BRPI0017566B1 - composição de antígeno incluindo uma cultura de bordetella bronchiseptica, composição de vacina, método de inativação e vacinas - Google Patents

Abstract

composição de antigeno, composição de vacina, método de inativação, composição de bordetella bronchiseptica, vacina e uso da mesma a presente invenção refere-se a adjuvantes que contem uma lecitina, um óleo e um tensoativo anfifílico e que são capazes de formar urmi emulsão de vacina estável de óleo em água, de forma a minimizar as rea- ções locais à vacina no animal injetado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO DE ANTÍGENO INCLUINDO UMA CULTURA DE BORDETELLA BRONCHISEPTÍCA, COMPOSIÇÃO DE VACINA, MÉTODO DE INATIVA-ÇÃOE VACINAS".

Dividido do PI 0000126-0, depositado em 19.01.2000.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a adjuvantes imunológicos. Partícula rmente, a invenção refere-se a adjuvantes que compreendem uma emulsão de óleo em água e um tensoatívo. Os adjuvantes da invenção são proveitosos para uma variedade de formulações de vacinas, incluindo vacinas contendo componentes bactéria nos ou virais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A criação de imunidade a organismos infecciosos é uma ferramenta poderosa no controle de doenças. Os antígenos que induzem a imunidade á infecção são conhecidos como antígenos. O anticorpo protetor que aqueles induzem pode cooperar com outras defesas naturais para inibir o processo infeccioso ou pode neutralizar produtos nocivos do organismo infeccioso, tais como toxinas.

Uma forma eficaz de aumentar a resposta dos anticorpos é através da utilização de um adjuvante. Por conseguinte, o adjuvante é incluído na vacina como aditivo ou veículo para aumentar a resposta ao antígeno. Um adjuvante pode funcionar através de diferentes mecanismos, inclusive (1) sequestrando o antígeno no organismo originando posteriormente a sua libertação lenta, (2) atraindo células do sistema imunológico para o local de injeção, (3) estimulando a proliferação e ativação de células do sistema imunológico, e (4) melhorando a dispersão do antígeno no corpo do receptor. Vários agentes com propriedades químicas variadas têm sido utilizados como adjuvantes, incluindo emulsões de água em óleo, de óleo em água, sais minerais, polinucleotídeos e substâncias naturais. Um adjuvante, conhecido sobre o nome comercial AMPHIGEN™, é descrito na Patente dos Estados Unidos 5.084.269. O adjuvante AMPHIGEN™ consiste em lecitina desoleificada dissolvida em um óleo, geral mente parafina líquida fina.

Na preparação de vacinas, o AMPHIGEN™ é disperso em uma suspensão aquosa do antígeno imunizador formando uma emulsão de óleo em água.

Foram observados problemas quando foi utilizado o adjuvante AMPHIGEN™ segundo a Patente dos Estados Unidos 5.084.269 referida anteriormente. Por exemplo, a lecitina no AMPHIGEN™ é insuficiente para produzir uma emulsão estável do óleo dando origem, desta forma, a um depósito de óleo nos tecidos injetados. O óleo mineral não pode ser metaboli-zado ou eliminado pelo animal. Como resultado, o óleo torna-se uma de fonte inflamações crônicas graves e escoriações. O emulsionamento direto do AMPHIGEN™ na preparação antigênica acarreta o risco de danificar o antígeno. Além disso, se a emulsão pretendida não for obtida, o antígeno valioso tem de ser rejeitado.

Um adjuvante proveitoso em vacinas para animais, incluindo os seres humanos, que seja eficaz e resolva os problemas descritos acima será, por conseguinte, extremamente desejável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um adjuvante proveitoso para aumentar a resposta imunológica de um animal a um antígeno. Particularmente, a invenção refere-se a um adjuvante que é capaz de formar uma emulsão de óleo em água na composição da vacina. A invenção refere-se também com um adjuvante que, quando utilizado na formulação de uma vacina, origina uma inflamação e escoriação mínima no local de vacinação. A invenção refere-se ainda à formulação de vacina que contém um adjuvante da invenção. Finalmente, a invenção refere-se ao método de utilização de um adjuvante da invenção na vacinação.

Em uma das concretizações, o adjuvante da invenção inclui uma lecitina, um óleo e um tensoativo anfifílico capaz de emulsionar o adjuvante, por exemplo um tensoativo Tween ou Span. Em uma outra aparência preferida, o tensoativo é Tween 80, Tween 85, Span 80 ou Span 85.

Em uma outra concretização, o adjuvante da invenção inclui uma lecitina, um óleo e dois tensoativos anfifílicos capazes de emulsionar o adjuvante ou a formulação de vacina que contém o adjuvante. Em uma aparên- cia preferida, um dos tensoativos encontra-se predominantemente presente na fase aquosa, por exemplo, o Tween 80, e o outro tensoativo está predominantemente na fase oleosa, por exemplo, o Span 80. A lecitina é um fosfatídeo. Os preparados brutos de lecitina podem incorporar triglicerídeos. Para os objetivos da presente invenção, o termo "lecitina" abrange preparados brutos e preparados purificados. Na aparência preferida, a lecitina está desoleificada.

Os óleos adequados incluem um óleo mineral, por exemplo, o óleo mineral fino DRAKEOL™.

Ainda em uma outra concretização, o adjuvante da invenção contém um veículo aquoso, por exemplo, um tampão fisiologicamente aceitável, água ou uma solução salina.

Em uma concretização preferida, o adjuvante da invenção contém lecitina, óleo mineral, dois tensoativos anfifílicos e um veículo aquoso (por exemplo, solução salina).

Em uma outra concretização da invenção, é descrito um método para tornar inerte uma cultura de Bordetella bronchiseptica ("£?. bronchisepti-ca") usando formalina e glutaraldeído. Em uma outra aparência, é fornecida uma cultura de B. bronchiseptica que foi tornada inerte usando formalina e glutaraldeído. Ainda em uma outra aparência, é indicado um extrato de antí-genos obtidos a partir de uma cultura de B. bronchiseptica que foi tornada inerte usando formalina e glutaraldeído. Ainda em uma outra aparência, é indicada uma outra formulação de vacina que contém um extrato de antíge-nos obtidos a partir de uma cultura de B. bronchiseptica que foi tornada inerte usando formalina e glutaraldeído.

