q S L S L S C S V T G Y S I TS G Y G W N W I R Q F P G Q K V E W M G F I Y Y E G S T Y Y N P S I K S R I S I T R D T S K N Q F F L Q V N S V T T E D T A T Y Y C A R Q T G Y F D Y W G Q G T M V T V S S
aagatgagactgttgggtcttctgtacctggtgacagcccttcctggtgtcctgtcccagatccagcttcaggagtcaggacctggcctggtgaacccctcacaatcactgtccctctcttgctctgtcactggttactccatcaccagtggttatggatggaactggatcaggcagttcccagggcagaaggtggagtggatgggattcatatattatgagggtagcacctactacaacccttccatcaagagccgcatctccatcaccagagacacatcgaagaaccagttcttcctgcaggtgaattctgtgaccactgaggacacagccacatattactgtgcgagacaaactgggtactttgattactggggccaaggaaccatggtcaccgtctcctca
Пример 12. Конструирование scFv против CTLA4 с маскирующими частями и расщепляемыми частями
Чтобы определить оптимальную ориентацию scFv против CTLA4 для экспрессии и функционирования, были сконструированы праймеры для амплификации методом ПЦР вариабельных областей легкой и тяжелой цепей с половиной линкера (GGGS)3 у N- или С-конца для последующего выполнения ПЦР со ”сплайсингом при помощи перекрывающего удлиняющего сегмента” (SOE-ПЦР; Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K. and Pease, L.R. (1989) Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77, 61-68) VH или VL у N-конца. Сайт рестрикции NdeI был сконструирован у N-конца для образования инициирующего кодона в рамке считывания в начале нуклеотидной последовательности, метка His и терминирующий кодон были добавлены к С-концу. Легкую и тяжелую цепи затем соединяли при помощи сшивающей ПЦР, используя внешние праймеры для конструирования scFv в VHVL и VLVH (фиг.10). Праймеры представлены ниже в таблице 18.
Таблица 18
Праймеры для конструирования VHVL и VLVH scFv
VL for1 caaggaccatagcatatggacatcatgatgacccagtct
VL линкер rev1 acttccgcctccacctgatccaccaccacctttgatttccaccttggtcc
линкер VH for2 ggatcaggtggaggcggaagtggaggtggcggttcccagatccagcttcaggagtcagga
VH his rev2 ggccggatccaagcttttagtggtgatggtgatgatgtgaggagacggtgaccatggttcc
VH for3 acaaggaccatagcatatgcagatccagcttcaggagtca
VH линкер rev3 acttccgcctccacctgatccaccaccacctgaggagacggtgaccatggttcc
линкер VL for4 ggtggatcaggtggaggcggaagtggaggtggcggttccgacatcatgatgacccagtctcct
VL his rev4 cggccggatccaagcttttagtggtgatggtgatgatgtttgatttccaccttggtcccagc
Затем был сконструирован набор перекрывающихся праймеров для добавления сайтов sfi и xho1 с целью клонирования маскирующей части с последующей ММР-9-расщепляемой последовательностью и линкером (GGS)2 у N-конца конструкций scFv. Указанные праймеры приведены в таблице 19 и схематически показаны на фиг.10.
Таблица 19
Праймеры для клонирования маскирующей части и расщепляемой части
for1c линкер gccagtctggccggtagggctcgagcggccaagtgcacatgccactgggcttcctgggtc
for1d линкер VL gccactgggcttcctgggtccgggtggaagcggcggctcagacatcatgatgacccagtc
for1e линкер VH gccactgggcttcctgggtccgggtggaagcggcggctcacagatccagcttcaggagtca
for1a ttcaccaacaaggaccatagcatatgggccagtctggccggtagggc
VH his rev2 ggccggatccaagcttttagtggtgatggtgatgatgtgaggagacggtgaccatggttcc
VH линкер rev3 acttccgcctccacctgatccaccaccacctgaggagacggtgaccatggttcc
Содержащие линкер scFv амплифицировали методом ПЦР, расщепляли при помощи Ndel и EcoRI (внутренний сайт рестрикции в VH) и очищали гель-хроматографией. Фрагменты, полученные при помощи ПЦР, лигировали в векторы и трансформировали в E. coli. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности приведены в таблице 20.
Таблица 20
Последовательность линкера маскирующей части - расщепляемой части - линкера антитела scFv против CTLA4
Аминокислотная последовательность:
(-------MM Линкер-------) (---------------------CM-------------------) (-scFv Линкер-)
G G S G G S G G S S G Q V H M P L G F L G P G G S G G S
Нуклеотидная последовательность:
GGCGGTTCTGGTGGCAGCGGTGGCTCGAGCGGCCAAGTGCACATGCCACTGGGCTTCCTGGGTCCGGGTGGAAGCGGCGGCTCA
Последовательности маскирующей части амплифицировали методом ПЦР, расщепляли на сайтах sfi1 и xho1, лигировали в конструкции scFv против CTLA4 с линкером, трансформировали в E. coli и секвенировали. Полные нуклеотидная и аминокислотная последовательности ММ115-СМ-АВ приведены ниже соответственно в таблицах 21 и 22.
Таблица 21
Аминокислотная последовательность ММ115-антитела scFv против CTLA4
M I L L C A A G R T W V E A C A N G R G G S G G S G G S S G Q V H M P L G F L G P G G S G G S Q I Q L Q E S G P G L V N P S Q S L S L S C S V T G Y S I T S G Y G W N W I R Q F P G Q K V E W M G F I Y Y E G S T Y Y N P S I K S R I S I T R D T S K N Q F F L Q V N S V T T E D T A T Y Y C A R Q T G Y F D Y W G Q G T M V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S D I M M T Q S P S S L S V S A G E K A T I S C K S S Q S L F N S N A K T N Y L N W Y L Q K P G Q S P K L L I Y Y A S T R H T G V P D R F R G S G S G T D F T L T I S S V Q D E D L A F Y Y C Q Q W Y D Y P Y T F G A G T K V E I K
Таблица 22
Нуклеотидная последовательность ММ115-антитеа scFv против CTLA4
atgattttgttgtgcgcggcgggtcggacgtgggtggaggcttgcgctaatggtaggggcggttctggtggcagcggtggctcgagcggccaagtgcacatgccactgggcttcctgggtccgggtggaagcggcggctcacagatccagcttcaggagtcaggacctggcctggtgaacccctcacaatcactgtccctctcttgctctgtcactggttactccatcaccagtggttatggatggaactggatcaggcagttcccagggcagaaggtggagtggatgggattcatatattatgagggtagcacctactacaacccttccatcaagagccgcatctccatcaccagagacacatcgaagaaccagttcttcctgcaggtgaattctgtgaccactgaggacacagccacatattactgtgcgagacaaactgggtactttgattactggggccaaggaaccatggtcaccgtctcctcaggtggtggtggatcaggtggaggcggaagtggaggtggcggttccgacatcatgatgacccagtctccttcatccctgagtgtgtcagcgggagagaaagccactatcagctgcaagtccagtcagagtcttttcaacagtaacgccaaaacgaactacttgaactggtatttgcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatctattatgcatccactaggcatactggggtccctgatcgcttcagaggcagtggatctgggacggatttcactctcaccatcagcagtgtccaggatgaagacctggcattttattactgtcagcagtggtatgactacccatacacgttcggagctgggaccaaggtggaaatcaaacatcatcaccatcaccactaa
С целью конструирования гибридов ММ-СМ-scFv-Fc против CTLA4 были сконструированы праймеры, приведенные в таблице 23, для амплификации методом ПЦР конструкций, предназначенных для клонирования в вектор pfuse Fc при помощи системы гибридизации (Clontech). Плазмиды трансформировали в E. coli и проверяли последовательность отдельных клонов.
Таблица 23
Праймеры для конструирования гибридов ММ-СМ-scFv против CTLA4
HLCTLA4ScFv pFuse нижний праймер tcagatctaaccatggctttgatttccaccttggtcc
LHCTLA4ScFv pFuse нижний праймер tcagatctaaccatggctgaggagacggtgaccatgg
p115CTLA4 pfuse верхний праймер cacttgtcacgaattcgatgattttgttgtgcgcggc
p182CTLA4 pfuse верхний праймер cacttgtcacgaattcgtgggcggatgttatgcctg
p184CTLA4 pfuse верхний праймер cacttgtcacgaattcggctgagcggttgtgcgcgtg
p175CTLA4 pfuse верхний праймер cacttgtcacgaattcgagtgatggtcgtatggggag
pnegCTLA4 pfuse верхний праймер cacttgtcacgaattcgccgtgttctgagtggcagtcg
Пример 13. Экспрессия и анализ маскированного/ММР-9/антитела scFv-Fc против CTLA4 в клетках НЕК-293
10 мкг экспрессирующих векторов для p175CTLA4pfuse, p182CTLA4pfuse, p184CTLA4pfuse, p115CTLA4pfuse или pnegCTLA4pfuse трансфицировали в 107 свободных клеток НЕК-293 (Invitrogen), используя трансфектамин 2000 в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen). Трансфицированные клетки инкубировали в течение 72 часов. После инкубации кондиционированную среду собирали и очищали клетки и дебрис центрифугированием. Кондиционированную среду анализировали в отношении активности при помощи описанного ниже анализа ELISA.
Пятьдесят микролитров кондиционированной среды из клеток НЕК-293, экспрессирующих ММ175-scFv против CTLA4, ММ182-scFv против CTLA4, ММ184-scFv против CTLA4, ММ115-scFv против CTLA4 или scFV против CTLA4 без маскирующей части, вводили в 200 мкл буфера для расщепления ММР-9 и инкубировали с ~19 ед. ММР-9 или без него в течение 2 часов при 37°С. Затем образцы разводили в отношении 1:1 в PBS с 4% обезжиренного сухого молока (NFDM) и анализировали в отношении активности связывания при помощи конкурентного анализа ELISA.
100 мкл 0,5 мг/мл раствора мышиного слитого белка CTLA4-Fc (R & D Systems) в PBS вводили в лунки 96-луночного планшета Easy Wash (Corning) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем лунки блокировали в течение одного часа при комнатной температуре 100 мкл 2% обезжиренного сухого молока (NFDM) в PBS и трижды промывали PBS с 0,05% твина-20 (PBST). В лунки добавляли 50 мкл кондиционированной среды из культур трансфицированных клеток НЕК-293, экспрессирующих ММ175-scFv против CTLA4, ММ182-scFv против CTLA4, ММ184-scFv против CTLA4, ММ115-scFv против CTLA4 или scFV против CTLA4 без маскирующей части, которые ранее не обрабатывали или обрабатывали ММР-9, и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. После инкубации в каждую лунку добавляли 50 мкл PBS, содержащего 0,5 мкг/мл биотинилированного мышиного белка В71-Fc (R & D Systems). После последующей инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут лунки пять раз промывали 150 мкл PBST. Добавляли 100 мкл PBS, содержащего комплекс авидин-HRP, разведенный в отношении 1:3000, планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 45 минут и 7 раз промывали 150 мкл PBST. Анализ ELISA выполняли, используя 100 мкл ТМВ (Pierce), реакцию прекращали, добавляя 100 мкл 1 н. раствора HCl, и измеряли оптическую плотность при 450 нМ.
Пример 14. Конструирование антитела против CTLA4
В таблицах 24 и 25 приведены соответственно нуклеотидная и аминокислотная последовательности scFv против CTLA-4 человека. Бактериофаг М13, способный связывать CTLA человека, был предоставлен (по контракту компанией Creative Biolabs, 21 Brookhaven Blvd., Port Jefferson Station, NY 11776). Фаг был продуцироован в E. coli TG-1 и очищен путем преципитации PEG и NaCl.
Таблица 24
Нуклеотидная последовательность антитела scFv против CTLA4 человека
gaaattgtgttgacacagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcaccgctcactttcggcggagggaccaaggtggaaatcaaacgttccggagggtcgaccataacttcgtataatgtatactatacgaagttatcctcgagcggtacccaggtgcagctggtgcagactgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggatccacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggtggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgacaaactccctttactggtacttcgatctctggggccgtggcaccctggtcactgtctcttcagctagc
Таблица 25
Аминокислотная последовательность антитела scFv против CTLA4 человека
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGGTKVEIKRSGGSTITSYNVYYTKLSSSGTQVQLVQTGGGVVQPGRSLRLSCAASGSTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIAGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATNSLYWYFDLWGRGTLVTVSSAS
Измерение связывания CTLA-4 при помощи анализа ELISA на фаге
Для измерения связывания scFv-C2 против CTLA-4 в лунки микропланшета (96-луночный планшет Well East; Corning) вводили 100 мкл 0,5 мкг/мл CTLA-4-IgG человека или CTLA-4-IgG мыши (R&D Systems) в PBS и инкубировали в течение ночи при 4°С. Лунки блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре 150 мкл 2% обезжиренного сухого молока (NFDM) в PBST (PBS, рН 7,4, 0,5% твина-20). Затем лунки трижды промывали 300 мкл PBST. После промывки в три одинаковые лунки добавляли 100 мкл очищенного фага scFv против CTLA-4 в PBST и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем лунки трижды промывали 300 мкл PBST. Добавляли сто микролитров антитела, конъюгированного с HRP против М13, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Обнаружение HRP заканчивали, добавляя 100 мкл раствора ТМВ (Pierce). Реакцию прекращали, добавляя 100 мкл 1 н раствора HCl, и измеряли оптическую плотность при 450 нМ. На фиг.19 показано связывание scFv против CTLA-4 с CTLA-4 мыши и человека.
Активируемые антитела, содержащие IgG в качестве антитела
В следующих разделах приведены примеры активируемых антител, содержащих IgG человека против EGFR и VEGF. Указанные активируемые антитела являются маскированными и неактивными в нормальных условиях. Активируемые антитела, достигшие больной ткани, расщепляются специфичной для заболевания протеазой и затем могут связываться с мишенью. Для обнаружения приемлемых маскирующих частей для антител против EGFR и VEGF использовали бактериальный дисплей. В приведенных примерах отобранные маскирующие части объединены с субстратом для фермента, используемым в качестве пускового механизма для конструирования активируемых антител, специфически связывающихся с мишенью после активации протеазой. Кроме того, бактериальный дисплей использовали для изменения обнаруженных пептидов с целью увеличения сродства к антителам и усиления ингибирования связывания с мишенью в нерасщепленном состоянии. Более высокое сродство маскирующей части и более сильное ингибирование имеют важное значение для правильного функционирования активируемого антитела.
Пример 15. Конструирование АА, содержащего IgG против VEGF
Конструирование антитела IgG против VEGF
Вариабельную область легкой цепи антитела против VEGF амплифицировали при помощи ПЦР с праймерами СХ0311 и СХ0702, используя антитело mmp-9 306 scFv против VEGF (описанное выше) в качестве матрицы, и затем клонировали в вектор pFIL2-CL-hk, используя сайты рестрикции EcoRI и BsiWI (pFIL2-VEGF-Lc). Легкую цепь 306 mmp-9 амплифицировали при помощи ПЦР с праймерами СХ0325 и СХ0702, используя антитело mmp-9 scFv против VEGF в качестве матрицы, и клонировали, как было описано выше (pFIL2-306m VEGF-Lc). Вариабельные области тяжелой цепи антитела против VEGF амплифицировали при помощи ПЦР с праймерами СХ0700 и СХ0701, используя 306 ММ/ММР-9 СМ/scFv против VEGF (описанное выше) в качестве матрицы, и клонировали в вектор pFIL-CHIg-hG1, используя сайты рестрикции EcoRI и NheI (pFIL-VEGF-Hc). Праймеры приведены в нижеследующей таблице 26.
