JP3035712B2 - 新規なワクチンおよびそのための方法 - Google Patents
新規なワクチンおよびそのための方法Info
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- JP3035712B2 JP3035712B2 JP03503734A JP50373491A JP3035712B2 JP 3035712 B2 JP3035712 B2 JP 3035712B2 JP 03503734 A JP03503734 A JP 03503734A JP 50373491 A JP50373491 A JP 50373491A JP 3035712 B2 JP3035712 B2 JP 3035712B2
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- A61K39/099—Bordetella
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K2039/10—Brucella; Bordetella, e.g. Bordetella pertussis; Not used, see subgroups
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、一般的にヒトのワクチン剤として使用する
のに安全な形態にボルデテラ（Bordetella）毒素を無毒
化またはトキソイド化する方法に関する。より詳細に
は、本発明は百日咳毒素を無毒化し、得られたトキソイ
ドを百日咳菌（Bordetella pertussis）に対するワクチ
ンの成分として使用する方法を提供する。
のに安全な形態にボルデテラ（Bordetella）毒素を無毒
化またはトキソイド化する方法に関する。より詳細に
は、本発明は百日咳毒素を無毒化し、得られたトキソイ
ドを百日咳菌（Bordetella pertussis）に対するワクチ
ンの成分として使用する方法を提供する。
百日咳は主に子供がかかる非常に伝染性の疾患であ
る。呼吸合併症を起こすほかに、百日咳は神経障害と高
い死亡率をもたらし、特に低所得層の子供や母親の抗百
日咳抗体をもたない新生児に発生する。百日咳の原因物
質はグラム陰性球杆菌の百日咳菌（Bordetella pertuss
is）である。この菌は呼吸器に侵入して、細菌の消失後
も残存する毒性状態を誘発すると考えられる。
る。呼吸合併症を起こすほかに、百日咳は神経障害と高
い死亡率をもたらし、特に低所得層の子供や母親の抗百
日咳抗体をもたない新生児に発生する。百日咳の原因物
質はグラム陰性球杆菌の百日咳菌（Bordetella pertuss
is）である。この菌は呼吸器に侵入して、細菌の消失後
も残存する毒性状態を誘発すると考えられる。
世界保健機関は現在百日咳の発生と広がりを防ぐため
に乳幼児の免疫化を推奨しているが、種々のワクチン型
のネガティブな作用に対して大きな関心が寄せられてい
る。通常の百日咳ワクチン処方物の毒性は単なる紅潮か
ら永久的な神経学的障害および／または死へ至る広範な
副作用を引き起こす。その結果、通常の百日咳ワクチン
の使用が激減し、百日咳の発生が急激に増加した。最も
広く使用されているワクチンは、56℃で30分の処理によ
り不活化される完全な百日咳菌を含んでいる。この細菌
はあらゆる無毒化処理を受けにくいので、昇温に耐えら
れる毒性物質がワクチンに含まれ、副作用の発生の一因
となっている。この型のワクチンのもう一つの結果は、
投与の際の応答として広範囲の抗体が形成されることで
ある。かかるワクチンにより誘導された血清は予防また
は治療剤として使用するための高い特異性および高い防
御能を欠き、さらに診断物質としては何の価値も有して
いない。
に乳幼児の免疫化を推奨しているが、種々のワクチン型
のネガティブな作用に対して大きな関心が寄せられてい
る。通常の百日咳ワクチン処方物の毒性は単なる紅潮か
ら永久的な神経学的障害および／または死へ至る広範な
副作用を引き起こす。その結果、通常の百日咳ワクチン
の使用が激減し、百日咳の発生が急激に増加した。最も
広く使用されているワクチンは、56℃で30分の処理によ
り不活化される完全な百日咳菌を含んでいる。この細菌
はあらゆる無毒化処理を受けにくいので、昇温に耐えら
れる毒性物質がワクチンに含まれ、副作用の発生の一因
となっている。この型のワクチンのもう一つの結果は、
投与の際の応答として広範囲の抗体が形成されることで
ある。かかるワクチンにより誘導された血清は予防また
は治療剤として使用するための高い特異性および高い防
御能を欠き、さらに診断物質としては何の価値も有して
いない。
ワクチン用に病原体を無毒化するための最も重要な方
法は熱処理とホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドに
よる化学的処理である。しかし、百日咳菌の培養上清の
培養時の変化は微生物の最終組成を変化させ、また不活
化剤のグルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドが貯
蔵の際に活性毒性物質に変換されやすい凝集物質へ導く
ことがある。
法は熱処理とホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドに
よる化学的処理である。しかし、百日咳菌の培養上清の
培養時の変化は微生物の最終組成を変化させ、また不活
化剤のグルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドが貯
蔵の際に活性毒性物質に変換されやすい凝集物質へ導く
ことがある。
例えば、Relyveldによる米国特許第3,983,229号は、
ウイルスを0.00131M−0.0526Mの濃度のグルタルアルデ
ヒドと１−３時間接触させることによるワクチンの調製
法に関する。この方法は35−40℃行われ、グルタルアル
デヒドをブロックするか又は遊離状態のグルタルアルデ
ヒドと反応する薬剤の添加により反応を停止することが
できる。ブロッキング剤はアミノ酸または無機塩であり
うる。Relyveldによる米国特許第4,070,454号は、ウイ
ルスを0.00263Mの濃度のグルタルアルデヒドで1.5時間
ないし約５日間不活化することを伴うウイルスワクチン
の別の調製法を開示している。
ウイルスを0.00131M−0.0526Mの濃度のグルタルアルデ
ヒドと１−３時間接触させることによるワクチンの調製
法に関する。この方法は35−40℃行われ、グルタルアル
デヒドをブロックするか又は遊離状態のグルタルアルデ
ヒドと反応する薬剤の添加により反応を停止することが
できる。ブロッキング剤はアミノ酸または無機塩であり
うる。Relyveldによる米国特許第4,070,454号は、ウイ
ルスを0.00263Mの濃度のグルタルアルデヒドで1.5時間
ないし約５日間不活化することを伴うウイルスワクチン
の別の調製法を開示している。
米国特許第4,075,321号は、完全細菌を約0.00131−0.
