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Impfstoff zur Immunisierung von Schweinen gegen Rhinitis
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atrophicans (Schnüffelkrankheit) Die vorliegende Erfindung betrifft
einen neuen Impfstoff zur Immunisierung von Schweinen gegen Rhinitis atrophicans
(RA) auf der Basis von Mikroorganismen der Gattung Bordetella und Pasteurella, Verfahren
zu seiner Herstellung und seine Verwendung.
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Die Rhinitis atrophicans (Schnüffelkrankheit) des Schweines befällt
vor allem Ferkel und Läufer. Die Krankheit kommt in fast allen Ländern vor und ruft
durch Todesfälle, verzögertes Wachstum und ungünstige Futterverwertung erhebliche
wirtschaftliche Schäden hervor.
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Bisher wurde noch kein spezifischer Erreger der RA gefunden. Dennoch
wird heute weitgehend eine infektiöse Primärursache angenommen. Bei der Untersuchung
erkrankter oder geschlachteter Tiere wurden besonders häufig Pasteurella multocida,
Bordetella bronchiseptica, Haemophilus suis, Pseudomonas aeroginosa und Mycoplasma
hyorhinis gefunden.
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Die Rhinitis atrophicans wird meist durch Tropfcheninfektion von Schwein
zu Schwein übertragen.
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Prophylaktische und therapeutische Antibiotika- und Sulfonamid-Gaben
haben sich bei der Bekampfung der Rhinitis atrophicans bewahrt.
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Sie erfordern jedoch eine laufende Behandlung der Tiere mit Medikamentgaben
oder mediziertem Futter, Es ist bekannt, zur Immunisierung gegen Rhinitis atrophicans
durch Formal in, Ultraschall oder mit Thimerosal inaktivierte Impfstoffe zu verwenden,
mit Keimkonzentrationen zwischen 1 - 6 x 1012 Keimen/ml. Die Impfstoffe sind Einfach-
oder Kombinationsimpfstoffe (Bordetella/Pasteurella), Beschrieben werden die unterschiedlichsten
Impfprogramme für Sauen und Ferkel. Auch die Dosierungen schwanken zwischen 0,5
ml und 20 ml pro Injektion (vgl. US-P 4 203 970>.
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Es sind bereits Komibnationsimpfstoffe mit inaktivierten Bordetella-
und Pasteurella-Stämmen gegen RA auf dem Markt, Sie enthalten als Adjuvantien entweder
Aluminiumhydroxid oder Öladjuvantien unbekannter Zusammensetzung, Die Immunprophylaxe
gegen Rhinitis atrophicans ist aber in der Praxis noch nicht zufriedenstellend,
so daß an der Bereitstellung weiterer Impfstoffe erhebliches wirtschaftliches Interesse
besteht Es wurde nun gefunden, daß ein hervorragender Impfstoff gegen Rhinitis atrophicans
auf Basis der Stamm
Bordetella bronchiseptica mit der CNCM Nr, 1
436 und Pasteurella multocida mit der CNCM Nr, I 437 sowie deren Varianten und Mutanten
hergestellt werden kann.
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Es wurde ferner ein neuer Impfstoff gegen Rhinitis atrophicans auf
der Basis der Stämme Bordetella bronchiseptica mit der CNCM Nr. I 436 und Pasteurella
multocida mit der CNCM Nr. I 437 sowie deren Varianten und Mutanten gefunden Es
wurden ferner die Stamme Bordetella bronchiseptica mit der CNCM Nr. I 436 und Pasteurella
multocida mit der CNCM Nr. I 437 gefunden.
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Der Stamm Bordetella bronchiseptica (rot) wurde am 24. 4. 1985 unter
der CNCM Nr. I 436 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (Institut
Pasteur) 25, rue de Docteur Roux, Paris, hinterlegt.
