CN1323718C - 一种利用植物油佐剂制备动物病毒性、细菌性疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用植物油佐剂制备动物病毒性、细菌性疫苗的方法，其特征在于它包括以下步骤：(1)制作抗原剂，将制苗毒(菌)株用敏感细胞或培养基复制，灭活后，获得抗原；并将所述的抗原制成抗原剂；(2)制作植物油佐剂；(3)混匀，将所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合，均质，制成疫苗。所述的抗原剂为抗原与灭菌的吐温-80混合物；所述的植物油佐剂为植物油与司盘-80的混合物。本发明采用新型佐剂来制备动物病毒性、细菌性疫苗，使其应用时，既不影响疫苗的免疫效力，又能降低疫苗的不良反应，同时又有利于生产安全的食品肉类；与现有技术相比，具有明显的优点。本发明适于各种动物病毒性、细菌性疫苗使用。
Description
技术领域：
本发明涉及利用植物油佐剂生产疫苗的方法，特别是利用植物油佐剂制备动物病毒性、细菌性疫苗的方法。
背景技术：
佐剂作为一种能协助抗原提升免疫反应的物质，可以帮助抗原在注射部位缓慢释放，以增加免疫刺激的效果。在现有的技术中，矿物油佐剂在动物疫苗的应用中较为普遍，但在近年来在动物矿物油佐剂疫苗的免疫预防中，由于时常出现免疫反应过大，引起部分注苗动物数天高热、减食、废食、流产及生产性能下降，如奶畜产奶量减少，青年动物增重减慢等不良反应，尤其是极少数动物因发生过敏反应而导致死亡，不利于畜牧业的发展。另外，矿物油(白油)是一种利用化学方法从原油中提取的物质，把其作为疫苗佐剂注入动物体内，长期缓慢代谢，甚至极少量成分滞留在局部，既影响动物肉品质量，又影响人体健康。因此研究一种新型佐剂，使其既不影响疫苗的免疫效力，又能降低疫苗的不良反应，同时又有利于生产安全的肉食品，则是摆在我们面前的一个重要课题。
发明的内容
本发明的目的在于提供一种利用植物油佐剂制备动物病毒性、细菌性疫苗的方法，以解决上述存在的问题，从而获得既不影响疫苗的免疫效力，又能降低疫苗的不良反应，同时又有利于生产安全的肉食品的动物疫苗。
本发明的目的是按如下技术方案实现的。本发明利用植物油佐剂制备动物病毒性、细菌性疫苗的方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)制作抗原剂，将制苗毒(菌)株用敏感细胞或培养基复制，灭活后，获得抗原；并将所述的抗原制成抗原剂；可按本行业常规方法制备。
(2)制作植物油佐剂；
(3)混匀，将所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合，均质，制成疫苗。
在步骤(1)中，
所述的制苗毒(菌)株为下列中的任一或二种：O型***病毒Akesu/58毒株、OMIII毒株、以及OZ毒株、狂犬病病毒-CVS毒株、传染性胃肠炎(TEGV-TS株)、流行性腹泻病毒(PEDV-QD株)、亚型禽流感毒株H5N1、亚型禽流感毒株H9N2、鸡白痢沙门氏菌；此外，还可采用其他的动物病毒性、细菌性疫苗。
所述的敏感细胞为下列中的任一种：BHK-21细胞系和IB-RS-2细胞、Vero细胞、PK-细胞、293细胞、ST-细胞、Hela-细胞；还可采用其他的敏感细胞。
所述的培养基为下列中的任一种：LB、硫代硫酸钠琼脂、普通肉汤、普通琼脂平皿。还可采用其他的培养基。
在步骤(1)中，
所述的抗原剂为抗原与灭菌的吐温-80混合物；
在步骤(2)中，
所述的植物油佐剂为植物油与司盘-80的混合物。
所述的植物油为下列中的任一种：菜籽油、豆油、花生油、蓖麻油、胡麻油等植物油。还可采用其他的对人畜无害的食用油。