0526Mの濃度のグルタルアルデヒドと反応させることに
より細菌毒素のこの不活化法をさらに改良している。
0526Mの濃度のグルタルアルデヒドと反応させることに
より細菌毒素のこの不活化法をさらに改良している。
Gupta,J.Biol.Stand.,15:159−164（1987）は、古典
的な熱処理により得られた全細胞ワクチンを、グルタル
アルデヒド無毒化反応のRelyveldの方法により得られた
ものと比較している。両方の型のワクチンとも明らかに
35℃で30日間貯蔵した際にその効力の30−50％を失う。
さらに、これらの調製物は、比較的最近開発された無細
胞性ワクチンまたは成分ワクチンと比べたとき、低免疫
原性および投与時の残留毒性により起こる重症の副作用
といった重大な欠点をもっている。これらのワクチンは
強毒株から調製されたものよりも防御能がかなり劣るこ
とが証明されている。Wardlaw et al.,J.Med.Micro.Bio
l.,９:89−100（1976）を参照されたい。
的な熱処理により得られた全細胞ワクチンを、グルタル
アルデヒド無毒化反応のRelyveldの方法により得られた
ものと比較している。両方の型のワクチンとも明らかに
35℃で30日間貯蔵した際にその効力の30−50％を失う。
さらに、これらの調製物は、比較的最近開発された無細
胞性ワクチンまたは成分ワクチンと比べたとき、低免疫
原性および投与時の残留毒性により起こる重症の副作用
といった重大な欠点をもっている。これらのワクチンは
強毒株から調製されたものよりも防御能がかなり劣るこ
とが証明されている。Wardlaw et al.,J.Med.Micro.Bio
l.,９:89−100（1976）を参照されたい。
全ウイルスワクチンにより引き起こされる副作用を避
けるために、関心は無細胞または成分ワクチンに使用す
るための百日咳菌の毒性成分の研究へと向かった。一つ
の重要な百日咳菌抗原は百日咳毒素（PT）であり、この
タンパク質は百日咳の病因において主要な役割を演ずる
菌体外毒素であり、百日咳菌の主な防御抗原であると考
えられている［A.A.Weiss et al.,Ann.Rev.Microbiol.,
40:661（1986）］。PTは、単独で存在しようとあるいは
この生物からの他の抗原因子の汚染物質として存在しよ
うと、低用量で様々な重症の生物病理学的変化を誘発す
るので、良好な防御レベルを得るのに十分な量でワクチ
ン成分として百日咳菌細胞や細胞抽出物を投与すること
を妨げている。かくして、百日咳菌細胞または細胞抽出
物はワクチン製剤中で使用する前に無毒化されねばなら
ない。
けるために、関心は無細胞または成分ワクチンに使用す
るための百日咳菌の毒性成分の研究へと向かった。一つ
の重要な百日咳菌抗原は百日咳毒素（PT）であり、この
タンパク質は百日咳の病因において主要な役割を演ずる
菌体外毒素であり、百日咳菌の主な防御抗原であると考
えられている［A.A.Weiss et al.,Ann.Rev.Microbiol.,
40:661（1986）］。PTは、単独で存在しようとあるいは
この生物からの他の抗原因子の汚染物質として存在しよ
うと、低用量で様々な重症の生物病理学的変化を誘発す
るので、良好な防御レベルを得るのに十分な量でワクチ
ン成分として百日咳菌細胞や細胞抽出物を投与すること
を妨げている。かくして、百日咳菌細胞または細胞抽出
物はワクチン製剤中で使用する前に無毒化されねばなら
ない。
PT（またはPTを含む無細胞または成分ワクチン混合
物）の無毒化のために、３つの主な方法が開示されてい
る。欧州特許出願公開第121249A号では、百日咳菌の培
養上清から単離されてPTを含む赤血球凝集素画分がアミ
ノ酸の存在下でホルマリンにより無毒化され、その後ワ
クチンの処方において使用された。得られた免疫原性と
無毒化の程度は優れていたが、ワクチン調製物を37℃で
30日間貯蔵すると毒性が部分的に元に戻った。
物）の無毒化のために、３つの主な方法が開示されてい
る。欧州特許出願公開第121249A号では、百日咳菌の培
養上清から単離されてPTを含む赤血球凝集素画分がアミ
ノ酸の存在下でホルマリンにより無毒化され、その後ワ
クチンの処方において使用された。得られた免疫原性と
無毒化の程度は優れていたが、ワクチン調製物を37℃で
30日間貯蔵すると毒性が部分的に元に戻った。
Munoz,Infect.Immunol.,32:243−250（1981）はPTに
対してRelyveldの方法に類似した無毒化法を適用した
が、塩の存在下で行った。0.05％グルタルアルデヒドの
存在下に室温で２時間インキュベーション後、0.02Mま
でのリシンを加えてさらに２時間インキュベーションを
行い、最終透析にかけた後に高い免疫原性を有するアナ
トキシンを得た。このアナトキシンは安定であり、その
毒性は37℃で30日間貯蔵した後も元に戻らなかった。
対してRelyveldの方法に類似した無毒化法を適用した
が、塩の存在下で行った。0.05％グルタルアルデヒドの
存在下に室温で２時間インキュベーション後、0.02Mま
でのリシンを加えてさらに２時間インキュベーションを
行い、最終透析にかけた後に高い免疫原性を有するアナ
トキシンを得た。このアナトキシンは安定であり、その
毒性は37℃で30日間貯蔵した後も元に戻らなかった。
しかし、無毒化の程度はホルマリン／アミノ酸法によ
り得られたものより低かった。
り得られたものより低かった。
欧州特許出願公開第202947A号には、PTまたはPTを含
む百日咳菌画分の無毒化に有効な試薬としてカルボジイ
ミドが示されている。しかし、得られたトキソイドは37
℃で30日間貯蔵した際に安定でなかった。
む百日咳菌画分の無毒化に有効な試薬としてカルボジイ
ミドが示されている。しかし、得られたトキソイドは37
℃で30日間貯蔵した際に安定でなかった。
かくして、当分野では貯蔵の際に活性を保持しかつ毒
性に復帰しない百日咳に対する有効で安全なワクチンの
必要性がなお存在している。
性に復帰しない百日咳に対する有効で安全なワクチンの
必要性がなお存在している。
発明の要約 一面において、本発明は、ボルデテラ（Bordetella）
毒素の無毒化方法を提供する。本発明方法は、ボルデテ
ラ毒素を含む組成物をグルタルアルデヒドで部分的に無
毒化し、続いて部分的に無毒化した毒素を所定のアミノ
酸の存在下にホルマリンと反応させる工程を含む。得ら
れるトキソイドまたはトキソイド含有調製物は約23℃
（すなわち室温）以上の温度の影響下で毒性復帰に対し
て安定である。
毒素の無毒化方法を提供する。本発明方法は、ボルデテ
ラ毒素を含む組成物をグルタルアルデヒドで部分的に無
毒化し、続いて部分的に無毒化した毒素を所定のアミノ
酸の存在下にホルマリンと反応させる工程を含む。得ら
れるトキソイドまたはトキソイド含有調製物は約23℃
（すなわち室温）以上の温度の影響下で毒性復帰に対し
て安定である。
この方法の使用を例示するために用いられる抗原の例
は百日咳毒素である。本発明方法を受けやすい他の毒素
には、例えば破傷風毒素やジフテリア毒素がある。この
方法は主要成分としてまたは単独では無毒性である抗原
因子（例えば他の百日咳菌抗原FHA、69Kおよび凝集原）
を含む調製物中の汚染物質として存在する毒素（例えば
百日咳毒素、PT）を不活化するために使用することがで
きる。本発明方法は所定の毒素が単独でまたは同一病原
体の他の抗原因子の組成物中に存在することと関連した
毒性を、ワクチン処方物で使用するのに適したレベルに
軽減することができる。
は百日咳毒素である。本発明方法を受けやすい他の毒素
には、例えば破傷風毒素やジフテリア毒素がある。この
方法は主要成分としてまたは単独では無毒性である抗原
因子（例えば他の百日咳菌抗原FHA、69Kおよび凝集原）
を含む調製物中の汚染物質として存在する毒素（例えば
百日咳毒素、PT）を不活化するために使用することがで
きる。本発明方法は所定の毒素が単独でまたは同一病原
体の他の抗原因子の組成物中に存在することと関連した
毒性を、ワクチン処方物で使用するのに適したレベルに
軽減することができる。
他の面において、本発明は、無毒化ボルデテラ毒素、
特に23℃またはそれ以上の温度で毒性復帰に対して安定
である無毒化百日咳毒素を提供する。本発明のこのトキ
ソイドは、中和抗体を誘導するトキソイドの能力により
証明されるように、高度の免疫原性によっても特徴づけ
られる。中和抗体の存在は特異的検定、すなわちマウス
のヒスタミン感作またはチャイニーズ・ハムスター卵巣
細胞の凝集（clustering）、により検出される。本発明