BREVE DESCRICÂO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra um gráfico onde está representada a distribuição dos tamanhos das gotas de uma emulsão preparada como descrita a-baixo. As linhas (a) e (b) indicam que cerca de 94% das gotas têm um diâmetro inferior ou igual 1 pm.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção refere-se a um adjuvante proveitoso para melhorar a resposta imunológica a um antígeno. Particularmente, a invenção refere-se a um adjuvante oleoso que é capaz de emulsionar uma formulação de vacina. Além disso, a invenção refere-se a um adjuvante que, quando utilizado na formulação de uma vacina, é capaz de evitar, de forma substancial, a inflamação ou escoriação do local de injeção, típico de vacinas contendo óleo mineral. Os adjuvantes da invenção incluem uma lecitina, um óleo e um ten-soativo anfifílico capaz de emulsionar o adjuvante ou a composição de vacina que contém o adjuvante. A invenção baseia-se, em parte, na descoberta de que a adição cerca de 1,5% v/v (isto é, a concentração de 1,5% de volume por volume obtida, por exemplo, misturando 98,5 volumes da vacina contendo o adjuvante com 1,5 volumes do tensoativo anfifílico) a 3,5% v/v de um tensoativo anfifílico a uma vacina contendo um adjuvante, como descrito na Patente dos Estados Unidos 5.084.269, é eficaz para emulsionar uma composição de vacina formulada com tal adjuvante e para minimizar a irritação no local de injeção do animal vacinado.

Em uma concretização, o adjuvante da invenção contém uma lecitina, um óleo e um tensoativo anfifílico. Em uma concretização, o adjuvante da invenção inclui uma lecitina, um óleo e um tensoativo anfifílico capaz de emulsionar uma composição de vacina formulada com um adjuvante da invenção. Em uma outra concretização preferida, dois tensoativos anfifíli-cos são utilizados em um adjuvante da invenção, por exemplo, um tensoativo Tween e um tensoativo Span. O adjuvante preferido, aqui referido por "Adjuvante n° 1" inclui cerca de 2% v/v de lecitina, cerca de 18% v/v de óleo mineral, e cerca de 8% v/v de tensoativo (por exemplo, cerca de 5,6% v/v de Tween 80 e cerca de 2,4% v/v de Span 80), com o volume remanescente sendo uma solução salina. Em uma aparência preferida, a composição da vacina é formulada contendo um antígeno em uma concentração cerca de 75% v/v e um adjuvante, preferivelmente o Adjuvante n° 1, em uma concentração cerca de 25% v/v da composição da vacina. Todas as concentrações aqui referidas em percentagem são em volume por volume, exceto quando indicado em contrário.

TENSOATIVOS PROVEITOSOS PARA O ADJUVANTE DA INVENÇÃO

Os tensoativos proveitosos para o adjuvante da invenção são anfifflicos e aceitáveis para uso veterinário ou médico. A adequabilidade de um tensoativo específico para uso médico ou veterinário pode ser estabelecido por aqueles versados na técnica. Um tensoativo é anfifílico se a sua molécula contém uma parte hidrofóbica e uma parte hidrofílica. Veja-se as Patentes dos Estados Unidos 5.690.942, 5.376.369, 4.933.179 e 4.606.918, as quais descrevem tensoativos que podem ser utilizados no adjuvante da presente invenção. Exemplos de tensoativos úteis no adjuvante da invenção incluem, mas não se limitam, ao tensoativo Tween e ao tensoativo Span. Os tensoativos Tween e Span incluem, mas não se limitam, ao monolaureato (Tween 20, Tween 21, Span 20), monopalmitato (Tween 40, Span 40), mo-noestearato (Tween 60, Tween 61, Span 60), triestearato (Tween 65, Span 65), monooleato (Tween 80, Tween 81, Span 80) e trioleato (Tween 85, Span 85). Em uma concretização preferida, é utilizado o Tween 80, Tween 85, Span 80 ou Span 85. O tensoativo útil no adjuvante da invenção é preferivelmente anfifílico e com um valor de HLB (equilíbrio hidrofílico-lipofílico) que é preferivelmente, pelo menos, cerca de metade da soma dos valores de HLB de todos os outros componentes do adjuvante. Mais preferivelmente, o tensoativo tem um valor de HLB entre cerca de metade e cerca do dobro da soma dos valores de HLB de todos os outros componentes do adjuvante. Mais preferivelmente, o tensoativo tem um valor de HLB semelhante ao valor de HLB de todos os outros componentes do adjuvante. Os valores de HLB para tensoativos, lecitinas, óleos e veículos estão facilmente disponíveis ou, se necessário, poderão ser determinados através de ensaios de rotina. Veja-se, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos 4.504.275 e 4.261.925, e as referências indicadas nestes documentos.

Os tensoativos anfifílicos proveitosos no adjuvante da invenção têm valores de HLB cerca de 2 até cerca de 20 e preferivelmente cerca de 3 até cerca de 17. Os métodos para determinar o valor de HLB de tensoativos específicos são conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos 5.603.951, 4.933.179 e 4.606.918 que descrevem ten-soativos com valores específicos de HLB. A concentração de tensoativo em uma composição de vacina formulada com o adjuvante da presente invenção é cerca de 1,5% a 3,5% v/v, mais preferivelmente cerca de 1,5% até cerca de 3% v/v, mais preferivelmente cerca de 1,5% até cerca de 2,5% e na mais preferida de todas é cerca de 2% v/v. Nos casos em que são utilizados mais do que um tensoativo, a soma das concentrações de todos os tensoativos utilizados na composição da vacina formulada com o adjuvante da invenção é também cerca de 1,5% a 3,5%, mais preferivelmente cerca de 1,5% a cerca de 3%, mais preferivelmente cerca de 1,5% a cerca de 2,5% e nos mais preferidos de todos é cerca de 2% v/v. A concentração do tensoativo no adjuvante da invenção depende ainda da concentração em que este é utilizado na composição de vacina. Por exemplo, a composição de vacina pode ser formulada com o adjuvante da invenção de tal forma que cerca de 25% do volume da vacina é adjuvante ("25% de adjuvante") e os cerca de 75% restantes é constituída por outros componentes, por exemplo, a composição de antígeno. Em uma aparência, a concentração do tensoativo nos 25% do adjuvante é cerca de 6% até 14% v/v. Mais preferivelmente, a concentração de tensoativo nos 25% de adjuvante é cerca de 6% até cerca de 12%, mais preferivelmente cerca de 6% até 10% e mais preferivelmente é cerca de 8% v/v. A concentração de tensoativo no adjuvante da invenção depende de vários fatores. Por exemplo, quanto mais elevada for a concentração de óleo no adjuvante maior é o teor de tensoativo exigido para emulsionar a composição de vacina formulada com o adjuvante da invenção. Outro fator útil para determinar a concentração de tensoativo é a concentração de leciti-na. Quanto maior for a concentração de lecitina no adjuvante menor poderá ser o teor de tensoativo requerido na preparação da emulsão.