Таблица 26
Праймеры для конструирования антитела IgG против VEGF
СХ0311 cttgtcacgaattcggatattcaactgacccagagc
СХ0702 gtgcagccaccgtacgcttaatctccactttggtg
СХ0325 tgcttgctcaactctacgtc
СХ0289 gctttcaccgcaggtacttccgtagctggccagtctggcc
СХ0687 cgctccatgggccaccttggccgctgccaccgctcgagcc
СХ0700 cacttgtcacgaattcggaggtccagctggtagaaag
СХ0701 ggcccttggtgctagcgctcgacactgtaaccagagtac
Таблица 27
Последовательности для тяжелой и легкой цепи антитела против VEGF
pFIL2-CL-hk анти-VEGF Lc (pFIL2-VEGF-Lc)
gatattcaactgacccagagcccttcttccctgagtgccagcgtgggtgaccgtgttacgatcacttgctcggccagccaagatatttctaactacctgaattggtaccagcagaagccaggaaaggcaccaaaagtcctgatctacttcacaagttcactgcattccggcgtaccgtcgcgctttagcggttctggcagtggtaccgacttcaccctgactatctcgagtctgcaacctgaggattttgctacatattactgtcagcaatattcgaccgtgccgtggacgttcgggcagggcaccaaagtggagattaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Как было указано выше, маска 306, используемая при конструировании активируемого антитела против VEGF, неэффективно маскировала связывание с мишенью при продолжительном воздействим мишени из-за низкого сродства маскирующей части к антителу. Одним способом увеличения сродства маскирующей части является созревание аффинности пептида, описанное ниже.
Конструирование библиотеки для созревания аффиности
Маскирующую часть 306 антитела против VEGF подвергали созреванию аффинности методом случайного отбора. Библиотека отображения на клетках есрХ была сконструирована при соотношениях нуклеотидов, показанных в таблице 28. Конечная вариабельность библиотеки (306 SR) была равна примерно 2,45×108.
Таблица 28
Исходное основание Соотношение оснований
G G=70%; T=8%; A=11%; C=11%
T T=70%; G=8%; A=11%; C=11%
A A=80%; G=5%; T=6%; C=9%
C C=80%; G=5%; T=6%; A=9%
Скрининг библиотеки 306 SR
Начальный цикл MACS выполняли, используя магнитные шарики, меченные белком А, и клетки в количестве, обеспечивающем более, чем 100-кратную избыточную выборку библиотеки. До выполнения магнитного отбора клетки инкубировали с 100 нМ IgG против VEGF и 10 мкМ пептида 306 (306Р, PCSEWQSMVQPRCYYG) для уменьшения связывания вариантов с одинаковым или более низким сродством по сравнению с исходной последовательностью 306. Магнитный отбор позволил выделить 2×107 клеток.
Первый цикл сортировки методом FACS выполняли с использованием клеток, меченных 1 нМ флуоресцентного красителя DyLight (fluor 530 нМ) против VEGF. Для избирательного давления популяци второй и третий циклы FACS выполняли с использованием клеток, меченных 1 нМ DyLight против VEGF в присутствии 100 нМ пептида 306. Параметры отбора были заданы с возможностью отбора только 5% клеток с наибольшим связыванием. Популяцию клеток, сортированную в третьем цикле, сначала инкубировали с 10 нМ DyLight против VEGF, затем добавляли пептид 306 до конечной концентрации 100 нМ и инкубировали при 37°С в течение 20 минут. Собирали лучшие 2% позитивной популяции, характеризующиеся связыванием, с которым не конкурировал пептид 306. Циклы 5-7 анализа FACS выполняли следующим образом: популяции метили 10 нМ DyLight против VEGF и подвергали конкурентному связыванию с немеченым VEGF (100 нМ) при 37°С в течение соответственно 7, 10 и 15 минут. При выполнении циклов 5-7 анализа FACS был выделен лучший 1% популяции клеток.
Таблица 29
Пептидные последовательности 306SR M1F7
JS306 PCSEWQSMVQPRCYYG
JS1825 SCTAWQSMVEQRCYFG 3X
JS1826 PCSKWESMVEQRCYFA
JS1827 PCSAWQSMVEQRCYFG 2X
JS1829 PCSKWESMVLQSCYFG 4X
JS1830 TCSAWQSMVEQRCYFG 2X
JS1837 TCSQWESMVEPRCYFG
Анализ пептидов с созревшей аффинностью 306SR
Связывание клонов еСРХ3.0 306, JS1825, JS1827 и JS1829 анализировали методом FACS в 3 разных концентрациях с использованием меченного DyLight антитела против VEGF. Кривые связывания показаны на фиг.21. Все три пептида с созревшей аффинностью характеризовались по меньшей мере в 10 раз более высоким сродством по сравнению с пептидом 306.
Конструирование активируемых антител против VEGF
Клоны есрХ3.0 с созревшей аффиностью (JS1825, JS1827 и JS1829) амплифицировали при помощи ПЦР с праймерами СХ0289 и СХ0687 и клонировали в вектор pFIL2-306mVEGF-Lc, используя сайты рестрикции SfiI для получения векторов pFIL2-1825mVEGF-Lc, pFIL2-1827mVEGF-Lc и pFIL2-1829mVEGF-Lc. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности приведены в нижеследующих таблицах. В скобках указано разграничение между разными доменами последовательности: (Линкер)(ММ)(Линкер)(СМ)(Линкер)(антитело).
ТАБЛИЦЫ 30-33 (см. в конце описания)
Экспрессия и очистка антитела и активируемого антитела против VEGF
3 мкг pFIL-VEGF-Hc и 3 мкг pFIL2-VEGF-Lc котрансфицировали в клетки СНО-S (Invitrogen), используя липофектамин 200 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителей. Трансфицированные клетки культивировали в среде для свободных клеток СНО (Invitrogen) и производили отбор в отношении устойчивости к зеоцину и бластицидину. Отдельные клоны выделяли путем ограничивающего разведения и отбирали методом ELISA на основании экспрессии IgG человека, способного связываться с EGFR. Все антитела и активируемые антитела очищали хроматографией на белке А стандартными методами.
Аналогичным образом 3 мкг каждого экспрессирующего вектора для легких цепей активируемого антитела pFIL2-306mVEGF-Lc, pFIL2-1825mVEGF-Lc, pFIL2-1827mVEGF-Lc или pFIL2-1829mVEGF-Lc котрансфицировали в клетки СНО-S с 3 мкг pFIL-VEGF-Hc. Трансфицированные клетки культивировали в среде для свободных клеток СНО (Invitrogen) и производили отбор в отношении устойчивости к зеоцину и бластицидину. Отдельные клоны выделяли путем ограничивающего разведения и отбирали при помощи анализа ELISA на основании экспрессии IgG человека, способного связываться с EGFR.
Анализ замещения мишенью антитела и активируемого антитела против VEGF
VEGF адсорбировали в лунки 96-лучного титрационного микропланшета, промывали и блокировали молочным белком. Примерно 25 мл культуральной среды, содержащей антитело против VEGF или активируемое антитело против VEGF, содержащее маскирующие части JS306, JS1825, JS1827 и JS1829, вводили в сенсибилизированные лунки и инкубировали в течение примерно 1, 2, 4, 8 или 24 часов. После инкубации лунки промывали и при помощи иммунологического анализа против huIgG измеряли количество связанных активируемых антител.
Пример 16. Конструирование активируемого антитела, содержащего IgG против EGFR
Конструирование антитела IgG против EGFR
Ген вариабельной области легкой цепи С225 синтезировали при помощи ПЦР, используя олигонуклеотиды СХ638-СХ655, в соответствии с описанием, приведенным в публикации Bessette et al., Methods in Molecular Biology, vol. 231. Полученный продукт расщепляли BamHI/NotI и лигировали в большой фрагмент pXMal, расщепленный BamHI/NotI, с конструированием плазмиды pX-scFv225-Vk. Аналогичным образом ген вариабельной области тяжелой цепи С225 синтезировали при помощи ПЦР, используя олигонуклеотиды СХ656-СХ677, расщепляли BglII/NotI и лигировали в pXMal BamHI/NotI с конструированием плазмиды pX-scFv225-Vh. Ген вариабельной области легкой цепи затем клонировали из pX-scFv225-Vk в виде фрагмента BamHI/NotI в плазмиду pX-scFv225-Vh на сайте BamHI/Not с конструированием плазмиды pX-scFv225m-HL, содержащей ген scFv на основе С225.
Сигнальную последовательность IL2 удаляли из pINFUSE-hIgG1-Fc2 (InvivoGen) в виде фрагмента KasI/NcoI и переносили в pFUSE2-CLIg-hk (InvivoGen), расщепленную KasI/NcoI, в результате чего была получена плазмида pFIL2-CL-hk. Сигнальную последовательность IL2 также удаляли из pINFUSE-hIgG1-Fc2 в виде фрагмента KasI/EcoRI и переносили в pFUSE-CHIg-hG1 (InvivoGen), расщепленную KasI/EcoRI (большие и средние фрагменты), путем трехстадийного лигирования, в результате чего была получена плазмида pFIL-CHIg-hG1.
Константную область легкой цепи IgG человека подвергали сайт-специфическому мутагенезу путем амплификации из плазмиды pFUL2-CL-hk с помощью олигонуклеотидов СХ325/СХ688, расщепления BsiWI/NheI и клонирования в pFIL2-CL-hk на сайте BsiWI/NheI, в результате чего была получена плазмида pFIL2-CL225.
Константную область тяжелой цепи IgG человека подвергали сайт-специфическому мутагенезу путем амплификации из плазмиды pFIL-CHIg-hGI в трех сегментах с помощью олигонуклеотидов СХ325/СХ689, СХ690/СХ692 и СХ693/СХ694 с последующим выполнением перекрывающей ПЦР в отношении всех трех продуктов с использованием внешних праймеров СХ325/СХ694. Полученный продукт расщепляли EroRI/AvrII и клонировали в pINFUSE-hIgG1-Fc2 на сайте EcoRI/NheI, в результате чего была получена плазмида pFIL-CH225.
Сегмент гена вариабельной области легкой цепи амплифицировали из pX-scFv225m-HL с помощью олигонуклеотидов СХ695/СХ696, расщепляли BsaI и клонировали в pFIL2-CL225 на сайте EcoRI/BsiWI, в результате чего был получен экспрессирующий вектор легкой цепи С225 pFIL2-C225-light.
Сегмент гена вариабельной области тяжелой цепи амплифицировали из pX-scFv225m-HL с помощью олигонуклеотидов СХ697/СХ698, расщепляли BsaI и клонировали в pFIL-CH225 на сайте EcoRI/NheI, в результате чего был получен экспрессирующий вектор тяжелой цепи pFIL-C225-heavy.
Таблица 33.1
Праймеры, используемые при конструировании антитела IgG против EGFR
CX268 ccgcaggtacctcgagcgctagccagtctggccag
CX325 tgcttgctcaactctacgtc
CX370 aacttgtttattgcagctt
CX448 gagttttgtcggatccaccagagccaccgctgccaccgctcgagcc
CX638 gcgtatgcaggatccggcggcgatattctgctgacccaga
CX639 cacgctcagaatcaccgggctctgggtcagcagaatatcg
CX640 gcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgtgtgag
CX641 ggctcgcgcggcagctaaagctcacacgttcgcccgggct
CX642 ctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacatt
CX643 gtgcgctgctgataccaatgaatgttggtgccaatgctct
CX644 cattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgc
CX645 ttcgctcgcatatttaatcagcaggcgcgggctgccgttg
CX646 tgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgag
CX647 tgccgctgccgctaaagcggctcggaatgccgctaatgct
CX648 ccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctg
CX649 ctttccacgctgttaatgctcagggtaaaatcggtgccgc
CX650 agcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattatt
CX651 gttgttgttctgctggcaataataatccgcaatatcttcg
CX652 attgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgc
CX653 tcagttccagtttggtgcccgcgccaaaggtggtcggcca
CX654 gggcaccaaactggaactgaaacgcggccgccatcaccat
CX655 ctcccacgcgtatggtgatgatggtgatggcggccgcgtt
CX656 cgtatgcaagatctggtagcggtacccaggtgcagctgaa
CX657 ccaggcccgggccgctctgtttcagctgcacctgggtacc
CX658 acagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctg
CX659 ctcacggtgcaggtaatgctcaggctctggctcggctgca
CX660 agcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaact
CX661 gcgcacccaatgcacgccatagttggtcaggctaaagccg
CX662 atggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcct
CX663 aaatcacgcccagccattccaggcctttgcccgggctctg
CX664 ggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgat
CX665 ctggtaaacggggtgttataatcggtgttgccgccgctcc
CX666 tataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaag
CX657 cacctggcttttgctgttatctttgttaatgctcaggcgg
CX658 ataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcct
CX659 tcgcggtatcgttgctttgcaggctgttcattttaaaaaa
CX670 gcaaagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcg
CX671 tcataatcataataggtcagcgcgcgcgcgcaataataaa
CX672 ctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagg
CX673 gctcacggtcaccagggtgccctggccccaatacgcaaat
CX674 gcaccctggtgaccgtgagcgcgggtggtagcggtagcgg
CX675 taccgccgcctccagatcctccgctaccgctaccacccgc
CX676 aggatctggaggcggcggtagtagtggtggaggatccggt
CX677 tggtgatggcggccgcggccaccggatcctccaccactac
CX688 cgagctagctccctctacgctcccctgttgaagctctttg
CX690 acaagcgcgttgagcccaaatcttgtg
CX692 cagttcatcccgggatgggggcagggtg
CX693 ccccatcccgggatgaactgaccaagaaccaggtcagc
CX694 ctggccacctaggactcatttaccc
CX695 gcactggtctcgaattcggatattctgctgacccagag
CX696 ggtgcggtctccgtacgtttcagttccagtttggtg
CX697 gcactggtctcgaattcgcaggtgcagctgaaacagag
CX698 gagacggtctcgctagccgcgctcacggtcaccag
CX730 tgcgtatgcaagatctggtagcggtaccgatattctgctgacccagag
CX731 actactaccgccgcctccagatcctccgctaccgctaccacctttcagttccagtttggtg
CX732 tctggaggcggcggtagtagtggtggaggctcaggcggccaggtgcagctgaaacagag
CX733 gatggtgatggcggccgcgcgcgctcacggtcaccag
CX735 tgtcggatccaccgctaccgcccgcgctcacggtcaccag
CX740 tcacgaattcgcaaggccagtctggccagggctcgagcggtggcagcggtggctctggtggatccggcggtggca
CX741 tggtggatccggcggtggcagcggtggtggctccggcggtaccggcggtagcggtagatctgacaaaactcacac
CX747 gatccccgtctccgccagtcaaaatgatgccggaaggcggtac
CX748 cgccttccggcatcattttgactggcggagacggg
Конструирование экспрессирующих векторов для активируемых антител против EGFR
Плазмиду pX-scFv225m-HL амплифицировали при помощи ПЦР в виде отдельных реакций, выполняемых с праймерами СХ730/СХ731 и СХ732/СХ733, и полученные продукты амплифицировали при помощи перекрывающей ПЦР с внешними праймерами СХ730/СХ733, расщепляли BglII/NotI и клонировали в pXMal на сайте BamHI/NotI, в результате чего была получена плазмида pX-scFv225m-LH.
Линкерную последовательность добавляли к N-концу гена Fc-фрагмента IgG человека путем амплификации при помощи ПЦР плазмиды pFUSE-hIgG-Fc2 при выполнении реакции с перекрыванием верхних праймеров СХ740, СХ741 и нижнего праймера СХ370. Полученный продукт расщепляли EcoRI/BglII и фрагмент длиной ~115 п.о. клонировали в pFUSE-hIgG-Fc2 на сайте EcoRI/BglII. Полученную плазмиду расщепляли KpnI/BglII и большой фрагмент лигировали в KpnI/BamHI-расщепленный продукт ПЦР, полученный путем амплификации pX-scFv225m-LH с помощью олигонуклеотидов СХ736/СХ735, в результате чего была получена плазмида рРНВ3734.
Полученную плазмиду расщепляли SfiI/XhoI и маскирующий пептид 3690 клонировали в виде фрагмента SfiI/XhoI плазмиды рРНВ3690, в результате чего была получена плазмида рРНВ3783.