の無毒化毒素は十分に安定であって、37℃の不利な貯蔵
条件下で１カ月以上の間免疫原性を保持する。これらの
トキソイドは高品質の百日咳ワクチンの成分として有用
な出発物質であり、混合ワクチンや高度免疫血清の調製
にも使用できる。
特に23℃またはそれ以上の温度で毒性復帰に対して安定
である無毒化百日咳毒素を提供する。本発明のこのトキ
ソイドは、中和抗体を誘導するトキソイドの能力により
証明されるように、高度の免疫原性によっても特徴づけ
られる。中和抗体の存在は特異的検定、すなわちマウス
のヒスタミン感作またはチャイニーズ・ハムスター卵巣
細胞の凝集（clustering）、により検出される。本発明
の無毒化毒素は十分に安定であって、37℃の不利な貯蔵
条件下で１カ月以上の間免疫原性を保持する。これらの
トキソイドは高品質の百日咳ワクチンの成分として有用
な出発物質であり、混合ワクチンや高度免疫血清の調製
にも使用できる。
本発明の他の面では、百日咳菌に対するワクチンの調
製に有用でありかつ上記のような無毒化PT毒素の少なく
とも痕跡量を含む百日咳菌抗原因子（例えば繊維状赤血
球凝集素（FHA）、69K因子または他の百日咳菌凝集素）
の組成物が提供される。
製に有用でありかつ上記のような無毒化PT毒素の少なく
とも痕跡量を含む百日咳菌抗原因子（例えば繊維状赤血
球凝集素（FHA）、69K因子または他の百日咳菌凝集素）
の組成物が提供される。
さらに別の面において、免疫原量の、無毒化ボルデテ
ラ毒素を含有して成る所定の病原体に対するワクチン、
特に最高56℃の温度で安定しており、そのために特別の
低温輸送・配達条件を必要としない百日咳ワクチンが提
供される。本発明のワクチンは最適条件より劣った条件
下で簡便に維持・貯蔵できる点に特徴がある。本発明の
トキソイドを使って開発されたワクチンのおかげで、他
のトキソイド含有ワクチンの維持に通常必要とされる低
温貯蔵条件が利用できずしかも大気条件が極端な孤立し
た地域や低開発地域で、ワクチン接種計画を実行するこ
とが可能である。このような条件下でさえ、本発明のワ
クチンは安定であり、高品質を保つ。
ラ毒素を含有して成る所定の病原体に対するワクチン、
特に最高56℃の温度で安定しており、そのために特別の
低温輸送・配達条件を必要としない百日咳ワクチンが提
供される。本発明のワクチンは最適条件より劣った条件
下で簡便に維持・貯蔵できる点に特徴がある。本発明の
トキソイドを使って開発されたワクチンのおかげで、他
のトキソイド含有ワクチンの維持に通常必要とされる低
温貯蔵条件が利用できずしかも大気条件が極端な孤立し
た地域や低開発地域で、ワクチン接種計画を実行するこ
とが可能である。このような条件下でさえ、本発明のワ
クチンは安定であり、高品質を保つ。
本発明のさらに他の面は、有効量の本発明トキソイド
を含有する単一機能性または多機能性ワクチンの調製方
法に関する。本発明の他の面および利点は以下の詳細な
説明でさらに詳しく述べることにする。
を含有する単一機能性または多機能性ワクチンの調製方
法に関する。本発明の他の面および利点は以下の詳細な
説明でさらに詳しく述べることにする。
発明の詳細な説明 本発明は、ワクチン処方物、所定のトキソイドを含む
改良されたワクチン処方物およびトキソイド化抗原を含
む調製物中で使用するために、ボルデテラ毒素（例えば
百日咳菌毒素）を無毒化する方法を提供する。
改良されたワクチン処方物およびトキソイド化抗原を含
む調製物中で使用するために、ボルデテラ毒素（例えば
百日咳菌毒素）を無毒化する方法を提供する。
本発明方法はワクチンが望まれる種々の病原体微生物
からの多数の毒性抗原（中でも、例えば破傷風毒素やジ
フテリア毒素）をトキソイド化することができる。しか
しながら、説明および実験作業を簡便にするために、こ
こでは病原体百日咳菌からの百日咳毒素を使用してこの
トキソイド化法の効果を説明することにする。
からの多数の毒性抗原（中でも、例えば破傷風毒素やジ
フテリア毒素）をトキソイド化することができる。しか
しながら、説明および実験作業を簡便にするために、こ
こでは病原体百日咳菌からの百日咳毒素を使用してこの
トキソイド化法の効果を説明することにする。
簡単に述べると、本発明のトキソイド化PTは、試薬と
してグルタルアルデヒドを使って毒素を部分的に無毒化
し、その後PTをアミノ酸の存在下でホルムアルデヒドと
反応させることにより得られる。
してグルタルアルデヒドを使って毒素を部分的に無毒化
し、その後PTをアミノ酸の存在下でホルムアルデヒドと
反応させることにより得られる。
本発明によれば、PTの抽出物が百日咳菌の発酵ブロス
または培地から得られる。本発明方法で使用する百日咳
菌の種々の菌株は開示されており、メリーランド州ロッ
クビルのアメリカ・タイプ・カルチャー・コレクション
のような商業コレクションから簡単に入手できる。これ
らの利用可能な菌株は液体培地に十分量の所望の抗原因
子PTを産生しうる限り、どれも本発明方法で使用するこ
とができる。
または培地から得られる。本発明方法で使用する百日咳
菌の種々の菌株は開示されており、メリーランド州ロッ
クビルのアメリカ・タイプ・カルチャー・コレクション
のような商業コレクションから簡単に入手できる。これ
らの利用可能な菌株は液体培地に十分量の所望の抗原因
子PTを産生しうる限り、どれも本発明方法で使用するこ
とができる。
本発明で使用しうる菌株の例としては、百日咳菌Ｉ
相、百日咳菌II相、百日咳菌Ｉ相CS、百日咳菌Tohama、
百日咳菌185−30株、百日咳菌18−323株、百日咳菌134
株、百日咳菌509株、百日咳菌Wellcome28株、およびOff
ice of Biologics百日咳菌165株が含まれ、これらに限
定されない。本発明で使用するのに好適な菌株は、大阪
にある発酵研究所（the Institute of Fermentation）
から寄託番号IFO−14073として入手できる百日咳菌Ｉ
相、Tohamaである。
相、百日咳菌II相、百日咳菌Ｉ相CS、百日咳菌Tohama、
百日咳菌185−30株、百日咳菌18−323株、百日咳菌134
株、百日咳菌509株、百日咳菌Wellcome28株、およびOff
ice of Biologics百日咳菌165株が含まれ、これらに限
定されない。本発明で使用するのに好適な菌株は、大阪
にある発酵研究所（the Institute of Fermentation）
から寄託番号IFO−14073として入手できる百日咳菌Ｉ
相、Tohamaである。
本発明で使用するために、選択した百日咳菌株は当分
野で習熟した者に知られたいろいろな方法で増殖させる
ことができる。種培養物の量、起源または保存法に応じ
て、異なる培養工程および液状または固形培地を用いた
様々の培養方法が知られている。しかし、大規模生産の
ために通常許容できる量の接種物を供給する既知方法は
どれも本発明での使用に適しているだろう。
野で習熟した者に知られたいろいろな方法で増殖させる
ことができる。種培養物の量、起源または保存法に応じ
て、異なる培養工程および液状または固形培地を用いた
様々の培養方法が知られている。しかし、大規模生産の
ために通常許容できる量の接種物を供給する既知方法は
どれも本発明での使用に適しているだろう。
百日咳菌接種物の適当な増殖培地は、制限するもので
はないが、Gengou培地［欧州特許第0077646号;N.Andorn
et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,23:356−360（19
88）およびその中の引用文献に記載された培地］;Verwa
y培地［米国特許第4,784,589号］；合成培地B2［P.Van
Hemert,in Prog.Indust.Microbiol.,（Bull,M.J.,ed）,
vol.13,p.151,Elsevier Sci.,Amsterdam（1977）］また
はその記載された改変培地を含めて、当分野で習熟した
者により選択される。
はないが、Gengou培地［欧州特許第0077646号;N.Andorn
et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,23:356−360（19
88）およびその中の引用文献に記載された培地］;Verwa
y培地［米国特許第4,784,589号］；合成培地B2［P.Van
Hemert,in Prog.Indust.Microbiol.,（Bull,M.J.,ed）,
vol.13,p.151,Elsevier Sci.,Amsterdam（1977）］また