Nos casos em que o adjuvante da presente invenção é utilizado em uma composição de vacina em uma concentração inferior a 25% v/v, a concentração dos componentes do adjuvante tem de ser proporcionalmente aumentada. O veículo aquoso constitui uma exceção já que este vai perfazer o volume que permanece desocupado por todos os outros componentes; assim, se a concentração de todos os componentes, à exceção do veículo, aumentar, a concentração do último no adjuvante diminuirá e vice-versa. Por exemplo, quando o adjuvante é utilizado em uma concentração cerca de 12,5% v/v em uma composição de vacina, a concentração dos componentes no adjuvante é cerca do dobro da concentração dos componentes em um adjuvante a 25%. De forma semelhante, quando o adjuvante da invenção é utilizado em uma composição de vacina em uma concentração superior a 25% v/v, a concentração dos componentes no adjuvante tem de ser proporcionalmente diminuída, por exemplo, quando o adjuvante é utilizado em uma composição de vacina a uma concentração cerca de 50% v/v, a concentração dos componentes no adjuvante é cerca de metade da concentração dos componentes em um adjuvante a 25%.

Em uma concretização, podem ser utilizados dois tensoativos no adjuvante da invenção. Preferivelmente, a mistura incluirá um tensoativo que estará mais concentrado na fase aquosa do que na fase oleosa do adjuvante ("tensoativo hidrofílico") e um tensoativo que estará mais concentrado na fase oleosa do adjuvante tensoativo lipofílico. Por exemplo, o Tween 80 con-centrar-se-á mais na fase aquosa e o Span 80 concentrar-se-á mais na fase oleosa. O tensoativo hidrofílico preferido tem um valor de HLB cerca de 9 até cerca de 20 e o tensoativo lipofílico preferido tem um valor de HLB cerca de 2 até cerca de 9. Vejam-se as Patentes dos Estados Unidos 5.603.951, 4.933.179 e 4.606.918, as quais descrevem tensoativos com valores de HLB em ambas as gamas e que são proveitosos para o adjuvante da invenção.

Quando são utilizados dois tensoativos no adjuvante da invenção a concentração total de ambos os tensoativos combinados na composição da vacina formulada com o adjuvante da invenção é cerca de 1,5% a 3,5%, mais preferivelmente cerca de 1,5% até cerca de 3%, mais preferivelmente cerca de 1,5% até cerca de 2,5% e nos casos mais preferidos de todos cerca de 2% v/v. A concentração de cada um dos dois tensoativos usados no adjuvante da invenção pode diferir uma da outra. Por exemplo, quan- do são utilizados tensoativos hidrofílicos e lipofílicos, por exemplo, Tween 80 e Span 80, a concentração do Tween 80 pode ser cerca de 1,2x até cerca de 5x, mais preferivelmente cerca de 1,5x até cerca de 4x, mais preferivelmente cerca de 1,8x até cerca de 3x, mais preferivelmente cerca de 2x até cerca de 2,5x e mais preferivelmente cerca de 2,3x a concentração de Span 80, preferivelmente quando utilizado em um adjuvante com uma concentração em lecitina e em óleo como referidas anteriormente para o Adjuvante n°1.

A concentração de tensoativo hidrofílico usado no adjuvante da invenção depende, em parte, da dimensão da fase aquosa, e a concentração do tensoativo lipofílico depende, em parte, da dimensão da fase oleosa. Em uma concretização, o adjuvante da invenção compreendendo uma fase aquosa a 80% v/v e uma fase oleosa a 20% v/v pode conter o tensoativo hidrofílico em uma concentração até cerca de 4x (isto é, 80/20) a concentração do tensoativo lipofílico ou, por exemplo, até cerca de 2x. COMPONENTES NÃO-TENSOATIVOS DO ADJUVANTE DA INVENÇÃO

Além do tensoativo anfifílico, o adjuvante da invenção contém uma lecitina e um óleo. Em uma outra aparência, o adjuvante da invenção contém um veículo aquoso.

Qualquer lecitina conhecida na técnica é proveitosa para o adjuvante da invenção. Lecitina refere-se a uma mistura de fosfatídeos. Quando fornecido como um extrato não-refinado, a lecitina pode também conter tri-glicerídeos. As lecitinas podem ser de origem vegetal ou animal. Além disso, as lecitinas podem ser sinteticamente modificadas. As Patentes dos Estados Unidos 5.690.942, 5.597.602 e 5.084.269 descrevem exemplos de lecitinas. Em uma concretização preferida, o teor de triglicerídeos na lecitina usada no adjuvante da invenção é reduzido relativamente à respectiva fonte natural, isto é, a lecitina é desoleificada. Existem uma série de processos conhecidos na técnica para extrair a fração oleosa da lecitina, por exemplo, como está descrito na Patente dos Estados Unidos 5.597.602. A concentração de lecitina na composição da vacina formulada com o adjuvante da invenção é cerca de 0,25% até cerca de 12,5% v/v, mais preferivelmente cerca de 0,5% até cerca de 10% v/v, mais preferivelmente cerca de 0,5% até cerca de 7,5%, mais preferivelmente cerca de 0,5% até cerca de 5%, mais preferivelmente cerca de 0,5% até cerca de 2,5%, e na mais preferida de todas cerca de 0,5% até cerca de 1,25% v/v. A concentração de lecitina no adjuvante a 25% é de pelo menos cerca de 1% v/v, preferivelmente de pelo menos cerca de 2% v/v. Em uma outra aparência, a concentração de lecitina no adjuvante a 25% é cerca de 1% até cerca de 50% v/v, mais preferivelmente cerca de 2% até cerca de 40% v/v, mais preferivelmente cerca de 2% até cerca de 30% v/v, mais preferivelmente cerca de 2% até cerca de 20% v/v, mais preferivelmente cerca de 2% até cerca de 10% v/v e na mais preferida de todas cerca de 2% até cerca de 5% v/v. A concentração de lecitina no adjuvante da invenção com uma concentração superior ou inferior é determinada como exemplificado anteriormente. O adjuvante da invenção contém um óleo, por exemplo, um óleo descrito nas Patentes dos Estados Unidos 5.814.321 e 5.084.269. Em uma aparência preferida o adjuvante da invenção contém um óleo mineral, por exemplo, DRAKEOL™. Em uma outra aparência, é utilizada uma mistura de dois óleos. O óleo utilizado na preparação do adjuvante da invenção pode ser fornecido como óleo puro ou como uma mistura de um óleo e outro componente, por exemplo, lecitina. A concentração do óleo na composição da vacina formulada com o adjuvante da invenção é cerca de 1% até cerca de 23% v/v, mais preferivelmente cerca de 1,5% até cerca de 20% v/v, mais preferivelmente cerca de 2,5% até cerca de 15%, mais preferivelmente cerca de 3,5% até cerca de 10%, mais preferivelmente cerca de 3,5% até cerca de 7,5%, mais preferivelmente cerca de 4% até cerca de 6% v/v, e na mais preferida de todas cerca de 4,5%. A concentração do óleo no adjuvante a 25% é de pelo menos cerca de 5% v/v, preferivelmente de pelo menos cerca de 8% v/v e mais preferivelmente de pelo menos cerca de 12% v/v. Em uma outra aparência, a concentração de óleo no adjuvante a 25% é cerca de 4% até cerca de 92% v/v, mais preferivelmente cerca de 6% até cerca de 80% v/v, mais preferivelmente cerca de 10% até cerca de 60% v/v, mais preferivelmente cerca de 14% até cerca de 40% v/v, mais preferivelmente cerca de 14% até cerca de 30% v/v, mais preferivelmente cerca de 16% até cerca de 24% e na mais preferida de todas cerca de 18%. A concentração do óleo no adjuvante da invenção com uma concentração superior ou inferior é determinada como exemplificado anteriormente.