Добавляли субстрат для протеазы SM984, расщепляя полученную плазмиду BamHI/KpnI и лигируя продукт гибридизации фосфорилированных олигонуклеотидов СХ747/СХ748, в результате чего была получена плазмида рРНВ3822.
Сдвоенная пептидная маска была сконструирована путем расщепления полученной плазмиды при помощи XhoI, дефосфорилирования 5'-концов и клонирования в XhoI-расщепленный продукт ПЦР, полученный путем амплификации рРНВ3579 с праймерами СХ268/СХ448, в результате чего была получена плазмида рРНВ3889.
Маскирующую область, линкер, субстрат и вариабельную область легкой цепи рРНВ3783, рРНВ3822 и рРНВ3889 амплифицировали при помощи ПЦР с праймерами СХ325/СХ696, расщепляли EcoRI/BsiWI и клонировали в pFIL2-CL225 на сайте EcoRI/BsiWI, в результате чего были получены экспрессирующие векторы легкой цепи активируемого антитела рРНВ4007, рРНВ3902 и рРНВ3913.
Маскирующие пептиды с созревшей аффинностью вводили в экспрессирующие векторы легкой цепи активируемого антитела путем клонирования в виде фрагментов SfiI/XhoI. Субстраты для протеазы вводили в виде совместимых фрагментов BamHI/KpnI.
Экспрессия и очистка антитела и активируемых антител против EGFR
3 мкг pFIL-CH225-HL и 3 мкг pFIL2-CH225-light котрансфицировали в клетки СНО-S (Invitrogen), используя липофектамин 200 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителей. Трансфицированные клетки культивировали в среде для свободных клеток СНО (Invitrogen) и производили отбор в отношении устойчивости к зеоцину и бластицидину. Отдельные клоны выделяли путем ограничивающего разведения и отбирали при помощи анализа ELISA на основании экспрессии IgG человека, способного связываться с EGFR. Все антитела и активируемые антитела очищали хроматографией на белке А стандартными методами.
Аналогичным образом 3 мкг каждого экспрессирующего вектора для легких цепей активируемого антитела котрансфицировали в клетки СНО-S с 3 мкг pFIL-CH225-HL. Трансфицированные клетки культивировали в среде для свободных клеток СНО (Invitrogen) и производили отбор в отношении устойчивости к зеоцину и бластицидину. Отдельные клоны выделяли путем ограничивающего разведения и отбирали при помощи анализа ELISA на основании экспрессии IgG человека, способного связываться с EGFR.
Скрининг библиотеки маскирующих частей с созревшей аффинностью антител против EGFR
Начальный цикл MACS выполняли, используя динамические гранулы SA и 1,4×108 клеток из библиотеки ecpX3-755. До выполнения магнитного отбора клетки инкубировали с 3 нМ меченного биотином моноклонального антитела С225. В результате магнитного отбора было выделено 6×106 клеток. Первый цикл сортировки методом FACS выполняли с использованием 2×107 клеток, меченных 0,1 нМ флуоресцентного красителя DyLight (fluor 530 нМ) для моноклонального антитела С225, в результате чего было выделено 1,5×105 клеток с позитивным связыванием. Для приложения более высокого избирательного давления к популяции второй цикл FACS выполняли с использованием клеток, меченных 10 нМ DyLight для моноклонального антитела C225 в присутствии 100 мкМ пептида 3690 (CISPRGC) при 37°С. Для дальнейшего повышения избирательного давления 3-й и 4-й циклы выполняли с использованием клеток, меченных 100 нМ DyLight для моноклонального антитела C225 в присутствии 100 мкМ пептида 3690 (CISPRGC) при 37°С. Собирали лучший 1% позитивной популяции, характеризующийся связыванием, с которым не конкурировал пептид 3690. В результате измерений сродства клеток в отдельных популяциях, выделенных в результате выполнения вышеуказанного скрининга, были выявлены три пептида, 3954 (CISPRGCPDGPYVM), 3957 (CISPRGCEPGTYVPT) и 3958 (CISPRGCPGQIWHPP) со сродством к С225, которое было по меньшей мере в 100 раз больше, чем у пептида 3690 (CISPRGC). Три указанные маскирующие части были введены в активируемые антитела против EGFR. На фиг.22 показан процесс созревания аффинности некоторых маскирующих частей для антител против EGFR.
Измерение сродства для маскирующих частей С225
Измерение сродства связывания Fab-фрагмента С225 с маскирующими частями 3690, 3954 и 3957 с использованием клеток. Связывание клонов еСРХ3.0 3690, 3954 и 3957 анализировали в клеточном сортере с возбуждением флуоресценции (FACS) с использованием меченного DyLight Fab-фрагмента против EGFR в 3 разных концентрациях. Кривые связывания показаны на фиг.23. Маскирующие части 3954 и 3957 характеризовались по меньшей мере в 100 раз более высоким сродством по сравнению с маскирующей частью 3690.
Анализ замещения мишенью в активируемых антителах против EGFR
EGFR адсорбировали в лунки 96-луночного титрационного микропланшета, промывали и блокировали молочным белком. 25 мл культуральной среды, содержащей 2 нМ антитела против EGFR или активируемых антител против EGFR, содержащих маскирующие части 3690, 3957, 3954 и 3960/3579, вводили в сенсибилизированные лунки и инкубировали в течение 1, 2, 4, 8 или 24 часов. После инкубации лунки промывали и при помощи иммунологического анализа с использованием антитела против huIgG измеряли степень связывания активируемого антитела. Связывание активируемого антитела против EGFR нормализовали в отношении связывания антитела против EGFR (100%) для прямого сравнения эффективности маскировки активируемого антитела. Степени равновесного связывания в виде процентного значения связывания исходного или немодифицированного антитела показаны в таблице 34 и на фиг.24. В то время как маскирующие части 3954 и 3957 характеризуются одинаковым сродством связывания, которое в 100 раз больше, чем у 3609; маскирующая часть 3954 по меньшей мере в 2 раза эффективнее ингибирует связывание с мишенью. В нижеследующих таблицах приведены последовательности тяжелой и легкой цепей С225, маскирующих частей и активируемых антител. В нижеследующих таблицах приведены нуклеотидные и аминокислотные последовательности. В скобках указано разграничение между разными доменами последовательности: (Линкер)(ММ)(Линкер)(СМ)(Линкер)(антитело).
Таблица 34
Анализ замещения мишенью С225: процентное значение связывания исходного антитела ± стандартная ошибка среднего в разные моменты времени
Время (часы) Активируемое антитело 3690 Активируемое антитело 3954 Активируемое антитело 3975 Активируемое антитело 3690/3579
1 15,5±4,2 4,4±1,8 7,3±2,0 3,6±1,2
2 19,3±6,0 6,0±2,0 9,3±2,8 2,1±0,6
4 21,5±5,0 7,6±1,7 12,8±2,3 3,3±1,2
8 27,6±7,4 9,7±0,4 14,9±0,03 3,0±1,6
24 20,0±9,1 13,4±1,2 22,3±2,6 2,8±0,1
Таблица 35
Тяжелая цепь С225
caggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcaaagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcggctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagcgcgttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgaactgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ТАБЛИЦЫ 36-41 (см. в конце описания)
Таблица 42
Последовательности маскирующих частей С225
3690 CISPRGCG
3579 GSHCLIPINMGAPSC
3690-3579 CISPRGCGGSSASQSGQGSHCLIPINMGAPSC
3954 CISPRGCPDGPYVMY
3957 CISPRGCEPGTYVPT
3858 CISPRGCPGQIWHPP
4124 CNHHYFYTCGCISPRGCPG
4125 ADHVFWGSYGCISPRGCPG
4127 CHHVYWGHCGCISPRGCPG
4133 CPHFTTTSCGCISPRGCPG
4137 CNHHYHYYCGCISPRGCPG
4138 CPHVSFGSCGCISPRGCPG
4140 CPYYTLSYCGCISPRGCPG
4141 CNHVYFGTCGCISPRGCPG
4143 CNHFTLTTCGCISPRGCPG
4148 CHHFTLTTCGCISPRGCPG
4157 YNPCATPMCCISPRGCPG
Консенсусные последовательности маскирующих частей антитела против EGFR
Ниже приведены консенсусные последовательности маскирующих частей антитела против EGFR. Консенсусная последовательность маскирующей части 3690 (CISPRGC) является главной консенсусной последовательностью.
Таблица 43
Консенсусные последовательности маскирующих частей антитела против EGFR C225
Figure 00000001
Консенсусные последовательности антитела против EGFR, полученные в результате выполнения 2-го цикла скрининга масок с более высоким сродством
Figure 00000002
Figure 00000003
Пример 17. Обнаружение и тестирование избирательного субстрата/ расщепляемой части
В нижеследующем разделе описан процесс обнаружения и тестирования избирательного субстрата для нескольких типичных ферментов.
Обнаружение uPA-избирательного субстрата
uPA-избирательные субстраты были выделены из библиотеки бактерий 8eCLiPS, состоящей из ~108 произвольных 8-мерных субстратов, экспрессированных в виде N-концевых гибридов на поверхности E. coli. Для обогащения субстратов, оптимизированных для расщепления uPA и устойчивых к расщеплению сериновыми протеазами klk5 и 7, не являющимися мишенями, выполняли поочередные циклы позитивного и негативного отбора методом FACS. Не подвергнутую никакому воздействию библиотеку инкубировали с 8 мкг/мл uPA в течение 1 часа при 37°С и метили красителями SAPE (красный) и уРЕТ mona (зеленый). В результате расщепления uPA метка SAPE пропадала, позволяя отделить бактерии, экспрессирующие субстраты для uPA (только зеленые, позитивный отбор) от бактерий, экспрессирующих нерасщепленные пептиды (красный+зеленый). Субстраты для uPA сортировали методом FACS, после чего обогащенный пул амплифицировали и инкубировали с 5 нг/мл KLK5 и 7 в течение 1 часа при 37°С, метили SAPE и уРЕТ mona, сортировали в отношении отсутствия расщепления указанными протеазами, не являющимися мишенями (красный+зеленый, негативный отбор). Полученный пул амплифицировали и сортировали, выполняя 4 дополнительных поочередных цикла позитивного и негативного отбора методом FACS с использованием уменьшающихся концентраций uPA (4 мкг/мл, 2 мкг/мл) и увеличивающихся концентраций klk5 и 7 (5 нг/мл, 10 нг/мл). Отдельные клоны, полученные в результате выполнения 3 последних циклов FACS, секвенировали и группировали по несколько консенсусных последовательностей (таблица 44). Клоны с каждой консенсусной последовательностью отдельно анализировали в отношении расщепления, используя разные концентрации uPA, klk5 и 7 и плазмина в отношении специфичности расщепления протеазами, не являющимися мишенями, приведенными в таблице 44. На фиг.25 показано, что в отличие от контрольного образца uPA и субстрата SM16 клоны КК1203, 1204 и 1214 были устойчивы к расщеплению KLK5, KLK7 и плазмином.
Таблица 44
Консенсусные последовательности uPA
Figure 00000004
Figure 00000005
Figure 00000006
Обнаружение субстрата, избирательного к плазмину
Субстраты, избирательные к плазмину, выделяли из библиотеки бактерий, содержащей плазмин второго поколения 10eCLiPS, которая состоит из ~108 произвольных 10-мерных субстратов, экспрессированных в виде N-концевых гибридов на поверхности E. coli (ссылка). Чередующиеся циклы позитивного и негативного отбора методом FACS были использованы для обогащения субстратов, оптимизированных в отношении расщепления плазмином и устойчивых к расщеплению матриксными металлопротеиназами, не являющимися мишенями, (представленными ММР-9) и сериновыми протеазами (представленными klk5 и klk7).
Библиотека плазминов 10eCLiPS второго поколения была сконструирована на основе консенсусной последовательности, идентифицированной авторами изобретения путем отбора не подвергнутого никакому воздействию 8eCLiPS, для обнаружения быстро расщепляемых субстратов для плазмина, с использованием для отбора низких концентраций, равных 30 пМ плазмина. Отдельные остатки в 10-мере были произвольными (n=20), ограниченными (1<n<20) или фиксированными (n=1) для смещения пептида в направлении консенсусной последовательности, обеспечивая необходимую гибкость для понижающего отбора из неблагоприятных последовательностей, не являющихся мишенью.
Библиотеку плазминов 10eCLiPS второго поколения инкубировали с 300 пМ плазмина в течение 1 часа при 37°С и метили меткой SAPE (красный) и уРЕТ mona (зеленый). Расщепление плазмином вызывает утрату метки SAPE и позволяет отделить бактерии, экспрессирующие субстраты для плазминов (только зеленый, позитивный отбор), от бактерий, экспрессирующих нерасщепленные пептиды (красный+зеленый). Субстраты для плазмина сортировали методом FACS, после чего обогащенный пул амплифицировали и инкубировали с 80 ед./мл ММР-9 в течение 2 часов при 37°С, метили меткой SAPE и уРЕТ mona и сортировали в отношении отсутствия расщепления указанными протеазами, не являющимися мишенями (красный+зеленый, негативный отбор). Указанный пул амплифицировали и сортировали, выполняя 4 дополнительных поочередных цикла позитивного и негативного отбора методом FACS с использованием плазмина (третий цикл при 100 пМ или 300 пМ, пятый цикл при 100 пМ или 300 пМ) и klk5 и 7 (четвертый цикл при 100 нг/мл, шестой цикл при 200 нг/мл). Отдельные клоны, полученные в результате выполнения 2-х последних циклов FACS, секвенировали (таблица 45). Клоны из каждой консенсусной последовательности анализировали отдельно в отношении расщепления плазмином, ММР-9, klk5 и klk7 в отношении специфичности расщепления протеазами, не являющимися мишенью. Типичные данные, показывающие возросшую специфичность в отношении расщепления плазмином, как показано на фиг.26. На фиг.26 показано, что в отличие от неоптимизированного субстрата, оптимизированные субстраты Plas1237, Plas129 и Plas1254 устойчивы к расщеплению KLK5, KLK7.
Таблица 45
Пептидные последовательности, полученные в результате выполнения трех циклов позитивного отбора в отношении расщепления плазмином и негативного отбора в отношении ММР9, KLK5 и KLK7
SM1191 EHPRVKVVSE
SM1197 PPPDMKLFPG
SM1200 PPPVLKLLEW
SM1203 VLPELRSVFS
SM1206 APPSFKLVNA
SM1212 PPPEVRSFSV
SM1214 ALPSVKMVSE
SM1215 ETPSVKTMGR
SM1219 AIPRVRLFDV
SM1224 GLGTPRGLFA
SM1276 DRPKVKTMDF
SM1275 RVPKVKVMLD
SM1274 APPLVKSMVV
SM1272 REPFMKSLPW
SM1270 PVPRLKLIKD
SM1269 KGPKVKVVTL
SM1268 ERPGVKSLVL
SM1267 NZPRVRLVLP
SM1265 PRPFVKSVDQ
SM1263 RFPSLKSFPL
SM1261 ESPVMKSMAL
SM1260 VAPQLKSLVP
SM1255 APPLVKSMVV
SM1254 NMPSFKLVTG
SM1245 DRPEMKSLSG
SM1244 EQPEVKMVKG
SM1243 AVPKVRVVPE
SM1241 DLPLVKSLPS
SM1240 EAPKVKALPK
SM1239 GFPHMKTFQH
SM1238 YDPZVKVVLA
SM1237 ASPTMKTVGL
SM1236 DVPPMKTLRP
SM1235 AFPDMRSVRS
SM1234 SAPYFRMMDM
SM1233 EKPRMKLFQG
SM1231 YVPRVKALEM
Последовательности активируемого антитела, активированного ферментом uPA
В нижеследующих таблицах приведены легкие цепи активируемых антител против VEGF, активируемые ферментом uPA. В скобках указано разграничение между разными доменами последовательности: (Линкер)(ММ)(Линкер)(СМ)(Линкер)(АВ).