はその記載された改変培地を含めて、当分野で習熟した
者により選択される。
本発明の出発物質である百日咳菌培養物を増殖させる
場合は、接種物を適当な液体培地に加え、当分野で知ら
れた通常の発酵法と発酵槽デザインを使用して発酵を行
う。当業者には、発酵槽デザイン、発酵培地、方法およ
びパラメーターの特定の組合せの選択に応じて、異なる
結果が得られることが理解されよう。本発明で使用する
のに好適な組合せは大規模生産での使用に適したもので
ある。方法、デザインおよび培地のかかる組合せの例は
欧州特許出願公開第A077,646;A121,249;A239,504号;And
ornら、Satoら（1983）、SekuraらおよびSvobodaらの上
記引用文献に例示されている。欧州特許出願公開第A12
1,249号;Andornらの上記引用文献；および欧州特許出願
公開第A239,504号に記載された方法が最適である。
場合は、接種物を適当な液体培地に加え、当分野で知ら
れた通常の発酵法と発酵槽デザインを使用して発酵を行
う。当業者には、発酵槽デザイン、発酵培地、方法およ
びパラメーターの特定の組合せの選択に応じて、異なる
結果が得られることが理解されよう。本発明で使用する
のに好適な組合せは大規模生産での使用に適したもので
ある。方法、デザインおよび培地のかかる組合せの例は
欧州特許出願公開第A077,646;A121,249;A239,504号;And
ornら、Satoら（1983）、SekuraらおよびSvobodaらの上
記引用文献に例示されている。欧州特許出願公開第A12
1,249号;Andornらの上記引用文献；および欧州特許出願
公開第A239,504号に記載された方法が最適である。
本発明の実施において、発酵完了後、百日咳菌発酵ブ
ロスは目的のPT因子の変性および／または分解を避ける
ために無菌条件下に維持する。本発明の好適な実施態様
では、ブロスを１−10℃に冷却して、この温度に保つ。
pHは7.0以下に調整する。好ましくは、リン酸または酢
酸で約pH6.0−6.4の間に調整する。場合により防腐剤を
添加してもよく、例えばナトリウムチメロサールを最高
0.2g/lの最終濃度でまたは２−フェノキシ−エタノール
を0.5−１％の最終濃度でブロスに加える。所望によ
り、防腐剤は本発明方法で使用する緩衝溶液に添加して
もよい。
ロスは目的のPT因子の変性および／または分解を避ける
ために無菌条件下に維持する。本発明の好適な実施態様
では、ブロスを１−10℃に冷却して、この温度に保つ。
pHは7.0以下に調整する。好ましくは、リン酸または酢
酸で約pH6.0−6.4の間に調整する。場合により防腐剤を
添加してもよく、例えばナトリウムチメロサールを最高
0.2g/lの最終濃度でまたは２−フェノキシ−エタノール
を0.5−１％の最終濃度でブロスに加える。所望によ
り、防腐剤は本発明方法で使用する緩衝溶液に添加して
もよい。
本発明方法の任意の第一段階として、発酵ブロスをフ
ィルターに通して、主な粒子やペレットを除くことがで
き、その際環境からの汚染危険物との接触を避けるよう
にする。得られたブロスは本方法の次の段階に付される
だろう。また、より精製されたPT含有溶液も次の段階で
処理することができる。説明しやすいように、本方法は
PTと場合により他の百日咳菌抗原因子（例えばFHA）を
含む調製物として定義される“抗原因子溶液”について
述べることにする。この調製物には主にPTを含む発酵ブ
ロス、および主要量の他の百日咳菌抗原と汚染量のPTを
含む精製溶液が含まれる。
ィルターに通して、主な粒子やペレットを除くことがで
き、その際環境からの汚染危険物との接触を避けるよう
にする。得られたブロスは本方法の次の段階に付される
だろう。また、より精製されたPT含有溶液も次の段階で
処理することができる。説明しやすいように、本方法は
PTと場合により他の百日咳菌抗原因子（例えばFHA）を
含む調製物として定義される“抗原因子溶液”について
述べることにする。この調製物には主にPTを含む発酵ブ
ロス、および主要量の他の百日咳菌抗原と汚染量のPTを
含む精製溶液が含まれる。
本発明方法によれば、抗原因子溶液はほぼ中性pH、す
なわちpH5−９に緩衝化された水性媒体中約0.02−2mg/m
l、好ましくは0.1−0.25mg/mlの毒素濃度に希釈され
る。好ましくは、pH範囲は7.5−7.7である。この希釈に
望ましい水性緩衝液はリン酸緩衝溶液（PBS）である。
代表的な緩衝液は50mMリン酸塩と0.5M NaClを含み、こ
こではこれを緩衝液Ｄと呼ぶことにする。
なわちpH5−９に緩衝化された水性媒体中約0.02−2mg/m
l、好ましくは0.1−0.25mg/mlの毒素濃度に希釈され
る。好ましくは、pH範囲は7.5−7.7である。この希釈に
望ましい水性緩衝液はリン酸緩衝溶液（PBS）である。
代表的な緩衝液は50mMリン酸塩と0.5M NaClを含み、こ
こではこれを緩衝液Ｄと呼ぶことにする。
希釈後、溶液は場合により、例えば0.22mcm無菌メン
ブランを通して濾過することにより滅菌される。この抗
原因子溶液を0.03−0.07重量％の25％グルタルアルデヒ
ド水溶液で処理する。より好ましくは、この処理段階で
は、0.55％の25％グルタルアルデヒド水溶液を含む希釈
液を使用する。この段階のために、好ましくは0.55重量
％のグルタルアルデヒドが上記緩衝液Ｄ中に存在する。
ブランを通して濾過することにより滅菌される。この抗
原因子溶液を0.03−0.07重量％の25％グルタルアルデヒ
ド水溶液で処理する。より好ましくは、この処理段階で
は、0.55％の25％グルタルアルデヒド水溶液を含む希釈
液を使用する。この段階のために、好ましくは0.55重量
％のグルタルアルデヒドが上記緩衝液Ｄ中に存在する。
グルタルアルデヒド溶液は抗原因子溶液に約１−４時
間適用される。より好ましくは、グルタルアルデヒド処
理段階に１−３時間をかける。目下好適な時間は２時間
である。グルタルアルデヒド処理段階の温度は望ましく
は周囲温度、約20−25℃である。場合により、より短い
反応時間を周囲温度より高い温度と組み合わせるか、ま
たはより長い時間を周囲温度より低い温度と共に採用す
ることができる。不活化はまた異なる反応温度と適度に
修正した接触時間でも得られ、例えば10℃の温度は２−
８時間、より好ましくは４時間を要する。30℃の温度は
30分ないし２時間、より好ましくは１時間を要する。ま
た、37℃の温度は15分ないし１時間、より好ましくは30
分を要する。このグルタルアルデヒド処理段階は、反応
時間および試薬の濃度に応じて、抗原因子の部分的無毒
化をもたらす。例えば、上記濃度のグルタルアルデヒド
で20−25℃、２時間処理すると、毒性活性の0.003％が
低下する。他の処理条件は毒性活性をより大幅に低下さ
せることができる。
間適用される。より好ましくは、グルタルアルデヒド処
理段階に１−３時間をかける。目下好適な時間は２時間
である。グルタルアルデヒド処理段階の温度は望ましく
は周囲温度、約20−25℃である。場合により、より短い
反応時間を周囲温度より高い温度と組み合わせるか、ま
たはより長い時間を周囲温度より低い温度と共に採用す
ることができる。不活化はまた異なる反応温度と適度に
修正した接触時間でも得られ、例えば10℃の温度は２−
８時間、より好ましくは４時間を要する。30℃の温度は
30分ないし２時間、より好ましくは１時間を要する。ま
た、37℃の温度は15分ないし１時間、より好ましくは30
分を要する。このグルタルアルデヒド処理段階は、反応
時間および試薬の濃度に応じて、抗原因子の部分的無毒
化をもたらす。例えば、上記濃度のグルタルアルデヒド
で20−25℃、２時間処理すると、毒性活性の0.003％が
低下する。他の処理条件は毒性活性をより大幅に低下さ
せることができる。
この無毒化段階後、溶液中の部分無毒化抗原因子に少
なくとも１種の所定のアミノ酸が加えられる。アミノ酸
は約0.05−２重量％の最終濃度で添加する。アミノ酸の
好適な濃度は0.8重量％である。
なくとも１種の所定のアミノ酸が加えられる。アミノ酸
は約0.05−２重量％の最終濃度で添加する。アミノ酸の
好適な濃度は0.8重量％である。
この段階で使用される所定のアミノ酸にはトリプトフ
ァン、グリシン、リシンおよびその誘導体またはタンパ
ク質加水分解物中に存在するような他のアミノ酸類が含
まれる。好ましくは、アミノ酸トリプトファン、リシン
およびグリシンまたはその誘導体である。アミノ酸は好
ましくは溶液として、例えば上記緩衝液Ｄ中に調製さ
れ、抗原因子溶液に別々にまたは２種以上のアミノ酸の