Em uma outra concretização, é utilizado um veículo aquoso no adjuvante da invenção, por exemplo, solução salina (por exemplo, solução salina de tampão de fosfato), tris-HCI, tampão de citrato-fosfato, tampões Hepes, outros tampões conhecidos na técnica que sejam aceitáveis farma-ceuticamente ou água. Preferivelmente, o pH do veículo é fisiologicamente compatível, por exemplo, entre 6 e 8, e mais preferivelmente cerca de 7. Preferivelmente, o veículo aquoso utilizado no adjuvante da invenção ocupa o volume que não é preenchido por nenhum dos outros componentes. O adjuvante da invenção é preferivelmente fornecido em uma concentração cerca de 2x até cerca de 10x a concentração do adjuvante após formulação na composição de vacina, mais preferivelmente cerca de 2 x até cerca de 8x, mais preferivelmente cerca de 3x até cerca de 6x e nos mais preferidos de todos cerca de 4x.

APLICAÇÕES DOS ADJUVANTES DA INVENÇÃO

Os adjuvantes da invenção podem ser utilizados para melhorar a resposta imunológica a um antígeno presente em uma formulação de vacina. Os adjuvantes da invenção podem ser usados com antígenos obtidos a partir de qualquer bactéria ou de qualquer vírus, desde que o antígeno não seja destruído ou desnaturado. Exemplos de antígenos, os quais não constituem contudo qualquer limitação à invenção, são antígenos de Erysipelothrix rhu-siopathiae, antígenos de Bordetella bronchiseptica, antígenos de cepas toxi-gênicas de Pasteurella multocida, antígenos de cepas de Eschericia coli que causam diarréia neonatal, antígenos de Actinobacillus pleuropneumoniae, antígenos de Pasteurella haemolitica, ou qualquer combinação dos anteriormente mencionados. Os adjuvantes da invenção são ainda proveitosos nas composições de vacina que contenham um antígeno descrito nas Patentes dos Estados Unidos 5.616.328 e 5.084.269.

Em uma concretização preferida, o adjuvante da invenção é utilizado na formulação de uma vacina contendo um antígeno obtido a partir da fase líquida de uma cultura de Erysipelothrix rhusiopathiae ("E. rhusiopathia-e"). Em uma aparência preferida, a cultura de E. rhusiopathiae é tornada i-nerte pela adição de formalina (concentração final cerca de 0,5% v/v) e, a-pós incubação durante 24 horas a 37°C, as células são removidas, por e-xemplo, por centrifugação ou por filtração. O sobrenadante da cultura, Em uma concretização preferida, é concentrada cerca de 10 vezes sendo posteriormente adicionado, ao sobrenadante concentrado, gel de hidróxido de a-lumínio (preferivelmente REHYDRAGEL™) em uma concentração final cerca de 30% v/v, para estabilizar o antígeno. Em uma outra concretização preferida, são adicionados ao antígeno timerosal (concentração final cerca de 0,01% v/v) (Dimportex, Espanha, importado via Flavine Inc., Klosters, New Jersey) com EDTA (concentração final cerca de 0,07% v/v) como conservantes. Em uma outra concretização preferida, a composição da vacina é formulada incluindo o antígeno e o adjuvante da invenção (por exemplo Adjuvante n°1), com o adjuvante correspondendo, por exemplo, cerca de 25% v/v da composição da vacina. O antígeno preferido de E. rhusiopathiae está descrito no pedido de Patente dos Estados Unidos com o número de série ___________apresentado em 29 de Janeiro de 1999, denominada "Erysipelothrix rhusiopathiae antígenos e composições de vacinas", que se considera aqui transcrita por referência.

Em uma outra concretização preferida, o adjuvante da invenção é utilizado em uma composição de vacina contendo antígenos de uma cultura de B. bronchiseptica que foi tornada inerte através da adição de formalina na fase logarítmica do crescimento, preferivelmente na fase logarítmica tardia, seguida da adição de glutaraldeído. Além de matar as células bacteria-nas o objetivo deste processo de inativação, novo e sem paralelo, é tornar inócuas a endotoxina e exotoxina da B. bronchiseptica, deixando os antígenos das células de B. bronchiseptica eficazes para induzir a resposta imuno- lógica pretendida. A formalina é adicionada à cultura de B. bronchiseptica em uma concentração cerca de 0,2% v/v até cerca de 1% v/v, mais preferivelmente cerca de 0,4% v/v até cerca de 0,8% v/v e nos casos mais preferidos de todos cerca de 0,6% v/v. O glutaraldeído é adicionado cerca de 10 minutos até cerca de 40 minutos após a adição de formalina à cultura, mais preferivelmente entre cerca de 15 minutos e cerca de 30 minutos e no caso mais preferido de todos cerca de 20 minutos. O glutaraldeído é adicionado à cultura de B. bronchiseptica em uma concentração cerca de 0,2% v/v até cerca de 1% v/v, mais preferivelmente cerca de 0,4% v/v até cerca de 0,8% v/v e no caso mais preferidos de todos cerca de 0,6% v/v. Antes da adição do glutaraldeído à cultura, tem-se uma concentração cerca de 10% v/v até cerca de 50% v/v, mais preferivelmente cerca de 15% v/v até cerca de 35% v/v e no caso mais preferido de todos cerca de 25% v/v. Após a adição de formalina e glutaraldeído à cultura de B. bronchiseptica, a mistura é incubada sob agitação entre cerca de 32°C e cerca de 42°C, mais preferivelmente entre cerca de 35°C e cerca de 39°C e no caso mais preferido de todos a cerca de 37°C. A mistura é incubada por um período cerca de 12 horas até cerca de 60 horas, mais preferivelmente cerca de 24 horas até cerca de 48 horas. Todas as restantes etapas do processo de preparação da composição de antígenos da invenção a partir da cultura de B. bronchiseptica estão descritos no Exemplo 7, infra, e nas Patentes dos Estados Unidos 5.019.388 e 4.888.169.