ТАБЛИЦЫ 46-49 (см. в конце описания)
Последовательности активируемого антитела, активированного плазмином
В нижеследующих таблицах приведены нуклеотидные и аминокислотные последовательности легких цепей активируемых антител против VEGF, активированных ферментом плазмином. В скобках указано разграничение между разными доменами последовательности: (Линкер)(ММ)(Линкер)(СМ)(Линкер)(АВ).
ТАБЛИЦА 50 (см. в конце описания)
Активируемые антитела, активированные легумаином
В данной области известны последовательности субстратов для легумаина AANL и PTNL (Liu, et al., 2003. Cancer Research 63, 2957-2964; Mathieu, et al., 2002. Molecular and Biochemical Parisitology 121, 99-105). В нижеследующих таблицах приведены нуклеотидные и аминокислотные последовательности легких цепей активируемых антител против VEGF, активированных ферментом легумаином. В скобках указано разграничение между разными доменами последовательности: (Линкер)(ММ)(Линкер)(СМ)(Линкер)(АВ).
ТАБЛИЦЫ 51-53 (см. в конце описания)
Активируемые антитела, активированные каспазой
В нижеследующих таблицах приведены нуклеотидные и аминокислотные последовательности легких цепей активируемых антител против VEGF, активированных ферментом каспазой. В скобках указано разграничение между разными доменами последовательности: (Линкер)(ММ)(Линкер)(СМ)(Линкер)(АВ). В данной области известен субстрат для каспазы, последовательность DEVD.
ТАБЛИЦА 54 (см. в конце описания)
Конструирование экспрессирующих векторов для активируемых антител, активированных легумаином и каспазой
Субстраты создавали двухстадийным методом. Во-первых, два продукта амплифицировали при помощи ПЦР с использованием верхнего праймера СХ0325 и специфичной к субстрату нижнего праймера (СХ0720 AANL, CX0722 PTNL, CX0724 PTN и CX0758 DEVD), другой продукт амплифицировали при помощи ПЦР с использованием нижнего праймера СХ0564 и специфичной к субстрату верхнего праймера (CX0721 AANL, CX0723 PTNL, CX0725 PTN и CX0754 DEVD). В обоих случаях субстратом для ПЦР было антитело mmp-9 306 scFv против VEGF. Во-вторых, два продукта объединяли и амплифицировали при помощи ПЦР с использованием внешних праймеров СХ0325 и СХ0564. Конечные продукты клонировали в pFIL2-CL-против VEGF Lc, используя сайты рестрикции EcoRI и XhoI.
Таблица 55
Праймеры для конструирования экспрессирующих векторов для активируемых антител, активированных легумаином и каспазой
CX0564 aggttgcagactcgagatagtcagggtgaagtc
CX0720 tcctccgctgcccagattagctgcttggccaccttggccgctgccac
CX0721 gcagctaatctgggcagcggaggaagtagcggcggttctgatattcaactg
CX0722 tcctccgctgcccagattagtcggttggccaccttggccgctgccac
CX0723 ccgactaatctgggcagcggaggaagtagcggcggttctgatattcaactg
CX0724 tcctccgctgccaccattagtcggttggccaccttggccgctgccac
CX0725 ccgactaatggtggcagcggaggaagtagcggcggttctgatattcaactg
CX0754 gacgaagtcgatggcagcggaggaagtagcggcggttctgatattcaactg
CX0758 tcctccgctgccatcgacttcgtcttggccaccttggccgctgccac
Экспрессия и очистка активируемых антител, активированных легумаином
3 мкг pFIL-VEGF-HL и 3 мкг pFIL2-306-субстрат-VEGF-light котрансфицировали в клетки СНО-S (Invitrogen), используя липофектамин 200 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Трансфицированные клетки культивировали в среде для свободных клеток СНО (Invitrogen) и отбирали клетки, устойчивые к зеоцину и бластицидину. Отдельные клоны выделяли путем ограничивающего разведения и отбирали методом ELISA на основании экспрессии IgG человека, способного связываться с EGFR. Все антитела и активируемые антитела очищали хроматографией на белке А стандартными методами.
Описание анализа для гидролизата активируемого антитела scFv
Активируемые антитела scFv разводили до 200 нМ в буфере для анализа и объединяли с rh-легумаином, разведенным в буфера для анализа до 2 мкг/мл. Гидролизаты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Активируемые антитела IgG разводили до 200 нМ в буфере для анализа и объединяли с rh-легумаином, разведенным в буфере для анализа в концентрациях 2-40 мг/мл (конечные концентрации rh-легумаина равны 1 мкг/мл, 5 мкг/мл, 20 мкг/мл). Гидролизаты инкубировали в течение ночи при 37°С. После расщепления измеряли степень активации на основании величины связывания активируемого антитела с VEGF на планшетах для выполнения анализа ELISA, визуализировали при помощи антитела против Fc человека. На фиг.27, блок А, показана активация активируемых антител scFv, содержащих субстраты для легумаина AANL и PTNL, после обработки 5 мг/мл легумаина. В блоке В показана активация активируемого антитела IgG против VEGF, содержащего субстрат для легумаина PNTL.
Устойчивость активируемых антител, активированных легумаином, in vivo
Четырем мышам Balb/C в возрасте 12 недель инъецировали одну ударную дозу, равную 100 мкг активируемого антитела, активированного плазмином, AAPLASVEGF или одного из активируемых антител, активированных легумаином, AAAANLVEGF или AAPTNLVEGF. Сыворотку собирали через 15 минут, 1 день, 3 дня и 7 дней после инъекции. Общую концентрацию активируемого антитела определяли, измеряя общее содержание Fc-фрагмента человека в сыворотке при помощи анализа ELISA. Концентрацию активированного антитела вычисляли путем измерения связывания с VEGF человека методом ELISA; результаты приведены на фиг.28. Активируемые антитела, активированные легумаином, выделявшиеся из сыворотки в течение 7 дней после инъекции, оставались маскированными (n=4). Отношение активированного активируемого антитела к общему содержанию активируемого антитела в каждый период времени показано на фиг.28 в виде среднего значения, измеренного у отдельных животных, и выражено в виде процентного значения активированных антител. Активируемые антитела, активированные плазмином, почти полностью были активированы через 7 дней, в то время как активируемые антитела, активированные легумаином, были активированы в минимальном количестве.
Пример 18. Период полувыведения из сыворотки активируемых антител
На фиг.29 показано, что маскированные одноцепочечные слитые проантитела Fv-Fc характеризуются более продолжительным периодом полувыведения из сыворотки. Маскирующий полипептид присоединяют к N-концу антитела таким образом, что маска может взаимодействовать с сайтом связывания антитела для увеличения термодинамической устойчивости или блокирования нейтрализующих антител. Субстрат для протеазы может быть использован для удаления маски с разной скоростью в сыворотке или определенных тканях.
На фиг.30 показана концентрация scFv-Fc в сыворотке здоровых мышей через 10 дней. Мышам C57BI/6 (n=3 в один период времени) вводили одну дозу (150 мкг) scFv-Fc против VEGF, AAMMPVEGF (АА 1) или ААплазминVEGF (АА 2). Сыворотку собирали в указанные периоды времени и методом ELISA измеряли концентрацию общего scFv-Fc. Концентрация активируемого антитела оставалась постоянной в течение 7 дней после инъекции, в то время как концентрация исходного scFv-Fc сократилась через 3 дня и почти не обнаруживалась через 10 дней.
На фиг.31 показано, что концентрации активируемого антитела scFv-Fc повышены и дольше сохраняются в сыворотке по сравнению с исходным scFv-Fc у мышей, несущих опухоль: эквивалентную однократную дозу scFv-Fc против VEGF, AAMMPVEGF (АА 1) или ААплазминVEGF (АА 2) вводили голым мышам, несущим ксенотрансплантаты НТ29 (А) или ксенотрансплантаты MDA-MB-231 (B). Сыворотку собирали в указанные периоды времени и методом ELISA измеряли концентрацию общего scFv-Fc. В обоих исследованиях были обнаружены более высокие процентные значения начальной дозы активируемого антитела в сыворотке через 3 дня (В) и через 3 и 7 дней (А).
На фиг.32 показано, что активируемые антитела сохраняются в более высоких концентрациях в исследовании с введением нескольких доз. Мышам nu/nu Balb-c, несущим опухоль, инъецировали 5 мг/кг исходного scFv-Fc против VEGF, АА1, 2 или 3 раза каждые 3 дня. Сыворотку собирали в указанные периоды времени и методом ELISA измеряли концентрацию активируемого антитела или исходного scFv-Fc. Все три активируемых антитела оставались в значительно более высоких концентрациях в сыворотке по сравнению с исходным антителом на протяжении всего исследования.
Аминокислотные последовательности активируемых антител scFv-Fc против VEGF
Таблица 56
Аминокислотная последовательность scFv-Fc против VEGF, из которого были получены scFv активируемых антител
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKGGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSGGSGAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
Таблица 57
AAMMPVEGF: активируемые антитела содержат маскирующий пептид и субстрат для ММР, присоединенный коротким линкером
маскирующий пептид субстрат
GQSGQPCSEWQSMVQPRCYYGGGSGGSGQGGQVHMPLGFLGPGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKGGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSGGSGAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
Таблица 58
ААплазминVEGF: активируемые антитела содержат маскирующий пептид и субстрат для плазмина, присоединенный коротким линкером
маскирующий пептид субстрат
GQSGQPCSEWQSMVQPRCYYGGGSGGSGQGGQQGPMFKSLWDGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSGGSGAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
Таблица 59
ААбез субстратаVEGF: активируемые антитела содержат маскирующий пептид, линкеры Gly Ser (GS) и VEGF при отсутствии субстрата, присоединенного коротким линкером
маскирующий пептид субстрат
PCSEWQSMVQPRCYYGGSGGGSGQSGQGGSGGSGQGGQGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKGGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSGGSGAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
Активируемые антитела характеризуются более продолжительным периодом полувыведения из сыворотки по сравнению с исходным антителом
Восьми мышамй Balb/C в возрасте 12 недель инъецировали одну ударную дозу, равную 100 мкг ММР-активированного активируемого антитела, AAMMPVEGF, активируемое антитело, активированное плазмином, AAPLASVEGF или исходного антитела против VEGF Ab-VEGF. Сыворотку собирали через 15 минут, 8 часов, 1 день, 3 дня, 7 дней и 10 дней после инъекции. Общую концентрацию активируемого антитела определяли методом ELISA на основании измерения общего количества Fc-фрагмента человека в сыворотке. Концентрация общего количества активируемого антитела в каждый период времени показана на фиг.33 в виде среднего значения измерений у отдельных животных и выражена в процентного значения от начальной дозы. Активируемые антитела и исходное антитело распределены аналогичным образом и как предполагалось. Высокая и равная концентрация была достигнута через 15 минут, и распределение в тканях произошло после первого дня. В отличие от исходного антитела, которое почти полностью исчезло через 10 дней, оба активируемых антитела сохранялись на высоких уровнях в сыворотке на протяжении всего эксперимента.
Пример 19. Уменьшение побочных эффектов при введении активируемого антитела
Более чем у 80% субъектов обычно вводимое терапевтическое средство на основе антитела против EGFR оказывает токсическое воздействие на кожу, самый большой орган тела. Предполагается, что при введении субъектам активируемых антител против EGFR токсическое воздействие на кожу должно быть незначительным или полностью отсутствовать, так как активируемое антитело не активируется в коже из-за отсутствия специфичной для болезни расщепляемой части. Таким образом, ожидается, что антитело против EGFR активируемого антитела не сможет специфически связываться с мишенью, являющейся EGFR. Кроме того, можно предположить, что благодаря отсутствию активности активируемого антитела в коже активируемое антитело не будет органоспецифическим у таких субъектов, при этом уровни активируемого антитела в сыворотке будут оставаться высокими, что позволит увеличить концентрацию активируемого антитела в больной ткани, повысив таким образом эффективную дозу. Гидролиз расщепляемой части в больной ткани под воздействием среды, обусловленной болезнью, приведет к удалению маски активируемого антитела и специфическому связыванию антитела с мишенью, являющейся EGFR, с достижением требуемого терапевтического эффекта.
Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные варианты его осуществления, специалистам в данной области должно быть понятно, что в данное изобретение могут быть внесены разные изменения, не выходящие за пределы существа и объема изобретения. Кроме того, в объект, существо и объем настоящего изобретения могут быть внесены многие модификации для адаптации к определенной ситуации, веществу, композиции, процессу, стадии или стадиям процесса. Предполагается, что все такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

Claims (60)

1. Активируемое антитело (АА), содержащее:
антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (АВ), связывающееся с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), причем АВ имеет равновесную константу диссоциации связывания (Kd) с EGFR, равной не более чем примерно 100 нМ или меньше;
маскирующую часть (ММ), которая ингибирует специфичное связывание АВ активируемого антитела в нерасщепленном состоянии с EGFR, где:
(А) ММ содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из CISPRGC, CISPRGCPDGPYVM, CISPRGCEPGTYVPT, CISPRGCPGQIWHPP и последовательностей ММ, причисленных в Таблице 42 и Таблице 43,
(В) ММ активируемого антитела в расщепленном состоянии не препятствует связыванию АВ или не конкурирует с АВ за связывание с EGFR;
расщепляемую часть (СМ), где СМ представляет собой полипептид, который действует в качестве субстрата для протеазы; и
линкеры L1, связывающие ММ с СМ, и L2, связывающие СМ с АВ;
где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет структуру от N-конца к С-концу: (MM)-L1-(CM)-L2-(АВ), и
где присоединение ММ к АВ снижает способность АВ связываться с EGFR по меньшей мере на 90% по сравнению со способностью АВ, не связанного с ММ, связывать EGFR при исследовании при помощи иммуноадсорбционного анализа замещения мишенью in vitro, и
где активируемое антитело активируется в ткани-мишени, локализованной вместе с мишенью и протеазой, для которой СМ может действовать в качестве субстрата.
2. Активируемое антитело по п.1, в котором линкеры содержат первый линкерный пептид и второй линкерный пептид, каждый из которых является пептидом длиной от 1 до 20 аминокислот, где первому линкерному пептиду и второму линкерному пептиду не требуется быть идентичными относительно друг друга.
3. Активируемое антитело по п.2, где один или несколько линкеров присутствуют в конструкции АА для придания гибкости одному или нескольким соединениям ММ-СМ, СМ-АВ или им обоим.
4. Активируемое антитело по п.1, где его антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab-фрагмента, F(ab')2-фрагмента, scFv, scAb, dAb, антитела с одним доменом тяжелой цепи и антитела с одним доменом легкой цепи.
5. Активируемое антитело по п.1, где антитело представляет собой полноразмерное антитело.
6. Активируемое антитело по п.1, в котором АВ представляет собой цетуксимаб или фрагмент антитела цетуксимаба или вариант цетуксимаба.
7. Активируемое антитело по п.1, в котором СМ является субстратом для фермента, выбираемого из группы, состоящей из uPA, матриптазы, легумаина, плазмина, TMPRSS-3/4, ММР-9, МТ1-ММР, катепсина, каспазы, эластазы нейтрофилов человека, бета-секретазы, PSA и фермента из Таблицы 3.
8. Активируемое антитело по п.1, где СМ представляет собой субстрат для фермента, выбранного из группы, состоящей из uPA, матриптазы, легумаина и ММР.
9. Активируемое антитело по п.1, где последовательность ММ полипептида не более чем на 50% идентична природному партнеру связывания АВ.
10. Активируемое антитело по п.1, где последовательность ММ полипептида не более чем на 25% идентична природному партнеру связывания АВ.
11. Активируемое антитело по п.1, где последовательность ММ полипептида не более чем на 10% идентична природному партнеру связывания АВ.
12. Активируемое антитело по п.1, где протеаза совместно локализуется в первой ткани с EGFR.
13. Активируемое антитело по п.12, где сродство связывания активируемого антитела с EGFR является более высоким в первой ткани по сравнению со связыванием активируемого антитела с EGFR во второй ткани, где первая ткань является больной тканью.