混合物として添加される。一つの目下好適な実施態様で
は、それぞれ10％（w/v）Tween80溶液、33mlの57.4mM N
−アセチル−トリプトファンおよび11mlの2.2Mグリシン
を含む３種類の溶液を緩衝液Ｄ中に調製する。これらの
３種類の溶液は0.22mcm無菌メンブランを通して濾過滅
菌する。
ァン、グリシン、リシンおよびその誘導体またはタンパ
ク質加水分解物中に存在するような他のアミノ酸類が含
まれる。好ましくは、アミノ酸トリプトファン、リシン
およびグリシンまたはその誘導体である。アミノ酸は好
ましくは溶液として、例えば上記緩衝液Ｄ中に調製さ
れ、抗原因子溶液に別々にまたは２種以上のアミノ酸の
混合物として添加される。一つの目下好適な実施態様で
は、それぞれ10％（w/v）Tween80溶液、33mlの57.4mM N
−アセチル−トリプトファンおよび11mlの2.2Mグリシン
を含む３種類の溶液を緩衝液Ｄ中に調製する。これらの
３種類の溶液は0.22mcm無菌メンブランを通して濾過滅
菌する。
ホルマリンは抗原因子およびアミノ酸溶液に１−10重
量％、より好ましくは２−４重量％の濃度で添加され
る。ホルマリン溶液も緩衝液Ｄや同様の緩衝液中に調製
する。ホルマリンは抗原因子／アミノ酸溶液にほぼ等量
で３−10日間かけて、より好ましくは７日間かけて添加
する。ホルマリン処理の間、毒素を37−45℃の温度に維
持する。好適な実施態様では、この段階の間毒素を39−
41℃に維持する。好ましくは、この期間中毒素を定期的
にかき混ぜて、無菌条件下に保つ。ホルマリン／アミノ
酸処理段階の終わりに、無毒化百日咳トキソイド溶液は
低温で、好ましくは２−６℃で一夜貯蔵することができ
る。無毒化の間に形成された凝集物はその後トキソイド
を超音波処理にかけて破壊する。例えば、溶液を1000ワ
ットの電力、16−89KHzの周波数で１−30秒間音波処理
に付す。好ましくは、音波処理は約20KHzの周波数を用
いる。音波処理時間は好ましくは５−15秒間である。得
られた溶液は好ましくは50mcmスクリーンを通して濾過
する。
量％、より好ましくは２−４重量％の濃度で添加され
る。ホルマリン溶液も緩衝液Ｄや同様の緩衝液中に調製
する。ホルマリンは抗原因子／アミノ酸溶液にほぼ等量
で３−10日間かけて、より好ましくは７日間かけて添加
する。ホルマリン処理の間、毒素を37−45℃の温度に維
持する。好適な実施態様では、この段階の間毒素を39−
41℃に維持する。好ましくは、この期間中毒素を定期的
にかき混ぜて、無菌条件下に保つ。ホルマリン／アミノ
酸処理段階の終わりに、無毒化百日咳トキソイド溶液は
低温で、好ましくは２−６℃で一夜貯蔵することができ
る。無毒化の間に形成された凝集物はその後トキソイド
を超音波処理にかけて破壊する。例えば、溶液を1000ワ
ットの電力、16−89KHzの周波数で１−30秒間音波処理
に付す。好ましくは、音波処理は約20KHzの周波数を用
いる。音波処理時間は好ましくは５−15秒間である。得
られた溶液は好ましくは50mcmスクリーンを通して濾過
する。
本発明の無毒化法の最終段階として、インキュベート
した生産物は慣用方法でPBSに対して透析して過剰の試
薬類を除去する。透析緩衝液と透析時間を変えて、残留
ホルマリン濃度が200ppm以下となるように十分な回数を
行う。より好ましくは、ホルマリン濃度を約20ppmに保
つ。この濃度は不活化法で使用した他の薬剤の濃度を検
出不能または極めて低い濃度に低下させるのに十分であ
る。
した生産物は慣用方法でPBSに対して透析して過剰の試
薬類を除去する。透析緩衝液と透析時間を変えて、残留
ホルマリン濃度が200ppm以下となるように十分な回数を
行う。より好ましくは、ホルマリン濃度を約20ppmに保
つ。この濃度は不活化法で使用した他の薬剤の濃度を検
出不能または極めて低い濃度に低下させるのに十分であ
る。
得られた精製百日咳菌毒素または本発明方法によりト
キソイド化されたPTを含む他の百日咳菌抗原因子の混合
物は、毒性が完全に不可逆的に不活化される点に特徴が
ある。毒性型への復帰に対するこの安定性は温度が室温
（約23℃）より高い貯蔵条件下でさえも維持される。か
かる安定性は56℃で少なくとも１週間および37℃で少な
くとも４週間の実験により証明された。さらに、本発明
のトキソイドは４−８℃の低い貯蔵温度では２年以上安
定した状態のままであることが期待される。得られたト
キソイドまたは抗原因子はその後ワクチン製造のために
分配される百日咳菌抗原調製物の成分として使用され
る。
キソイド化されたPTを含む他の百日咳菌抗原因子の混合
物は、毒性が完全に不可逆的に不活化される点に特徴が
ある。毒性型への復帰に対するこの安定性は温度が室温
（約23℃）より高い貯蔵条件下でさえも維持される。か
かる安定性は56℃で少なくとも１週間および37℃で少な
くとも４週間の実験により証明された。さらに、本発明
のトキソイドは４−８℃の低い貯蔵温度では２年以上安
定した状態のままであることが期待される。得られたト
キソイドまたは抗原因子はその後ワクチン製造のために
分配される百日咳菌抗原調製物の成分として使用され
る。
従って、本発明はさらに免疫防御量の本発明トキソイ
ドまたは抗原因子を含有して成るワクチンを提供し、す
なわち重大な副作用なしに百日咳菌感染に対して防御抗
体応答を誘発させるために十分量のトキソイド化PTまた
は他の抗原因子が投与される。この種のワクチンは通常
の技法で製造することができる。例えば、ヒトの百日咳
菌感染に対する防御を刺激するワクチンは上記の安定し
たトキソイドおよび抗原因子並びに適当な慣用担体を含
むだろう。直接使用するために、本発明のトキソイドま
たは抗原因子の１種以上を生理学的pHに緩衝化した水溶
液に溶解することができる。これとは別に、トキソイド
化抗原を水酸化アルミニウムやリン酸アルミニウムとい
った慣用のアジュバントに混合または吸着させることも
できる。また、このような百日咳菌トキソイドは、１種
より多い病原体に対する防御を誘発しうるコンビネーシ
ョンまたは多機能性ワクチンを製造するために、他の免
疫原と組み合わせることもできる。例えば、New Trends
and Developments in Vaccines,eds.Voller et al.,Un
iversity Park Press,Baltimore,MD（1978）を参照され
たい。
ドまたは抗原因子を含有して成るワクチンを提供し、す
なわち重大な副作用なしに百日咳菌感染に対して防御抗
体応答を誘発させるために十分量のトキソイド化PTまた
は他の抗原因子が投与される。この種のワクチンは通常
の技法で製造することができる。例えば、ヒトの百日咳
菌感染に対する防御を刺激するワクチンは上記の安定し
たトキソイドおよび抗原因子並びに適当な慣用担体を含
むだろう。直接使用するために、本発明のトキソイドま
たは抗原因子の１種以上を生理学的pHに緩衝化した水溶
液に溶解することができる。これとは別に、トキソイド
化抗原を水酸化アルミニウムやリン酸アルミニウムとい
った慣用のアジュバントに混合または吸着させることも
できる。また、このような百日咳菌トキソイドは、１種
より多い病原体に対する防御を誘発しうるコンビネーシ
ョンまたは多機能性ワクチンを製造するために、他の免
疫原と組み合わせることもできる。例えば、New Trends
and Developments in Vaccines,eds.Voller et al.,Un
iversity Park Press,Baltimore,MD（1978）を参照され
たい。
かかるワクチンは相応の経路で、例えば皮下、静脈内
または筋肉内経路で投与される。各ワクチン用量中に存
在する本発明トキソイドの量は患者の年齢、体重、性
別、一般的な体の調子などを考慮して医師により選択さ
れる。有意な副作用なしに患者に免疫防御応答を誘発さ
せる量は使用する免疫原とアジュバントの有無により変
化する。一般に、各用量は２−50μ/gの抗原、好ましく
は５−25μ/gずつのトキソイドと抗原因子を含むと予想
される。所望により、初回用量に続いて反復ブースター
量（追加抗原量）を投与することができる。以下の実施
例は本発明の代表的トキソイドの調製法、並びにその免
疫原性と貯蔵中の毒性復帰に対する抵抗性の評価を示す
ものである。また、本発明トキソイドを用いた代表的ワ
クチン調製物も示される。
または筋肉内経路で投与される。各ワクチン用量中に存
在する本発明トキソイドの量は患者の年齢、体重、性
別、一般的な体の調子などを考慮して医師により選択さ
れる。有意な副作用なしに患者に免疫防御応答を誘発さ