COMPOSIÇÕES DE VACINA CONTENDO ADJUVANTES DA INVENÇÃO E RESPECTIVA ADMINISTRAÇÃO O adjuvante da invenção pode ser utilizado na formulação de uma vacina destinada a imunizar um animal. Em uma concretização, a formulação de vacina contém o adjuvante da invenção e um antígeno. As proporções ótimas de cada componente na formulação da vacina podem ser determinadas por técnicas bem conhecidas dos versados na técnica. A formulação da vacina pode ser administrada a um sujeito tal qual (per se) ou na forma de uma composição farmacêutica ou terapêutica. As composições farmacêuticas compreendendo o adjuvante da invenção e um antígeno podem ser produzidas através dos processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, produção de drágeas, levigação, emulsio-namento, encapsulação, sequestração ou processo de liofilização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas da maneira convencional utilizando um ou mais veículos fisiologicamente aceitáveis, diluentes, excipien-tes ou auxiliares que facilitem a introdução do antígeno da invenção em preparados que possam ser utilizados farmaceuticamente. A formulação apropriada depende da via de administração selecionada. Para os objetivos deste pedido, "veículo fisiologicamente aceitável" abrange veículos que são a-ceitáveis para uso em seres humanos ou animais, sem efeitos secundários relativamente nocivos (relativo à condição em tratamento), tais como diluentes, excipientes ou auxiliares que sejam igualmente aceitáveis.

As formulações sistêmicas incluem aquelas destinadas para administração por injeção por exemplo, injeção subcutânea, intradérmica, intramuscular ou intraperitoneal.

Os preparados de vacina para injeção podem ser formulados em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hanks, solução de Ringer, solução salina de tampão de fosfato, ou qualquer outro tampão salino fisiológico. A solução pode conter agentes de formulação tais como agentes suspensivos, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, as proteínas podem encontrar-se sob a forma de pó para reconstituição em um veículo adequado, por exemplo, á-gua estéril livre de pirogênios, antes de ser usado. A determinação da dosagem eficaz da formulação de vacina está dentro das capacidades dos versados na técnica, especialmente quando à luz da exposição detalhada fornecida aqui. A dose eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios in vitro. Por exemplo, a dose poderá ser determinada em modelos animais para obter-se uma indução da resposta imunológica utilizando técnicas que são bem conhecidas na técnica. Alguém versado na técnica poderá facilmente otimizar a administração a todas as espécies animais com base nos resultados aqui descritos. A quantidade e intervalo de dosagem podem ser individualmente ajustado. Por exemplo, quando usada como vacina, as formulações de vacina da invenção podem ser administradas em 1 a 3 doses por um período de 1 a 36 semanas. Preferivelmente, são administradas 1 ou 2 doses em intervalos cerca de 3 semanas até cerca de 4 meses, podendo ser administrados reforços de forma periódica em períodos ulteriores. Protocolos alternativos podem ser apropriados para animais específicos. A dose adequada é a quantidade de formulação de vacina que, quando administrada como descrito anteriormente, é capaz de promover uma resposta imuno-lógica, em um animal imunizado, suficiente para proteger o animal de uma infecção por um período de, pelo menos, 4 a 12 meses. Geralmente, a quantidade de antígeno presente em uma dose varia cerca de 1 pg até cerca de 100 mg/kg de hospedeiro, tipicamente cerca de 10 pg até cerca de 1 mg e preferivelmente cerca de 100 pg até cerca de 1 pg. A dose adequada varia com a via de injeção e a dimensão do paciente, mas situa-se tipicamente na gama cerca de 0,1 ml até cerca de 5ml.

Tendo sido descrita a invenção, são seguidamente apresentados exemplos que são ilustrativos mas não-limitativos da invenção.

Exemplo 1. Utilização de um adiuvante contendo óleo e lecitina O seguinte exemplo descreve o uso de um adjuvante, que contém lecitina desoleificada dissolvida em um óleo ("adjuvante de óleo de lecitina"), normalmente um óleo mineral (parafina líquida fina), em vacinas de uso veterinário. Veja-se a Patente dos Estados Unidos 5.084.269, que descreve um adjuvante de óleo de lecitina. Um preparado de vacina utilizando um adjuvante de óleo de lecitina é uma emulsão de óleo em água.

Todas as concentrações expressas em percentagem referem-se a teores em volume por volume, exceto quando indicado em contrário. Os valores em percentagem para um adjuvante de óleo de lecitina referem-se à concentração de uma mistura de lecitina (10% da mistura) e do veículo oleoso (DRAKEOL™) (90% da mistura) em um veículo aquoso (fase contínua), exceto quando indicado em contrário. Por exemplo, um adjuvante com 20% de óleo de lecitina contém 2% v/v de lecitina (Central Soya, Fort Wayne, Indiana), 18% v/v DRAKEOL™ 5 (Penreco, Karns City, Pennsylvania) e 80% v/v de solução salina (com o teor da solução salina a ser reduzido se forem adicionados outros componentes, por exemplo, tensoativos). Os valores em percentagem de um adjuvante de óleo de lecitina na composição de um vacina, isto é, após diluição da solução de adjuvante com a solução de antíge-no, refere-se à concentração de uma mistura de lecitina (10% da mistura) e do veículo oleoso (DRAKEOL™) (90% da mistura) no preparado de vacina que compreende o adjuvante e a solução contendo um antígeno, exceto quando o contexto indicar o contrário. Em todos os casos em que um tenso-ativo foi adicionado à composição de um adjuvante, os valores em percentagem para a concentração do tensoativo referem-se à concentração total de todos os tensoativos adicionados no adjuvante ou no preparado de vacina, exceto quando o contexto indicar o contrário.

Quando foi utilizado um adjuvante de óleo de lecitina como adjuvante na formulação de vacinas, verificou-se que aquele não emulsiona preparados aquosos a menos que se adicione tensoativos suplementares, já que a quantidade de lecitina no adjuvante de óleo de lecitina é insuficiente para emulsionar a mistura. Consequentemente, as vacinas produzidas utilizando o adjuvante de óleo de lecitina inadequadamente disperso originam bolhas ou depósitos, constituídos fundamentalmente por óleo mineral, nos tecidos no local da injeção. Este óleo não pode ser metabolizado ou eliminado pelo animal injetado, permanecendo como uma fonte de inflamações crônicas graves e escoriações.