14. Активируемое антитело по п.13, где больной тканью является ткань груди, ткань головы, ткань шеи, ткань легкого, ткань поджелудочной железы, ткань нервной системы, ткань печени, ткань простаты, ткань мочеполовой системы или ткань шейки матки.
15. Активируемое антитело по п.1, где СМ расщеплена по меньшей мере первой протеазой и второй протеазой.
16. Активируемое антитело по п.1, содержащее по меньшей мере одно из следующего:
(i) второе АВ, для которого мишень выбрана из группы, состоящей из EGFR, ТNFальфа, CD11a, CSFR, CTLA-4, ЕрСАМ, VEGF, CD40, CD20, Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4, Jagged 1, Jagged 2, CD52, MUC1, IGF1R, трансферрина, gp130, VCAM-1, CD44, DLL4, IL4 и мишени из Таблицы 1, или
(ii) по меньшей мере первую СМ и вторую СМ, где первая СМ расщепляется первым расщепляющим средством в ткани-мишени, а вторая СМ расщепляется вторым расщепляющим средством в ткани-мишени.
17. Активируемое антитело по п.16, в котором первая СМ, вторая СМ, первое расщепляющее средство или второе расщепляющее средство обладают по меньшей мере одной из следующих характеристик:
(i) первое расщепляющее средство и второе расщепляющее средство представляют собой один и тот же фермент, при этом первая СМ и вторая СМ являются разными субстратами для фермента;
(ii) первое расщепляющее средство и второе расщепляющее средство являются разными ферментами;
(iii) первое расщепляющее средство и второе расщепляющее средство расположены вместе в первой ткани; или
(iv) первая СМ и вторая СМ расщепляются по меньшей мере одним расщепляющим средством в первой ткани.
18. Активируемое антитело по п.1, в котором по меньшей мере один из L1 и L2 содержит аминокислотную последовательность, выбираемую из (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, GGSG, GGSGG, GSGSG, GSGGG, GGGSG и GSSSG, где n является целым числом, равным по меньшей мере единице.
19. Активируемое антитело по п.1, в котором СМ содержит аминокислотную последовательность LSGRSDNH.
20. Активируемое антитело по п.1, в котором АВ представляет собой цетуксимаб, или фрагмент антитела цетуксимаба, или вариант цетуксимаба и в котором СМ содержит аминокислотную последовательность LSGRSDNH.
21. Активируемое антитело по п.20, в котором L1 содержит аминокислотную последовательность GGSGGS, и в котором L2 содержит аминокислотную последовательность GS.
22. Активируемое антитело по любому из пп.1-21, содержащее детектируемую часть или дополнительно содержащее терапевтическое средство, конъюгированное с АВ.
23. Активируемое антитело по п.22, где детектируемая часть представляет собой диагностическое средство.
24. Активируемое антитело по п.22, где терапевтическое средство представляет собой противоопухолевое средство.
25. Композиция для лечения опухоли, аутоиммунного заболевания или воспалительного заболевания, которые связаны с аномальной экспрессией или активностью EGFR, у субъекта или для ингибирования ангиогенеза у субъекта, содержащая эффективное количество активируемого антитела по любому из пп.1-24.
26. Применение активируемого антитела по любому одному из пп.1-24 для получения лекарственного средства для лечения у субъекта опухоли, аутоиммунного заболевания или воспалительного заболевания, которые связаны с аномальной экспрессией или активностью EGFR, или для получения лекарственного средства для ингибирования у субъекта ангиогенеза.
27. Способ получения активируемого антитела, где способ включает:
(а) культивирование клетки, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты, которая кодирует активируемое антитело в условиях, вызывающих экспрессию активируемого антитела, где активируемое антитело содержит маскирующую часть (ММ), первый линкер (L1), расщепляемую часть (СМ), второй линкер (L2) и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (АВ), которое специфично связывается с EGFR,
(i) где ММ содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из CISPRGC, CISPRGCPDGPYVM, CISPRGCEPGTYVPT, CISPRGCPGQIWHPP и последовательностей ММ, причисленных в Таблице 42 и Таблице 43,
(ii) где СМ представляет собой полипептид, который действует в качестве субстрата для протеазы;
(iii) где L1 присоединяет ММ с СМ и L2 присоединяет СМ с АВ и где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет структурную организацию в направлении от N-конца к С-концу: ММ-L1-CM-L2-AB; и
(iv) где ММ активируемого антитела в нерасщепленном состоянии препятствует специфическому связыванию АВ с EGFR и ММ активируемого антитела в расщепленном состоянии не препятствует или конкурирует за специфическое связывание АВ с EGFR;
(b) выделение активируемого антитела.
28. Способ по п.27, в котором линкеры содержат первый линкерный пептид и второй линкерный пептид, каждый из которых является пептидом длиной от 1 до 20 аминокислот, где первому линкерному пептиду и второму линкерному пептиду не требуется быть идентичными относительно друг друга.
29. Молекула выделенной нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, где полипептид содержит активируемое антитело, содержащее:
антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (АВ), связывающееся с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), причем АВ имеет равновесную константу диссоциации связывания (Kd) с EGFR, равной не более чем примерно 100 нМ или меньше;
маскирующую часть (ММ), которая ингибирует специфичное связывание АВ активируемого антитела в нерасщепленном состоянии с EGFR, где:
(А) ММ содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из CISPRGC, CISPRGCPDGPYVM, CISPRGCEPGTYVPT, CISPRGCPGQIWHPP и последовательностей ММ, причисленных в Таблице 42 и Таблице 43,
(В) ММ активируемого антитела в расщепленном состоянии не препятствует связыванию АВ или не конкурирует с АВ за связывание с EGFR;
расщепляемую часть (СМ), где СМ представляет собой полипептид, который действует в качестве субстрата для протеазы; и
линкеры L1, связывающие ММ с СМ, и L2, связывающие СМ с АВ;
где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет структуру от N-конца к С-концу: (MM)-L1-(CM)-L2-(АВ), и
где присоединение ММ к АВ снижает способность АВ связываться с EGFR по меньшей мере на 90% по сравнению со способностью АВ, не связанного с ММ, связывать EGFR при исследовании при помощи иммуноадсорбционного анализа замещения мишенью in vitro, и
где активируемое антитело активируется в ткани-мишени, локализованной вместе с мишенью и протеазой, для которой СМ может действовать в качестве субстрата.
30. Способ получения активируемого антитела по любому из пп.1-21 посредством культивирования клетки в условиях, вызывающих экспрессию активируемого антитела, где клетка содержит вектор, содержащий молекулу выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующую активируемое антитело.
RU2011133819A 2009-01-12 2010-01-12 Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения RU2636046C2 (ru)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14410509P 2009-01-12 2009-01-12
US14411009P 2009-01-12 2009-01-12
US61/144,110 2009-01-12
US61/144,105 2009-01-12
US24941609P 2009-10-07 2009-10-07
US24944109P 2009-10-07 2009-10-07
US61/249,416 2009-10-07
US61/249,441 2009-10-07
PCT/US2010/020820 WO2010081173A2 (en) 2009-01-12 2010-01-12 Modified antibody compositions, methods of making and using thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017136814A Division RU2799787C2 (ru) 2009-01-12 2010-01-12 Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2011133819A RU2011133819A (ru) 2013-02-20
RU2636046C2 true RU2636046C2 (ru) 2017-11-17

Family

ID=42317225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011133819A RU2636046C2 (ru) 2009-01-12 2010-01-12 Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения

Country Status (9)

Country Link
US (9) US20100189651A1 (ru)
EP (2) EP2385955B1 (ru)
JP (5) JP5851842B2 (ru)
CN (2) CN102482347B (ru)
AU (4) AU2010203353B2 (ru)
BR (1) BRPI1006141B8 (ru)
CA (1) CA2749339A1 (ru)
RU (1) RU2636046C2 (ru)
WO (1) WO2010081173A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11932697B2 (en) 2016-11-28 2024-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding domain, and polypeptide including conveying section

Families Citing this family (235)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
ES2368387T5 (es) 2000-10-09 2019-03-07 Cytomx Therapeutics Inc Anticuerpos terapéuticos y que inducen tolerancia
EP1996716B1 (en) 2006-03-20 2011-05-11 The Regents of the University of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
EP4342995A3 (en) 2006-03-31 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
US8293685B2 (en) 2007-07-26 2012-10-23 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing bacterial cell display of proteins and peptides
CA2697032C (en) * 2007-08-22 2021-09-14 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
WO2009032949A2 (en) 2007-09-04 2009-03-12 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting and detection
WO2009041643A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cdrのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
JP4954326B2 (ja) 2008-04-11 2012-06-13 中外製薬株式会社 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子
EP2385955B1 (en) * 2009-01-12 2020-08-12 CytomX Therapeutics, Inc. Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
EP2398504B1 (en) 2009-02-17 2018-11-28 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and kits for diagnosis of cancer and prediction of therapeutic value
WO2010096838A2 (en) * 2009-02-23 2010-08-26 Cytomx Therapeutics, Llc Proproteins and methods of use thereof
MX354143B (es) 2009-12-02 2018-02-14 Imaginab Inc Minicuerpos j591 y diacuerpos-cys para apuntar con especificidad de objetivo a un antígeno de membrana específico para próstata de humano (psma) y métodos para su uso.
EP4231014A3 (en) 2010-11-30 2024-03-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
EP2646470B1 (en) 2010-11-30 2017-03-01 F. Hoffmann-La Roche AG Low affinity anti-transferrin receptor antibodies and their use to transfer therapeutic scfv across the blood brain barrier
US20140093496A1 (en) 2011-02-25 2014-04-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc-gamma-RIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY
CA2828940C (en) 2011-03-10 2024-04-16 Provectus Pharmaceuticals, Inc. Combination of local and systemic immunomodulative therapies for enhanced treatment of cancer
US9402916B2 (en) 2011-03-17 2016-08-02 The University Of Birmingham Re-directed immunotherapy
EP2707030B1 (en) 2011-05-09 2020-02-19 Mayo Foundation For Medical Education And Research Cancer treatments
EP2762493B1 (en) 2011-09-30 2021-06-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
TW201326209A (zh) 2011-09-30 2013-07-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
KR20210074395A (ko) 2011-11-30 2021-06-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 면역 복합체를 형성하는 세포내로의 운반체（캐리어）를 포함하는 의약
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
CN104540518A (zh) * 2012-04-27 2015-04-22 西托姆克斯治疗公司 结合表皮生长因子受体的可活化的抗体其使用方法
WO2013180200A1 (ja) 2012-05-30 2013-12-05 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
US9856314B2 (en) * 2012-06-22 2018-01-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies having non-binding steric moieties and methods of using the same
RU2015101803A (ru) 2012-06-22 2016-08-20 Сайтомкс Терапьютикс, Инк. Перекрестно реактивные антитела к jagged 1/k jagged 2, активируемые антитела к jagged и способы их применения
WO2014026136A2 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-resistant systems for polypeptide display and methods of making and using thereof
CN104520328B (zh) 2012-08-13 2019-06-07 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗锯齿蛋白抗体及使用方法
NZ705370A (en) 2012-08-24 2018-06-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcγriib-specific fc region variant
US9487590B2 (en) 2012-09-25 2016-11-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind interleukin-6 receptor and methods of use thereof
WO2014055415A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Mayo Foundation For Medical Education And Research Cancer treatments
CN112162094A (zh) 2013-01-04 2021-01-01 西托姆克斯治疗公司 用于检测生物***中的蛋白酶活性的组合物和方法
RU2519546C1 (ru) * 2013-01-16 2014-06-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Биоинтегратор" (Ооо "Биоинтегратор") КОНЪЮГАТЫ И МАЛЫЕ МОЛЕКУЛЫ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С РЕЦЕПТОРОМ CD16а
WO2014141064A1 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Novartis Ag Notch2 binding molecules for treating respiratory diseases
US20160009817A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-14 Bayer Healthcare Llc Pro-drug antibodies against tissue factor pathway inhibitor
KR102318483B1 (ko) 2013-04-02 2021-10-27 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Ｆｃ영역 개변체
CN105377297B (zh) * 2013-05-28 2019-09-17 Dcb-美国有限责任公司 用于蛋白质药物失活的抗体锁扣
CN116063479A (zh) * 2013-06-04 2023-05-05 西托姆克斯治疗公司 用于缀合可活化抗体的组合物和方法
ES2683268T3 (es) * 2013-07-25 2018-09-25 Cytomx Therapeutics, Inc. Anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos activables multiespecíficos y métodos para usar los mismos
WO2015023927A2 (en) * 2013-08-16 2015-02-19 University Of Rochester Composition and method for detection of nanomaterials
MX2016003957A (es) * 2013-09-25 2017-02-02 Cytomx Therapeutics Inc Substratos de metaloproteinasas de matriz y otras porciones escindibles y metodos para usar los mismos.
WO2015066279A2 (en) 2013-10-30 2015-05-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
TW202043467A (zh) 2013-12-04 2020-12-01 日商中外製藥股份有限公司 因應化合物濃度使抗原結合能力變化的抗原結合分子及其資料庫
US9737623B2 (en) 2013-12-11 2017-08-22 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies that bind activatable antibodies and methods of use thereof
JP2017503803A (ja) 2014-01-10 2017-02-02 シャンハイ バーディー バイオテック インコーポレイテッド Ｅｇｆｒ発現腫瘍を処置するための化合物及び組成物
JP6835586B2 (ja) 2014-01-31 2021-02-24 シトムクス セラピューティクス，インコーポレイティド マトリプターゼ及びｕ‐プラスミノーゲン活性化因子の基質及び他の切断可能部分、並びにその使用方法
CA2945486A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 Mcmaster University Trifunctional t cell-antigen coupler and methods and uses thereof
MX2016010433A (es) * 2014-02-12 2016-09-22 Genentech Inc Anticuerpos anti-jagged1 y metodos de uso.