在所述的步骤(1)中，将所述的抗原制成抗原剂为：把抗原与灭菌的吐温-80按10-40∶1的比例混合，制成抗原剂；
在所述的步骤(2)中，制作植物油佐剂为：将植物油与司盘-80按5-15∶1的比例混合，经消毒，制成植物油佐剂；
在所述的步骤(3)中，所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合为：将所述的抗原剂与植物油佐剂按0.5-1.5∶1的比例混合，搅拌，形成均匀的初乳；所述的均质为：用高压均质机将所述的初乳进行高速剪切和乳化均质。
在所述的步骤(3)中，所述的抗原剂与植物油佐剂混合时，先将部分的抗原剂加到全部植物油佐剂中，边加边搅拌，使其形成均匀的初乳；再将其余的抗原剂加入到所述的均匀的初乳中。
本发明采用植物油作为佐剂的组分，制成植物油佐剂。植物油是从植物籽实中提取的一种天然物质，把其作为佐剂注入动物体内既不影响动物性食品质量，又不影响食用该动物产品的人的健康，同时又具有矿物油佐剂的性能：①它能增加抗原的表面面积，易为巨噬细胞所吞噬；②延长抗原在体内的存留期，增加与免疫细胞接触的机遇；③诱发抗原注射部位及其局部***的炎症反应，有利于刺激免疫细胞的增殖作用。因此，植物油佐剂，在疫苗的开发过程中，必将是矿物油佐剂的最佳替代品。
综上所述，本发明采用新型佐剂来制备动物病毒性、细菌性疫苗，使其应用时，既不影响疫苗的免疫效力，又能降低疫苗的不良反应，同时又有利于生产安全的食品肉类；与现有技术相比，具有明显的优点。本发明适于各种动物病毒性、细菌性疫苗使用。
具体实施方式
实施例1
本实施例为利用植物油佐剂制备的动物病毒性亚型禽流感H5N1和H9N2植物油佐剂灭活混合疫苗，其制备方法包括以下步骤：
(1)制作抗原剂，将制苗毒株用敏感细胞或培养基复制，灭活后，获得抗原并将所述的抗原制成抗原剂；其中：
1)毒株：制苗用流行毒株H5N1和H9N2(按1∶1配比)，制苗毒株的生物学特性：鸡胚半数感染量(EID50)为8.25log2/ml，即种毒的病毒含量为每ml含有8.25个EID50；鸡胚平均死亡时间(MDT)为尿囊腔接种0.1ml后72小时；血凝(HA)滴度即收获的鸡胚尿囊液灭活前对1％SPF鸡红细胞的HA≥8log2；纯净程度为无任何外源病毒和细菌污染。
2)病毒的复制和灭活：尿囊腔接种9-11日龄的SPF鸡胚0.1ml，72小时HA试验检测鸡胚尿囊液的HA滴度，收获HA≥8log2的鸡胚尿囊液，加入甲醛溶液，37℃灭活，形成抗原。
灭活后的抗原接种适当的培养基(普通琼脂平皿)，进行细菌、霉菌和支原体检验，灭活后的尿囊液0.1ml经尿囊腔接种9-11日龄鸡胚，连续盲传3代。
3)把灭活后的尿囊液与高压灭菌的吐温-80按25∶1的比例混合制成抗原剂，
(2)制作植物油佐剂；
将植物油(豆油)与司盘-80按10∶1的比例混合乳化，经1.5Mpa，30min高压消毒，制成植物油佐剂；
(3)将所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合，均质，制成疫苗。将所述的抗原剂与植物油佐剂按1∶1的比例混合，本实施例中，先将40-60％灭活后的抗原剂加到植物油佐剂中，边加边搅拌，使其形成均匀的初乳，然后在制成油包水乳剂的基础上，再其余的抗原剂加到植物油佐剂中，进一步乳化。然后再经高压均质机高速的剪切和乳化，制成外观为乳白色的疫苗。
实施例2
本实施例为利用植物油佐剂制备的猪O型***灭活疫苗，其制备方法包括以下步骤：
(1)制作抗原剂，将制苗毒株用敏感细胞或培养基复制，灭活后，获得抗原并将所述的抗原制成抗原剂；其中：
1)毒株：制苗毒株为猪O型***病毒OZ毒株