Foi ainda determinado que a adição de tensoativos à formulação de uma vacina, contendo um adjuvante de óleo de lecitina e um antígeno, não é uma solução adequada para emulsionar a formulação. Os problemas inesperadamente encontrados quando adicionou-se óleo e tensoativos à formulação de vacina, antes de emulsionar, foram que o antígeno podia ficar danificado e, se não fosse obtida uma emulsão apropriada, que a formulação tinha de ser rejeitada, incluindo o antígeno dispendioso.

Foram testadas diferentes composições de adjuvantes compreendendo um adjuvante à base de óleo de lecitina em combinação com tensoativos para se emulsionar as formulações de vacinas.

Exemplo 2. Utilização de um adiuvante contendo um tensoativo em baixa concentração O exemplo que se segue descreve o uso de uma emulsão contendo 40% de óleo de lecitina e 2% de tensoativos sintéticos, isto é, Tween 80 e Span 80 (Van Water & Rogers, Omaha, Nebraska), em solução salina de tampão de fosfato. Este adjuvante foi preparado separadamente do antí-geno e em condições assépticas. A emulsão foi adicionada ao antígeno sem emulsionamento adicional. Os tensoativos sintéticos auxiliaram o adjuvante de óleo de lecitina a dispersar formando uma emulsão grosseira relativamente estável. A emulsão do adjuvante foi adicionada ao preparado aquoso anti-gênico na proporção de um para oito, reduzindo o conteúdo do adjuvante de óleo de lecitina de 40% para 5% e os tensoativos de um teor acumulado de 2% para 0,25%. O adjuvante foi utilizado em várias vacinas. Verificou-se que, devido ao fato da emulsão ser grossa e não muito estável, as gotas de óleo tendiam a coalescer e a separar-se formando um depósito de óleo permanente, causador de irritações no tecidos injetados. Outro problema observado com este adjuvante foi a sua tendência para se agregar a gel de alumínio (Al gel). Uma quantidade de vacinas contém Al gel para diversos fins de onde se nomeia, por exemplo, a sua função como adjuvante, estabilizante de um antígeno ou ligar uma endotoxina. O adjuvante de óleo de lecitina contém um carga negativa que lhe permite ligar-se ao gel de alumínio positivamente carregado para formar agregados grosseiros. Estes agregados invisíveis são difíceis de passar através da agulha hipodérmica e muito irritantes para os tecidos injetados.

Exemplo 3. Utilização de um adiuvante contendo um tensoativo em alta concentração Um adjuvante de óleo de lecitina (5% v/v) foi emulsionado no preparado antigênico com o auxílio dos tensoativos Tween 80 e Span 80, como descrito acima, mas em uma concentração total de tensoativos de 8% na composição da vacina. A emulsão formada era muito fina e estável. Esta tinha praticamente a transparência de uma solução e não gelificava quando estagnada. Sob o microscópio, com a máxima ampliação (0,2 micrometros de resolução), a maioria das gotas eram demasiado pequenas para serem visíveis. Consequentemente, tratava-se de uma microemulsão. Este adju-vante, quando utilizado na formulação de uma vacina, foi achado ser praticamente livre de fenômenos reativos no local de injeção e, quando foi adicionado o Al gel, não houve a formação de um agregado detectável de óleo e gel. Em consequência do seu elevado teor em tensoativo, este adjuvante é fácil de emulsionar, de aspecto atrativo, estável, não-reativo com Al gel e praticamente livre de efeitos irritativos no local de vacinação. Apesar destas vantagens, esta emulsão apresentava, contudo, uma potência de adjuvante ligeiramente inferior relativamente à versão mais grossa feita com tensoati-vos em concentração baixa.

Exemplo 4. Utilização de um adjuvante contendo o tensoativo em concentração média Foi feito um esforço para encontrar uma emulsão adjuvante que fosse agradavelmente suave e totalmente eficaz como adjuvante. Um adjuvante com 20% de óleo de lecitina foi utilizado nestes ensaios, uma vez que já tinha sido determinado que é mais fácil de produzir uma emulsão de adjuvante com 20% de óleo de lecitina do que a correspondente emulsão de adjuvante com 40% de óleo de lecitina. A adição daquele a vacinas na proporção de um para quatro, para perfazer uma concentração final de 5% de óleo deixará 75% do volume da dosagem para os antígenos. Ensaios preliminares mostraram que uma emulsão macia submicrométrica (a maior parte das gotas tinham um diâmetro inferior a 1 micrometro, veja-se a Figura 1) podería ser preparada com 20% de óleo e 16% dos tensoativos Tween 80 e Span 80.

Duas emulsões foram preparadas para os ensaios. Uma continha um adjuvante com 20% de óleo de lecitina e 16% dos tensoativos Tween 80 e Span 80. A diluição desta na proporção de um para quatro originou uma emulsão contendo um adjuvante com 5% de óleo de lecitina e 4% de tensoativos, no preparado da vacina. A outra emulsão foi preparada a partir de um adjuvante com 40% de óleo de lecitina e 2% dos tensoativos Tween 80 e Span 80. A respectiva diluição na proporção de um para oito originou uma emulsão contendo um adjuvante com 5% de óleo de lecitina e 0,25% de tensoativos. O Al gel (REHYDRAGEL™ foi obtida de Reheis, Berkeley Hei-ghts, New Jersey) foi adicionado, a amostras de cada uma das emulsões, em uma concentração de 10%. Na emulsão com 0,25% de tensoativos o óleo e o Al gel agregaram-se e separaram-se formando uma camada espessa no topo da coluna de líquido (gelatinosa). Na emulsão com 4% de tensoativos, em contrapartida, não houve qualquer agregação ou gelificação. Com 4% de tensoativos, o Al gel sedimentou no fundo do tubo deixando as gotas de óleo dispersas no fluido sobrenadante.

Exemplo 5. Inchaco nos locais de iniecão guando é utilizado um adjuvante contendo o tensoativo em concentração média Preparados de vacinas foram testados em porcos para determinar se ocorria inchação nas zonas de injeção quando foi usado um adjuvante com uma concentração média de tensoativo. Os preparados de vacina que contém o adjuvante com 5% de óleo de lecitina e 0,25% ou 4% de tensoativos não originou inchaços nos porcos no local de injeção. Quando foi adicionado Al gel ao preparado de vacina em uma concentração de 10%, o preparado com 0,25% de tensoativos causou inchaços graves no local de injeção, enquanto que o preparado com 4% de tensoativos resultou em quase nenhum inchaço.