せる量は使用する免疫原とアジュバントの有無により変
化する。一般に、各用量は２−50μ/gの抗原、好ましく
は５−25μ/gずつのトキソイドと抗原因子を含むと予想
される。所望により、初回用量に続いて反復ブースター
量（追加抗原量）を投与することができる。以下の実施
例は本発明の代表的トキソイドの調製法、並びにその免
疫原性と貯蔵中の毒性復帰に対する抵抗性の評価を示す
ものである。また、本発明トキソイドを用いた代表的ワ
クチン調製物も示される。
実施例１−トキソイド化法 欧州特許出願公開第EP−Ａ−0 352 250号（参照によ
りここに引用される）に記載されるように、発酵槽増殖
培地から百日咳菌毒素を抽出し、精製した。１リットル
の精製PT毒素を最初室温（例えば25℃）で緩衝液Ｄ中に
調製した0.55％（w/v）グルタルアルデヒド溶液100mlを
用いて処理した。この溶液を中性pHの上記緩衝液Ｄで0.
2mg/mlの最終タンパク質濃度に希釈し、0.22mcm無菌メ
ンブランを通して滅菌濾過する。グルタルアルデヒド処
理段階は２時間反応させる。その後4.4mlの10％（w/v）
Tween80溶液、33mlの57.4mM N−アセチル−トリプトフ
ァンおよび11mlの2.2Mグリシンを加えた。これら３つの
溶液は緩衝液Ｄで調製し、0.22mcm無菌メンブランを通
して滅菌濾過した。次に、ホルマリン、すなわち緩衝液
Ｄ中の3.7％（w/v）溶液、を次の計画に従って３回に分
けて加えた：一日目に33ml;二日目に33ml;三日目に22ml
のホルマリンを加えた。最終ホルマリン濃度は0.26％
（w/v）であった。７日間のホルマリン処理の間、PT毒
素は攪拌しながら無菌条件下で40℃±１℃に維持した。
この方法の終わりに、無毒化したPT溶液を一夜２−６℃
で貯蔵した。その後この溶液を音波処理に付し、得られ
た抗原溶液は50mcmスクリーンを通して濾過した。
りここに引用される）に記載されるように、発酵槽増殖
培地から百日咳菌毒素を抽出し、精製した。１リットル
の精製PT毒素を最初室温（例えば25℃）で緩衝液Ｄ中に
調製した0.55％（w/v）グルタルアルデヒド溶液100mlを
用いて処理した。この溶液を中性pHの上記緩衝液Ｄで0.
2mg/mlの最終タンパク質濃度に希釈し、0.22mcm無菌メ
ンブランを通して滅菌濾過する。グルタルアルデヒド処
理段階は２時間反応させる。その後4.4mlの10％（w/v）
Tween80溶液、33mlの57.4mM N−アセチル−トリプトフ
ァンおよび11mlの2.2Mグリシンを加えた。これら３つの
溶液は緩衝液Ｄで調製し、0.22mcm無菌メンブランを通
して滅菌濾過した。次に、ホルマリン、すなわち緩衝液
Ｄ中の3.7％（w/v）溶液、を次の計画に従って３回に分
けて加えた：一日目に33ml;二日目に33ml;三日目に22ml
のホルマリンを加えた。最終ホルマリン濃度は0.26％
（w/v）であった。７日間のホルマリン処理の間、PT毒
素は攪拌しながら無菌条件下で40℃±１℃に維持した。
この方法の終わりに、無毒化したPT溶液を一夜２−６℃
で貯蔵した。その後この溶液を音波処理に付し、得られ
た抗原溶液は50mcmスクリーンを通して濾過した。
実施例２−ワクチン成分の毒性 実施例１のトキソイド調製物を、グルタルアルデヒド
単独で、ホルマリンとアミノ酸のみで、およびここに記
載するようなグルタルアルデヒドとホルマリン／アミノ
酸でトキソイド化することにより調製した生産物と比較
して、本発明の生産物および方法の利点を証明する。
単独で、ホルマリンとアミノ酸のみで、およびここに記
載するようなグルタルアルデヒドとホルマリン／アミノ
酸でトキソイド化することにより調製した生産物と比較
して、本発明の生産物および方法の利点を証明する。
トキソイドの残留毒性の試験は、各試料を４℃または
37℃で１カ月間貯蔵した後に行った。この試験はチャイ
ニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞の形態を調べるこ
とを含んでいた。活性PTにさらされると、この細胞は当
業者なら正常の増殖細胞から容易に識別しうるクラスタ
ーを形成する。例えば、Gillenius et al.,J.Biol.Stan
d.,13:61−66（1985）を参照されたい。この試験は、マ
イクロタイタープレートで試験すべきトキソイドまたは
抗原因子の段階的希釈物を培養ブロス200μｌ中の2x104
CHO細胞の懸濁体と混合し、細胞を沈降させて37℃で２
日間増殖させることにより行われる。インキュベーショ
ンの終わりに、クラスターの程度を顕微鏡で調べて記録
する。この試験は約100ピコグラムの活性毒素に対する
感度を有している。
37℃で１カ月間貯蔵した後に行った。この試験はチャイ
ニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞の形態を調べるこ
とを含んでいた。活性PTにさらされると、この細胞は当
業者なら正常の増殖細胞から容易に識別しうるクラスタ
ーを形成する。例えば、Gillenius et al.,J.Biol.Stan
d.,13:61−66（1985）を参照されたい。この試験は、マ
イクロタイタープレートで試験すべきトキソイドまたは
抗原因子の段階的希釈物を培養ブロス200μｌ中の2x104
CHO細胞の懸濁体と混合し、細胞を沈降させて37℃で２
日間増殖させることにより行われる。インキュベーショ
ンの終わりに、クラスターの程度を顕微鏡で調べて記録
する。この試験は約100ピコグラムの活性毒素に対する
感度を有している。
以下の表１に例示した結果は、ホルマリン／アミノ酸
のみでの処理が完全な不活化をもたらすが、不安定なた
め37℃で４週間後に毒性へ逆戻りすることを示してい
る。グルタルアルデヒド処理単独は不完全であるが、安
定した不活化をもたらす。グルタルアルデヒドおよびホ
ルマリン／アミノ酸処理を含む本発明方法は完全でしか
も安定した不活化をもたらす。
のみでの処理が完全な不活化をもたらすが、不安定なた
め37℃で４週間後に毒性へ逆戻りすることを示してい
る。グルタルアルデヒド処理単独は不完全であるが、安
定した不活化をもたらす。グルタルアルデヒドおよびホ
ルマリン／アミノ酸処理を含む本発明方法は完全でしか
も安定した不活化をもたらす。
この試験はさらに水酸化アルミニウム吸着ワクチンに
よるマウスでのヒスタミン感作を含んでいた。１群10匹
のマウス（Swiss OF1）に１回量のワクチン（６μｇの
百日咳トキソイドと25μｇの処理FHAを含む）を静脈内
に接種する。４日後、緩衝化食塩水中の1mgのヒスタミ
ンで腹腔内にチャレンジする。チャレンジの２時間後、
各群の死亡数を記録する。例えば、Munoz et al.,Infec
t.Immunol.,33:820−826（1981）を参照されたい。ヒス
タミン試験は約30ngの活性毒素／マウスに対する感度を
有している。
よるマウスでのヒスタミン感作を含んでいた。１群10匹
のマウス（Swiss OF1）に１回量のワクチン（６μｇの
百日咳トキソイドと25μｇの処理FHAを含む）を静脈内
に接種する。４日後、緩衝化食塩水中の1mgのヒスタミ
ンで腹腔内にチャレンジする。チャレンジの２時間後、
各群の死亡数を記録する。例えば、Munoz et al.,Infec
t.Immunol.,33:820−826（1981）を参照されたい。ヒス
タミン試験は約30ngの活性毒素／マウスに対する感度を
有している。
この検定の結果を表２に示す。CHO試験と同様に、ホ
ルマリン／アミノ酸処理は完全であるが、37℃で１カ月
のインキュベーション後に可逆的な不活化を与えること
が分かる。しかしながら、この試験はグルタルアルデヒ
ドで処理した調製物とグルタルアルデヒドおよびホルマ
リン／アミノ酸で処理した調製物の両方において毒性ま
たは毒性復帰を検出できなかった。この結果はCHO試験
結果と矛盾するものではない。というのは、ヒスタミン
チャレンジ試験はCHO試験よりも感度が低く、グルタル
アルデヒド処理試料中の残留毒性レベルを検出できない
からである。
ルマリン／アミノ酸処理は完全であるが、37℃で１カ月
のインキュベーション後に可逆的な不活化を与えること
が分かる。しかしながら、この試験はグルタルアルデヒ
ドで処理した調製物とグルタルアルデヒドおよびホルマ
リン／アミノ酸で処理した調製物の両方において毒性ま
たは毒性復帰を検出できなかった。この結果はCHO試験
結果と矛盾するものではない。というのは、ヒスタミン
チャレンジ試験はCHO試験よりも感度が低く、グルタル