US20160230202A1 (en) * 2014-03-11 2016-08-11 Eric William Olle Process for Generating Synthetic Engineered Recombinant Proteins for Vaccination, Diagnosis and Treatment of Disease
AU2015259465A1 (en) 2014-05-13 2016-11-17 Bioatla Llc Conditionally active biological proteins
KR20210125603A (ko) 2014-06-16 2021-10-18 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치 골수종의 치료
WO2016004383A1 (en) * 2014-07-03 2016-01-07 City Of Hope Tumor-selective ctla-4 antagonists
CN112546231A (zh) 2014-07-09 2021-03-26 博笛生物科技有限公司 用于治疗癌症的联合治疗组合物和联合治疗方法
ES2910446T3 (es) 2014-07-09 2022-05-12 Birdie Biopharmaceuticals Inc Combinaciones anti-PD-L1 para tratar tumores
EP3172235A2 (en) 2014-07-25 2017-05-31 Cytomx Therapeutics Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
CN112546238A (zh) 2014-09-01 2021-03-26 博笛生物科技有限公司 用于***的抗-pd-l1结合物
US9446148B2 (en) 2014-10-06 2016-09-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Carrier-antibody compositions and methods of making and using the same
EP3244907B1 (en) 2015-01-13 2020-02-19 City of Hope Ctla4-binding protein peptide-linker masks
MA41374A (fr) 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
JP2018508481A (ja) 2015-02-02 2018-03-29 ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム 複数のｔ細胞エピトープを有する標的化部分ペプチドエピトープ複合体
RU2733658C2 (ru) 2015-02-24 2020-10-06 Биоатла Ллс Условно активные биологические белки
AU2016233495B2 (en) * 2015-03-13 2022-02-24 Cytomx Therapeutics, Inc Anti-PDL1 antibodies, activatable anti-PDL1 antibodies, and methods of use thereof
EP3288981A1 (en) 2015-05-01 2018-03-07 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
EA201792414A1 (ru) * 2015-05-04 2018-06-29 Сайтомкс Терапьютикс, Инк. Антитела против cd166, активируемые антитела против cd166 и способы их применения
LT3292149T (lt) 2015-05-04 2022-03-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Aktyvinami antikūnai prieš cd71 ir jų naudojimo būdai
EP3292151A1 (en) 2015-05-04 2018-03-14 Cytomx Therapeutics Inc. Anti-itga3 antibodies, activatable anti-itga3 antibodies, and methods of use thereof
WO2016182064A1 (ja) 2015-05-13 2016-11-17 中外製薬株式会社 多重抗原結合分子融合体、医薬組成物、線状エピトープの同定方法、および多重抗原結合分子融合体の製造方法
EP3297672B1 (en) 2015-05-21 2021-09-01 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
EP3303394B1 (en) 2015-05-29 2020-04-08 Agenus Inc. Anti-ctla-4 antibodies and methods of use thereof
EP3302467A4 (en) 2015-05-31 2019-01-02 Curegenix Corporation Combination compositions for immunotherapy
CN107849145B (zh) 2015-06-16 2021-10-26 基因泰克公司 抗cd3抗体及其使用方法
WO2016210447A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 University Of Southern California Masking chimeric antigen receptor t cells for tumor-specific activation
KR20180040138A (ko) * 2015-07-13 2018-04-19 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 항pd-1 항체, 활성화 가능한 항pd-1 항체, 및 이들의 사용 방법
EP3328427B1 (en) 2015-07-27 2024-05-29 The General Hospital Corporation Antibody derivatives with conditionally enabled effector function
EA034582B1 (ru) 2015-08-07 2020-02-21 АЭлЭкс ОНКОЛОДЖИ ИНК. Конструкции варианта sirp-альфа и их применение
KR20180050321A (ko) 2015-08-07 2018-05-14 이미지냅 인코포레이티드 분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체
DK3331902T3 (da) 2015-08-07 2021-07-26 Alx Oncology Inc Konstruktioner med et sirp-alpha-domæne eller en variant deraf
TW201707725A (zh) 2015-08-18 2017-03-01 美國馬友醫藥教育研究基金會 載體－抗體組合物及其製造及使用方法
PE20181275A1 (es) 2015-08-28 2018-08-03 Amunix Operating Inc Ensamble de polipeptido quimerico y metodos para hacer y usar el mismo
US10758886B2 (en) * 2015-09-14 2020-09-01 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Conditioned surfaces for in situ molecular array synthesis
TW201713360A (en) 2015-10-06 2017-04-16 Mayo Foundation Methods of treating cancer using compositions of antibodies and carrier proteins
MA43135A (fr) 2015-10-30 2018-09-05 Aleta Biotherapeutics Inc Compositions et méthodes pour le du traitement du cancer
CA3003144A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Aleta Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for tumor transduction
JP7064769B2 (ja) 2015-11-02 2022-05-11 バイオアトラ、エルエルシー 条件的活性型ポリペプチド
EP3373950B1 (en) 2015-11-11 2024-05-01 Serimmune Inc. Methods and compositions for assessing antibody specificities
ES2873846T3 (es) 2015-11-19 2021-11-04 Revitope Ltd Complementación de fragmento de anticuerpo funcional para un sistema de dos componentes para eliminación redirigida de células no deseadas
WO2017106630A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The General Hospital Corporation Polyacetal polymers, conjugates, particles and uses thereof
US11571469B2 (en) 2016-01-07 2023-02-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of treating cancer with interferon wherein the cancer cells are HLA negative or have reduced HLA expression
CN105601751B (zh) * 2016-02-01 2019-06-07 中国人民解放军第三军医大学 一种重组蛋白Vo及其制备方法和应用
WO2017139698A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Hematologic cancer treatments
ES2886958T3 (es) * 2016-02-29 2021-12-21 Regeneron Pharma Roedores que tienen un gen TMPRSS humanizado
WO2017165440A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for reducing toxicity of a chemotherapeutic drug
AU2017238118A1 (en) 2016-03-21 2018-10-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for improving the therapeutic index for a chemotherapeutic drug
US10618969B2 (en) 2016-04-06 2020-04-14 Mayo Foundation For Medical Education And Research Carrier-binding agent compositions and methods of making and using the same
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
JP7101621B2 (ja) 2016-05-20 2022-07-15 ハープーン セラピューティクス，インク． 単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質
US11560433B2 (en) 2016-05-27 2023-01-24 Albert Einstein College Of Medicine Methods of treatment by targeting VCAM1 and MAEA
CN109313200B (zh) 2016-05-27 2022-10-04 豪夫迈·罗氏有限公司 用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法
WO2017205560A1 (en) * 2016-05-27 2017-11-30 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Methods for treating cancer by targeting vcam1 and maea
WO2018004338A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Cleavable tetrazine used in bio-orthogonal drug activation
WO2018022957A1 (en) * 2016-07-29 2018-02-01 Tarveda Therapeutics, Inc. T cell binding conjugates and methods of use
CN109843336A (zh) 2016-09-01 2019-06-04 梅约医学教育与研究基金会 用于靶向t细胞癌症的方法和组合物
EP4177271A1 (en) 2016-09-01 2023-05-10 Mayo Foundation for Medical Education and Research Carrier-pd-l1 binding agent compositions for treating cancers
MX2019002562A (es) 2016-09-06 2019-09-18 Mayo Found Medical Education & Res Métodos para tratar cáncer que expresa la proteína del ligando 1 de muerte celular programada (pd-l1).
JP7025412B2 (ja) 2016-09-06 2022-02-24 マヨ ファウンデーション フォー メディカル エデュケーション アンド リサーチ パクリタキセル－アルブミン－結合剤組成物並びに該組成物の使用及び製造方法
US11590098B2 (en) 2016-09-06 2023-02-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of treating triple-negative breast cancer using compositions of antibodies and carrier proteins
MX2019004775A (es) * 2016-11-03 2019-08-05 Squibb Bristol Myers Co Anticuerpos anti antigeno 4 del linfocito t citotoxico (ctla-4) activables y sus usos.
US10844134B2 (en) 2016-11-23 2020-11-24 Harpoon Therapeutics, Inc. PSMA targeting trispecific proteins and methods of use
US20200207846A1 (en) * 2016-11-28 2020-07-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding molecule having adjustable ligand binding activity
WO2018106738A1 (en) 2016-12-05 2018-06-14 Massachusetts Institute Of Technology Brush-arm star polymers, conjugates and particles, and uses thereof
AU2017373944B2 (en) 2016-12-07 2022-02-03 Agenus Inc. Anti-CTLA-4 antibodies and methods of use thereof
CN110300599A (zh) 2016-12-07 2019-10-01 艾吉纳斯公司 抗体和其使用方法
EP3551667A4 (en) 2016-12-09 2020-06-17 Seattle Genetics, Inc. BIVALENT ANTIBODIES MASKED BY COILS
CN106519034B (zh) 2016-12-22 2020-09-18 鲁南制药集团股份有限公司 抗pd-1抗体及其用途
JP2020504123A (ja) * 2016-12-29 2020-02-06 ディベロップメント センター フォー バイオテクノロジーＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｋｌｋ６媒介性ｃｎｓ特異的抗体プロドラッグ活性化
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
US20210130494A1 (en) * 2017-02-22 2021-05-06 Aleta Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for treatment of cancer
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN
KR20190134654A (ko) 2017-03-09 2019-12-04 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. Cd147 항체, 활성화가능한 cd147 항체, 그리고 이를 만들고, 이용하는 방법
MY200973A (en) 2017-04-11 2024-01-26 Inhibrx Inc Multispecific Polypeptide Constructs Having Constrained Cd3 Binding And Methods Of Using The Same
JP2020512825A (ja) * 2017-04-12 2020-04-30 ファイザー・インク 条件的親和性を有する抗体およびその使用の方法
CN108728444A (zh) 2017-04-18 2018-11-02 长春华普生物技术股份有限公司 免疫调节性多核苷酸及其应用
AU2018265856B2 (en) 2017-05-12 2023-04-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
WO2018213335A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Scalmibio, Inc. Activatable antibodies and methods of use thereof
US11168144B2 (en) 2017-06-01 2021-11-09 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-PDL1 antibodies, and methods of use thereof
EP3645530A2 (en) 2017-06-30 2020-05-06 Massachusetts Institute of Technology Branched multi-functional macromonomers and related polymers and uses thereof
JP2020531045A (ja) 2017-07-14 2020-11-05 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗ｃｄ１６６抗体およびその使用
JP2020530554A (ja) 2017-07-20 2020-10-22 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 活性化抗体の特性を定性的および／または定量的に分析する方法およびその使用
KR102003594B1 (ko) * 2017-08-08 2019-07-24 숙명여자대학교산학협력단 염증 반응 매개 신혈관생성 질환 진단용 조성물
JP2020531430A (ja) * 2017-08-16 2020-11-05 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 抗体を標的とする抗ｃｔｌａ４プロボディ療法
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
BR112020004231A2 (pt) 2017-08-30 2020-09-08 Cytomx Therapeutics, Inc. anticorpos anti-cd166 ativáveis e métodos de uso dos mesmos
JP2020534811A (ja) * 2017-09-08 2020-12-03 マベリック セラピューティクス， インコーポレイテッドＭａｖｅｒｉｃｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｆｃ領域を含有する条件的に活性化された結合部分
EP3679067A2 (en) * 2017-09-08 2020-07-15 Maverick Therapeutics, Inc. Constrained conditionally activated binding proteins
EP3694997A4 (en) 2017-10-12 2021-06-30 Mcmaster University T-CELL ANTIGEN COUPLER WITH Y182T MUTATION, AND PROCEDURES AND USES THEREOF
CR20200196A (es) 2017-10-13 2020-06-05 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas trispecìficas y mètodos de uso
SG11202003341UA (en) 2017-10-13 2020-05-28 Harpoon Therapeutics Inc B cell maturation antigen binding proteins
RS61596B1 (sr) 2017-10-14 2021-04-29 Abbvie Inc Anti-cd71 aktivirani konjugati leka-antitela i metode njihovog korišćenja
CA3078911A1 (en) 2017-10-14 2019-04-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
US20200369781A1 (en) * 2017-11-28 2020-11-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide including antigen-binding domain and carrying section
SG11202004627WA (en) 2017-11-28 2020-06-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Ligand-binding molecule having adjustable ligand-binding activity
WO2019108733A2 (en) * 2017-12-01 2019-06-06 Seattle Genetics, Inc. Cd47 antibodies and uses thereof for treating cancer
KR20200117997A (ko) 2017-12-15 2020-10-14 알레타 바이오쎄라퓨틱스, 인크. Cd19 변이체
EP3727468A4 (en) * 2017-12-19 2021-09-22 Akouos, Inc. AAV-MEDIATED DELIVERY OF THERAPEUTIC ANTIBODIES TO THE INNER EAR
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) * 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
EP3749361A1 (en) 2018-02-08 2020-12-16 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
WO2019173771A1 (en) 2018-03-09 2019-09-12 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable cd147 antibodies and methods of making and use thereof
JP2021518603A (ja) 2018-03-20 2021-08-02 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 哺乳動物対象における活性化可能抗体種の定量薬理学モデリングのためのシステムおよび方法
WO2019213444A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
US20210299286A1 (en) 2018-05-04 2021-09-30 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Tetrazines for high click conjugation yield in vivo and high click release yield
US20210292421A1 (en) * 2018-05-14 2021-09-23 Harpoon Therapeutics, Inc. Binding moiety for conditional activation of immunoglobulin molecules
CA3100018A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin 12 polypeptides and methods of use thereof
JP7460609B2 (ja) 2018-05-14 2024-04-02 ウェアウルフ セラピューティクス， インコーポレイテッド 活性化可能なインターロイキン－２ポリペプチド及びその使用方法
EP3807312A4 (en) * 2018-05-30 2022-07-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha POLYPEPTIDE WITH AGGRECAN-BINDING DOMAIN AND A CARRIER UNIT
WO2019230866A1 (en) * 2018-05-30 2019-12-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide comprising il-1r1 binding domain and carrying moiety
US20210253672A1 (en) 2018-05-30 2021-08-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding molecule containing single domain antibody
US10640562B2 (en) 2018-07-17 2020-05-05 Mcmaster University T cell-antigen coupler with various construct optimizations
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
CN112789294A (zh) 2018-07-24 2021-05-11 印希比股份有限公司 含有受限cd3结合结构域和受体结合区的多特异性多肽构建体及其使用方法
TW202019466A (zh) 2018-07-31 2020-06-01 美商安進公司 包含掩蔽的抗原結合蛋白質之配製物及藥物組成物
WO2020037236A1 (en) 2018-08-17 2020-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Degradable polymers of a cyclic silyl ether and uses thereof
US10815311B2 (en) 2018-09-25 2020-10-27 Harpoon Therapeutics, Inc. DLL3 binding proteins and methods of use
CN113166262A (zh) 2018-10-11 2021-07-23 英伊布里克斯公司 Pd-1单结构域抗体及其治疗组合物
JP2022504802A (ja) 2018-10-11 2022-01-13 インヒブルクス インコーポレイテッド ５ｔ４シングルドメイン抗体およびその治療組成物
CA3115089A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
US20230124851A1 (en) 2018-10-11 2023-04-20 Inhibrx, lnc. B7h3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
TW202029980A (zh) * 2018-10-26 2020-08-16 美商免疫遺傳股份有限公司 Ｅ ｐ Ｃ Ａ Ｍ 抗體、可活化抗體及免疫偶聯物以及其用途
CN113260383A (zh) 2018-11-02 2021-08-13 西托姆克斯治疗公司 可活化的抗cd166抗体及其使用方法
WO2020118109A2 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Cytomx Therapeutics, Inc. Matrix metalloprotease-cleavable and serine or cysteine protease-cleavable substrates and methods of use thereof
CA3121813A1 (en) * 2018-12-14 2020-06-18 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited Il-15 compositions and methods of use thereof
MX2021007769A (es) * 2018-12-26 2021-09-23 Xilio Dev Inc Proteínas de unión anti-ctla4 enmascaradas activables.
EP3930761A1 (en) 2019-02-26 2022-01-05 CytomX Therapeutics, Inc. Combined therapies of activatable immune checkpoint inhibitors and conjugated activatable antibodies
CN114390938A (zh) 2019-03-05 2022-04-22 武田药品工业有限公司 受约束的条件性活化的结合蛋白
KR20220022112A (ko) 2019-03-21 2022-02-24 이뮤노젠 아이엔씨 세포-결합 제제-약물 콘쥬게이트를 준비하는 방법
CN113993540A (zh) 2019-04-15 2022-01-28 奎克赛尔治疗学有限责任公司 用于治疗癌症的一种或多种包含靶向掩蔽i型干扰素(ifna和ifnb)和针对肿瘤抗原的抗体的融合蛋白组合物
ES2966473T3 (es) 2019-04-26 2024-04-22 Immunogen Inc Derivados de camptotecina
JP2022532217A (ja) 2019-05-14 2022-07-13 ウェアウルフ セラピューティクス， インコーポレイテッド 分離部分及びその使用方法
WO2020236679A1 (en) * 2019-05-17 2020-11-26 Cytomx Therapeutics, Inc. Methods and compositions for determining the biodistribution of activatable anti-cd166 antibody conjugates
KR20220010525A (ko) 2019-05-20 2022-01-25 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 보론산 에스테르 전구약물 및 그의 용도
US11613564B2 (en) 2019-05-31 2023-03-28 ALX Oncology Inc. Methods of treating cancer
US20220233709A1 (en) 2019-06-05 2022-07-28 Seagen Inc. Masked Antibody Formulations
KR20220017430A (ko) 2019-06-05 2022-02-11 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 절단 부위 결합 분자
US20220306727A1 (en) 2019-06-05 2022-09-29 Seagen Inc. Methods of Purifying Masked Antibodies
WO2020251878A1 (en) 2019-06-11 2020-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ctla4 antibody prodruggable (probody) at a cdr position
US20220296692A1 (en) 2019-06-13 2022-09-22 Cytomx Therapeutics, Inc. Use of an activatable anti-pdl1 antibody and an anti-ctla-4 antibody in a neoadjuvant combination therapy for the treatment of cancer
JP2022536511A (ja) 2019-06-13 2022-08-17 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 癌の処置のための併用療法での活性化可能抗ｐｄｌ１抗体および抗ｃｔｌａ－４抗体の使用
CA3143925A1 (en) 2019-06-17 2020-12-24 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Compounds for fast and efficient click release
IL289094A (en) 2019-06-17 2022-02-01 Tagworks Pharmaceuticals B V Tetrazines for increasing the speed and yield of the "click release" reaction
EP4034171A1 (en) 2019-09-23 2022-08-03 Cytomx Therapeutics Inc. Anti-cd47 antibodies, activatable anti-cd47 antibodies, and methods of use thereof
GB201918230D0 (en) 2019-12-11 2020-01-22 Prec Therapeutics Ltd Antibodies and their uses
AU2020403145A1 (en) 2019-12-13 2022-07-07 Genentech, Inc. Anti-Ly6G6D antibodies and methods of use
US20210220391A1 (en) 2020-01-10 2021-07-22 Massachusetts Institute Of Technology Proteolysis targeting chimeric molecules (protacs) with functional handles and uses thereof
KR20220145833A (ko) * 2020-01-23 2022-10-31 아다젠 아게 Fc 돌연변이를 갖는 이형이량체 단백질
CN115380047A (zh) 2020-01-29 2022-11-22 印希比股份有限公司 Cd28单结构域抗体及其多价和多特异性构建体
JP2023527609A (ja) 2020-02-21 2023-06-30 ハープーン セラピューティクス，インク． Ｆｌｔ３結合タンパク質および使用方法
MX2022011676A (es) * 2020-03-23 2023-03-08 Zymeworks Bc Inc Proteinas de fusion de il12 con enmascaramiento y metodos para su uso.