Foram realizados ensaios para determinar a gama de concentração de tensoativo eficaz na prevenção da agregação com Al gel e na inchação do local de injeção. Quando foi usado o tensoativo na concentração de 1,5% na vacina, foi observada uma ligeira agregação de óleo e Al gel. A agregação foi muito mais acentuada para baixas concentrações de tensoativo. Nas concentrações de 2 e 4% de tensoativo não houve agregação. O inchaço causado em porcos pelos preparados de vacina contendo tensoativos em teores inferiores ou iguais a 0,5% foram maiores duas a quatro semanas após vacinação do que os causados pelos preparados contendo tensoativos em teores superiores ou iguais a 1%. Aproximadamente seis sema- nas após vacinação, tornou-se evidente que 1,5% de tensoativos era a quantidade mínima necessária para evitar inchaços crônicos.

Exemplo 6. Adiuvantes com propriedades proveitosas In Vitro e In Vivo Foram realizados ensaios para determinar um adjuvante que não reagisse com Al gel e que não originasse qualquer reação no animal após vacinação. Um adjuvante com 20% de óleo de lecitina que contenha 8% de tensoativos e que resulte em um preparado de vacinação com adjuvante de óleo de lecitina a 5% e 2% de tensoativos, foi determinado ser suficiente para evitar a reatividade in vitro com Al gel e a irritação dos tecidos no local de vacinação. A evidência da existência de uma relação entre a concentração de tensoativo e a força do adjuvante foi muito menos clara. Houve indicações ocasionais de que 4% de tensoativos na vacina era excessivo, por exemplo na indução de aglutinina em E. Coli K99 e na neutralização da antitoxina à toxina de P. multocida Tipo D.

Desta forma, foi determinado que a concentração ótima de tensoativos é de 8% em um adjuvante com 20% de óleo de lecitina, resultando em 2% de tensoativos na composição da vacina. Estes teores contribuem para um emulsionamento razoavelmente fácil e para uma boa estabilidade na armazenagem em frio. Nas vacinas formuladas com o adjuvante de óleo de lecitina a 5%, 2% de tensoativos foi o teor ideal para a força do adjuvante e para a inexistência de irritação nos tecidos injetados.

Foi determinado o tamanho de gota na emulsão submicrométrica de adjuvante com 20% de óleo de lecitina e 8% de tensoativos. Os 8% de tensoativos consistiam em 5,6% de Tween 80 na fase aquosa e 2,4% de Span 80 na fase oleosa. Cerca de 94% das gotas possuíam um diâmetro inferior a 1 micrometro, veja-se a Figura 1.

Mil mililitros de material a 20% de óleo de lecitina e 8% de tensoativos foram preparados a partir de 200 ml da solução de lecitina-óleo esterilizada por filtração (10% de lecitina em óleo mineral DRAKEOL™), Tween 80 (56 ml) e Span 80 (24 ml) esterilizados em autoclave, e da solução salina de tampão de fosfato (720 ml) (Dulbecco PBS). A solução de lecitina-óleo e o Span 80 foram combinados e misturados em um recipiente estéril durante pelo menos 1 hora, à temperatura ambiente até ao emulsionamento completo da mistura. A solução salina e o Tween 80 foram combinados e misturados em um recipiente asséptico durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente. A mistura oleosa foi emulsionada na mistura aquosa utilizando um emulsionador. O processo de emulsionamento foi mantido em recirculação até à total adição do adjuvante à solução salina. A emulsão foi subsequentemente passada duas vezes através de um homogeneizador à temperatura ambiente. O adjuvante foi armazenado entre 2 e 8°C.

Exemplo 7. Vacina da rinite atrófica utilizando um adiuvante contendo o ten-soativo em uma concentração média O adjuvante descrito no Exemplo 4, com uma concentração média de tensoativos, foi utilizado na vacina da rinite atrófica, a qual contém antígenos de Bordetella bronchiseptica e Pasteurella multocida toxigênica. A vacina Bacteriana-Toxóide Bordetella bronchiseptica-Pasteurella multocida foi preparada a partir de células de B. bronchiseptica e da toxóide de P. multocida.

As células de B. bronchiseptica, cepa 2-9 NADL, foram preparadas como está descrito nas Patentes dos Estados Unidos 5.019.388 e 4.888.169, à exceção de que no final do ciclo de crescimento as culturas foram continuamente misturadas e uma solução de formalina foi adicionada até à concentração final de 0,6%. No intervalo de 20 minutos após a adição da formalina, uma solução de glutaraldeído a 25% foi adicionada até à concentração final de 0,6%. A cultura foi agitada a 37 ± 2°C durante 24 a 48 horas para completar a inativação e desintoxicação. (Veja Tabela 1). Em seguida os fluídos da cultura foram arrefecidos a 15°C ou menos para processamento. As culturas tornadas inertes que não foram processadas de imediato, foram armazenadas entre 2 e 8°C por um período de até 14 dias. Após inativação, as bactérias foram separadas do fluido da cultura por centrifugação. O sobrenadante foi rejeitado e as células foram ressus-pensas em uma solução salina de tampão de fosfato em aproximadamente um décimo do volume inicial. A suspensão concentrada foi armazenada entre 2 e 8°C. O tratamento da B. bronchiseptica com dois aldeídos torna inerte ambas as endotoxina e exotoxina, evitando outros tratamentos de segurança. A toxóide da P. multocida foi preparada de duas formas diferentes como descrito nas Patentes dos Estados Unidos 5.536.496 e 5.695.769. Em um método a toxina é convertida a toxóide dentro da célula bacteriana através da adição de formaldeído à cultura; a toxóide permanece dentro das células. No outro método, as células vivas são mecanicamente desintegradas e a toxina extraída. A toxina é convertida a toxóide por exposição a um pH elevado, como está descrito na Patente dos Estados Unidos 5.536.496. Ambas as formas do toxóide são tratadas com Al gel para controlar a endotoxina livre por um processo patenteado, como está descrito na Patente dos Estados Unidos 5.616.328. (Veja Tabela 1). A sinergia entre as duas formas de toxóide Pasteurella origina respostas antitoxínicas ultrapassando largamente a soma das respostas a cada uma das formas quando utilizadas separadamente, como está descrito na Patente dos Estados Unidos 5.695.769. Tabela 1: Tratamento das células no decurso da preparação da Vacina Bacteriana-Toxóide Bordetella bronchiseotica-Pasteurella multocida O adjuvante descrito no Exemplo 4 foi adicionado até se obter uma concentração final na formulação de vacina do adjuvante com 5% de óleo de lecitina e 2% de tensoativos.