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Der Stamm Pasteurella multocida (R2) wurde am 24. 4. 1985 unter der
CNCM Nr. 1 437 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (Institut
Pasteur) 25, rue de Docteur Roux, Paris, hinterlegt.
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Stamm R1 (Bordetella bronchiseptica) Stamm R2 (Pasteurella Multocida
war. mis) Der Stamm R1 wurde 1978 in Spanien aus Kaninchen, die in Kontakt mit RA-kranken
Schweinen waren, isoliert.
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Der Stamm R2 wurde 1975 aus einem Schwein isoliert.
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Identifizierung durch Immunofluoreszens mit spezifischem Antiserum
der ATCC,
Identifizierung mit Hilfe des API 20E Testsystems der
Firma API System SA La Balme les Grottes 38 390 Montalien Vezien, Frankreich. Danach
werden folgende biochemische Reaktionen duchgeführt und folgende Ergebnisse erhalten:
R1 R2 (Bordetella) (Pasteurella) ONPG CIT + IND - + MAN - + SAC OX + ADH SH2 VP
+ INO MEL NO2 + + LDC HREA + Gel SOR - + AMY ODC TDA GLU - + RHA ARA - + Beide Stamme
sind gram-negativ.
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Sie wachsen auf brain-heart-infusion Agar (Firma Difco)
mit
typischer Kolonienform.
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Bordetella wächst in glatten, erhabenen, glänzenden Kolonien, Pasteurella
wachst in Form runder, kleiner (Durchmesser 1-3 mm) grauer Kolonien, Beide Stämme
können in üblicher Weise z.B. als Lyophylisat oder in Schrägröhrchenagar oder in
flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden.
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Die Vermehrung der Stamme erfolgt in üblicher Weise in Nahrmedien
die die üblichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und die notwendigen Salze enthalten
unter aeroben Bedingungen.
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Als Nährmedien seien genannt: Hirn-Herz-Dextrose-Bouillon, brain-heart-infusion,
oder Hirn-Herz-Dextrose-Bouillon-Agar, brain-heart-infusionagar.
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Hirn-Herz-Dextrose-Bouillon hat z.B, pro Liter folgende Zusammensetzung:
Kalbshirninfusion 12,5 g Rinderherzinfusion 5,0 g Proteose-Tepton (Oxoid L 46) 10,0
g Dextrose 2,0 g Kochsalz 5,0 g Dinatriumphosphat 2,5 g pH = 7,4
Hirn-Herz-Dextrose-Bouillon-Agar
hat z.B. pro Liter folgende Zusammensetzung: Kalbshirninfusion 12,5 g Rinderherzinfusionla
5,0 g Proteose-Tepton (oxoid L 46) 10,0 g Dextrose 2,0 g Kochsalz 5,0 g Dinatriumphosphat
2,5 g Agar Nr. 1 (Oxid L 11) 10,0 g pH = 7,4 Als Kohlenstoffquellen können verwendet
werden: Kohlenhydrate, insbesondere Polysaccharide, wie z.B.
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Stärke, Monosaccharide, wie z.B. Glucose oder Fructose.
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Weiterhin können noch verwendet werden Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit
oder Glycerin, außerdem auch natürlich vorkommende Gemische, wie z.B. Malzextrakt
oder Distiller soluble sowie Gemische aus den erwähnten Quellen.
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Als Stickstoffquellen können die üblichen Stickstoffquellen Verwendung
finden, so z.B. Eiweißstoffe, Eiwei5-hydrolysate, Aminosäuren, Ammoniumsalze, komplexe
Naturprodukte wie Sojabohnenmehl, Fleischextrakte, Hefeextrakte, Milchpulver und
geeignete Mischungen derselben.
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Als Hilfsstoffe werden im Nährmedium Mineralsalze benötigt, z.B. Phosphate,
Sulfate oder Chloride, des Kaliums, des Natriums, des Calciums, des Magnesiums,
Eisens, Zinks und Mangans. Die Konzentration dieser Stoffe kann in weiten Grenzen
schwanken, z.T. sind die notwendigen Konzentrationen der Mineralsalze in den o.a.