制苗毒株的生物学特性：制苗毒株应符合O型***病毒特性。乳鼠毒用O型***病猪水泡皮毒通过6-8日龄喂乳小白鼠，4-5代的乳鼠肌肉毒，以PH7.6-7.8的磷酸缓冲液稀释，颈背部皮下注射3-4日龄乳鼠0.2ml/只，每个滴度不少于4只，观察5天判定，其LD50不得低于8.5。
制苗毒种复壮：细胞毒种应复壮不少于3代，应符合标准。连续生产的代数不得超过14代。纯净程度为无任何外源病毒和细菌污染。
2)病毒的复制和灭活：用3-14代的制苗细胞毒种，接种已形成良好单层的BHK-21细胞系和IB-RS-2细胞，收取细胞毒液。经无菌检验和毒价测定符合标准的进行灭活。用灭活剂BEI按一定的量加到除去细胞碎片的毒液中，升温至30℃，灭活28小时，灭活终止后，立即用除菌的硫代硫酸钠溶液组断，形成抗原，放入5℃的条件下保存。
灭活后的抗原接种肉汤，进行细菌、霉菌和支原体检验。灭活后的抗原颈部皮下注射3-4日龄乳鼠4-5只，0.2ml/只，，设健康空白对照鼠2只，观察7天，全部乳鼠均不得出现***症状和发病死亡。
3)把灭活后的抗原与高压灭菌的吐温-80按25∶1的比例混合制成抗原剂。
(2)制作植物油佐剂；
将植物油(豆油)与司盘-80按10∶1的比例混合乳化，经1.5Mpa，30min高压消毒，制成植物油佐剂；
(3)将所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合，均质，制成疫苗。
将所述的抗原剂与植物油佐剂按1∶1的比例混合，本实施例中，先将40-60％灭活后的抗原剂加到植物油佐剂中，边加边搅拌，使其形成均匀的初乳，然后在制成油包水乳剂的基础上，再其余的抗原剂加到植物油佐剂中，进一步乳化。然后再经高压均质机高速的剪切和乳化，制成外观为乳白色的疫苗。
实施例3
本实施例为利用植物油佐剂制备的牛O型***灭活疫苗，其制备方法包括以下步骤：
(1)制作抗原剂，将制苗毒(菌)株用敏感细胞或培养基复制，灭活后，获得抗原并将所述的抗原制成抗原剂；其中：
1)毒株：制苗毒株为牛O型***病毒Akesu/58毒株制苗毒株的生物学特性：制苗毒株应符合O型***病毒特性。将毒种用PBS(磷酸盐缓冲液)进行1∶1000倍稀释，上醇划痕和舌面涂擦无***O型血清抗体的2-4岁黄牛2ml，于24-48小时内，试验牛应出现典型的***次发性病损。
制苗毒种复壮：细胞毒种应复壮不少于3代，应符合标准。连续生产的代数不得超过14代。纯净程度为无任何外源病毒和细菌污染。
2)病毒的复制和灭活：用3-14代的制苗细胞毒种，接种已形成良好单层的BHK-21细胞系和IB-RS-2细胞，收取细胞毒液。经无菌检验和毒价测定符合标准的进行灭活。用灭活剂BEI按一定的量加到除去细胞碎片的毒液中，升温至30℃，灭活28小时，灭活终止后，立即用除菌的硫代硫酸钠溶液组断，形成抗原，放入5℃的条件下保存。
灭活后的抗原接种普通琼脂平皿，进行细菌、霉菌和支原体检验。灭活后的抗原颈部皮下注射3-4日龄乳鼠4-5只，0.2ml/只，，设健康空白对照鼠2只，观察7天，全部乳鼠均不得出现***症状和发病死亡。
3)把灭活后的抗原与高压灭菌的吐温-80按25∶1的比例混合制成抗原剂，
(2)制作植物油佐剂；
将植物油(豆油)与司盘-80按10∶1的比例混合乳化，经1.5Mpa，30min高压消毒，制成植物油佐剂；
(3)将所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合，均质，制成疫苗。
将所述的抗原剂与植物油佐剂按1∶1的比例混合，本实施例中，先将40-60％灭活后的抗原剂加到植物油佐剂中，边加边搅拌，使其形成均匀的初乳，然后在制成油包水乳剂的基础上，再其余的抗原剂加到植物油佐剂中，进一步乳化。然后再经高压均质机高速的剪切和乳化，制成外观为乳白色的疫苗。
实施例4