Uma experiência conduzida para determinar a dose mínima de imunização da vacina da rinite atrófica demonstrou as propriedades adjuvan-tes do adjuvante de óleo de lecitina com uma concentração média de tensoativos. Porcas grávidas foram vacinadas com duas doses de 2 ml em um intervalo 4 semanas, tendo parido duas semanas após a administração da segunda dose. Ao primeiro mês, os leitões foram submetidos a um desafio violento, consistindo na administração intranasal e em sequência de culturas virulentas de B. bronchiseptica e P. multocida. Os leitões nascidos de 7 porcas vacinadas apenas com o placebo desenvolveram rinite atrófica grave. As ninhadas das 7 porcas administradas com a vacina contendo a dose total de antígenos estavam fortemente protegidas pelos anticorpos maternais ainda presentes em circulação. Porcas às quais foram administradas vacinas contendo 1/2 ou 1/8 da dose de antígenos não muniram as suas ninhadas com a proteção adequada.

Exemplo 8. Vacina da erisipela utilizando um adiuvante contendo o tensoati-vo em uma concentração média O adjuvante descrito no Exemplo 4, com uma concentração média de tensoativos, foi utilizado na vacina da erisipela, a qual continha antígenos de E. rhusiopathiae. Os antígenos para uso na vacina foram obtidos a partir de culturas de E. rhusiopathiae tornadas inertes com 0,5% de formali-na, durante pelo menos 24 horas. As culturas tornadas inertes foram centrifugadas e concentradas cerca de dez vezes, por filtração molecular. Os concentrados foram estabilizados adicionando Al gel, isto é REHYDRAGEL™, até uma concentração de 30%. Os concentrados pré-adsorvidos foram incluídos na vacina em uma quantidade tal que cada dose de 2 ml continha pelo menos 3,2 unidades de opacidade (OU), calculadas a partir da densidade óptica (OD) da cultura no momento da inativação. (A OD é multiplicada pelo fator de concentração final para originar um valor em OU por ml).

Uma vacinação de erisipelas foi levada realizada para determinar a eficácia da vacina contendo o adjuvante de óleo de lecitina com uma concentração média de tensoativos. O adjuvante descrito no Exemplo 4 foi adicionado em uma concentração final de 25% v/v, originando uma concentração final de lecitina-óleo de 5%. Timerosal (0,01% p/v) com EDTA (0,07% p/v) foi adicionado como conservante.

As vacinas produzidas de acordo com esta fórmula foram testadas duas vezes em porcos, para avaliar a respectiva eficácia. Em cada um dos casos os porcos foram vacinados com duas doses de 2 ml administradas por via intramuscular (IM), uma dose às três semanas (desmamados) e a segunda dose três semanas mais tarde. Os controles foram administrados com uma solução salina de tampão de fosfato como placebo. A imunidade foi provocada através da injeção intramuscular de E. Rhusiopathiae virulento em cerca de 9 semanas de idade em um estudo e aos 6 meses de idade no outro. Como referenciado no Tabela 2, a proteção adquirida pela vacinação foi de 100% em 9 semanas e de 75% aos 6 meses (isto é idade de abate). Os resultados indicam que a vacina proporciona uma proteção adequada contra Erisipelas durante o período normal de alimentação. A vacina utilizada no grupo provocado em 9 semanas tinha sido preparada há 12 meses. O resultado do ensaio confirma que o antígeno protetor foi estabilizado com sucesso.

Tabela 2: Proteção dos porcos contra Erisipelas Nota: Foi excluído o vigésimo porco, do grupo vacinado que foi exposto em 9 semanas. O animal era extremamente irascível e debatia-se de forma tão violenta quando manuseado, que foi impossível determinar a respectiva temperatura em descanso. Após exposição à Erisipelas este porco manteve-se perfeitamente saudável. A invenção não se limita no âmbito às concretizações exemplificadas, os quais são apenas ilustrativos de aspectos particulares da invenção, e quaisquer adjuvantes que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do propósito da invenção. Na realidade, diversas variações da invenção, além das aqui descritas, tornar-se-ão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição precedente e dos esboços que lhe estão associados. Tais variações estão dentro do alcance das reivindicações anexas.

Todas as publicações aqui citadas estão incorporadas na sua integridade por referência.

Claims (12)

1. Composição de antígeno incluindo uma cultura de Bordetella bronchiseptica, caracterizada pelo fato de que foi tornada inerte através da adição de formalina seguida da adição de glutaraldeído.

2. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a composição de antígeno como definida na reivindicação 1 e um adjuvante.

3. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o dito adjuvante compreende de 0,25% até 12,5% volume/volume (v/v) de uma lecitina, de 1% até 23% v/v de um óleo, de 1,5% até 3,5% v/v de pelo menos um tensoativo anfifílico.

4. Método de inativação de uma cultura de Bordetella bronchiseptica, caracterizado pelo fato de que consiste na adição de formalina à dita cultura seguida da adição de glutaraldeído à dita cultura, em que a) a formalina é adicionada a uma concentração entre 0,2% v/v e 1 % v/v; b) glutaraldeído é adicionado de 10 a 40 minutos após a adição da formalina a uma concentração entre 0,2% v/v e 1% v/v; c) após a adição de glutaraldeído, a cultura resultante é encuba-da a uma temperatura entre 32 °C e 42 °C.

5. Vacina de Bordetella bronchiseptica, caracterizada pelo fato de que compreende Bordetella bronchiseptica preparada pelo método como definido na reivindicação 4.

6. Vacina para proteger um mamífero contra uma infecção pela Bordetella bronchiseptica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade de 1 pg a 100 mg por Kg de hospedeiro de células de Bordetella bronchiseptica obtidas a partir de uma cultura tornada inerte através do método como definido na reivindicação 4, eficaz para proteger o dito mamífero contra a infecção pela Bordetella bronchiseptica e um veículo fisiologicamen-te aceitável.

7. Vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende de 10 pg a 1 mg por Kg de hospedeiro de células de Bordetella bronchiseptica.

8. Vacina de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que compreende de 100 pg a 1 pg por Kg de hospedeiro de células de Bordetella bronchiseptica.

9. Vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que inclui adicionalmente uma quantidade de 1 pg a 100 mg por Kg de hospedeiro de antígenos de Pasteurella multocida toxigênica, eficaz para proteger um mamífero contra a infecção pela Pasteurella multocida toxigênica.

10.Vacina de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende de 10 pg a 1 mg por Kg de hospedeiro de células de Pasteurella multocida.

11.Vacina de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende de 100 pg a 1 pg por Kg de hospedeiro de células de Pasteurella multocida.

12.Vacina de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de ser para proteger um porco contra uma infecção pela Bordetella bronchiseptica e/ou uma infecção pela Pasteurella multocida.