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Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen oder im verwendeten Wasser als
Verunreinigungen enthalten.
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Weiterhin können als Hilfsstoffe noch Antischaummittel der verschiedensten
Art Verwendung finden, wie z.B.
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Polyole oder Silikone.
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Die Stämme können mit Hilfe üblicher fester, halbfester oder flüssiger
Nährmedien vermehrt werden. Bevorzugt werden wässrig flüssige Nährmedien.
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Die Beimpfung der Nährmedien erfolgt dabei nach allgemein üblichen
Methoden, z.B. über Schrägröhrchen oder Kolbenkulturen.
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Die Kultur erfolgt unter aeroben Bedingungen und kann gemäß den allgemein
üblichen Methoden wie unter Verwendung von Schüttelkulturen z.B. in Schüttelkolben,
von luftbewegten Kulturen oder von Submerskulturen durchgeführt werden. Bevorzugt
erfolgt die Kultivierung im aeroben Submersverfahren in belüfteten Fermentern, z.B.
in üblichen Submersfermentationstanks. Es ist möglich, die Kulturen kontinuierlich
oder diskontinuierlich durchzuführen. Vorzugsweise wird diskontinuierlich gearbeitet.
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Die Prozentverhältnisse der Nährlösungsbestandteile können in weiten
Bereichen schwanken, im allgemeinen machen die Kohlenstoffquellen 0,5 - 8 %, vorzu
sweise 0,5 -6 %, aus, die Stickstoffquellen 0,1 - 5 %, vorzugsweise 0,5 - 2 %, aus,
die Salze liegen in üblichen Konzentrationen vor, vorzugsweise im Bereich zwischen
0,001 -2 Gew.-%. Die Antischaummittel liegen etwa in 0,5 %iger Konzentration vor.
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Der pH-Wert der wachsenden Kulturen sollte vorzugsweise zwischen etwa
5 und etwa 10, insbesondere zwischen 6,5 und 8,0 gehalten werden. Ein zu starker
pH-Abfall in den sauren Bereich kann durch Zusätze einer organischen oder anorganischen
Base, vorzugsweise von CaC03 vermieden werden. Wie in der Fermentationstechnologie
üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung durchgeführt werden, bei der
sterile organische oder anorganische Säuren, z.B. H2S04, oder sterile Laugen, z.B.
NaOH in Abständen in die Kulturlösung eingespritzt werden. Oder der pH-Wert wird
durch Einblasen steriler C02-haltiger Luft gesteuert.
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Es ist zweckmäßig sicherzustellen, daß die Mikroorganismen ausreichend
mit Sauerstoff sowie den Nährstoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach
den allgemein üblichen Methoden wie Schütteln oder Rühren erfolgen.
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Die Züchtungstemperatur kann zwischen etwa 15°C und etwa 50°C, vorzugsweise
zwischen 20 und 40"C liegen, besonders bevorzugt liegt sie bei etwa 37"C. Die Dauer
der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z.B. die Zusammensetzung des Nährmediums
und die Züchtungstemperatur eine Rolle spielen. Die jeweiligen optimalen Bedingungen
können von jedem Fachmann auf dem mikrobiologischen Gebiet leicht festgelegt werden.
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Wie allgemein bei mikrobiologischen Verfahren sollten Fremdinfektionen
der Kulturmedien vermieden werden.
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Hierzu werden die üblichen Vorkehrungen getroffen, wie Sterilisation
der Nährmedien, der Kulturgefässe sowie der für die Belüftung notwendigen Luft.
Zur Sterilisation der Vorrichtung können z.B. die Dampf- als auch die Trockensterilisation
verwendet werden. Die zur Sterilisation angewandten Temperaturen liegen bei 100
- 200"C, bevorzugt bei 120 - 1300C.