WO2021207657A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Cytomx Therapeutics, Inc. Compositions containing activatable antibodies
AU2021254283A1 (en) 2020-04-10 2022-11-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
CN111951884B (zh) * 2020-07-10 2022-03-22 中南大学 蛋白质小分子结合口袋上关键柔性氨基酸的识别方法
US11512113B2 (en) 2020-08-11 2022-11-29 Janux Therapeutics, Inc. Cleavable linker compositions and methods
US20220089642A1 (en) * 2020-09-17 2022-03-24 City Of Hope Fc Receptor-ACE2 Conjugates and Use Thereof
JP2023552812A (ja) 2020-12-09 2023-12-19 ジャナックス セラピューティクス，インク． Ｐｓｍａおよびエフェクタ細胞抗原を標的とする腫瘍活性化抗体に関連する組成物ならびに方法
WO2022170619A1 (en) * 2021-02-11 2022-08-18 Adagene Pte. Ltd. Anti-cd3 antibodies and methods of use thereof
AU2022237504A1 (en) 2021-03-16 2023-10-05 Cytomx Therapeutics, Inc. Masked activatable cytokine constructs and related compositions and methods
EP4117668A4 (en) * 2021-04-16 2023-12-06 Provectus Pharmatech, Inc. COMPOSITION AND METHOD FOR THE ORAL TREATMENT OF LEUKEMIA
KR20240021943A (ko) 2021-06-18 2024-02-19 남미 테라퓨틱스, 인크. 암의 치료에 사용하기 위한 마스킹된 유형 I 인터페론 (IFNα 및 IFNβ)을 포함하는 융합 단백질 조성물(들) 및 그의 방법
US11453723B1 (en) 2021-06-25 2022-09-27 Mcmaster University BCMA T cell-antigen couplers and uses thereof
WO2023288236A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Seagen Inc. Antibody masking domains
WO2023034825A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Cytomx Therapeutics, Inc. Method for determining protease activity in a biological sample
WO2023049825A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Seagen Inc. Improved antibody masking domains
IL311972A (en) 2021-10-08 2024-06-01 Cytomx Therapeutics Inc Activatable Cytokine Structures and Conjugation Methods
IL311971A (en) 2021-10-08 2024-06-01 Cytomx Therapeutics Inc Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
WO2023064945A2 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 Harpoon Therapeutics, Inc. Conditional activation of immunoglobulin molecules
TW202323282A (zh) 2021-10-15 2023-06-16 美商賽特艾克斯生物製藥公司 可活化之多肽複合物
WO2023064955A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-cd3, anti-egfr, heteromultimeric bispecific polypeptide complex
WO2023064927A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable polypeptide complex
TW202334238A (zh) 2021-11-30 2023-09-01 日商第一三共股份有限公司 蛋白酶分解性遮蔽抗體
WO2023104190A1 (en) * 2021-12-09 2023-06-15 Vibrant Pharma Limited Antibody masks and uses thereof
TW202342106A (zh) * 2022-02-09 2023-11-01 日商第一三共股份有限公司 環境應答性遮蔽抗體及其利用
US20240116997A1 (en) 2022-02-23 2024-04-11 Bright Peak Therapeutics Ag Activatable il-18 polypeptides
WO2023183888A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antigen-binding protein constructs and uses of the same
WO2023183923A1 (en) * 2022-03-25 2023-09-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable dual-anchored masked molecules and methods of use thereof
WO2023192973A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable multispecific molecules and methods of use thereof
WO2023192606A2 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Cytomx Therapeutics, Inc. Cd3-binding proteins and methods of use thereof
WO2023201291A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of mosunetuzumab and methods of use
WO2023222580A1 (en) 2022-05-16 2023-11-23 Byondis B.V. Novel masked antibodies
WO2024015830A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Epcam immunoconjugates and uses thereof
WO2024030858A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
WO2024030847A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
WO2024030843A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
WO2024030845A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
WO2024030850A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
WO2024039973A2 (en) * 2022-08-05 2024-02-22 Staidson Biopharma Inc. Masking polypeptide, activatable novel prodrugs and methods of use thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001091798A2 (en) * 2000-06-01 2001-12-06 Universite Catholique De Louvain Tumor activated prodrug compounds
WO2007105027A1 (en) * 2006-03-10 2007-09-20 Diatos Anticancer drugs conjugated to antibody via an enzyme cleavable linker

Family Cites Families (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) * 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
JPS5686121A (en) * 1979-12-14 1981-07-13 Teijin Ltd Antitumor proten complex and its preparation
US4867973A (en) * 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
US4671958A (en) * 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4732863A (en) 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US5306731A (en) * 1985-06-14 1994-04-26 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Method and products for treating the eye
US5849478A (en) 1986-08-14 1998-12-15 Cashman; Daniel P. Blocked-polymerase polynucleotide immunoassay method and kit
EP0623679B1 (en) 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US4975278A (en) * 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US4952394A (en) * 1987-11-23 1990-08-28 Bristol-Myers Company Drug-monoclonal antibody conjugates
US5720937A (en) * 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
JP3040121B2 (ja) * 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
US5322678A (en) 1988-02-17 1994-06-21 Neorx Corporation Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification
US5144012A (en) * 1988-08-08 1992-09-01 Eli Lilly And Company Cytotoxic drug conjugates
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
AU4128089A (en) * 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
JPH02100685A (ja) * 1988-10-05 1990-04-12 Res Dev Corp Of Japan ポリペプチド分泌発現ベクター，該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物によるポリペプチドの製造
US5010176A (en) * 1988-11-10 1991-04-23 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
WO1990005749A1 (en) 1988-11-18 1990-05-31 The Regents Of The University Of California Conjugated polypeptides and methods for their preparation and use
US5162218A (en) * 1988-11-18 1992-11-10 The Regents Of The University Of California Conjugated polypeptides and methods for their preparation
KR0162259B1 (ko) * 1989-12-05 1998-12-01 아미 펙터 감염성 병변 및 염증성 병변을 검출 및 치료하기 위한 키메라 항체
US5459061A (en) 1990-01-26 1995-10-17 W. Alton Jones Cell Science Center, Inc. Hybridomas producing monoclonal antibodies which specifically bind to continuous epitope on the human EGF receptor and compete with EGF for binding to the EGF receptor
US5525491A (en) 1991-02-27 1996-06-11 Creative Biomolecules, Inc. Serine-rich peptide linkers
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JP4124480B2 (ja) * 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
US5272253A (en) 1991-07-01 1993-12-21 Eli Lilly And Company Cluster conjugates of drugs with antibodies
EP1306095A3 (en) 1992-03-05 2003-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US6093399A (en) 1992-03-05 2000-07-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature
US6107059A (en) * 1992-04-29 2000-08-22 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
DE69327620T2 (de) 1992-08-18 2000-08-03 Immunologia Molecular Ciudad D Monoklonale Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor, Zellen und Verfahren zur ihrer Herstellung und sie erhaltende Zusammensetzungen
WO1994007921A1 (en) 1992-09-25 1994-04-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Target binding polypeptide
US5834247A (en) * 1992-12-09 1998-11-10 New England Biolabs, Inc. Modified proteins comprising controllable intervening protein sequences or their elements methods of producing same and methods for purification of a target protein comprised by a modified protein
US5679548A (en) * 1993-02-02 1997-10-21 The Scripps Research Institute Methods for producing polypeptide metal binding sites and compositions thereof
WO1994018221A1 (en) * 1993-02-02 1994-08-18 The Scripps Research Institute Methods for producing polypeptide binding sites
US5556623A (en) * 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US5777078A (en) 1993-04-28 1998-07-07 Worcester Foundation For Experimental Biology Triggered pore-forming agents
CA2160909A1 (en) * 1993-04-28 1994-11-10 Hagan Bayley Cell-targeted lytic pore-forming agents
EP0706573A1 (en) * 1993-07-09 1996-04-17 The Institute Of Cancer Research Protein tyrosine kinase and ligands thereof
GB9322156D0 (en) 1993-10-27 1993-12-15 Univ Newcastel Upon Tyne Activation of molecules
US5733757A (en) * 1995-12-15 1998-03-31 The Scripps Research Institute Aldolase catalytic antibody
US5468785A (en) * 1994-04-15 1995-11-21 University Of Akron Cobaloxime photoinitiated free radical polymerizations
US5686600A (en) 1994-06-28 1997-11-11 Novartis Finance Corporation Antibodies which bind to insect gut proteins and their use
AU694546C (en) 1994-08-19 2001-09-06 La Region Wallonne Compounds, pharmaceutical composition and diagnostic device comprising same and their use
DK0706799T3 (da) 1994-09-16 2002-02-25 Merck Patent Gmbh Immunkonjugater II
US5877155A (en) 1995-03-17 1999-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Mimotopes and anti-mimotopes of human platelet glycoprotein Ib/IX
US5641870A (en) * 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
WO1996034892A1 (en) 1995-05-03 1996-11-07 Bioenhancements Ltd. Bispecific antibodies in which the binding capability is reversibly inhibited by a photocleavable moiety
US7060808B1 (en) * 1995-06-07 2006-06-13 Imclone Systems Incorporated Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody
CN101712720A (zh) 1996-02-09 2010-05-26 艾博特生物技术有限公司 结合人TNFα的人抗体
GB9603507D0 (en) 1996-02-20 1996-04-17 Isis Innovation Antibody variants
US5866341A (en) * 1996-04-03 1999-02-02 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Compositions and methods for screening drug libraries
US5922845A (en) * 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
NZ334595A (en) 1996-09-09 2000-08-25 Zealand Pharmaceuticals As Peptide prodrugs containing an alpha-hydroxyacid linker that have increased stability against enzymatic cleavage
US6368598B1 (en) 1996-09-16 2002-04-09 Jcrt Radiation Oncology Support Services, Inc. Drug complex for treatment of metastatic prostate cancer
US5994104A (en) 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
US5990286A (en) * 1996-12-18 1999-11-23 Techniclone, Inc. Antibodies with reduced net positive charge
DE19701141C1 (de) 1997-01-16 1998-04-09 Hoechst Ag Genkonstrukte für durch Proteasen aktivierbare Wirksubstanzen
US7122636B1 (en) 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
US20020032315A1 (en) * 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
SI1325932T1 (ru) * 1997-04-07 2005-08-31 Genentech Inc
US6884879B1 (en) * 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US7365166B2 (en) * 1997-04-07 2008-04-29 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US6323322B1 (en) * 1997-04-30 2001-11-27 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
WO1998049307A1 (en) * 1997-05-01 1998-11-05 Zymogenetics, Inc. Mammalian cytokine-like receptor
US6235883B1 (en) * 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
AU7582298A (en) * 1997-05-19 1998-12-11 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Tissue specific prodrug
EP0998572A2 (en) * 1997-07-25 2000-05-10 Du Pont Pharmaceuticals Company Aggrecan degrading metallo proteases
KR100230578B1 (ko) 1997-07-25 1999-12-01 허영섭 포스포리불로키나제를 융합파트너로 이용하는 재조합 인간 부갑상선호르몬의 발현벡터
US20030073169A1 (en) 1997-09-18 2003-04-17 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6391311B1 (en) * 1998-03-17 2002-05-21 Genentech, Inc. Polypeptides having homology to vascular endothelial cell growth factor and bone morphogenetic protein 1
BR9813365A (pt) * 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
US6551795B1 (en) * 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
CA2335324A1 (en) 1998-07-17 2000-01-27 Genetag Technology, Inc. Methods for detecting and mapping genes, mutations and variant polynucleotide sequences
US7157418B1 (en) * 1998-07-22 2007-01-02 Osprey Pharmaceuticals, Ltd. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
US6203989B1 (en) 1998-09-30 2001-03-20 Affymetrix, Inc. Methods and compositions for amplifying detectable signals in specific binding assays
US6180343B1 (en) * 1998-10-08 2001-01-30 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Green fluorescent protein fusions with random peptides
SK287491B6 (sk) 1998-10-16 2010-11-08 Biogen Idec Ma Inc. Fúzne proteíny interferónu- beta-1a a ich použitie
US6682736B1 (en) * 1998-12-23 2004-01-27 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to CTLA-4
US6015557A (en) * 1999-02-24 2000-01-18 Tobinick; Edward L. Tumor necrosis factor antagonists for the treatment of neurological disorders
CA2365913C (en) * 1999-04-12 2015-03-03 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor receptor homologs and nucleic acids encoding the same
IL129427A0 (en) * 1999-04-13 2000-02-17 Yeda Res & Dev Preparation of biologically active molecules
CA2372053C (en) * 1999-04-28 2008-09-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
US6268488B1 (en) * 1999-05-25 2001-07-31 Barbas, Iii Carlos F. Prodrug activation using catalytic antibodies
US6903196B1 (en) * 1999-06-17 2005-06-07 Utah Ventures Ii, L.P. Methods for identifying and isolating tissue-specific lumen-exposed molecules
US20040146516A1 (en) * 1999-06-17 2004-07-29 Utah Ventures Ii L.P. Lumen-exposed molecules and methods for targeted delivery
DK2283866T3 (en) 1999-06-25 2015-05-18 Genentech Inc METHODS OF TREATMENT USING ANTI-ERBB ANTIBODY-MAYTANSINOID CONJUGATES
JP2003508028A (ja) * 1999-07-28 2003-03-04 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍治療のための組成物と方法
CN1371416B (zh) * 1999-08-24 2012-10-10 梅达里克斯公司 人ctla-4抗体及其应用
US20050208558A1 (en) * 1999-10-19 2005-09-22 Applera Corporation Detection kits, such as nucleic acid arrays, for detecting the expression or 10,000 or more Drosophila genes and uses thereof
DE19952956A1 (de) * 1999-11-03 2001-05-17 Acgt Progenomics Ag Verfahren zur Verbindung von molekularen Substanzen
US7220552B1 (en) 1999-11-19 2007-05-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bifunctional molecules and their use in the disruption of protein-protein interactions