アルデヒド処理試料中の残留毒性レベルを検出できない
からである。
実施例３−ワクチン成分の抗原性 ホルマリン／アミノ酸処理のみ、グルタルアルデヒド
処理のみ、または実施例１に記載したような本発明方法
で不活化することにより得られたトキソイド調製物は、
PTに対して誘導された特異的ウサギ抗体を使って酵素イ
ムノアッセイで試験した。この抗体はウサギをホルマリ
ン／アミノ酸不活化トキソイドで免疫することにより得
られた。
処理のみ、または実施例１に記載したような本発明方法
で不活化することにより得られたトキソイド調製物は、
PTに対して誘導された特異的ウサギ抗体を使って酵素イ
ムノアッセイで試験した。この抗体はウサギをホルマリ
ン／アミノ酸不活化トキソイドで免疫することにより得
られた。
この抗体はビオチンに結合させて、490nmでの吸光度
を測定することによりストレプトアビジン：ペルオキシ
ダーゼ試薬で結合抗体を検出できるようにした。
を測定することによりストレプトアビジン：ペルオキシ
ダーゼ試薬で結合抗体を検出できるようにした。
結果を表３に示す。天然毒素が最も効率よく認識され
ることが分かる。グルタルアルデヒド不活化のみで調製
したトキソイドは最低の反応性を示す。ホルマリン／ア
ミノ酸処理で、または本発明方法の処理で調製したトキ
ソイドは中間の反応性を示す。
ることが分かる。グルタルアルデヒド不活化のみで調製
したトキソイドは最低の反応性を示す。ホルマリン／ア
ミノ酸処理で、または本発明方法の処理で調製したトキ
ソイドは中間の反応性を示す。
実施例４−マウスでのトキソイド化PTの防御効力 １群12匹のマウス（Balb/c）に２μｇのトキソイド調
製物を７日間隔で２回投与して免疫した。２回目の注射
の14日後、超毒性百日咳株［（18−323Ac+）；例えばBr
ezin et al.,FEMS Microbiol.Lett.,42:75−80（1987）
を参照］で鼻内にチャレンジした。チャレンジの６日後
死亡数を記録した。
製物を７日間隔で２回投与して免疫した。２回目の注射
の14日後、超毒性百日咳株［（18−323Ac+）；例えばBr
ezin et al.,FEMS Microbiol.Lett.,42:75−80（1987）
を参照］で鼻内にチャレンジした。チャレンジの６日後
死亡数を記録した。
以下の表４に示す結果から、本発明方法が最大の防御
効力を有する百日咳菌トキソイドをもたらすことが分か
る。
効力を有する百日咳菌トキソイドをもたらすことが分か
る。
実施例５−ワクチン調製物 ワクチンを処方するために、百日咳菌抗原は満足のゆ
く免疫学的特性を保持しつつ毒性をなくさねばならな
い。この目的は百日咳菌毒素をトキソイド化することに
より、および／または通常汚染量のPT毒素を含む他の抗
原に適用される類似の処理により達成される。米国特許
第4,675,321号のようなグルタルアルデヒド処理は不完
全な不活化をもたらす。欧州特許出願公開第121,249号
のようなホルマリン単独での処理は完全であるが部分的
に可逆的な不活化および保存された免疫原性をもたら
す。しかしながら、本発明方法、すなわちここに記載し
たグルタルアルデヒドおよびホルマリン／アミノ酸での
PT含有溶液の処理は、意外にも、完全な不活化と不可逆
的な不活化の両方をもたらす。得られた溶液は保存され
た免疫原性によっても特徴づけられる。かくして、本発
明の生産物および方法は、これらの抗原を含む百日咳菌
ワクチンの安全性と免疫原性に貢献するために価値があ
る。
く免疫学的特性を保持しつつ毒性をなくさねばならな
い。この目的は百日咳菌毒素をトキソイド化することに
より、および／または通常汚染量のPT毒素を含む他の抗
原に適用される類似の処理により達成される。米国特許
第4,675,321号のようなグルタルアルデヒド処理は不完
全な不活化をもたらす。欧州特許出願公開第121,249号
のようなホルマリン単独での処理は完全であるが部分的
に可逆的な不活化および保存された免疫原性をもたら
す。しかしながら、本発明方法、すなわちここに記載し
たグルタルアルデヒドおよびホルマリン／アミノ酸での
PT含有溶液の処理は、意外にも、完全な不活化と不可逆
的な不活化の両方をもたらす。得られた溶液は保存され
た免疫原性によっても特徴づけられる。かくして、本発
明の生産物および方法は、これらの抗原を含む百日咳菌
ワクチンの安全性と免疫原性に貢献するために価値があ
る。
実施例６−ワクチン調製物の安定性 実施例１に記載した本発明方法での不活化および実施
例５に記載した調製法により得られたワクチン調製物に
異なる加熱処理を施した:56℃で１週間、37℃で４週
間、または４−８℃で１年間保持した。その後ワクチン
試料は実施例２に記載したマウスでのヒスタミン感作検
定で活性PTについて分析した。表５に示す結果から、上
記処理後に毒性復帰が存在しないことが分かる。
例５に記載した調製法により得られたワクチン調製物に
異なる加熱処理を施した:56℃で１週間、37℃で４週
間、または４−８℃で１年間保持した。その後ワクチン
試料は実施例２に記載したマウスでのヒスタミン感作検
定で活性PTについて分析した。表５に示す結果から、上
記処理後に毒性復帰が存在しないことが分かる。
実施例７−４−８℃で長期貯蔵した際の免疫原性および
安定性 実施例５のように処方した抗原調製物を４−８℃で貯
蔵し、いろいろな時期に実施例２に記載したPTのヒスタ
ミン感作活性について、またPTに対するSwiss OF1マウ
スの免疫応答のED50、すなわち50％のマウスの血清転換
を誘導するのに必要な不活化PTの用量について調べた。
ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび無細胞
百日咳ワクチン成分繊維状赤血球凝集素と実施例１のよ
うに調製した不活化百日咳毒素を含む吸着三種混合DTP
ワクチンに対して類似の試験を行った。結果（表６）か
ら、復帰およびED50の有意な変動が存在しないことが分
かる。
安定性 実施例５のように処方した抗原調製物を４−８℃で貯
蔵し、いろいろな時期に実施例２に記載したPTのヒスタ
ミン感作活性について、またPTに対するSwiss OF1マウ
スの免疫応答のED50、すなわち50％のマウスの血清転換
を誘導するのに必要な不活化PTの用量について調べた。
ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび無細胞
百日咳ワクチン成分繊維状赤血球凝集素と実施例１のよ
うに調製した不活化百日咳毒素を含む吸着三種混合DTP
ワクチンに対して類似の試験を行った。結果（表６）か
ら、復帰およびED50の有意な変動が存在しないことが分
かる。
本発明方法はジフテリア毒素、破傷風毒素などの他の
抗原にも適用できる。本発明の組成物および方法のこの
ような修飾および変更はここに添付した請求の範囲に含
まれるものである。
抗原にも適用できる。本発明の組成物および方法のこの
ような修飾および変更はここに添付した請求の範囲に含
まれるものである。
フロントページの続き (56)参考文献 ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭ ＵＮＩＴＹ（1981）Ｖｏｌ．32，Ｎｏ. １，ｐ．243−250 ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭ ＵＮＩＴＹ（1981）Ｖｏｌ．32，Ｎｏ. ２，ｐ．759−768 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/02 C07K 14/235 A61K 39/10 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (14)
- 【請求項１】ボルデテラ毒素を含む部分的にまたは十分
に精製された調製物から該毒素を無毒化する方法であっ
て、該調製物をグルタルアルデヒドで処理して該毒素を
部分的に無毒化し、そして部分的に無毒化した該毒素を
所定のアミノ酸の存在下にホルマリンと反応させること
から成る方法。 - 【請求項２】前記毒素は百日咳毒素である、請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】前記アミノ酸はトリプトファン、グリシ
ン、リシンおよびそれらの誘導体より成る群から選ばれ
る、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】前記グルタルアルデヒド処理は0.02−2mg/
mlの濃度で前記毒素を含む水溶液を0.03−0.07重量％の