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Falls bei der Kultivierung in unerwünschter Menge Schaum entsteht,
können die üblichen chemischen Schaumdämpfungs mittel, z.B. flüssige Fette und Öle,
Öl-Wasser-Emulsionen, Paraffine, höhere Alkohole, wie Octadecanol, Siliconöle, Polyoxyethylen-
bzw. Polyoxypropylenverbindungen zugesetzt werden. Schaum kann auch mit Hilfe der
üblichen mechanischen Vorrichtungen (welche z.B. Zentrifugalkräfte benutzen) gedämpft
oder beseitigt werden.
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Die so erhaltenen Kulturen können entweder direkt zur Herstellung
des Impfstoffes eingesetzt werden, oder es werden die Zellen der Kultur in üblicher
Weise (z.B.
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durch Zentrifugieren doer Filtrieren) abgetrennt und weiter in üblicher
Weise formuliert.
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Zur Herstellung des Impfstoffes werden die Bakterienstämme entweder
vor ihrer Vereinigung oder danach inaktiviert. Die Inaktivierung erfolgt durch übliche
Inaktivierungsmittel wie z.B. Formalin, beta-Propioacton, Hydroxylamin, Ethylenoxid,
Ethylenimin und seine Derivate, Chloroform, Phenol, Thimerosal. Bevorzugt ist Formal
in.
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Wird die Inaktivierung z.B. mit Formalin vor der Abtrennung der Zellen
durchgeführt kann gegebenenfalls durch Abtrennung der Zellen eine gesondere Neutralisierung
des Inaktivierungsmittels vermieden werden.
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Die Inaktivierung mit Formal in (37-40 %) erfolgt bei Formalinkonzentrationen
von 0,1 - 2 Volumenprozent, bevorzugt bei 0,5-1 Volumenprozent.
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Zur Inaktivierung mit Formal in wird die Kultur 6 - 100 Stunden, bevorzugt
48 - 84 Stunden, besonders bevorzugt bei 70 - 80 Stunden, bei 37"C behandelt.
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Die Inaktivierung kann auch mit Thimerosal (Natriumethyl-mercurithiosalicylat)
in einer Konzentration von ca. 1:104 durchgeführt werden.
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Die inaktivierten Mikroorganismen können mit geeigneten Adjuvantien
zur Erhöhung der Wirksamkeit versetzt werden.
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Solche Adjuvantien sind z.B. komplettes oder inkomplettes Freund'sches
Adjuvans, Aluminiumoxide, -hydroxide, -oxigele, -salze wie z.B. Phosphate, Stearate
sowie Alginate wie Natriumalginat. Besonders bevorzugt sind Natriumalginat und Calciumgluconat.
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Nicht-ölige Adjuvantien sind im Impfstoff normalerweise in Konzentrationen
von 1-10 Gewichtsprozent, bevorzugt 5-10 Gewichtsprozent vorhanden. Ölige Adjuvantien
sind im Impfstoff normalerweise in Konzentrationen von 40-60 Volumenprozent vorhanden.
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Die Impfstoffe können noch weitere Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel
oder Pufferstoffe enthalten. Als Konservierungsmittel dienen z.B. Formalin sowie
Thimerosal.
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Als Pufferstoffe dienen z.B. Phosphate wie Dinatriumhydrogenphosphat.
Carbonate wie Natriumhydrogencarbonat.
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In den Impfstoffen liegen die inaktivierten Bakterienstämme in einem
Gehalt von 5 - 30 . 109 Keimen pro ml vor. Bevorzugt sind 15 . 109 Keime pro ml.
Das Verhältnis des Gehaltes beider Bakterienstämme ist etwa 1:1.
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Die Impfstoffe haben einen pH-Wert von 6 - 8. Bevorzugt ist ein pH-Wert
von 7.
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Impfstoffe
werden zur Impfung von Schweinen eingesetzt.