本实施例为利用植物油佐剂制备的猪O型***灭活疫苗(浓缩型)，其制备方法包括以下步骤：
(1)制作抗原剂，将制苗毒(菌)株用敏感细胞或培养基复制，灭活后，获得抗原并将所述的抗原制成抗原剂；其中：
1)毒株：制苗毒株为猪O型***病毒OZ毒株
制苗毒株的生物学特性：制苗毒株应符合O型***病毒特性。乳鼠毒用O型***病猪水泡皮毒通过6-8日龄喂乳小白鼠，4-5代的乳鼠肌肉毒，以PH7.6-7.8的磷酸缓冲液稀释，颈背部皮下注射3-4日龄乳鼠0.2ml/只，每个滴度不少于4只，观察5天判定，其LD50不得低于8.5。
制苗毒种复壮：细胞毒种应复壮不少于3代，应符合标准。连续生产的代数不得超过14代。纯净程度为无任何外源病毒和细菌污染。
2)病毒的复制和灭活：用3-14代的制苗细胞毒种，接种已形成良好单层的BHK-21细胞系和IB-RS-2细胞，病毒培养液的加入量按每平方厘米细胞单层0.1-0.3ml，收取细胞毒液。经无菌检验和毒价测定符合标准的进行灭活。用灭活剂BEI按一定的量加到除去细胞碎片的毒液中，升温至30℃，灭活28小时，灭活终止后，立即用除菌的硫代硫酸钠溶液组断，形成抗原，放入5℃的条件下保存。
灭活后的抗原接种适当的培养基(肉汤)，进行细菌、霉菌和支原体检验。灭活后的抗原颈部皮下注射3-4日龄乳鼠4-5只，0.2ml/只，，设健康空白对照鼠2只，观察7天，全部乳鼠均不得出现***症状和发病死亡。
3)把灭活后的抗原与高压灭菌的吐温-80按25∶1的比例混合制成抗原剂。
(2)制作植物油佐剂；
将植物油(花生油)与司盘-80按10∶1的比例混合乳化，经1.5Mpa，30min高压消毒，制成植物油佐剂；
(3)将所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合，均质，制成疫苗。将所述的抗原剂与植物油佐剂按1∶1的比例混合，本实施例中，先将50％灭活后的抗原剂加到植物油佐剂中，边加边搅拌，使其形成均匀的初乳，然后在制成油包水乳剂的基础上，再其余的抗原剂加到植物油佐剂中，进一步乳化。然后再经高压均质机高速的剪切和乳化，制成外观为乳白色的疫苗。
Claims (1)
1、一种利用植物油佐剂制备动物病毒性和/或细菌性疫苗的方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)制作抗原剂，将制苗毒株和/或菌株用敏感细胞或培养基复制，灭活后，获得抗原；并将所述的抗原制成抗原剂；
(2)制作植物油佐剂；
(3)混匀，将所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合，均质，制成疫苗；
在所述的步骤(1)中，所述的抗原剂为抗原与灭菌的吐温-80混合物；
在所述的步骤(2)中，所述的植物油佐剂为植物油与司盘-80的混合物；
在所述的步骤(1)中，将所述的抗原制成抗原剂为：把抗原与灭菌的吐温-80按10-40∶1的比例混合，制成抗原剂；
在所述的步骤(2)中，制作植物油佐剂为：将植物油与司盘-80按5-15∶1的比例混合，经消毒，制成植物油佐剂；
在所述的步骤(3)中，所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合为：将所述的抗原剂与植物油佐剂按0.5-1.5∶1的比例混合，搅拌，形成均匀的初乳；所述的均质为：用高压均质机将所述的初乳进行高速剪切和乳化均质；
在所述的步骤(3)中，所述的抗原剂与植物油佐剂混合时，先将部分所述的抗原剂加到全部所述的植物油佐剂中，边加边搅拌，使其形成均匀的初乳；再将其余所述的抗原剂加入到所述的均匀的初乳中。
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