25％グルタルアルデヒド水溶液で処理することから成
る、請求項１記載の方法。 - 【請求項５】前記ホルマリンおよびアミノ酸処理は前記
グルタルアルデヒド処理済毒素溶液に、該溶液を37−45
℃の温度に維持しながら、約0.05−２重量％の少なくと
も１種の所定のアミノ酸および１−10重量％のホルマリ
ンを加えることから成る、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】場合により前記溶液を超音波処理にかけて
無毒化の間に形成された凝集物を除くことをさらに含
む、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】前記溶液を透析して過剰の試薬を除くこと
を含み、その場合前記溶液の残留ホルマリン濃度は常に
200ppm以下である、請求項５記載の方法。 - 【請求項８】請求項２の方法で無毒化されそして約23℃
以上の温度で毒性復帰に対して安定性を保持し得る無毒
化された百日咳菌毒素。 - 【請求項９】請求項２の方法で無毒化されそして室温以
上の温度で毒性復帰に対して安定性を保持し得る無毒化
された百日咳菌毒素を含む、百日咳菌抗原因子の組成
物。 - 【請求項１０】37℃までの温度にさらしたとき１ヵ月以
上安定である点に特徴がある、請求項８記載の毒素。 - 【請求項１１】請求項１の方法により無毒化されたボル
デテラ毒素。 - 【請求項１２】37℃までの温度で安定である点に特徴が
ある、免疫原量の、請求項８の百日咳毒素を含有して成
る百日咳菌ワクチン。 - 【請求項１３】免疫原量の、第二の病原体生物の無毒化
毒素をさらに含み、多機能性である、請求項12記載のワ
クチン。 - 【請求項１４】免疫原量の、請求項11の無毒化ボルデテ
ラ毒素を含有して成る所定の病原体に対するワクチン。
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|---|---|---|---|
| US47909890A | 1990-02-12 | 1990-02-12 | |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05503936A JPH05503936A (ja) | 1993-06-24 |
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ID=23902647
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03503734A Expired - Lifetime JP3035712B2 (ja) | 1990-02-12 | 1991-02-07 | 新規なワクチンおよびそのための方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3035712B2 (ja) |
| KR (1) | KR100202052B1 (ja) |
| AT (1) | ATE129159T1 (ja) |
| AU (1) | AU646019B2 (ja) |
| CA (1) | CA2075711C (ja) |
| CY (1) | CY1935A (ja) |
| DE (1) | DE69113991T2 (ja) |
| DK (1) | DK0515415T3 (ja) |
| ES (1) | ES2080941T3 (ja) |
| GR (1) | GR3018440T3 (ja) |
| HK (1) | HK1004524A1 (ja) |
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| NZ (1) | NZ237069A (ja) |
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| GB9216351D0 (en) * | 1992-07-31 | 1992-09-16 | Wellcome Found | Vaccine production |
| ATE452651T1 (de) * | 1998-09-01 | 2010-01-15 | Merrion Res Iii Ltd | Orale impfstoff-zusammensetzung |
| AU769539B2 (en) * | 1999-01-29 | 2004-01-29 | Zoetis Services Llc | Adjuvants for use in vaccines |
| GB0313916D0 (en) | 2003-06-16 | 2003-07-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine composition |
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|---|---|---|---|---|
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| GB8601279D0 (en) * | 1986-01-20 | 1986-02-26 | Public Health Lab Service | Purification of pertussis antigens |
| US4888169A (en) * | 1986-10-14 | 1989-12-19 | Norden Laboratories, Inc. | Bordetella Bronchiseptica vaccine |
| WO1990009444A1 (en) * | 1989-02-10 | 1990-08-23 | Genesit Oy | A method for producing pertussis toxin subunits |
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- 1991-02-07 CA CA002075711A patent/CA2075711C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-07 ES ES91903336T patent/ES2080941T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-07 CY CY193591A patent/CY1935A/xx unknown
- 1991-02-07 AU AU72110/91A patent/AU646019B2/en not_active Expired
- 1991-02-07 EP EP91903336A patent/EP0515415B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1991-02-07 JP JP03503734A patent/JP3035712B2/ja not_active Expired - Lifetime
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- 1991-02-11 NZ NZ237069A patent/NZ237069A/en unknown
-
1992
- 1992-08-11 KR KR1019920701931A patent/KR100202052B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-12-15 GR GR950403570T patent/GR3018440T3/el unknown
-
1998
- 1998-04-28 HK HK98103622A patent/HK1004524A1/xx not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ（１９８１）Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１，ｐ．２４３−２５０ |
| ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ（１９８１）Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．２，ｐ．７５９−７６８ |
Also Published As
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