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Es werden bevorzugt trächtige Muttertiere, aber auch Ferkel aller
Altersstufen geimpft.
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Die Impfung erfolgt parenteral durch Injektion (intramuskulär oder
subkuttan) oder durch Besprühen der Nasen-und Rachenschleimhäute mit dem Impfstoff.
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Der Impfstoff wird zur Impfung in Mengen von 2-3 ml pro Tier eingesetzt.
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Die Impfung wird bevorzugt nach 3-4 Wochen und danach alle 3-4 Monate
wiederholt um einen andauernden Schutz zu gewährleisten.
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Beispiel 1 Mit 20 ml eines Inoculums aus Brain Heart Infuscion in
dem 24 Stunden bei 37*C eine Probe des Stammes Bordetella CNCM Nr. I 436 kultiviert
wurde, werden 20 1 sterile Nährlösung der folgenden Zusammensetzung beimpft: Na2H
P04 244 g NaCl 11 g Mg S04 . 7 H20 2g Glucose 100 g Hefe 80 g Wasser ad 20 1 Die
Kultur wurde 24 - 45 Stunden bei 37'C gehalten und 2 - 3 mal taglich aufgeschüttelt.
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Beispiel 2 Die in Beispiel 1 angegebene Vorschrift wurde mit dem Stamm
Pasteurella CNCM Nr. 1 437 wiederholt.
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Beispiel 3 Die aus den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Kulturen wurden
dann mit soviel Formal in (37-40 X) versetzt, dag die Formalinkonzentration 0,8
Volumenprozent beträgt, Die Inaktivierung der Bakterienstamme erfolgte wahrend 72-96
Stunden bei 37WC unter Rühren
BeisPiel 4 Die gemäß Beispiel 3 erhaltenen
Kulturen inaktivierter Bakterien wurden anschließend zentrifugiert und das Zellmaterial
in soviel physiologischer Kochsalzlösung (0,9 %) aufgenommen, daß ein Gehalt an
1012 Keimen pro ml entstand.Die so erhaltenen Lösungen beider Stämme wurden dann
vereinigt im Verhältnis 1:1 und mit 6 . 10 4 Gewichtsprozent Thimerosal versetzt.
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Beispiel 5 Die Lösung beider Stämme aus Beispiel 4 wurde mit soviel
steriler 15 %iger wäßriger Natriumalginatlösung und soviel steriler 20 %iger wäßriger
Calciumgluconatlösung versetzt, daß die Endkonzentration an Natriumalginat und die
Endkonzentration an Calciumgluconat jeweils 4 % beträgt. Der pH-Wert der Lösung
wurde auf 7,2 durch Zugabe von 20 %iger wäßriger NaOH eingestellt. Die gesamte Lösung
wurde 24 Stunden bei 37"C gehalten und anschließend steril abfiltriert.
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BeisPiel A 2 trachtige Schweine werden 7 Wochen und 2 Wochen vor dem
Werfen mit je 2 ml erfindungsgemaßer Vaccine (hergestellt nach Beispiel 5) subcutan
geimpft, Die geborenen Ferkel wurden im Alter von 16 Tagen mit einem Feldstamm von
Bordetella Brochiseptica intranasal infiziert.
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Ferkel gleichen Alters nicht geimpfter Schweine wurden als Kontrolle
eingesetzt, Die Ferkel der geimpften schweine zeigten nach 3-6 Tagen post infektionen
kein Fieber wahrend die Ferkel der nicht geimpften Schweine um 10C erhöhte Temperatur
zeigten, Nach Beendigung des Versuchs (ca. 18 Tage nach Infektion) wurde die Mortalitat
bestimmt. Bei den geschützten Schweinen starben keine der 16 Ferkel, O X der Ferkel
hatten RA (pathologisch anatomisch festgestellt). Bei den Kontrolltieren starben
3 von 18 Ferkeln, 88 X der Ferkel hatten RA (pathologisch anatomisch festgestellt).