US6436703B1 (en) * 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
JP2004507217A (ja) * 2000-04-11 2004-03-11 アンスティテュ・パストゥール リステリア菌ゲノム、ポリペプチドおよびその使用
US20110131679A2 (en) 2000-04-19 2011-06-02 Thomas La Rosa Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US7514067B2 (en) * 2000-04-25 2009-04-07 President And Fellows Of Harvard College Methods for tumor diagnosis and therapy
US20040181830A1 (en) * 2001-05-07 2004-09-16 Kovalic David K. Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
US20040014652A1 (en) * 2000-06-01 2004-01-22 Andre Trouet Tumor activated prodrug compounds and methods of making and using the same
CA2408103A1 (en) 2000-06-01 2001-12-06 Universite Catholique De Louvain Tumor activated prodrug compounds and methods of making and using the same
US6625945B2 (en) * 2000-08-08 2003-09-30 Alfred D. Commins Balanced, multi-stud hold-down
US8314060B2 (en) * 2000-09-05 2012-11-20 Biosight Ltd. Peptide conjugated anti-cancer prodrugs
EP1315512A4 (en) * 2000-09-08 2005-11-09 Univ Texas NOVIRAL AD TARGETING AND MANIPULATION OF IMMUNE SYSTEM RESPONSE USING TARGETING PEPTIDES
DE10045592A1 (de) * 2000-09-15 2002-03-28 Klaus Pfizenmaier Ein Antikörper-TNF-TNF Inhibitor Fusionsprotein (TNF-Selektokin) als zielspezifisches Prozytokin zur Tumortherapie
US7465790B2 (en) 2000-10-09 2008-12-16 Isis Innovation, Inc. Therapeutic antibodies
ES2368387T5 (es) 2000-10-09 2019-03-07 Cytomx Therapeutics Inc Anticuerpos terapéuticos y que inducen tolerancia
WO2002066656A2 (en) 2001-01-04 2002-08-29 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Detection of protein conformation using a split ubiquitin reporter system
US7141392B2 (en) * 2001-01-09 2006-11-28 Queen Mary And Westfield College Latent fusion protein
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
WO2002060488A1 (en) 2001-01-30 2002-08-08 Universite Catholique De Louvain Anti-tumor compounds
JP2004519233A (ja) 2001-02-19 2004-07-02 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 免疫原性の低減された修飾された抗ｅｇｆｒ抗体
PL362324A1 (en) * 2001-02-19 2004-10-18 Merck Patent Gmbh Artificial fusion proteins with reduced immunogenicity
WO2002079415A2 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
GB0118155D0 (en) * 2001-07-25 2001-09-19 Lorantis Ltd Superantigen
US7820178B2 (en) 2001-08-01 2010-10-26 University of Brisol VEGF isoforms and their use as anti-angiogenic, anti-vasodilatory, anti-permeability and anti-proliferative agents
US20030082191A1 (en) 2001-08-29 2003-05-01 Poduslo Joseph F. Treatment for central nervous system disorders
US20040142325A1 (en) * 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US20030134824A1 (en) * 2001-11-12 2003-07-17 Ronald Breslow Beta-cyclodextrin dimers and phthalocyanines and uses thereof
CA2470643C (en) * 2001-12-17 2011-10-18 Bryan Paul Morgan Cleavable reagents for specific delivery to disease sites
AU2003217415B2 (en) 2002-02-14 2009-01-08 William J Rutter Chimeric molecules for cleavage in a treated host
US7591994B2 (en) 2002-12-13 2009-09-22 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
IL164287A0 (en) * 2002-04-12 2005-12-18 Medarex Inc Methods of treatment using ctla-4 antibodies
JP4448440B2 (ja) * 2002-04-30 2010-04-07 株式会社ディナベック研究所 プロテアーゼ依存性トロピズムが改変されたベクター
US20040109855A1 (en) 2002-07-23 2004-06-10 Herman Waldmann Therapeutic antibodies with reduced side effect
AU2003265866A1 (en) 2002-09-03 2004-03-29 Vit Lauermann Targeted release
JP4351430B2 (ja) 2002-10-04 2009-10-28 財団法人癌研究会 ナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチド
WO2004054622A1 (en) * 2002-12-13 2004-07-01 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
CN1548537B (zh) 2002-12-27 2010-05-05 深圳市源兴生物医药科技有限公司 疫苗制备方法和抗肿瘤疫苗
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
AU2004248138B2 (en) * 2003-05-29 2009-09-03 The Scripps Research Institute Targeted delivery to legumain-expressing cells
US20050009110A1 (en) 2003-07-08 2005-01-13 Xiao-Jia Chang Methods of producing antibodies for diagnostics and therapeutics
JP2007501011A (ja) * 2003-08-01 2007-01-25 ジェネンテック・インコーポレーテッド 制限多様性配列を有する結合型ポリペプチド
US7256038B2 (en) 2003-08-18 2007-08-14 Regents Of The University Of California Polypeptide display libraries and methods of making and using thereof
US20050106100A1 (en) * 2003-09-03 2005-05-19 Harris Thomas D. Compounds containing matrix metalloproteinase substrates and methods of their use
US7985401B2 (en) * 2003-10-31 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Peptides whose uptake by cells is controllable
US7431915B2 (en) 2003-10-31 2008-10-07 The Regents Of The University Of California Peptides whose uptake by cells is controllable
WO2005051315A2 (en) * 2003-11-24 2005-06-09 The Regents Of The University Of California On-demand cleavable linkers for radioconjugates for cancer imaging and therapy
WO2005067980A2 (en) * 2004-01-12 2005-07-28 Pointilliste, Inc. Design of therapeutics and therapeutics
US7767792B2 (en) * 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
GB0404187D0 (en) * 2004-02-25 2004-03-31 Biotransformations Ltd Binding agents
CA2560305C (en) 2004-03-19 2016-07-05 Imclone Systems Incorporated Human anti-epidermal growth factor receptor antibody
EP1579873A1 (en) 2004-03-23 2005-09-28 Complex Biosystems GmbH Polymeric prodrugs
AU2005249490B2 (en) 2004-06-01 2010-07-29 Genentech, Inc. Antibody drug conjugates and methods
US7541330B2 (en) 2004-06-15 2009-06-02 Kosan Biosciences Incorporated Conjugates with reduced adverse systemic effects
PL1791565T3 (pl) 2004-09-23 2016-10-31 Modyfikowane cysteiną przeciwciała i koniugaty
EP1824796A4 (en) * 2004-11-16 2010-02-17 Avidia Res Inst PROTEIN SKELETONS AND USES THEREOF
EP1817059A2 (en) 2004-12-01 2007-08-15 Genentech, Inc. Conjugates of 1,8-bis-naphthalimides with an antibody
US20090022782A1 (en) 2005-02-25 2009-01-22 National University Corp. Hokkaido University Blood Retainable Device Exhibiting Selective Degradability in Tumor Tissue
WO2006108052A2 (en) * 2005-04-06 2006-10-12 Genzyme Corporation Peg and polysialic lysosomal enzyme conjugates via acid labile linkers for therapeutic targeting
FR2888850B1 (fr) * 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
DE102005036542A1 (de) 2005-08-03 2007-02-08 Universität Stuttgart CTL-Prodrug
CA2620886C (en) * 2005-08-31 2017-03-14 The Regents Of The University Of California Cellular libraries of peptide sequences (clips) and methods of using the same
US20090130776A1 (en) 2005-09-01 2009-05-21 Canon Kabushiki Kaisha Binding protein molecule
JP4567563B2 (ja) * 2005-09-22 2010-10-20 富士通株式会社 携帯端末装置、ヒンジ装置、筒状部材及び光通信システム
EP1770099A1 (en) 2005-09-28 2007-04-04 University of Geneva Method of producing a modified (poly)peptide
CN101374856A (zh) * 2005-11-29 2009-02-25 斯克里普斯研究学院 抑制肿瘤细胞浸润、转移和血管生成
EA013878B1 (ru) 2005-12-06 2010-08-30 Домантис Лимитед Лиганды, имеющие специфичность связывания в отношении рецептора эпидермального фактора роста (egfr) и/или сосудистого эндотелиального фактора роста (vegf), и способы их применения
GB0604187D0 (en) 2006-03-02 2006-04-12 Fusion Antibodies Ltd Peptide and uses thereof
EP1998684A4 (en) 2006-03-10 2014-09-17 Massachusetts Inst Technology CONJUGATES AND NANOSYSTEMS WITH TRIGGERED SELF ASSEMBLY
US7118159B1 (en) 2006-03-15 2006-10-10 Gary Randall Andrews Convertible tonneau cover
JP5374359B2 (ja) 2006-03-17 2013-12-25 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 安定化されたポリペプチド化合物
JP4959226B2 (ja) * 2006-05-19 2012-06-20 独立行政法人産業技術総合研究所 スリーフィンガー様蛋白質ライブラリ
MX2009001293A (es) * 2006-08-03 2009-02-11 Astrazeneca Ab Anticuerpos dirigidos a (v(6 y usos de los mismos.
US20100215670A1 (en) * 2006-10-30 2010-08-26 Jeannick Cizeau Immunotoxin Fusions Comprising An Antibody Fragment and a Plant Toxin Linked by Protease Cleavable Linkers
EP1930342B1 (en) * 2006-12-04 2012-01-25 Institut Pasteur OB-fold used as scaffold for engineering new specific binders
US8957251B2 (en) * 2007-04-19 2015-02-17 State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Pactamycin analogs and methods of making thereof
US20080317677A1 (en) 2007-06-22 2008-12-25 Szymczak Christopher E Laser Marked Dosage Forms
AU2008283802A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Polypeptide-nucleic acid conjugate for immunoprophylaxis or immunotherapy for neoplastic or infectious disorders
US8317505B2 (en) * 2007-08-21 2012-11-27 Johnson & Johnson Vision Care, Inc. Apparatus for formation of an ophthalmic lens precursor and lens
WO2009026274A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 Medarex, Inc. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
CA2697032C (en) * 2007-08-22 2021-09-14 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
BRPI0817108B8 (pt) 2007-09-21 2021-05-25 Univ California composição compreendendo uma proteína de fusão, kit compreendendo a referida composição e uso da mesma.
CA2711256C (en) 2008-01-03 2019-01-15 The Scripps Research Institute Antibody targeting through a modular recognition domain
JP2012511033A (ja) 2008-12-08 2012-05-17 テゴファーム コーポレーション 多価化合物の可逆阻害用マスキングリガンド
US20110178279A1 (en) 2009-08-03 2011-07-21 Williams John C Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects: application to anti-egfr antibodies
EP2385955B1 (en) * 2009-01-12 2020-08-12 CytomX Therapeutics, Inc. Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
CA2748662A1 (en) 2009-01-19 2010-07-22 Bayer Healthcare Llc Protein conjugate having an endopeptidase-cleavable bioprotective moiety
WO2010085845A1 (en) 2009-01-28 2010-08-05 The University Of Queensland Cancer therapy and/or diagnosis
DK3903829T3 (da) 2009-02-13 2023-06-26 Immunomedics Inc Immunkonjugater med en intracellulær spaltelig binding
WO2010096838A2 (en) * 2009-02-23 2010-08-26 Cytomx Therapeutics, Llc Proproteins and methods of use thereof
AU2010220324A1 (en) * 2009-03-05 2011-09-01 Ascendis Pharma As Interferon alpha carrier prodrugs
WO2011015921A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Avesthagen Limited A highly efficient process of purification and production of recombinant cetuximab
WO2011015918A2 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Avesthagen Limited Vectors and compounds for expression of recombinant cetuximab
WO2011101435A1 (en) 2010-02-19 2011-08-25 Novo Nordisk A/S Activatable constructs
WO2011133658A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Boston Medical Center Corporation Compositions and methods for targeting and delivering therapeutics into cells
US9193791B2 (en) 2010-08-03 2015-11-24 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects
CN104540518A (zh) 2012-04-27 2015-04-22 西托姆克斯治疗公司 结合表皮生长因子受体的可活化的抗体其使用方法
WO2015066279A2 (en) 2013-10-30 2015-05-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
EP3310440A1 (de) * 2015-06-22 2018-04-25 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) und binder-prodrug-konjugate (apdcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001091798A2 (en) * 2000-06-01 2001-12-06 Universite Catholique De Louvain Tumor activated prodrug compounds
WO2007105027A1 (en) * 2006-03-10 2007-09-20 Diatos Anticancer drugs conjugated to antibody via an enzyme cleavable linker

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAGSHAWE K. D., "Antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) for cancer", Expert Rev Anticancer Ther., 2006; 6(10):1421-1431. *
SELF C. H., THOMPSON S., "Light activatable antibodies: Models for remotely activatable proteins", Nature medicine, 1996, 2(7): 817-820. *
SELF C. H., THOMPSON S., "Light activatable antibodies: Models for remotely activatable proteins", Nature medicine, 1996, 2(7): 817-820. BAGSHAWE K. D., "Antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) for cancer", Expert Rev Anticancer Ther., 2006; 6(10):1421-1431. МОИСЕЕНКО В.М., "Моноклональные антитела в лечении злокачественных опухолей", Практическая онкология, 2003, 4(3):148-156. *
МОИСЕЕНКО В.М., "Моноклональные антитела в лечении злокачественных опухолей", Практическая онкология, 2003, 4(3):148-156. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11932697B2 (en) 2016-11-28 2024-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding domain, and polypeptide including conveying section

Also Published As

Publication number Publication date
RU2011133819A (ru) 2013-02-20
AU2018214147A1 (en) 2018-08-30
JP2012514982A (ja) 2012-07-05
BRPI1006141B8 (pt) 2021-05-25
US20210284721A1 (en) 2021-09-16
CN102482347B (zh) 2017-04-26
AU2020203143B2 (en) 2023-03-16
US20140024810A1 (en) 2014-01-23
JP6271476B2 (ja) 2018-01-31
US20100189651A1 (en) 2010-07-29
EP2385955A2 (en) 2011-11-16
US20190119370A1 (en) 2019-04-25
AU2016225810A1 (en) 2016-09-22
EP3543256A1 (en) 2019-09-25
US20120207756A1 (en) 2012-08-16
AU2016225810C1 (en) 2018-09-20
JP2017200955A (ja) 2017-11-09
JP6571730B2 (ja) 2019-09-04
WO2010081173A2 (en) 2010-07-15
AU2010203353A2 (en) 2011-08-11
BRPI1006141B1 (pt) 2020-08-04
EP2385955A4 (en) 2013-02-13
CA2749339A1 (en) 2010-07-15
US8513390B2 (en) 2013-08-20
JP7221259B2 (ja) 2023-02-13
US20160228546A1 (en) 2016-08-11
US20130309230A1 (en) 2013-11-21
CN102482347A (zh) 2012-05-30
EP2385955B1 (en) 2020-08-12
AU2010203353A1 (en) 2011-08-11
US9453078B2 (en) 2016-09-27
US20170081397A1 (en) 2017-03-23
WO2010081173A3 (en) 2010-11-04
US10059762B2 (en) 2018-08-28
JP2021004250A (ja) 2021-01-14
AU2018214147B2 (en) 2020-06-04
JP6860601B2 (ja) 2021-04-14
AU2020203143A1 (en) 2020-06-04
US20120149061A1 (en) 2012-06-14
AU2010203353B2 (en) 2016-06-16
AU2016225810B2 (en) 2018-05-24
JP2019077731A (ja) 2019-05-23
JP2015193654A (ja) 2015-11-05
RU2017136814A3 (ru) 2021-10-21
US10118961B2 (en) 2018-11-06
BRPI1006141A2 (pt) 2016-02-23
US8563269B2 (en) 2013-10-22
JP5851842B2 (ja) 2016-02-03
CN106995495A (zh) 2017-08-01
RU2017136814A (ru) 2019-02-08
US10875913B2 (en) 2020-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2636046C2 (ru) Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения
RU2715232C2 (ru) Субстраты матриксной металлопротеиназы и другие расщипляемые фрагменты и способы их использования
US20140045195A1 (en) Activatable Binding Polypeptides and Methods of Identification and Use Thereof
RU2799787C2 (ru) Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения

Legal Events

Date Code Title Description
HZ9A Changing address for correspondence with an applicant